CN112961938A

CN112961938A - 检测人类乳头瘤病毒的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN112961938A
Application number: CN201911283675.0A
Authority: CN
Inventors: 胡赓熙; 管祯玮
Original assignee: Zhejiang Wolwo Bio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Wolwo Bio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2039-12-13
Also published as: CN114929901A; JP2023505510A; EP4074843A4; JP7463513B2; EP4074843A1; WO2021115406A1; CN112961938B; US20230022218A1

Abstract

本申请公开了一种检测人类乳头瘤病毒的方法和试剂盒。本申请公开了一种检测至少65种人类乳头瘤病毒基因型的方法。本申请还公开了一种检测人类乳头瘤病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括能够检测至少65种人类乳头瘤病毒基因型的试剂。

Description

检测人类乳头瘤病毒的方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测人类乳头瘤病毒的方法和试剂盒。

背景技术

宫颈癌在女性恶性肿瘤中位居全球第二，全球每年约有53万的宫颈癌新发病例，死亡病例高达27.4万。宫颈癌发生、发展需经历较慢长的时期，从癌前病变通过原位癌发展到浸润癌往往需要10～20年的时间。由于宫颈癌的发生存在着一个较长的可逆转癌前病变期，如能在前驱病变阶段被确诊，即可进一步治疗或检测，成为降低宫颈癌的发病率和死亡率的关键。

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区，即早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)。HPV感染是宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的主要病因，全球范围的研究结果显示，在99.7％的宫颈癌患者体内检测到高危型HPV DNA的存在。目前，人乳头状瘤病毒的正式分类是基于来自L1区域的序列分型(Ethel-Michele de Villiers,Claude Fauquet,Thomas R Broker.Classification ofpapillomaviruses[J].Virology,2004:324(1):17-27.)。作为定义，如果2种HPV分离物之间在该区域的序列差异高于10％，则将它们分成不同类型。根据国际人乳头瘤病毒参考中心(International Human Papillomavirus(HPV)Reference Center)发布的数据，现已发现222种HPV基因型，约40余种与人类生殖道皮肤黏膜病变有关。国家食品药品监督管理总局(CFDA)发布的《人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》，依据WHO国际癌症研究机构(IARC)及其他国际组织的研究成果，建议将HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种基因型列为高危型别，26、53、66、73、82等5种基因型列为中等风险型别，并建议临床上进行上述18种HPV基因型检测，以期用于针对宫颈癌相关预期诊断。此外，病毒筛查也是确保生物制品例如细胞产品和血液制品等质量尤其安全性的重要环节。全面检测中高危基因型的HPV病毒，提高检出率，避免漏检是本领域急需解决的技术问题。

发明内容

发明人通过对已发现的222种HPV基因型的L1区DNA序列开展进化树分析(MegAlign软件(https://www.dnastar.com/))，发现这18种HPV基因型在进化树中并不互相临近。发明人找到覆盖以上18种HPV基因型的大分支，并且确定该大分支下包括的具体基因型，将此扩大的基因型组用于全面检测中高危基因型的HPV病毒，解决了本领域急需解决的技术问题。

本发明提供了一种检测样本中是否含有人类乳头瘤病毒的方法，所述方法包括检测至少65种基因型的人类乳头瘤病毒的步骤，所述65种基因型为：HPV32，HPV42，HPV54，HPV3，HPV10，HPV28，HPV29，HPV77，HPV78，HPV94，HPV117，HPV125，HPV160，HPV83，HPV102，HPV89，HPV61，HPV62，HPV72，HPV81，HPV84，HPV86，HPV87，HPV114，HPV2，HPV27，HPV57，HPV71，HPV90，HPV106，HPV26，HPV51，HPV69，HPV82，HPV30，HPV53，HPV56，HPV66，HPV18，HPV45，HPV97，HPV39，HPV68，HPV70，HPV59，HPV85，HPV7，HPV40，HPV43，HPV91，HPV16，HPV31，HPV35，HPV33，HPV58，HPV52，HPV67，HPV6，HPV11，HPV13，HPV44，HPV74，HPV34，HPV73，HPV177。

一些实施方式中，检测方法采用聚合酶链式反应来检测样本中所述基因型的存在情况，并根据聚合酶链式反应结果判断样本中是否含有人类乳头瘤病毒。一些实施方式中，所述聚合酶链式反应采用能够检测所述至少65种基因型人类乳头瘤病毒的引物对集合，其中一对或多对引物是简并引物对。

一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：

1)获取样本的DNA；

2)将步骤1)得到的DNA与能够检测所述至少65种基因型人类乳头瘤病毒的引物对集合中的各对引物分别进行聚合酶链式反应；优选地，所述集合中一对或多对引物是简并引物对；

3)根据聚合酶链式反应结果判断样本中是否含有人类乳头瘤病毒。

一些实施方式中，根据聚合酶链式反应结果判断样本中是否含有人类乳头瘤病毒包括比较实测Ct值和设定的Ct参考值，当聚合酶链式反应的实测Ct值小于参考值、或者聚合酶链式反应产物的溶解曲线为单峰且实测Ct值小于参考值时，聚合酶链式反应结果为阳性，当实测Ct值大于或等于参考值、或者无对数扩增曲线时，聚合酶链式反应结果为阴性；同时，当任一引物对聚合酶链式反应结果为阳性，则样本HPV检测结果为阳性；优选地，Ct参考值选自30-35、32-35、33-35、34或35。

