JP2018503366A - プラスミドdna精製のための方法及びキット - Google Patents
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Abstract
Description
核酸精製のための方法が、本明細書に開示され、該方法は、(a)少なくとも1つの核酸を含む試料を、懸濁バッファと混合し、懸濁液を形成する工程;(b)懸濁液を溶解バッファと混合し、溶解液を形成する工程;(c)溶解液を結合バッファと混合し、溶液を形成する工程;(d)溶液を少なくとも1つの磁性粒子と混合し、少なくとも1つの核酸に可逆的に結合された少なくとも1つの改質された磁性粒子を含む混合溶液を形成する工程;(e)少なくとも1つの改質された磁性粒子を混合溶液から分離する工程;(f)少なくとも1つの改質された磁性粒子を第1の洗浄バッファ及び第2の洗浄バッファで洗浄する工程;及び、(g)少なくとも1つの改質された磁性粒子を溶出バッファと混合する工程、を含む。
本開示はまた、核酸精製のためのキットにも関し、該キットは、懸濁バッファ、溶解バッファ、結合/中和バッファ、少なくとも1つの磁性粒子、第1の洗浄バッファ、第2の洗浄バッファ、及び必要に応じて溶出バッファを含む。バッファは、さまざまな実施形態において、精製方法に関して先に開示されたバッファS1、S2、S3、B1、W1、W2及びE1に対応しうる。各バッファに関して上述したさまざまな実施形態は、本明細書に開示されるキットを形成するために、限定されることなく、任意の方式で組み合わせることができるものと解されたい。
単なる論述の目的で、細菌培養からpDNAを精製するための例となるプロトコルが、以下に提供される。当然ながら、このプロトコルは、限定することを意図されておらず、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
b)懸濁バッファの調製:100μg/mlの最終濃度まで、懸濁バッファS1にRNアーゼを加える;
c)試料の懸濁:1mlの一晩細菌培養を1.5マイクロ遠心分離管に移し、1分間12,000gにおける遠心分離により細胞を採取し、その後、培養培地を除去し、250μlの調製S1バッファにより再懸濁する;
d)試料の溶解:250μlの溶解バッファS2を懸濁液に加え、最低10回の反転により混合する;
e)結合のための調製:350μlの結合バッファS3を細胞溶解物に加え、最低10回、又は濁った微粒子が見えるまで、反転により混合する;
f)細胞溶解物のクリアリング:溶液を12,000gで10分間遠心分離し、透明な溶解物を新しいマイクロ遠心分離管に移す;
g)磁性粒子の調製:使用前に少なくとも1分間、水又はカオトロピック剤中で磁性粒子の懸濁液をボルテックスする;
h)pDNAの結合:透明な溶解物に50μlの磁性粒子溶液を加え、反転により混合し、その後、室温で5分間インキュベートする;
i)pDNA結合磁性粒子の分離:1分間磁気スタンドを使用して可逆的に結合したpDNAを有する磁性粒子を磁気によって分離し、残存する溶解物を除去する;
j)pDNA−結合磁性粒子の洗浄:可逆的に結合したpDNAを含む磁性粒子を、500μlの洗浄バッファW1で一度及び700μlの洗浄バッファW2で一度洗浄する;
k)洗浄バッファの除去:洗浄バッファW1及びW2を除去し、可逆的に結合したpDNAを有する磁性粒子を磁気スタンド上で5分間、上下を逆にして空気乾燥させる;
l)pDNAの溶出:磁気スタンドから管を取り外し100μl(又はより濃縮した試料の生成のために50μl)の水を加え、室温で1分間インキュベートする;
m)pDNAの精製:管を磁気スタンド上に1分間置き、磁性粒子を除去し、溶出したpDNAを新しいマイクロ遠心分離管に移す。
pDNAを、1000μgのQbeads又は5000μgのGraceビーズを用いる上記プロトコルを使用して細菌培養物から精製した。同じ細菌培養物をまた、Promega社のWizard MagneSil Tfx(登録商標)を使用して精製した。各方法について平均全pDNA収率を定量し、図2に示した。Qbeadsを使用する本発明の方法についての平均全pDNA収率は、1mlの細菌培養(O.D.600≒1)の試料から10.0μgであった。Graceビーズを使用する本発明の方法についての平均pDNA収率は、9.2μgであるのに対し、比較例のPromega法は10.7μgのpDNAを生じた。
SDS又はSDBSを含む溶解バッファS2を用いる上記プロトコルを使用して、細菌培養物からpDNAを精製した。同じ細胞培養物をまた、Promega社のWizard MagneSil Tfx(登録商標)を使用して精製した。各方法について平均全pDNA収率を定量し、図4に示した。溶解バッファS2中でSDSを使用する本発明の方法についての平均全pDNA収率は、1mlの細胞培養物(O.D.600≒1)の試料から7.3μgであった。溶解バッファS2中でSDBSを使用する本発明の方法についての平均pDNA収率は、9.8μgであるのに対し、比較例のPromega法は6.4μgのpDNAを生じた。
核酸精製のための方法であって、
(a)少なくとも1つの核酸を含む試料を懸濁バッファと混合し、懸濁液を形成する工程;
(b)前記懸濁液を溶解バッファと混合し、溶解物を形成する工程;
(c)前記溶解物を結合バッファと混合し、溶液を形成する工程;
(d)前記溶液を少なくとも1つの磁性粒子と混合し、少なくとも1つの改質された磁性粒子を含む混合溶液を形成する工程であって、前記少なくとも1つの改質された磁性粒子が前記少なくとも1つの核酸に可逆的に結合される、工程;
(e)前記少なくとも1つの改質された磁性粒子を、前記混合溶液から分離する工程;
(f)前記少なくとも1つの改質された磁性粒子を、第1の洗浄バッファ及び第2の洗浄バッファで洗浄する工程;及び
(g)前記少なくとも1つの改質された磁性粒子を、溶出バッファと混合する工程;
を含み、
前記懸濁バッファが、約1mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のイオンキレート剤、及び約10mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のバッファ化合物を含み、
前記溶解バッファが、約1質量%〜約10質量%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの洗浄カオトロピック剤、及び約0.2M以上の濃度で存在する少なくとも1つの第2のバッファ化合物を含み、
前記結合バッファが、約4M〜約6Mの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のカオトロピック剤、約0.1M〜約2Mの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも1つの第1の塩、約1体積%〜約5体積%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のアルコール、及び約0.25質量%〜約3質量%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第3のバッファ化合物を含み、
