CZ34938U1 - Souprava pro izolaci nukleových kyselin - Google Patents

Description

Souprava pro izolaci nukleových kyselin

Oblast techniky

Technické řešení se týká oblasti izolace nukleových kyselin za využití paramagnetických částic.

Dosavadní stav techniky

V současném stavu techniky jsou známy metody pro izolaci nukleových kyselin, přičemž obecný postup zahrnuje rozrušení tkáně či buněk daného vzorku pomocí lyzačních pufrů, následuje navázání nukleových kyselin pomocí binding pufrů a dále extrakce a purifikace nukleových kyselin od proteinů a dalších příměsí pomocí promývacích pufrů. Výsledná nukleová kyselina je poté pomocí elučního pufiru uvolněna do čistého roztoku. Běžné metody, jako je fenol-chloroformová extrakce, adsorpce na silikát za použití chaotropních solí nebo iontová chromatografie, jsou ale často náročné, velmi pracné, a navíc u nich může lehce dojít ke kontaminaci vzorku.

V posledních letech se stále více používají postupy využívající magnetickou separaci, která zajišťuje rychlé výsledky. K magnetické separaci nukleových kyselin se využívají magnetické částice, které mají velikost řádově nanometrů až mikrometrů. Částice mají paramagnetické vlastnosti, což umožňuje jejich jednouché rozptylování či shlukování v závislosti na působení vnějšího magnetického pole. Postup izolace spočívá v účinné lýzi biologického materiálu pomocí lyzačního pufiru obsahujícího guanidium thiokyanát v kombinaci se štěpením enzymem proteinázou K. Po lýze následuje krok navázání nukleové kyseliny na magnetické částice. Částice s funkčním povrchem se na základě silanolových skupin navážou na nukleové kyseliny, což při promývání pufrem zaručí zachování nukleových kyselin a odstranění kontaminantů. Samotná magnetická separace je založena na elektrostatické interakci DNA s povrchem částic. V posledním krokuje nukleová kyselina eluována do elučního pufru.

Během izolace nukleových kyselin je velmi důležité využívat kombinaci vhodných reagencií v předem daných krocích a zachovávat stabilní pH a reakční teploty. Kromě jednotlivých reagencií je běžnou složkou používaných pufrů také voda bez nukleáz (NFW - Nuclease-Free Water). Existuje několik firem zabývajících se izolací nukleových kyselin pomocí paramagnetických částic, avšak žádná z nich nepopisuje jednoduchou, spolehlivou a přesnou metodu jak pro humánní vzorky, tak i pro bakterie, viry a různé klinické materiály. Další výhodou by byla univerzálnost, která by v praxi umožňovala jak manuální, tak i automatizovanou extrakci.

Podstata technického řešení

Výše uvedené nedostatky do jisté míry odstraňuje souprava pro izolaci nukleových kyselin zahrnující zkumavky s reagenciemi. Reagencie zahrnují právě jeden lyzační pufr, právě jeden vazebný pufr (binding pufr), alespoň jeden promývací pufr, právě jeden eluční pufr a magnetické kuličky. Uvedeného cíle je dosaženo vhodnou kombinací složek, kde lyzační pufr zahrnuje Guanidin SCN - guanidin thiokyanát, Tris-HCl - tris(hydroxymetyl)aminometan hydrochlorid pH 8, Triton X-100 - 2-[4-(2,4,4-trimetylpentan-2-yl)fenoxy]etanol a vodu bez nukleáz - NFW, vazebný pufr zahrnuje Guanidin SCN - guanidin thiokyanát, Tris-HCl tris(hydroxymetyl)aminometan hydrochlorid pH 8 aetanol, promývací pufr zahrnuje NaCl, Guanidin SCN - guanidin thiokyanát, Tris-HCl - tris(hydroxymetyl)aminometan hydrochlorid pH 8, etanol a NFW, eluční pufr zahrnuje Tris-HCl - tris(hydroxymetyl)aminometan hydrochlorid pH8aNFW.