一些实施方式中，所述引物对集合包括一对或多对选自表1的引物，其中F和R分别表示引物对中的上游引物和下游引物：

表1：

序列	SEQ ID NO:	序列	SEQ ID NO:
				F1:CWGGWRCWGAYAATAGRGAAAATG	1	R1:YRCCATATCMCCATCCTGWATA	2
F2:GCRACAAWCTTGAGGACCARAT	3	R2:YGTGTGCTAGATACRGGTTCAAATG	4
				F3:TGCGTGCCAGGAGABGYTAATAGAC	5	R3:RKGTCCTGGGTRCTAGATAC	6
F4:CCYGAKGTGRTTGACCTACA	7	R4:VVHRTYRGCCATGTCTCTTATG	8
				F5:TGCWGAGCCBTATGGCGATTG	9	R5:ACMCCAAAATTCCACTCATC	10
F6:TGTGGCCTAAACGACGTAAAC	11	R6:CGCGTGACATAGACATCCGTACTG	12
				F7:GGAGAMGTTRCTAGAACTGTATGA	13	R7:GGYDCTGYGTCCCACATTTC	14
F8:GTGCCAGGAGAAAATACTAGACT	15	R8:YSCYGBAGGTACTAGATACA	16
				F9:YGCCTATGGBGATTCTATGTG	17	R9:CCACTAGGHGTAGCAACATATAC	18
F10:GGCMCAGGGYCATAACAATGGT	19	R10:DCGWCCAAGRGGATATTGAT	20
				F11:GCWGATGTRTATGGRGACAGTATGT	21	R11:RGGCTTRTTAAAYAACTGGGARTC	22
F12:TGTCCACCAATGCTTATTACA	23	R12:CCTCTTCCTSGTKCAAATCTAATC	24
				F13:GATGGWAACCCAACTAGYATAG	25	R13:CCGTTGCTGTCAAATGGAAATG	26
F14:ASYGAAGTATCCTCTGTTGCGTCTA	27	R14:TCGAATCGCACTCGCTTTCTA	28
				F15:GTTGTWAGCACKGATGAATATG	29	R15:CCACTAATRCCYACACCYAATG	30
F16:GACGTGARCARATGTTTGTTAG	31	R16:GGWGGKGTWARRCCAAATTG	32
				F17:TRCACGYARACGCCGTAAAC	33	R17:KKCCYACWGCAAGTAGTCTA	34
F18:GGCMWTRTTAGATGATGCWACA	35	R18:CACGTTCATACAGTTCTAGGA，	36

其中R代表A或G，Y代表C或T，M代表A或C，K代表G或T，S代表C或G，W代表A或T，H代表A、C或T，B代表C、G或T，V代表A、C或G，D代表A、G或T。

一些实施方式中，所述聚合酶链式反应的退火温度为40℃-60℃，优选50℃-60℃，更优选55℃。

一些实施方式中，所述聚合酶链式反应的循环次数为30-50次，优选35-45次，更优选40次。

一些实施方式中，所述样本选自细胞、血液或分泌物。一些实施方式中，所述样本是细胞，例如干细胞，尤其间充质干细胞。

本发明还提供了一种检测人类乳头瘤病毒的试剂盒，它包含能够检测至少前文所述65种基因型的人类乳头瘤病毒的试剂。

一些实施方式中，所述试剂包含能够检测所述至少65种人类乳头瘤病毒基因型的引物对集合或由所述引物对集合组成；优选地，所述集合中一对或多对引物是简并引物对；优选地，所述引物对集合包括一对或多对选自表1的引物。

实施方式之一中，所述试剂盒为采用聚合酶链式反应的检测试剂盒。例如，所述试剂盒在上述引物之外还包括聚合酶链式反应体系的其他组分、参考品和/或质控品等。所述试剂盒还可以包含如何使用该试剂盒来检测上述至少65种人类乳头瘤病毒基因型的说明或是关于该说明获取途径的指示。

一些实施方式中，所述试剂盒是对选自细胞、血液或分泌物的样本进行检测的试剂盒。例如，一些实施方式中，所述样本是细胞，例如干细胞，尤其间充质干细胞。

本发明还提供了一组用于检测人类乳头瘤病毒的引物对，包括一对或多对选自表1的引物。一些实施方式中提供的是一组能够检测至少前文所述65种基因型人类乳头瘤病毒的引物对，包括一对或多对选自表1的引物，例如包括或由表1所列全部引物对组成的一组。

本发明还提供前文所述至少65种人类乳头瘤病毒基因型和/或能够检测这至少65种人类乳头瘤病毒基因型的试剂用于制造检测人类乳头瘤病毒的工具的用途。所述工具包括软件产品和硬件产品，例如试剂盒、仪器、设备、系统等等。实施方式之一中，所述试剂包含能够检测所述至少65种人类乳头瘤病毒基因型的引物对集合或由能够检测所述至少65种人类乳头瘤病毒基因型的引物对集合组成；优选地，所述集合中一对或多对引物是简并引物对；优选地，所述引物对集合包括一对或多对选自表1的引物。

本发明所述65种基因型涵盖了WHO国际癌症研究机构(IARC)推荐的13种高危型别基因型与5种中等风险型别的基因型，并且所述65种基因型全部位于进化树的同一支(实施例1-4)，说明所述65种基因型在进化上属于近源的型别，同样应有使感染者发生宫颈癌的风险。

本发明提供方法和工具涵盖了对至少上述65种基因型的检测，能够最大限度地检测出中高危型的人类乳头瘤病毒基因型，提高疾病筛查效率。另一方面，本发明提供的方法和工具能够对样本进行全面的中高危HPV病毒基因型监测，最大程度避免漏检从而进一步提高生物制品例如细胞产品和血液制品等的产品质量、安全性能以及质控效率。

附图说明

图1显示了实施例1中不同基因型HPV病毒L1区DNA序列比对进化树图及部分区域放大图。

图2显示了实施例2中不同基因型HPV病毒L2区DNA序列比对进化树图及部分区域放大图。

图3显示了实施例3中不同基因型HPV病毒E1区DNA序列比对进化树图及部分区域放大图。

图4显示了实施例4中不同基因型HPV病毒E6区DNA序列比对进化树图及部分区域放大图。

具体实施方案

在本说明书中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。

在本说明书中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方案以及优选实施方案可以相互组合形成新的技术方案。

在本说明书中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。

本文所公开的“范围”以下限或上限或以上两者来限定。可以分别有一个或多个下限，或有一个或多个上限。例如，给定范围可以通过选定一个下限和一个上限进行限定。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任一下限可以与任一上限组合形成一个范围，由此形成的所有范围都涵盖在本说明书和权利要求范围之内。例如，针对特定参数列出了30－50和35－45的范围时，应理解为同样公开了30－45和35－50的范围。

本文中“聚合酶链式反应”又称“PCR反应”。

具体而言，本发明涉及一种检测人类乳头瘤病毒基因型的检测方法及其在生物技术领域中的应用。发明人通过对已发现的HPV基因型的DNA序列进行亲缘关系分析(进化树分析)，找到与国家食品药品监督管理总局(CFDA)发布的《人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》建议的18种中高危HPV基因型亲缘关系相近的其他HPV基因型，其中包括以下65种基因型的人类乳头瘤病毒：HPV32，HPV42，HPV54，HPV3，HPV10，HPV28，HPV29，HPV77，HPV78，HPV94，HPV117，HPV125，HPV160，HPV83，HPV102，HPV89，HPV61，HPV62，HPV72，HPV81，HPV84，HPV86，HPV87，HPV114，HPV2，HPV27，HPV57，HPV71，HPV90，HPV106，HPV26，HPV51，HPV69，HPV82，HPV30，HPV53，HPV56，HPV66，HPV18，HPV45，HPV97，HPV39，HPV68，HPV70，HPV59，HPV85，HPV7，HPV40，HPV43，HPV91，HPV16，HPV31，HPV35，HPV33，HPV58，HPV52，HPV67，HPV6，HPV11，HPV13，HPV44，HPV74,HPV34，HPV73，HPV177。