前記第1の洗浄バッファが、約4M〜約6Mの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のカオトロピック剤、約1mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のイオンキレート剤、約30体積%〜約50体積%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のアルコール、及び約10mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第4のバッファ化合物を含み、
前記第2の洗浄バッファが、少なくとも1つの第3のアルコール、及び随意的な少なくとも1つの第2の塩を含む、
ことを特徴とする方法。
前記少なくとも1つの核酸を含む前記試料が、プラスミドDNAを含む少なくとも1つの細菌細胞物であることを特徴とする、実施形態1に記載の方法。
前記少なくとも1つの第1のイオンキレート剤が、エチレンジアミン4酢酸(EDTA);エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸(EDDS);シクロヘキサン−1,2−ジアミン四酢酸(CDTA);イミノジコハク酸(IDS);ポリアスパラギン酸(PASA);メチルグリシン二酢酸(MGDA);L−グルタミン酸N,N−二酢酸・四ナトリウム(GLDA)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1のバッファ化合物が、Tris、Tris−HCl、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態1又は2に記載の方法。
前記少なくとも1つの洗浄カオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SDBS)、ラウリル硫酸アンモニウム(ALS)、ドデシル硫酸カリウム(PDS)、ミレス硫酸ナトリウム、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のバッファ化合物が、水酸化ナトリウム(NaOH)、水酸化リチウム(LiOH)、水酸化カリウム(KOH)、水酸化ルビジウム(RbOH)、水酸化セシウム(CsOH)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態1〜3のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも1つの第1のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩(GuHCl)、チオシアン酸グアニジン(GuSCN)、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1の塩が、硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)、酢酸アンモニウム(NH4Ac)、酢酸リチウム(LiAc)、酢酸カリウム(KAc)、酢酸ナトリウム(NaAc)、塩化ナトリウム(NaCl)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第3のバッファ化合物が、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態1〜4のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも1つの第2のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩(GuHCl)、チオシアン酸グアニジン(GuSCN)、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のイオンキレート剤が、エチレンジアミン4酢酸(EDTA);エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸(EDDS);シクロヘキサン−1,2−ジアミン四酢酸(CDTA);イミノジコハク酸(IDS);ポリアスパラギン酸(PASA);メチルグリシン二酢酸(MGDA);L−グルタミン酸N,N−二酢酸・四ナトリウム(GLDA)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第4のバッファ化合物が、Tris、Tris−HCl、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態1〜5のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも1つの第3のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2の塩が、硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)、酢酸アンモニウム(NH4Ac)、酢酸リチウム(LiAc)、酢酸カリウム(KAc)、酢酸ナトリウム(NaAc)、塩化ナトリウム(NaCl)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態1〜6のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも1つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、実施形態1〜7のいずれかに記載の方法。
前記溶液を前記少なくとも1つの磁性粒子と混合する工程(d)の前に、前記溶液を遠心分離し、少なくとも1つの凝集体又は高分子を除去する工程をさらに含むことを特徴とする、実施形態1〜8のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも1つの改質された磁性粒子から前記少なくとも1つの核酸を放出するのに十分な時間、前記溶出バッファと共に前記少なくとも1つの改質された磁性粒子をインキュベートする工程をさらに含み、前記溶出バッファが、水、及び少なくとも1つのバッファ化合物及び/又は少なくとも1つのイオンキレート剤を含む溶液から選択されることを特徴とする、実施形態1〜9のいずれかに記載の方法。
核酸精製のためのキットであって、
(a)約1mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のイオンキレート剤、及び約10mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のバッファ化合物を含む懸濁バッファ;