Izolace nukleových kyselin je dosaženo kombinací chemických roztoků a přesného postupu, které umožňují degradaci složitých komponent, jejich postupné vymývání a zajištění čisté nukleové

-1 CZ 34938 UI kyseliny. Dostatečné vymytí a výtěžnost je zamčena použitím magnetických kuliček, které umožňují vyvázaní nukleové kyseliny a její separaci od roztoků.

Objasnění výkresů

Podstata technického řešení je dále objasněna na příkladech jeho uskutečnění, které jsou popsány s využitím připojeného výkresu, kde:

Obr. 1 Zobrazuje soupravu pro izolaci nukleové kyseliny

Příklady uskutečnění technického řešení

Uvedené uskutečnění znázorňuje příkladnou variantu provedení technického řešení, která však nemá z hlediska rozsahu ochrany žádný omezující vliv.

V příkladném uskutečnění souprava pro izolaci nukleových kyselin zahrnuje 9 zkumavek označených pozicemi 1. až 9., viz Obr. 1. První dvě zkumavky jsou prázdné a mohou sloužit k míšení reagencií. Třetí zkumavka zahrnuje vodu bez nukleáz, která zajišťuje konzistenci experimentu a minimální kontaminaci roztoků. Čtvrtá zkumavka zahrnuje eluční pufr zahrnující Tris-HCl pH 8 a vodu bez nukleáz. Eluční pufr uvolňuje přečištěnou nukleovou kyselinu do čistého roztoku. Pátá zkumavka zahrnuje třetí promývací pufr zahrnující vodu bez nukleáz. Šestá zkumavka zahrnuje druhý promývací pufr zahrnující NaCl, Tris-HCl pH 8, etanol a vodu bez nukleáz. Sedmá zkumavka zahrnuje první promývací pufr zahrnující Guanidin SCN, Tris-HCl pH 8, etanol a vodu bez nukleáz. Promývací pufiry slouží k odstranění proteinů a dalších příměsí z roztoku s nukleovou kyselinou. Osmá zkumavka zahrnuje binding pufr zahrnující Guanidin SCN, Tris-HCl pH 8 a etanol. Binding pufr zajišťuje navázání magnetických kuliček k nukleové kyselině. Devátá zkumavka zahrnuje lyzační roztok zahrnující Guanidin SCN, Tris-HCl pH 8, Triton X-100 a vodu bez nukleáz. Lyzační pufr rozkládá vnější membránu buněk, což způsobí vylití obsahu buňky do roztoku. V tomto uskutečnění za zkumavkami označenými pozicemi 1. až 9. dále následuje zkumavka sloužící k separaci vzorku. Souprava pro izolaci nukleových kyselin dále obsahuje dvě zkumavky, které jsou součástí termobloku a umožňují zahřátí vzorku na určitou teplotu.

- 2 CZ 34938 UI

Přehled využitých reagencií je uveden v následující tabulce:

Pufr	Složky	lllllllllllllllllllllllllll
Lyzační pufr	Guanidin SCN	6 až 7
Tris-HCl pH 8
Triton X-100
NFW
Binding pufr	Guanidin SCN	6 až 7
Tris-HCl pH 8
Ethanol
První promývací pufr	Guanidin SCN	6,5
Tris-HCl pH 8
Etanol
NFW
Druhý promývací pufr	NaCl	7 až 8
Tris-HCl pH 8
Etanol
NFW
Třetí promývací pufr	NFW	-
Magnetické kuličky	Paramagnetické částice	-
Eluční pufr	Tris-HCl pH 8	7 až 8
NFW