本发明所述的人类乳头瘤病毒的基因型的全长序列和各分区序列可以通过查询美国国立生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA数据库(GenBank：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)、日本DNA数据库(DDBJ：https:// www.ddbj.nig.ac.jp)、欧洲DNA数据库(EMBI：https://www.embl.org)、以及人类乳头瘤病毒主数据库(HumanReferenceclones-hpvcenter：https://www.hpvcenter.se/)获得，也可通过其他本领域技术人员熟知的方法获得，例如基因测序。本发明采用的亲缘关系分析方法，例如进化树分析方法，是本领域技术人员所熟知的。采用的多序列比对分析软件包括MegAlign、Cluster X、Muscle和Phylip，在本发明的一个具体实施方案中，采用了MegAlign分析软件。选择的建树方法包括距离法(Distance-based methods)和特征法(Character-based methods)等，优选距离法。

本发明所述的检测方法可以为聚合酶链式反应(PCR)，具体步骤包括DNA变性、退火、延伸和循环，也可以是其他本领域技术人员熟知的检测方法。

在一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：

1)样本DNA提取；

具体的步骤可包括例如从样本制备或分离细胞；可将细胞制备成PBS中的悬液，浓度例如1×10⁵-1×10⁷个/ml；裂解细胞得到DNA提取液；裂解方法可选自机械裂解法、化学裂解法、酶裂解法等本领域所知的细胞裂解方法或其任意组合；

2)将步骤1)得到的DNA提取液与能够检测所述至少65种基因型的人类乳头瘤病毒的引物对分别进行聚合酶链式反应；

一般，一个PCR反应体系只含有一对引物，包括上游引物与下游引物；其中，聚合酶链式反应体系是本领域技术人员所熟知的，例如含有dNTP、DNA聚合酶、缓冲液等；每个PCR的反应体系一般可为例如20-50μL；

在另一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：

1)样本DNA提取；

具体的步骤可包括例如充分洗脱宫颈刷上的分泌物标本；收集洗脱液并进行离心，例如13000rpm离心10分钟；弃去上清，保留管底的沉淀物；裂解所得沉淀物得到DNA提取液；裂解方法可选自机械裂解法、化学裂解法、酶裂解法等本领域所知的细胞裂解方法或其任意组合；

其中，一个PCR反应体系只含有一对引物；例如，用多对引物同时检测时可采用各自独立的多个并行PCR反应体系；具体的步骤可包括例如将引物、dNTP、DNA聚合酶、DNA提取液、反应缓冲液体系和双蒸水混合成PCR反应体系，总体积可为例如20-50μL；可选地，贴封板膜、离心、转移至扩增检测区；

一些实施方式中，所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶，Super Taq DNA聚合酶，UlltraPF^TM DNA聚合酶，LA Taq DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶，优选Taq DNA聚合酶。所述反应缓冲液体系包含氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl₂)、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和Tris-HCl。

聚合酶链式反应(PCR)退火温度优选40℃-60℃，更优选50℃-60℃，最优选55℃，循环次数可以是30-50次，优选35-45次，更优选40次。

一些实施方式中，根据聚合酶链式反应结果判断样本中是否含有人类乳头瘤病毒包括比较实测Ct值和设定的Ct参考值，当聚合酶链式反应的实测Ct值小于参考值、或者聚合酶链式反应产物的溶解曲线为单峰且实测Ct值小于参考值时，聚合酶链式反应结果为阳性，当实测Ct值大于或等于参考值、或者无对数扩增曲线时，聚合酶链式反应结果为阴性；同时，当任一引物对聚合酶链式反应结果为阳性，则样本HPV检测结果为阳性。所述判断也可以是其他本领域技术人员熟知的结果判断方法。

能够理解的是，Ct参考值的设定与所要检测的病毒DNA最低拷贝数(灵敏度)有关。举例来说，当样品中的病毒拷贝数为10⁶时，其Ct实测值一般为17-18；当样品中的病毒拷贝数为10⁵时，其Ct实测值一般为21-22；当样品中的病毒拷贝数为10⁴时，其Ct实测值一般为24-25；当样品中的病毒拷贝数为10³时，其Ct实测值一般为28-29；当样品中的病毒拷贝数为100时，其Ct实测值一般为31-32；当样品中的病毒拷贝数为50时，其Ct实测值一般为32-33；当样品中的病毒拷贝数为5-10时，其Ct实测值一般约为34。因此，本领域技术人员可以根据检测需要，设定相应的Ct参考值。例如，本发明的一些实施方式中，Ct参考值可设为30-35、32-35、33-35、34或35。实施方案之一中，Ct参考值为35。

本申请所述引物对即PCR反应中的上游引物(以“F”表示)与下游引物(以“R”表示)。为了减少PCR反应数量，也可以采用简并引物对，即一对引物同时检测多种HPV基因型。

在一个实施方案中，所述引物对包含能够检测至少65种基因型的人类乳头瘤病毒的引物，优选简并引物对。简并引物对是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基序列可能性引物的混合物，一般为等比例混合物。简并引物对序列中，R代表A或G，Y代表C或T，M代表A或C，K代表G或T，S代表C或G，W代表A或T，H代表A、C或T，B代表C、G或T，V代表A、C或G，D代表A、G或T，N代表A、C、G或T。本申请中，优选包含如下序列的引物对：

一些实施方式中，样本选自细胞、血液或分泌物。一些实施方式中，样本是细胞，例如干细胞，尤其间充质干细胞。

本发明还提供了一种检测人类乳头瘤病毒的试剂盒，它包含能够检测至少前文所述65种基因型的人类乳头瘤病毒的试剂。所述试剂可以包含或由引物对组成，优选简并引物对。实施方式之一中，本发明的试剂盒中包括一对或多对选自表1的引物。所述试剂盒可以是采用聚合酶链式反应的试剂盒。例如，所述试剂盒还可以包括聚合酶链式反应体系的其他组分用来形成完整的聚合酶链式反应体系。聚合酶链式反应体系是本领域技术人员所熟知的，除了模板和引物之外的其他组分是本领域技术人员熟知和能够自由确定的，例如dNTP、DNA聚合酶、缓冲液等。所述试剂盒还可以包括阴性对照和阳性对照。所述试剂盒可用于检测选自细胞、血液或分泌物的样本。所述细胞可以是干细胞，例如间充质干细胞。