(b)約1質量%〜約10質量%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの洗浄カオトロピック剤、及び約0.2M以上の濃度で存在する少なくとも1つの第2のバッファ化合物を含む溶解バッファ;
(c)約4M〜約6Mの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のカオトロピック剤、約0.1M〜約2Mの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも1つの第1の塩、約1体積%〜約5体積%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のアルコール、及び約0.25質量%〜約3質量%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第3のバッファ化合物を含む結合バッファ;
(d)約4.5M〜約6Mの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のカオトロピック剤、約1mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のイオンキレート剤、約30体積%〜約50体積%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のアルコール、及び約10mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第4のバッファ化合物を含む第1の洗浄バッファ;
(e)少なくとも1つの第3のアルコール、及び随意的な少なくとも1つの第2の塩を含む第2の洗浄バッファ;及び
(f)少なくとも1つの磁性粒子、
を含むことを特徴とするキット。
前記少なくとも1つの核酸を含む前記試料が、プラスミドDNAを含む少なくとも1つの細菌細胞であることを特徴とする、実施形態11に記載のキット。
前記少なくとも1つの第1のイオンキレート剤が、エチレンジアミン4酢酸(EDTA);エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸(EDDS);シクロヘキサン−1,2−ジアミン四酢酸(CDTA);イミノジコハク酸(IDS);ポリアスパラギン酸(PASA);メチルグリシン二酢酸(MGDA);L−グルタミン酸N,N−二酢酸・四ナトリウム(GLDA)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1のバッファ化合物が、Tris、Tris−HCl、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態11又は12に記載のキット。
前記少なくとも1つの洗浄カオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SDBS)、ラウリル硫酸アンモニウム(ALS)、ドデシル硫酸カリウム(PDS)、ミレス硫酸ナトリウム、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のバッファ化合物が、水酸化ナトリウム(NaOH)、水酸化リチウム(LiOH)、水酸化カリウム(KOH)、水酸化ルビジウム(RbOH)、水酸化セシウム(CsOH)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態11〜13のいずれかに記載のキット。
前記少なくとも1つの第1のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩(GuHCl)、チオシアン酸グアニジン(GuSCN)、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1の塩が、硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)、酢酸アンモニウム(NH4Ac)、酢酸リチウム(LiAc)、酢酸カリウム(KAc)、酢酸ナトリウム(NaAc)、塩化ナトリウム(NaCl)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第3のバッファ化合物が、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態11〜14のいずれかに記載のキット。
前記少なくとも1つの第2のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩(GuHCl)、チオシアン酸グアニジン(GuSCN)、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のイオンキレート剤が、エチレンジアミン4酢酸(EDTA);エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸(EDDS);シクロヘキサン−1,2−ジアミン四酢酸(CDTA);イミノジコハク酸(IDS);ポリアスパラギン酸(PASA);メチルグリシン二酢酸(MGDA);L−グルタミン酸N,N−二酢酸・四ナトリウム(GLDA)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第4のバッファ化合物が、Tris、Tris−HCl、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態11〜15のいずれかに記載のキット。
前記少なくとも1つの第3のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2の塩が、硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)、酢酸アンモニウム(NH4Ac)、酢酸リチウム(LiAc)、酢酸カリウム(KAc)、酢酸ナトリウム(NaAc)、塩化ナトリウム(NaCl)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態11〜16のいずれかに記載のキット。
前記少なくとも1つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、実施形態11〜17のいずれかに記載のキット。
(g)水、及び少なくとも1つのバッファ化合物及び/又は少なくとも1つのイオンキレート剤を含む溶液から選択される溶出バッファ、
をさらに含むことを特徴とする、実施形態11〜18のいずれかに記載のキット。
核酸精製のためのキットであって、
(a)約8mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する、EDTA、その異性体、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第1のイオンキレート剤、及び約10mM〜約40mMの範囲の濃度で存在する、Tris、Tris−HCl、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第1のバッファ化合物を含む、懸濁バッファ;
