JP7463513B2 - ヒトパピローマウィルス（ｈｐｖ）の検出方法及び検出用キット - Google Patents

ヒトパピローマウィルス（ｈｐｖ）の検出方法及び検出用キット Download PDF

Info

Publication number
JP7463513B2
JP7463513B2 JP2022534410A JP2022534410A JP7463513B2 JP 7463513 B2 JP7463513 B2 JP 7463513B2 JP 2022534410 A JP2022534410 A JP 2022534410A JP 2022534410 A JP2022534410 A JP 2022534410A JP 7463513 B2 JP7463513 B2 JP 7463513B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
human papillomavirus
genotypes
polymerase chain
chain reaction
detecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2022534410A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2023505510A (ja
Inventor
▲がん▼煕 胡
禎▲い▼ 管
Original Assignee
浙江我武生物科技股▲分▼有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 浙江我武生物科技股▲分▼有限公司 filed Critical 浙江我武生物科技股▲分▼有限公司
Publication of JP2023505510A publication Critical patent/JP2023505510A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7463513B2 publication Critical patent/JP7463513B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は、バイオテクノロジーの分野に属し、特に、ヒトパピローマウイルスを検出するための方法及び検出用キットに関するものである。
子宮頸がんは、女性の悪性腫瘍の中で世界第２位であり、全世界で年間約５３万人が新たに発症し、最大２７万４千人が死亡している。子宮頸がんは、長い時間をかけてゆっくりと発症・進行し、前がん病変から非浸潤がんを経て浸潤がんに至るまで１０～２０年かかることが多いとされている。子宮頸がんには、可逆的な前がん病変の期間が長いため、前がん病変の段階で診断され、さらに治療や発見が可能であれば、その発生率や死亡率を下げることが極めて重要である。
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）はパピローマウイルス科に属し、約８０００塩基対（ｂｐ）のゲノムを持ち、初期転写領域（Ｅ領域）、後期転写領域（Ｌ領域）、非転写領域（ロングコントロール領域、ＬＣＲ）という三つの機能領域に分けられる低分子非エンベロップドの円形の二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＨＰＶ感染は、子宮頸部上皮内新生物及び子宮頸がんの主な原因であり、世界的な研究により、子宮頸がん患者の９９．７％では、高リスクＨＰＶ ＤＮＡの存在が検出されることが示されている。現在、ヒトパピローマウイルスの公式分類は、Ｌ１領域からの配列タイピングに基づいている（Ｅｔｈｅｌ－Ｍｉｃｈｅｌｅ ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ、Ｃｌａｕｄｅ Ｆａｕｑｕｅｔ、Ｔｈｏｍａｓ Ｒ Ｂｒｏｋｅｒ． Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００４：３２４（１）： １７－２７．）。定義としては、２つのＨＰＶ分離株は、この領域で１０％以上の配列差違がある場合、異なる型に分類される。国際ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）レファレンスセンターが発表したデータによると、ＨＰＶの遺伝子型は２２２種類確認されており、約４０種類がヒト生殖器管皮膚粘膜病変と関連しているとされている。中国国家食品薬品監督管理総局（ＣＦＤＡ）が発行した「ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）核酸検出及びジェノタイピング、試薬技術の審査ガイドライン」には、ＷＨＯ国際がん研究機関（ＩＡＲＣ）などの研究結果を踏まえ、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８など１３種類の遺伝子型を高リスク、２６、５３、６６、７３、８２など５種類の遺伝子型を中リスクに分類し、上記１８種類のＨＰＶ遺伝子型を子宮頸がん関連の見込み診断に用いることを視野に入れて臨床検査することが提言されている。また、細胞製品、血液製品などのバイオ製品の品質、特に安全性を確保するために、ウイルススクリーニングは重要な役割を担っている。中間リスクの遺伝子型を持つＨＰＶウイルスを包括的に検出し、検出率を高め、検査漏れを回避することは、この分野の緊急の技術的課題である。