本发明还有提供了一组用于检测人类乳头瘤病毒的引物对，包括一对或多对选自表1的引物。实施方式之一是一组能够检测至少前文所述65种基因型人类乳头瘤病毒的引物对，包括或由表1所列全部引物对组成的一组。

下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。

实施例1-不同基因型的人类乳头瘤病毒的L1区DNA序列进化树分析

1)通过查询人类乳头瘤病毒主数据库(Human Reference clones-hpvcenter：https://www.hpvcenter.se/)、美国国立生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA数据库(GenBank：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)、日本DNA数据库(DDBJ：https://www.ddbj.nig.ac.jp)和欧洲DNA数据库(EMBI：https://www.embl.org)获得目前已被确定DNA序列的所有基因型的人类乳头瘤病毒的L1区序列，下载了222种不同基因型的人乳头瘤病毒L1区DNA序列。

2)将获得的222种不同基因型的人乳头瘤病毒的L1区DNA序列导入用于进化树分析的软件MegAlign(https://www.dnastar.com/)，进行L1区DNA序列的比对。

3)通过对进化树进行分析(结果见图1)，找到覆盖高危型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，中危型HPV包括HPV26、53、66、73、82的大分支及其覆盖的所有HPV基因型，总计包括65个HPV基因型，分别是HPV32，HPV42，HPV54，HPV3，HPV10，HPV28，HPV29，HPV77，HPV78，HPV94，HPV117，HPV125，HPV160，HPV83，HPV102，HPV89，HPV61，HPV62，HPV72，HPV81，HPV84，HPV86，HPV87，HPV114，HPV2，HPV27，HPV57，HPV71，HPV90，HPV106，HPV26，HPV51，HPV69，HPV82，HPV30，HPV53，HPV56，HPV66，HPV18，HPV45，HPV97，HPV39，HPV68，HPV70，HPV59，HPV85，HPV7，HPV40，HPV43，HPV91，HPV16，HPV31，HPV35，HPV33，HPV58，HPV52，HPV67，HPV6，HPV11，HPV13，HPV44，HPV74，HPV34，HPV73，HPV177。

实施例2-不同基因型的人类乳头瘤病毒的L2区DNA序列进化树分析

1)通过查询人类乳头瘤病毒主数据库(Human Reference clones-hpvcenter：https://www.hpvcenter.se/)、美国国立生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA数据库(GenBank：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)、日本DNA数据库(DDBJ：https://www.ddbj.nig.ac.jp)和欧洲DNA数据库(EMBI：https://www.embl.org)获得目前已被确定DNA序列的所有基因型的人类乳头瘤病毒的L2区序列，下载了221种不同基因型的人乳头瘤病毒L2区DNA序列。

2)将获得的221种不同基因型的人乳头瘤病毒的L2区DNA序列导入用于进化树分析的软件MegAlign(https://www.dnastar.com/)，进行L2区DNA序列的比对。

3)通过对进化树进行分析(结果见图2)，找到覆盖高危型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，中危型HPV包括HPV26、53、66、73、82的大分支及其覆盖的所有HPV基因型，总计包括65个HPV基因型，分别是HPV32，HPV42，HPV54，HPV3，HPV10，HPV28，HPV29，HPV77，HPV78，HPV94，HPV117，HPV125，HPV160，HPV83，HPV102，HPV89，HPV61，HPV62，HPV72，HPV81，HPV84，HPV86，HPV87，HPV114，HPV2，HPV27，HPV57，HPV71，HPV90，HPV106，HPV26，HPV51，HPV69，HPV82，HPV30，HPV53，HPV56，HPV66，HPV18，HPV45，HPV97，HPV39，HPV68，HPV70，HPV59，HPV85，HPV7，HPV40，HPV43，HPV91，HPV16，HPV31，HPV35，HPV33，HPV58，HPV52，HPV67，HPV6，HPV11，HPV13，HPV44，HPV74，HPV34，HPV73，HPV177。

实施例3-不同基因型的人类乳头瘤病毒的E1区DNA序列进化树分析

1)通过查询人类乳头瘤病毒主数据库(Human Reference clones-hpvcenter：https://www.hpvcenter.se/)、美国国立生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA数据库(GenBank：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)、日本DNA数据库(DDBJ：https://www.ddbj.nig.ac.jp)和欧洲DNA数据库(EMBI：https://www.embl.org)获得目前已被确定DNA序列的所有基因型的人类乳头瘤病毒的E1区序列，下载了220种不同基因型的人乳头瘤病毒E1区DNA序列。

2)将获得的220种不同基因型的人乳头瘤病毒的E1区DNA序列导入用于进化树分析的软件MegAlign(https://www.dnastar.com/)，进行E1区DNA序列的比对。

3)通过对进化树进行分析(结果见图3)，找到覆盖高危型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，中危型HPV包括HPV26、53、66、73、82的大分支及其覆盖的所有HPV基因型，总计包括65个HPV基因型，分别是HPV32，HPV42，HPV54，HPV3，HPV10，HPV28，HPV29，HPV77，HPV78，HPV94，HPV117，HPV125，HPV160，HPV83，HPV102，HPV89，HPV61，HPV62，HPV72，HPV81，HPV84，HPV86，HPV87，HPV114，HPV2，HPV27，HPV57，HPV71，HPV90，HPV106，HPV26，HPV51，HPV69，HPV82，HPV30，HPV53，HPV56，HPV66，HPV18，HPV45，HPV97，HPV39，HPV68，HPV70，HPV59，HPV85，HPV7，HPV40，HPV43，HPV91，HPV16，HPV31，HPV35，HPV33，HPV58，HPV52，HPV67，HPV6，HPV11，HPV13，HPV44，HPV74，HPV34，HPV73，HPV177。

实施例4-不同基因型的人类乳头瘤病毒的E6区DNA序列进化树分析

1)通过查询人类乳头瘤病毒主数据库(Human Reference clones-hpvcenter：https://www.hpvcenter.se/)、美国国立生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA数据库(GenBank：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)、日本DNA数据库(DDBJ：https://www.ddbj.nig.ac.jp)和欧洲DNA数据库(EMBI：https://www.embl.org)获得目前已被确定DNA序列的所有基因型的人类乳头瘤病毒的E6区序列，下载了214种不同基因型的人乳头瘤病毒E6区DNA序列。