(b)約1質量%〜約3質量%の範囲の濃度で存在する、SDS、SDBS、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの洗浄カオトロピック剤、及び約0.2M以上の濃度で存在する、アルカリ水酸化物及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第2のバッファ化合物、を含む溶解バッファ;
(c)約4M〜約4.5Mの範囲の濃度で存在する、GuHCl、GuSCN、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第1のカオトロピック剤、約0.3M〜約1.5Mの範囲の濃度で存在する、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第1の塩、約1体積%〜約2体積%のイソプロパノール、及び約1質量%〜約3質量%の範囲の濃度で存在する、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第3のバッファ化合物、を含む結合バッファ;
(d)約4.5M〜約5Mの範囲の濃度で存在する、GuHCl、GuSCN、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第2のカオトロピック剤、約1mM〜約3mMの範囲の濃度で存在する、EDTA、その異性体、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第2のイオンキレート剤、約30体積%〜約40体積%のイソプロパノール、及び約20mM〜約50mMの範囲の濃度で存在する、Tris、Tris−HCl、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第4のバッファ化合物、を含む第1の洗浄バッファ;
(e)少なくとも約70体積%のエタノール、及び約80mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第2の塩、を含む第2の洗浄バッファ;及び
(f)少なくとも1つのシリカ系磁性粒子、
を含むことを特徴とするキット。
110 汚染物質
115 核酸
120 pDNA
130 磁性粒子
135 磁石
核酸精製のための方法が、本明細書に開示され、該方法は、(a)少なくとも1つの核酸を含む試料を、懸濁バッファと混合し、懸濁液を形成する工程;(b)懸濁液を溶解バッファと混合し、溶解液を形成する工程;(c)溶解液を結合バッファと混合し、溶液を形成する工程;(d)溶液を少なくとも1つの磁性粒子と混合し、少なくとも1つの核酸に可逆的に結合された少なくとも1つの改質された磁性粒子を含む混合溶液を形成する工程;(e)少なくとも1つの改質された磁性粒子を混合溶液から分離する工程;(f)少なくとも1つの改質された磁性粒子を第1の洗浄バッファ及び第2の洗浄バッファで洗浄する工程;及び、(g)少なくとも1つの改質された磁性粒子を溶出バッファと混合する工程、を含む。
本開示はまた、核酸精製のためのキットにも関し、該キットは、懸濁バッファ、溶解バッファ、結合/中和バッファ、少なくとも1つの磁性粒子、第1の洗浄バッファ、第2の洗浄バッファ、及び必要に応じて溶出バッファを含む。バッファは、さまざまな実施形態において、精製方法に関して先に開示されたバッファS1、S2、S3、B1、W1、W2及びE1に対応しうる。各バッファに関して上述したさまざまな実施形態は、本明細書に開示されるキットを形成するために、限定されることなく、任意の方式で組み合わせることができるものと解されたい。
単なる論述の目的で、細菌培養からpDNAを精製するための例となるプロトコルが、以下に提供される。当然ながら、このプロトコルは、限定することを意図されておらず、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
b)懸濁バッファの調製:100μg/mlの最終濃度まで、懸濁バッファS1にRNアーゼを加える;
c)試料の懸濁:1mlの一晩細菌培養を1.5マイクロ遠心分離管に移し、1分間12,000gにおける遠心分離により細胞を採取し、その後、培養培地を除去し、250μlの調製S1バッファにより再懸濁する;
d)試料の溶解:250μlの溶解バッファS2を懸濁液に加え、最低10回の反転により混合する;
e)結合のための調製:350μlの結合バッファS3を細胞溶解物に加え、最低10回、又は濁った微粒子が見えるまで、反転により混合する;
f)細胞溶解物のクリアリング:溶液を12,000gで10分間遠心分離し、透明な溶解物を新しいマイクロ遠心分離管に移す;
g)磁性粒子の調製:使用前に少なくとも1分間、水又はカオトロピック剤中で磁性粒子の懸濁液をボルテックスする;
h)pDNAの結合:透明な溶解物に50μlの磁性粒子溶液を加え、反転により混合し、その後、室温で5分間インキュベートする;
i)pDNA結合磁性粒子の分離:1分間磁気スタンドを使用して可逆的に結合したpDNAを有する磁性粒子を磁気によって分離し、残存する溶解物を除去する;
j)pDNA−結合磁性粒子の洗浄:可逆的に結合したpDNAを含む磁性粒子を、500μlの洗浄バッファW1で一度及び700μlの洗浄バッファW2で一度洗浄する;
k)洗浄バッファの除去:洗浄バッファW1及びW2を除去し、可逆的に結合したpDNAを有する磁性粒子を磁気スタンド上で5分間、上下を逆にして空気乾燥させる;
l)pDNAの溶出:磁気スタンドから管を取り外し100μl(又はより濃縮した試料の生成のために50μl)の水を加え、室温で1分間インキュベートする;
m)pDNAの精製:管を磁気スタンド上に1分間置き、磁性粒子を除去し、溶出したpDNAを新しいマイクロ遠心分離管に移す。
pDNAを、1000μgのQbeads又は5000μgのGraceビーズを用いる上記プロトコルを使用して細菌培養物から精製した。同じ細菌培養物をまた、Promega社のWizard MagneSil Tfx(登録商標)を使用して精製した。各方法について平均全pDNA収量を定量し、図2に示した。Qbeadsを使用する本発明の方法についての平均全pDNA収量は、1mlの細菌培養(O.D.600≒1)の試料から10.0μgであった。Graceビーズを使用する本発明の方法についての平均pDNA収量は、9.2μgであるのに対し、比較例のPromega法は10.7μgのpDNAを生じた。
SDS又はSDBSを含む溶解バッファS2を用いる上記プロトコルを使用して、細菌培養物からpDNAを精製した。同じ細胞培養物をまた、Promega社のWizard MagneSil Tfx(登録商標)を使用して精製した。各方法について平均全pDNA収量を定量し、図4に示した。溶解バッファS2中でSDSを使用する本発明の方法についての平均全pDNA収量は、1mlの細胞培養物(O.D.600≒1)の試料から7.3μgであった。溶解バッファS2中でSDBSを使用する本発明の方法についての平均pDNA収量は、9.8μgであるのに対し、比較例のPromega法は6.4μgのpDNAを生じた。