Postup izolace nukleových kyselin zahrnuje 10 hlavních kroků. První krok je nastavení termobloku na teplotu 70 °C. Druhý krok zahrnuje pipeto vání vzorku do zkumavky, přičemž ve třetím kroku je ke vzorku přidána proteináza K s interní kontrolou. Proteináza K způsobí degradaci proteinů a inaktivuje DNázy a RNázy. Ve čtvrtém krokuje ke vzorku přidán lyzační pufr, přičemž vzorek je poté vortexován a inkubován po dobu 13 minut při 70 °C. Ihned po lýzi je nastavena teplota termobloku na 56 °C a do vzorku je pipetován eluční roztok vhodný pro temperování. V pátém krokuje vzorek krátce centrifůgován a je do něj přidán binding pufr s magnetickými kuličkami. Proces navázání magnetických kuliček trvá asi 5 minut při pokojové teplotě. Každou minutu je vzorek vortexován a po 5 minutách je centrifůgován a vložen na 2 minuty do magnetického stojánku pro separaci magnetických částic od pufiru. Na konci pátého kroku je odpipetována veškerá tekutina ze zkumavky, přičemž zkumavka musí být stále umístěná v magnetickém stojánku, aby se zabránilo ztrátě magnetických částic. Šestý krok zahrnuje promytí vzorku pomocí prvního promývacího pufiru. Po přidání prvního promývacího vzorku je vzorek vortexován 15 s a pak dále krátce centrifůgován. Následně je vzorek na 2 minuty vložen do magnetického stojánku pro separaci magnetických částic od pufiru. Na konci šestého kroku je odpipetována veškerá tekutina ze zkumavky, přičemž zkumavka musí být stále umístěná v magnetickém stojánku, aby se zabránilo ztrátě magnetických částic. Postup v kroku sedm je zcela stejný jako v kroku šest, avšak pro promývání je použit druhý promývací pufr. Osmý krok opět zahrnuje

-3CZ 34938 UI promývání, a to se třetím promývacím pufrem. Devátý krok představuje vysoušení magnetických částic po dobu 10 minut. Zkumavka se vzorkem se otevře a umístí do stojanu. Důležité je dodržení předem stanovené doby vysoušení, jinak se magnetické částice slepí k sobě. Poslední desátý krok zahrnuje eluci magnetických částic do elučního pufru, který je zahřátý na 56 °C. Vzorek se dále 5 vortexuje a inkubuje po dobu 5 minut při teplotě 56 °C. Každou minutu je vzorek vortexován a po 5 minutách je centrifugován a vložen na 2 minuty do magnetického stojánku pro separaci magnetických částic od pufru. Na závěr je eluát obsahující nukleovou kyselinu pipetován do čistého elučního pufru. Během celého postupuje dodržováno pH okolo hodnoty 7, tj. neutrální pH.

Průmyslová využitelnost

Souprava pro izolaci nukleových kyselin je určena k izolaci nukleových kyselin (RNA, DNA) z humánních vzorků, bakterií a virů z různých klinických materiálů. Je vhodná pro aplikaci 15 manuální extrakce i pro automatizovanou extrakci.

Claims (1)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   5 1. Souprava pro izolaci nukleových kyselin zahrnující zkumavky s reagenciemi, přičemž reagencie zahrnují právě jeden lyzační pufr, právě jeden vazebný pufr, alespoň jeden promývací pufr, právě jeden eluční pufr a magnetické kuličky, vyznačující se tím, že lyzační pufr zahrnuje guanidin thiokyanát, tris(hydroxymetyl)aminometan hydrochlorid pH 8, 2-[4-(2,4,4-trimetylpentan-2-yl)fenoxy]etanol a vodu bez nukleáz, vazebný pufr zahrnuje guanidin ίο thiokyanát, tris(hydroxymetyl)aminometan hydrochlorid pH 8 a etanol, promývací pufr zahrnuje NaCl, guanidin thiokyanát, tris(hydroxymetyl)aminometan hydrochlorid pH 8, etanol a vodu bez nukleáz a eluční pufr zahrnuje tris(hydroxymetyl)aminometan hydrochlorid pH 8 a vodu bez nukleáz.