2)将获得的214种不同基因型的人乳头瘤病毒的E6区DNA序列导入用于进化树分析的软件MegAlign(https://www.dnastar.com/)，进行E6区DNA序列的比对。

3)通过对进化树进行分析(结果见图4)，找到覆盖高危型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，中危型HPV包括HPV26、53、66、73、82的大分支及其覆盖的所有HPV基因型，总计包括65个HPV基因型，分别是HPV32，HPV42，HPV54，HPV3，HPV10，HPV28，HPV29，HPV77，HPV78，HPV94，HPV117，HPV125，HPV160，HPV83，HPV102，HPV89，HPV61，HPV62，HPV72，HPV81，HPV84，HPV86，HPV87，HPV114，HPV2，HPV27，HPV57，HPV71，HPV90，HPV106，HPV26，HPV51，HPV69，HPV82，HPV30，HPV53，HPV56，HPV66，HPV18，HPV45，HPV97，HPV39，HPV68，HPV70，HPV59，HPV85，HPV7，HPV40，HPV43，HPV91，HPV16，HPV31，HPV35，HPV33，HPV58，HPV52，HPV67，HPV6，HPV11，HPV13，HPV44，HPV74，HPV34，HPV73，HPV177。

实施例5-65种人类乳头瘤病毒基因型的简并引物对的验证

(一)引物设计与合成

通过比对65种人类乳头瘤病毒的全基因组，将这65个型别分为18个组别，对同一个组别的人类乳头瘤病毒基因型设计简并引物对(见表3)。人工合成简并引物对，简并引物对的灵敏度合格阈值设置为5-100拷贝数。

(二)对照组与实验组的设置

阴性对照1：水对照；

阴性对照2：gDNA阴性对照；

阳性对照：gDNA阳性对照；

实验组：在gDNA模板之外还含有人工合成的HPV基因型的片段模板。HPV基因型片段模板的具体序列见表2。表格中Gene ID是来自国际人乳头瘤病毒参考中心(International Human Papillomavirus(HPV)Reference Center)发布的数据(https://www.hpvcenter.se/human_reference_clones/)。

gDNA阳性对照和gDNA阴性对照中的模板都是从无HPV感染的人类细胞提取的基因组DNA，本文亦称“gDNA模板”，购自上海斯信生物科技有限公司，产品名称“人骨髓间充质干细胞基因组DNA(HMSC-bm gDNA)”。

gDNA阳性对照加入的引物为人β-珠蛋白(β-Globin)引物(序列为F：GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，R:CAACTTCATCCACGTTCACC)。水对照和gDNA阴性对照加入的引物均为表3中所示的引物对，每个PCR体系各含其中一对引物，由此形成18个不同引物对的水对照并行PCR反应体系和18个不同引物对的gDNA阴性对照并行PCR反应体系。实验组中，65个HPV基因型模板各自按表3中所示拷贝数与其所在组别的引物对反应，由此形成65个不同HPV基因型模板的并行PCR反应体系。

表2 HPV基因型片段模板

(三)核酸扩增准备

1)取出96孔PCR板置于冰上备用。

2)加入如下组成的对照组和试验组PCR体系：

3)贴封板膜，2000rpm 1分钟，转移至扩增检测区。

(四)PCR扩增

1)PCR扩增参数为：94℃变性30秒；然后每轮94℃5秒、55℃15秒、72℃35秒，循环40次。

2)在72℃时测定荧光值，根据荧光值变化曲线即S型对数扩增曲线读取Ct值结果。

3)质量控制如下表所示：

样品名称	Ct值	结果
			水对照	无对数扩增曲线	HPV阴性
gDNA阴性对照	无对数扩增曲线	HPV阴性
			gDNA阳性对照	Ct＜35	gDNA阳性

(五)结果分析

在本研究中，将Ct值为35定为参考阈值。当PCR产物的溶解曲线为单峰且Ct值小于35时，即判断为阳性；当Ct值大于或等于35或无对数扩增曲线，即判断为阴性。

当水对照和gDNA阴性对照结果为阴性，而gDNA阳性对照结果为阳性，且实验组结果为阳性时，认为该简并引物对能够扩增其对应组别的HPV基因型，定义该验证结果为阳性。65种HPV基因型简并引物对的验证结果见表3。

表3 不同组别HPV对应的简并引物对验证结果

具体地说，水对照和gDNA阴性对照各自的18个PCR反应体系均未见S型对数扩增曲线，因此结果为阴性。gDNA阳性对照的PCR产物为单峰型溶解曲线，Ct值为22，小于35，因此结果为阳性。实验组的65个PCR产物均为单峰型溶解曲线，Ct值介于31至34之间，均小于35。于此，引物对的验证结果均为阳性。

实施例6-细胞样本中人类乳头瘤病毒的检测

(一)样本处理与DNA提取

1)将从毛囊当中获得的间充质干细胞用PBS重悬至浓度为1×10⁶/ml，取5～10μL悬液加入到250μL裂解液即QuickExtract^TM DNA提取液(QuickExtract^TM DNA ExtractionSolution)中。

2)震荡混匀15秒，65℃水浴6分钟，取出震荡混匀15秒，瞬时离心，98℃水浴2分钟，取出震荡混匀15秒，瞬时离心，获得细胞裂解液上清，立即使用或放-20℃保存。

本实施例采用人为添加人乳头瘤病毒的方式模拟样本感染或污染HPV病毒情形，从而验证本方法检测样本中HPV感染情况的可行性。

(二)对照组和实验组的设置

阴性对照：10μL PBS+250μL QuickExtract^TM DNA提取液

阳性对照：间充质干细胞裂解液上清

试验组：间充质干细胞裂解液上清中加入人工合成的HPV61，HPV84，HPV26型片段模版(各100拷贝)

阳性对照加入的引物为人β-珠蛋白引物(序列为F：GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，R:CAACTTCATCCACGTTCACC)。阴性对照加入的引物为表4所示的18个简并引物对，分别形成18个PCR反应体系分别扩增。实验组加入的引物为表4所示的18个简并引物对，分别形成18个PCR反应体系分别扩增。