核酸精製のための方法であって、
(a)少なくとも1つの核酸を含む試料を懸濁バッファと混合し、懸濁液を形成する工程;
(b)前記懸濁液を溶解バッファと混合し、溶解物を形成する工程;
(c)前記溶解物を結合バッファと混合し、溶液を形成する工程;
(d)前記溶液を少なくとも1つの磁性粒子と混合し、少なくとも1つの改質された磁性粒子を含む混合溶液を形成する工程であって、前記少なくとも1つの改質された磁性粒子が前記少なくとも1つの核酸に可逆的に結合される、工程;
(e)前記少なくとも1つの改質された磁性粒子を、前記混合溶液から分離する工程;
(f)前記少なくとも1つの改質された磁性粒子を、第1の洗浄バッファ及び第2の洗浄バッファで洗浄する工程;及び
(g)前記少なくとも1つの改質された磁性粒子を、溶出バッファと混合する工程;
を含み、
前記懸濁バッファが、約1mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のイオンキレート剤、及び約10mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のバッファ化合物を含み、
前記溶解バッファが、約1質量%〜約10質量%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの洗浄カオトロピック剤、及び約0.2M以上の濃度で存在する少なくとも1つの第2のバッファ化合物を含み、
前記結合バッファが、約4M〜約6Mの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のカオトロピック剤、約0.1M〜約2Mの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも1つの第1の塩、約1体積%〜約5体積%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のアルコール、及び約0.25質量%〜約3質量%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第3のバッファ化合物を含み、
前記第1の洗浄バッファが、約4M〜約6Mの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のカオトロピック剤、約1mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のイオンキレート剤、約30体積%〜約50体積%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のアルコール、及び約10mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第4のバッファ化合物を含み、
前記第2の洗浄バッファが、少なくとも1つの第3のアルコール、及び随意的な少なくとも1つの第2の塩を含む、
ことを特徴とする方法。
前記少なくとも1つの核酸を含む前記試料が、プラスミドDNAを含む少なくとも1つの細菌細胞物であることを特徴とする、実施形態1に記載の方法。
前記少なくとも1つの第1のイオンキレート剤が、エチレンジアミン4酢酸(EDTA);エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸(EDDS);シクロヘキサン−1,2−ジアミン四酢酸(CDTA);イミノジコハク酸(IDS);ポリアスパラギン酸(PASA);メチルグリシン二酢酸(MGDA);L−グルタミン酸N,N−二酢酸・四ナトリウム(GLDA)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1のバッファ化合物が、Tris、Tris−HCl、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態1又は2に記載の方法。
前記少なくとも1つの洗浄カオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SDBS)、ラウリル硫酸アンモニウム(ALS)、ドデシル硫酸カリウム(PDS)、ミレス硫酸ナトリウム、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のバッファ化合物が、水酸化ナトリウム(NaOH)、水酸化リチウム(LiOH)、水酸化カリウム(KOH)、水酸化ルビジウム(RbOH)、水酸化セシウム(CsOH)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態1〜3のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも1つの第1のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩(GuHCl)、チオシアン酸グアニジン(GuSCN)、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1の塩が、硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)、酢酸アンモニウム(NH4Ac)、酢酸リチウム(LiAc)、酢酸カリウム(KAc)、酢酸ナトリウム(NaAc)、塩化ナトリウム(NaCl)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第3のバッファ化合物が、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態1〜4のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも1つの第2のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩(GuHCl)、チオシアン酸グアニジン(GuSCN)、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のイオンキレート剤が、エチレンジアミン4酢酸(EDTA);エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸(EDDS);シクロヘキサン−1,2−ジアミン四酢酸(CDTA);イミノジコハク酸(IDS);ポリアスパラギン酸(PASA);メチルグリシン二酢酸(MGDA);L−グルタミン酸N,N−二酢酸・四ナトリウム(GLDA)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第4のバッファ化合物が、Tris、Tris−HCl、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態1〜5のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも1つの第3のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2の塩が、硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)、酢酸アンモニウム(NH4Ac)、酢酸リチウム(LiAc)、酢酸カリウム(KAc)、酢酸ナトリウム(NaAc)、塩化ナトリウム(NaCl)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態1〜6のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも1つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、実施形態1〜7のいずれかに記載の方法。