Ｅｔｈｅｌ－Ｍｉｃｈｅｌｅ ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ、Ｃｌａｕｄｅ Ｆａｕｑｕｅｔ、Ｔｈｏｍａｓ Ｒ Ｂｒｏｋｅｒ． Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００４：３２４（１）： １７－２７．
本発明者らは、同定した２２２種類のＨＰＶ遺伝子型のＬ１領域のＤＮＡ配列を系統樹解析（ＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ／））することにより、これら１８種類のＨＰＶ遺伝子型が、系統樹において互いに近接していないことを見出した。本発明者らは、上記１８種類のＨＰＶ遺伝子型をカバーする大きいブランチを見出し、この大きいブランチの下に含まれる特定の遺伝子型を特定し、この拡張された遺伝子型セットを用いて、中～高リスク遺伝子型のＨＰＶウイルスを包括的に検出し、当該分野の緊急技術課題を解決したものである。
本発明は、サンプル中のヒトパピローマウイルスの存在を検出する方法を提供し、前記方法は、ヒトパピローマウイルスの少なくとも６５種類の遺伝子型を検出するステップを含み、前記６５種類の遺伝子型は、以下の通りである：ＨＰＶ３２、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ５４、ＨＰＶ３、ＨＰＶ１０、ＨＰＶ２８、ＨＰＶ２９、ＨＰＶ７７、ＨＰＶ７８、ＨＰＶ９４、ＨＰＶ１１７、ＨＰＶ１２５、ＨＰＶ１６０、ＨＰＶ８３、ＨＰＶ１０２、ＨＰＶ８９、ＨＰＶ６１、ＨＰＶ６２、ＨＰＶ７２、ＨＰＶ８１、ＨＰＶ８４、ＨＰＶ８６、ＨＰＶ８７、ＨＰＶ１１４、ＨＰＶ２、ＨＰＶ２７、ＨＰＶ５７、ＨＰＶ７１、ＨＰＶ９０、ＨＰＶ１０６、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、ＨＰＶ８２、ＨＰＶ３０、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ９７、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７０、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ８５、ＨＰＶ７、ＨＰＶ４０、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ９１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ６７、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ７４、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ７３、とＨＰＶ１７７。
いくつかの実施形態では、検出方法はポリメラーゼ連鎖反応を採用し、サンプル中の前記遺伝子型の存在状況を検出し、かつポリメラーゼ連鎖反応結果によってサンプル中にヒトパピローマウイルスが含まれるかどうかを判定する。いくつかの実施形態では、前記ポリメラーゼ連鎖反応は、前記少なくとも６５種類の遺伝子型のヒトパピローマウイルスを検出できるプライマー対セットを使用し、そのうち１対又は多対のプライマー対は縮退プライマー対である。
いくつかの実施形態では、前記方法は、以下のステップを含む。
１）サンプルのＤＮＡ取得；
２）ステップ１） で得られたＤＮＡと前記少なくとも６５種類の遺伝子型ヒトパピローマウイルスを検出できるプライマー対セット中の各ペアのプライマーをそれぞれポリメラーゼ連鎖反応させる；好ましくは、前記セットの１対又は多対のプライマーは縮退プライマー対である；
３）ポリメラーゼ連鎖反応の結果に基づいて、サンプルがヒトパピローマウイルスを含むかどうかを判定する。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応の結果に基づいてサンプルがヒトパピローマウイルスを含むかどうかを判定し、各ポリメラーゼ連鎖反応の測定Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）を設定されたＣｔ参照値と比較し、測定Ｃｔ値が参照値より小さい場合、又はポリメラーゼ連鎖反応生成物の溶解度曲線が単峰であり測定Ｃｔ値が参照値より小さい場合、ポリメラーゼ連鎖反応結果は陽性であり、 測定Ｃｔ値が参照値以上である場合、又は対数増幅曲線がない場合、ポリメラーゼ連鎖反応結果は陰性である；また、ポリメラーゼ連鎖反応結果において、いずれかのプライマーが陽性である場合、サンプルはＨＰＶ陽性であり、好ましくは、Ｃｔ参照値は３０～３５、３２～３５、３３～３５、３４又は３５から選択される。