(三)核酸扩增准备

1)取出96孔PCR板置于冰上备用

2)加入如下组成的对照组和试验组PCR体系：

3)贴封板膜，2000rpm 1min，转移至扩增检测区

(四)PCR扩增

3)质量控制如下表所示：

样品名称	Ct值	结果
			阴性对照	无对数扩增曲线	HPV阴性
阳性对照	Ct＜35	gDNA阳性

(五)结果分析

在本研究中，将Ct值为35定为本检测方法的参考域值。当PCR产物的溶解曲线为单峰且Ct值小于35时，即判断为阳性；当Ct值大于或等于35或无对数扩增曲线，即判断为阴性。

当阴性对照结果为阴性而阳性对照结果为阳性，且实验组中任一引物对的PCR反应为阳性，即认为检测到该引物对对应的HPV基因型，标记为阳性，同时该样本病毒检测结果亦为阳性，即感染了HPV病毒。试验结果见表4。

表4 HPV基因型的检测结果

具体地说，阴性对照的18个PCR反应体系均未见S型对数扩增曲线，因此结果为阴性。阳性对照的PCR反应产物为单峰型溶解曲线，Ct值为29，小于35，因此结果为阳性。实验组中，第4、第5和第8组别引物对的PCR反应产物均为单峰型溶解曲线，Ct值介于31与32之间，均小于35，因此检测结果为阳性；实验组其他引物对均无对数扩增曲线，因此结果为阴性。

据以上PCR反应结果判断，细胞样本HPV检测结果为阳性。

实施例7-宫颈分泌物样本中人类乳头瘤病毒检测

(一)样本处理与DNA提取

1)充分洗脱宫颈刷上的标本，并在管壁上挤干后，丢弃宫颈刷。把洗脱液全部转移到1.5ml微量离心管中，13000rpm离心10分钟，弃去上清，保留管底的沉淀物，样品沉淀中加入50μL裂解液即QuickExtract^TM DNA提取液(QuickExtract^TM DNA ExtractionSolution)。

2)震荡混匀15秒，65℃水浴6分钟，取出震荡混匀15秒，瞬时离心，98℃水浴2分钟，取出震荡混匀15秒，瞬时离心，获得分泌物裂解液上清，立即使用或放-20℃保存。

(二)对照组和实验组的设置

阴性对照：QuickExtract^TM DNA提取液

阳性对照：分泌物裂解液上清

试验组：分泌物裂解液上清中加入人工合成的HPV42，HPV28，HPV102型片段模版(各100拷贝)

阳性对照加入的引物为人β-珠蛋白引物(序列为F：GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，R:CAACTTCATCCACGTTCACC)，阴性对照加入的引物为表5所示的18个简并引物对，分别形成18个PCR反应体系分别扩增。实验组加入的引物为表5所示的18个简并引物对，分别形成18个PCR反应体系分别扩增。

(三)核酸扩增准备

1)取出96孔PCR板置于冰上备用

2)加入如下组成的对照组和试验组PCR体系：

3)贴封板膜，2000rpm 1分钟，转移至扩增检测区

(四)PCR扩增

1)PCR扩增参数为：94℃变性30秒；然后每轮94℃5秒、55℃15秒、72℃35秒，。

3)质量控制如下表所示：

(五)结果分析

当阴性对照结果为阴性而阳性对照结果为阳性，且实验组中任一引物对的PCR反应为阳性，即认为检测到该引物对对应的HPV基因型，标记为阳性，同时该样本病毒检测结果亦为阳性，即感染了HPV病毒。试验结果见表5。

表5 HPV基因型的检测结果

具体地说，阴性对照的18个PCR反应体系均都未见S型对数扩增曲线，因此结果为阴性。阳性对照PCR产物为单峰型溶解曲线，Ct值为30，小于35，因此结果为阳性。实验组中，第1、第2和第3组别引物对的PCR产物均为单峰型溶解曲线，Ct值为介于31至32之间，均小于35，因此检测结果为阳性；实验组其他引物对均无对数扩增曲线，因此结果为阴性。

据以上PCR反应结果判断，宫颈分泌物样本HPV检测结果为阳性。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

序列表

<110> 浙江我武生物科技股份有限公司

<120> 检测人类乳头瘤病毒的方法和试剂盒

<130> 199623 1CNCN

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> W＝A或T；R＝A或G；Y＝C或T；

<400> 1

cwggwrcwga yaatagrgaa aatg 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> Y＝C或T；R＝A或G；M＝A或C；W＝A或T；

<400> 2

yrccatatcm ccatcctgwa ta 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> R＝A或G；W＝A或T；

<400> 3

gcracaawct tgaggaccar at 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> Y＝C或T；R＝A或G；

<400> 4

ygtgtgctag atacrggttc aaatg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> B＝C，G或T；Y＝C或T；

<400> 5

tgcgtgccag gagabgytaa tagac 25

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> R＝A或G；K＝G或T；

<400> 6

rkgtcctggg trctagatac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> Y＝C或T；K＝G或T；R＝A或G；

<400> 7

ccygakgtgr ttgacctaca 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> V＝A，C或G；H＝A，C或T；R＝A或G；Y＝C或T；

<400> 8

vvhrtyrgcc atgtctctta tg 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> W＝A或T；B＝C，G或T；

<400> 9

tgcwgagccb tatggcgatt g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> M＝A或C；

<400> 10

acmccaaaat tccactcatc 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtggcctaa acgacgtaaa c 21

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgcgtgacat agacatccgt actg 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> M＝A或C；R＝A或G；

<400> 13

ggagamgttr ctagaactgt atga 24

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> Y＝C或T；D＝A，G或T；

<400> 14

ggydctgygt cccacatttc 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gtgccaggag aaaatactag act 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> Y＝C或T；S＝C或G；B＝C，G或T；

<400> 16

yscygbaggt actagataca 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> Y＝C或T；B＝C，G或T；

<400> 17

ygcctatggb gattctatgt g 21

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> H＝A，C或T；

<400> 18

ccactagghg tagcaacata tac 23

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> M＝A或C；Y＝C或T；

<400> 19

ggcmcagggy cataacaatg gt 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> D＝A，G或T；W＝A或T；R＝A或G；

<400> 20

dcgwccaagr ggatattgat 20

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> W＝A或T；R＝A或G；

<400> 21

gcwgatgtrt atggrgacag tatgt 25

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> R＝A或G；Y＝C或T；

<400> 22

rggcttrtta aayaactggg artc 24

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgtccaccaa tgcttattac a 21

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> S＝C或G；K＝G或T；

<400> 24

cctcttccts gtkcaaatct aatc 24

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> W＝A或T；Y＝C或T；

<400> 25

gatggwaacc caactagyat ag 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ccgttgctgt caaatggaaa tg 22