前記溶液を前記少なくとも1つの磁性粒子と混合する工程(d)の前に、前記溶液を遠心分離し、少なくとも1つの凝集体又は高分子を除去する工程をさらに含むことを特徴とする、実施形態1〜8のいずれかに記載の方法。
前記少なくとも1つの改質された磁性粒子から前記少なくとも1つの核酸を放出するのに十分な時間、前記溶出バッファと共に前記少なくとも1つの改質された磁性粒子をインキュベートする工程をさらに含み、前記溶出バッファが、水、及び少なくとも1つのバッファ化合物及び/又は少なくとも1つのイオンキレート剤を含む溶液から選択されることを特徴とする、実施形態1〜9のいずれかに記載の方法。
核酸精製のためのキットであって、
(a)約1mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のイオンキレート剤、及び約10mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のバッファ化合物を含む懸濁バッファ;
(b)約1質量%〜約10質量%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの洗浄カオトロピック剤、及び約0.2M以上の濃度で存在する少なくとも1つの第2のバッファ化合物を含む溶解バッファ;
(c)約4M〜約6Mの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のカオトロピック剤、約0.1M〜約2Mの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも1つの第1の塩、約1体積%〜約5体積%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のアルコール、及び約0.25質量%〜約3質量%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第3のバッファ化合物を含む結合バッファ;
(d)約4.5M〜約6Mの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のカオトロピック剤、約1mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のイオンキレート剤、約30体積%〜約50体積%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のアルコール、及び約10mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第4のバッファ化合物を含む第1の洗浄バッファ;
(e)少なくとも1つの第3のアルコール、及び随意的な少なくとも1つの第2の塩を含む第2の洗浄バッファ;及び
(f)少なくとも1つの磁性粒子、
を含むことを特徴とするキット。
前記少なくとも1つの核酸を含む前記試料が、プラスミドDNAを含む少なくとも1つの細菌細胞であることを特徴とする、実施形態11に記載のキット。
前記少なくとも1つの第1のイオンキレート剤が、エチレンジアミン4酢酸(EDTA);エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸(EDDS);シクロヘキサン−1,2−ジアミン四酢酸(CDTA);イミノジコハク酸(IDS);ポリアスパラギン酸(PASA);メチルグリシン二酢酸(MGDA);L−グルタミン酸N,N−二酢酸・四ナトリウム(GLDA)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1のバッファ化合物が、Tris、Tris−HCl、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態11又は12に記載のキット。
前記少なくとも1つの洗浄カオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SDBS)、ラウリル硫酸アンモニウム(ALS)、ドデシル硫酸カリウム(PDS)、ミレス硫酸ナトリウム、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のバッファ化合物が、水酸化ナトリウム(NaOH)、水酸化リチウム(LiOH)、水酸化カリウム(KOH)、水酸化ルビジウム(RbOH)、水酸化セシウム(CsOH)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態11〜13のいずれかに記載のキット。
前記少なくとも1つの第1のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩(GuHCl)、チオシアン酸グアニジン(GuSCN)、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1の塩が、硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)、酢酸アンモニウム(NH4Ac)、酢酸リチウム(LiAc)、酢酸カリウム(KAc)、酢酸ナトリウム(NaAc)、塩化ナトリウム(NaCl)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第3のバッファ化合物が、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態11〜14のいずれかに記載のキット。
前記少なくとも1つの第2のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩(GuHCl)、チオシアン酸グアニジン(GuSCN)、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のイオンキレート剤が、エチレンジアミン4酢酸(EDTA);エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸(EDDS);シクロヘキサン−1,2−ジアミン四酢酸(CDTA);イミノジコハク酸(IDS);ポリアスパラギン酸(PASA);メチルグリシン二酢酸(MGDA);L−グルタミン酸N,N−二酢酸・四ナトリウム(GLDA)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第4のバッファ化合物が、Tris、Tris−HCl、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態11〜15のいずれかに記載のキット。
前記少なくとも1つの第3のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2の塩が、硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)、酢酸アンモニウム(NH4Ac)、酢酸リチウム(LiAc)、酢酸カリウム(KAc)、酢酸ナトリウム(NaAc)、塩化ナトリウム(NaCl)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、実施形態11〜16のいずれかに記載のキット。
前記少なくとも1つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、実施形態11〜17のいずれかに記載のキット。
(g)水、及び少なくとも1つのバッファ化合物及び/又は少なくとも1つのイオンキレート剤を含む溶液から選択される溶出バッファ、
をさらに含むことを特徴とする、実施形態11〜18のいずれかに記載のキット。
核酸精製のためのキットであって、
(a)約8mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する、EDTA、その異性体、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第1のイオンキレート剤、及び約10mM〜約40mMの範囲の濃度で存在する、Tris、Tris−HCl、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第1のバッファ化合物を含む、懸濁バッファ;
(b)約1質量%〜約3質量%の範囲の濃度で存在する、SDS、SDBS、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの洗浄カオトロピック剤、及び約0.2M以上の濃度で存在する、アルカリ水酸化物及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第2のバッファ化合物、を含む溶解バッファ;
(c)約4M〜約4.5Mの範囲の濃度で存在する、GuHCl、GuSCN、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第1のカオトロピック剤、約0.3M〜約1.5Mの範囲の濃度で存在する、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第1の塩、約1体積%〜約2体積%のイソプロパノール、及び約1質量%〜約3質量%の範囲の濃度で存在する、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第3のバッファ化合物、を含む結合バッファ;
(d)約4.5M〜約5Mの範囲の濃度で存在する、GuHCl、GuSCN、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第2のカオトロピック剤、約1mM〜約3mMの範囲の濃度で存在する、EDTA、その異性体、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第2のイオンキレート剤、約30体積%〜約40体積%のイソプロパノール、及び約20mM〜約50mMの範囲の濃度で存在する、Tris、Tris−HCl、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第4のバッファ化合物、を含む第1の洗浄バッファ;
(e)少なくとも約70体積%のエタノール、及び約80mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも1つの第2の塩、を含む第2の洗浄バッファ;及び
(f)少なくとも1つのシリカ系磁性粒子、
を含むことを特徴とするキット。
110 汚染物質
115 核酸
120 pDNA
130 磁性粒子
135 磁石
Claims (10)
- 核酸精製のための方法であって、
(a)少なくとも1つの核酸を含む試料を懸濁バッファと混合し、懸濁液を形成する工程;
(b)前記懸濁液を溶解バッファと混合し、溶解物を形成する工程;
(c)前記溶解物を結合バッファと混合し、溶液を形成する工程;
(d)前記溶液を少なくとも1つの磁性粒子と混合し、少なくとも1つの改質された磁性粒子を含む混合溶液を形成する工程であって、前記少なくとも1つの改質された磁性粒子が前記少なくとも1つの核酸に可逆的に結合される、工程;
(e)前記少なくとも1つの改質された磁性粒子を、前記混合溶液から分離する工程;
(f)前記少なくとも1つの改質された磁性粒子を、第1の洗浄バッファ及び第2の洗浄バッファで洗浄する工程;及び
(g)前記少なくとも1つの改質された磁性粒子を、溶出バッファと混合する工程;
を含み、
前記懸濁バッファが、約1mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のイオンキレート剤、及び約10mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のバッファ化合物を含み、
前記溶解バッファが、約1質量%〜約10質量%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの洗浄カオトロピック剤、及び約0.2M以上の濃度で存在する少なくとも1つの第2のバッファ化合物を含み、
前記結合バッファが、約4M〜約6Mの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のカオトロピック剤、約0.1M〜約2Mの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも1つの第1の塩、約1体積%〜約5体積%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のアルコール、及び約0.25質量%〜約3質量%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第3のバッファ化合物を含み、