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> S＝C或G；Y＝C或T；

<400> 27

asygaagtat cctctgttgc gtcta 25

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tcgaatcgca ctcgctttct a 21

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> W＝A或T；K＝G或T；

<400> 29

gttgtwagca ckgatgaata tg 22

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> R＝A或G；Y＝C或T；

<400> 30

ccactaatrc cyacaccyaa tg 22

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> R＝A或G；

<400> 31

gacgtgarca ratgtttgtt ag 22

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> W＝A或T；K＝G或T；R＝A或G；

<400> 32

ggwggkgtwa rrccaaattg 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> R＝A或G；Y＝C或T；

<400> 33

trcacgyara cgccgtaaac 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> K＝G或T；Y＝C或T；W＝A或T；

<400> 34

kkccyacwgc aagtagtcta 20

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> M＝A或C；W＝A或T；R＝A或G；

<400> 35

ggcmwtrtta gatgatgcwa ca 22

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cacgttcata cagttctagg a 21

Claims

1.一种检测样本中是否含有人类乳头瘤病毒的方法，其特征在于，所述方法包括检测至少65种基因型的人类乳头瘤病毒的步骤，所述65种基因型为：HPV32，HPV42，HPV54，HPV3，HPV10，HPV28，HPV29，HPV77，HPV78，HPV94，HPV117，HPV125，HPV160，HPV83，HPV102，HPV89，HPV61，HPV62，HPV72，HPV81，HPV84，HPV86，HPV87，HPV114，HPV2，HPV27，HPV57，HPV71，HPV90，HPV106，HPV26，HPV51，HPV69，HPV82，HPV30，HPV53，HPV56，HPV66，HPV18，HPV45，HPV97，HPV39，HPV68，HPV70，HPV59，HPV85，HPV7，HPV40，HPV43，HPV91，HPV16，HPV31，HPV35，HPV33，HPV58，HPV52，HPV67，HPV6，HPV11，HPV13，HPV44，HPV74，HPV34，HPV73，HPV177。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测方法采用聚合酶链式反应检测样本中所述基因型的存在情况，并根据聚合酶链式反应结果判断样本中是否含有人类乳头瘤病毒；优选地，所述聚合酶链式反应采用能够检测所述至少65种基因型人类乳头瘤病毒的引物对集合，所述集合中一对或多对引物为简并引物对。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)获取样本的DNA；

4.根据权利要求2或3所述的方法，所述根据聚合酶链式反应结果判断样本中是否含有人类乳头瘤病毒包括比较实测Ct值和设定的Ct参考值，当聚合酶链式反应的实测Ct值小于参考值、或者聚合酶链式反应产物的溶解曲线为单峰且实测Ct值小于参考值时，聚合酶链式反应结果为阳性，当实测Ct值大于或等于参考值、或者无对数扩增曲线时，聚合酶链式反应结果为阴性；同时，当任一引物对聚合酶链式反应结果为阳性，则样本HPV检测结果为阳性；优选地，Ct参考值选自30-35、32-35、33-35、34或35。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述引物对集合包括一对或多对选自以下列表的引物，其中F和R分别表示引物对中的上游引物和下游引物：

F1:CWGGWRCWGAYAATAGRGAAAATG，R1:YRCCATATCMCCATCCTGWATA；

F2:GCRACAAWCTTGAGGACCARAT，R2:YGTGTGCTAGATACRGGTTCAAATG；

F3:TGCGTGCCAGGAGABGYTAATAGAC，R3:RKGTCCTGGGTRCTAGATAC；

F4:CCYGAKGTGRTTGACCTACA，R4:VVHRTYRGCCATGTCTCTTATG；

F5:TGCWGAGCCBTATGGCGATTG，R5:ACMCCAAAATTCCACTCATC；

F6:TGTGGCCTAAACGACGTAAAC，R6:CGCGTGACATAGACATCCGTACTG；

F7:GGAGAMGTTRCTAGAACTGTATGA，R7:GGYDCTGYGTCCCACATTTC；

F8:GTGCCAGGAGAAAATACTAGACT，R8:YSCYGBAGGTACTAGATACA；

F9:YGCCTATGGBGATTCTATGTG，R9:CCACTAGGHGTAGCAACATATAC；

F10:GGCMCAGGGYCATAACAATGGT，R10:DCGWCCAAGRGGATATTGAT；

F11:GCWGATGTRTATGGRGACAGTATGT，R11:RGGCTTRTTAAAYAACTGGGARTC；

F12:TGTCCACCAATGCTTATTACA，R12:CCTCTTCCTSGTKCAAATCTAATC；

F13:GATGGWAACCCAACTAGYATAG，R13:CCGTTGCTGTCAAATGGAAATG；

F14:ASYGAAGTATCCTCTGTTGCGTCTA，R14:TCGAATCGCACTCGCTTTCTA；

F15:GTTGTWAGCACKGATGAATATG，R15:CCACTAATRCCYACACCYAATG；

F16:GACGTGARCARATGTTTGTTAG，R16:GGWGGKGTWARRCCAAATTG；

F17:TRCACGYARACGCCGTAAAC，R17:KKCCYACWGCAAGTAGTCTA；和

F18:GGCMWTRTTAGATGATGCWACA，R18:CACGTTCATACAGTTCTAGGA；

6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其特征在于，

(a)所述聚合酶链式反应的退火温度为40℃-60℃，优选50℃-60℃，更优选55℃；

或者/并且，

(b)所述聚合酶链式反应循环次数为30-50次，优选35-45次，更优选40次。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述样本选自细胞、血液或分泌物；或者，所述样本是细胞，例如干细胞，尤其间充质干细胞。

8.一种检测人类乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含能够检测至少65种基因型人类乳头瘤病毒的试剂，所述65种基因型为：HPV32，HPV42，HPV54，HPV3，HPV10，HPV28，HPV29，HPV77，HPV78，HPV94，HPV117，HPV125，HPV160，HPV83，HPV102，HPV89，HPV61，HPV62，HPV72，HPV81，HPV84，HPV86，HPV87，HPV114，HPV2，HPV27，HPV57，HPV71，HPV90，HPV106，HPV26，HPV51，HPV69，HPV82，HPV30，HPV53，HPV56，HPV66，HPV18，HPV45，HPV97，HPV39，HPV68，HPV70，HPV59，HPV85，HPV7，HPV40，HPV43，HPV91，HPV16，HPV31，HPV35，HPV33，HPV58，HPV52，HPV67，HPV6，HPV11，HPV13，HPV44，HPV74，HPV34，HPV73，HPV177。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包含能够检测所述至少65种人类乳头瘤病毒基因型的引物对集合或由能够检测所述至少65种人类乳头瘤病毒基因型的引物对集合组成；优选地，所述集合中一对或多对引物是简并引物对；优选地，所述引物对集合包括一对或多对选自以下列表的引物，其中F和R分别表示引物对中的上游引物和下游引物：

F1:CWGGWRCWGAYAATAGRGAAAATG，R1:YRCCATATCMCCATCCTGWATA；

F2:GCRACAAWCTTGAGGACCARAT，R2:YGTGTGCTAGATACRGGTTCAAATG；

F3:TGCGTGCCAGGAGABGYTAATAGAC，R3:RKGTCCTGGGTRCTAGATAC；

F4:CCYGAKGTGRTTGACCTACA，R4:VVHRTYRGCCATGTCTCTTATG；

F5:TGCWGAGCCBTATGGCGATTG，R5:ACMCCAAAATTCCACTCATC；

F6:TGTGGCCTAAACGACGTAAAC，R6:CGCGTGACATAGACATCCGTACTG；

F7:GGAGAMGTTRCTAGAACTGTATGA，R7:GGYDCTGYGTCCCACATTTC；

F8:GTGCCAGGAGAAAATACTAGACT，R8:YSCYGBAGGTACTAGATACA；

F9:YGCCTATGGBGATTCTATGTG，R9:CCACTAGGHGTAGCAACATATAC；

F10:GGCMCAGGGYCATAACAATGGT，R10:DCGWCCAAGRGGATATTGAT；

F11:GCWGATGTRTATGGRGACAGTATGT，R11:RGGCTTRTTAAAYAACTGGGARTC；

F12:TGTCCACCAATGCTTATTACA，R12:CCTCTTCCTSGTKCAAATCTAATC；

F13:GATGGWAACCCAACTAGYATAG，R13:CCGTTGCTGTCAAATGGAAATG；

F14:ASYGAAGTATCCTCTGTTGCGTCTA，R14:TCGAATCGCACTCGCTTTCTA；

F15:GTTGTWAGCACKGATGAATATG，R15:CCACTAATRCCYACACCYAATG；

F16:GACGTGARCARATGTTTGTTAG，R16:GGWGGKGTWARRCCAAATTG；

F17:TRCACGYARACGCCGTAAAC，R17:KKCCYACWGCAAGTAGTCTA；和

F18:GGCMWTRTTAGATGATGCWACA，R18:CACGTTCATACAGTTCTAGGA；

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其具有一项或多项以下特征：

(a)所述试剂盒为采用聚合酶链式反应的试剂盒；优选地，所述试剂盒还包括聚合酶链式反应体系的其他组分；

(b)所述试剂盒是对选自细胞、血液或分泌物的样本进行检测的试剂盒；

(c)所述试剂盒是对细胞样本进行检测的试剂盒；例如，所述细胞为干细胞，尤其间充质干细胞。

11.一组用于检测人类乳头瘤病毒的引物对，其特征在于，包含一对或多对选自以下列表的引物，其中F和R分别表示引物对中的上游引物和下游引物：

F1:CWGGWRCWGAYAATAGRGAAAATG，R1:YRCCATATCMCCATCCTGWATA；

F2:GCRACAAWCTTGAGGACCARAT，R2:YGTGTGCTAGATACRGGTTCAAATG；

F3:TGCGTGCCAGGAGABGYTAATAGAC，R3:RKGTCCTGGGTRCTAGATAC；

F4:CCYGAKGTGRTTGACCTACA，R4:VVHRTYRGCCATGTCTCTTATG；

F5:TGCWGAGCCBTATGGCGATTG，R5:ACMCCAAAATTCCACTCATC；

F6:TGTGGCCTAAACGACGTAAAC，R6:CGCGTGACATAGACATCCGTACTG；

F7:GGAGAMGTTRCTAGAACTGTATGA，R7:GGYDCTGYGTCCCACATTTC；

F8:GTGCCAGGAGAAAATACTAGACT，R8:YSCYGBAGGTACTAGATACA；

F9:YGCCTATGGBGATTCTATGTG，R9:CCACTAGGHGTAGCAACATATAC；

F10:GGCMCAGGGYCATAACAATGGT，R10:DCGWCCAAGRGGATATTGAT；

F11:GCWGATGTRTATGGRGACAGTATGT，R11:RGGCTTRTTAAAYAACTGGGARTC；

F12:TGTCCACCAATGCTTATTACA，R12:CCTCTTCCTSGTKCAAATCTAATC；

F13:GATGGWAACCCAACTAGYATAG，R13:CCGTTGCTGTCAAATGGAAATG；

F14:ASYGAAGTATCCTCTGTTGCGTCTA，R14:TCGAATCGCACTCGCTTTCTA；

F15:GTTGTWAGCACKGATGAATATG，R15:CCACTAATRCCYACACCYAATG；

F16:GACGTGARCARATGTTTGTTAG，R16:GGWGGKGTWARRCCAAATTG；

F17:TRCACGYARACGCCGTAAAC，R17:KKCCYACWGCAAGTAGTCTA；和

F18:GGCMWTRTTAGATGATGCWACA，R18:CACGTTCATACAGTTCTAGGA；

12.能够检测至少65种人类乳头瘤病毒基因型的试剂用于制造检测人类乳头瘤病毒的工具的用途，所述65种基因型为：HPV32，HPV42，HPV54，HPV3，HPV10，HPV28，HPV29，HPV77，HPV78，HPV94，HPV117，HPV125，HPV160，HPV83，HPV102，HPV89，HPV61，HPV62，HPV72，HPV81，HPV84，HPV86，HPV87，HPV114，HPV2，HPV27，HPV57，HPV71，HPV90，HPV106，HPV26，HPV51，HPV69，HPV82，HPV30，HPV53，HPV56，HPV66，HPV18，HPV45，HPV97，HPV39，HPV68，HPV70，HPV59，HPV85，HPV7，HPV40，HPV43，HPV91，HPV16，HPV31，HPV35，HPV33，HPV58，HPV52，HPV67，HPV6，HPV11，HPV13，HPV44，HPV74，HPV34，HPV73，HPV177。

13.如权利要求12所述的用途，所述试剂包含能够检测所述至少65种人类乳头瘤病毒基因型的引物对集合或由能够检测所述至少65种人类乳头瘤病毒基因型的引物对集合组成；优选地，所述引物对集合中一对或多对引物是简并引物对；优选地，所述的引物对集合如权利要求11所述。