前記第1の洗浄バッファが、約4M〜約6Mの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のカオトロピック剤、約1mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のイオンキレート剤、約30体積%〜約50体積%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のアルコール、及び約10mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第4のバッファ化合物を含み、
前記第2の洗浄バッファが、少なくとも1つの第3のアルコール、及び随意的な少なくとも1つの第2の塩を含む、
ことを特徴とする方法。 - 前記少なくとも1つの核酸を含む前記試料が、プラスミドDNAを含む少なくとも1つの細菌細胞物であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの第1のイオンキレート剤が、エチレンジアミン4酢酸(EDTA);エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸(EDDS);シクロヘキサン−1,2−ジアミン四酢酸(CDTA);イミノジコハク酸(IDS);ポリアスパラギン酸(PASA);メチルグリシン二酢酸(MGDA);L−グルタミン酸N,N−二酢酸・四ナトリウム(GLDA)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1のバッファ化合物が、Tris、Tris−HCl、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの洗浄カオトロピック剤が、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SDBS)、ラウリル硫酸アンモニウム(ALS)、ドデシル硫酸カリウム(PDS)、ミレス硫酸ナトリウム、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のバッファ化合物が、水酸化ナトリウム(NaOH)、水酸化リチウム(LiOH)、水酸化カリウム(KOH)、水酸化ルビジウム(RbOH)、水酸化セシウム(CsOH)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの第1のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩(GuHCl)、チオシアン酸グアニジン(GuSCN)、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1の塩が、硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)、酢酸アンモニウム(NH4Ac)、酢酸リチウム(LiAc)、酢酸カリウム(KAc)、酢酸ナトリウム(NaAc)、塩化ナトリウム(NaCl)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第1のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第3のバッファ化合物が、氷酢酸、塩酸、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの第2のカオトロピック剤が、グアニジン塩酸塩(GuHCl)、チオシアン酸グアニジン(GuSCN)、尿素、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のイオンキレート剤が、エチレンジアミン4酢酸(EDTA);エチレンジアミン−N,N’−ジコハク酸(EDDS);シクロヘキサン−1,2−ジアミン四酢酸(CDTA);イミノジコハク酸(IDS);ポリアスパラギン酸(PASA);メチルグリシン二酢酸(MGDA);L−グルタミン酸N,N−二酢酸・四ナトリウム(GLDA)、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第2のアルコールが、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも1つの第4のバッファ化合物が、Tris、Tris−HCl、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、及びそれらの組合せから選択される、
ことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸精製のためのキットであって、
(a)約1mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のイオンキレート剤、及び約10mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のバッファ化合物を含む懸濁バッファ;
(b)約1質量%〜約10質量%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの洗浄カオトロピック剤、及び約0.2M以上の濃度で存在する少なくとも1つの第2のバッファ化合物を含む溶解バッファ;
(c)約4M〜約6Mの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のカオトロピック剤、約0.1M〜約2Mの範囲の濃度で存在する随意的な少なくとも1つの第1の塩、約1体積%〜約5体積%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第1のアルコール、及び約0.25質量%〜約3質量%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第3のバッファ化合物を含む結合バッファ;
(d)約4.5M〜約6Mの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のカオトロピック剤、約1mM〜約10mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のイオンキレート剤、約30体積%〜約50体積%の範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第2のアルコール、及び約10mM〜約100mMの範囲の濃度で存在する少なくとも1つの第4のバッファ化合物を含む第1の洗浄バッファ;
(e)少なくとも1つの第3のアルコール、及び随意的な少なくとも1つの第2の塩を含む第2の洗浄バッファ;及び
(f)少なくとも1つの磁性粒子、
を含むことを特徴とするキット。 - 前記少なくとも1つの核酸を含む前記試料が、プラスミドDNAを含む少なくとも1つの細菌細胞であることを特徴とする、請求項8に記載のキット。
- 前記少なくとも1つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、請求項8又は9に記載のキット。
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