いくつかの実施形態では、前記プライマー対セットは１対又は多対が表１から選択するプライマー対を含み、そのうちＦとＲはそれぞれプライマー対の上流プライマーと下流プライマーを表す。
ここで、ＲはＡ又はＧを表し、ＹはＣ又はＴを表し、ＭはＡ又はＣを表し、ＫはＧ又はＴを表し、ＳはＣ又はＧを表し、ＷはＡ又はＴを表し、ＨはＡ、Ｃ又はＴを表し、ＢはＣ、Ｇ又はＴを表し、ＶはＡ、Ｃ又はＧを表し、ＤはＡ、Ｇ又はＴを表す。
いくつかの実施形態では、前記ポリメラーゼ連鎖反応は、それぞれ４０℃～６０℃、好ましくは５０℃～６０℃、より好ましくは５５℃の温度でアニーリングされる。
いくつかの実施形態では、前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数は、それぞれ３０～５０、好ましくは３５～４５、より好ましくは４０である。
本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで行われる。本発明に記載されるサンプルは、ｅｘ ｖｉｖｏのサンプルである。いくつかの実施形態では、前記サンプルは、細胞、血液又は分泌物から選択される。いくつかの実施形態では、前記サンプルは、細胞、例えば幹細胞、特に間葉系幹細胞である。
また、本発明は、前述したヒトパピローマウィルスの少なくとも６５種類の遺伝子型を検出できる試薬を含むヒトパピローマウィルス検出用キットを提供するものである。
いくつかの実施形態では、前記試薬は前記少なくとも６５種のヒトパピローマウイルス遺伝子型を検出できるプライマー対セットを含むか、又は前記プライマー対セットからなる；好ましくは、前記セットには、１対又は多対のプライマーは縮退プライマー対である；好ましくは、前記プライマー対セットは、表１から選択される１対又は多対のプライマー対を含む。
一実施形態では、前記キットは、ポリメラーゼ連鎖反応を採用したアッセイキットである。例えば、前記キットは、前記プライマーに加えて、ポリメラーゼ連鎖反応系の他の構成要素、参照品及び／又は品質管理品等から構成される。前記キットは、上記のような少なくとも６５種類のヒトパピローマウイルスの遺伝子型を検出するためのキットの使用方法に関する説明書、又は説明書の入手方法に関する指示を含むこともできる。
いくつかの実施形態では、前記キットは、細胞、血液又は分泌物から選択されるサンプルを検査するためのキットである。例えば、いくつかの実施形態において、前記サンプルは、細胞であり、例えば幹細胞、特に間葉系幹細胞である。
本発明はさらにヒトパピローマウイルスの検出に用いる１組のプライマー対を提供し、当該プライマー対は、１対又は多対が表１から選択するプライマー対を含む。いくつかの実施形態に提供されるのは、少なくとも、前述した６５種類の遺伝子型のヒトパピローマウイルスを検出できるプライマー対セットであって、当該１組のプライマー対は、表１から選択される１対又は多対のプライマーを含む；当該セットは、例えば、表１に記載された全てのプライマー対を含むか、または表１に記載された全てのプライマー対からなるセットである。
また、本発明は、ヒトパピローマウイルスを検出するツールの製造における前述した少なくとも６５種類のヒトパピローマウイルス遺伝子型及び／又はこの少なくとも６５種類のヒトパピローマウイルス遺伝子型を検出できる試薬の用途を提供する。前記ツールには、ソフトウェア製品及び、キット、機器、装置、システムなどのハードウェア製品も含まれる。一実施形態では、前記試薬は前記少なくとも６５種類のヒトパピローマウイルス遺伝子型を検出できるプライマー対セットを含むか、又は前記少なくとも６５種類のヒトパピローマウイルス遺伝子型を検出できるプライマー対セットからなる；好ましくは、前記セットには、１対又は多対のプライマーは縮退プライマー対である；好ましくは、前記プライマー対セットは、表１から選択される１対又は多対のプライマー対を含む。
本発明はまた、サンプル中のヒトパピローマウイルスの存在を検出するためのシステムを提供し、前記システムは、前述した少なくとも６５種類の遺伝子型のヒトパピローマウイルスを検出するための装置を含むものである。前記装置は、前記用途を達成するためのハードウェア、又はプログラムなどのソフトウェア、あるいはその両方を含む。いくつかの実施形態では、前記システムは、子宮頸がんのスクリーニングなどの疾患スクリーニングのための中高リスクのヒトパピローマウイルス遺伝子型を検出するために使用される。
いくつかの実施形態では、前記システムは、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の前記遺伝子型の存在を検出するための装置と、ポリメラーゼ連鎖反応の結果に基づいてサンプルがヒトパピローマウイルスを含むかどうかを判定するための装置とを備える。好ましくは、前記ポリメラーゼ連鎖反応は前記少なくとも６５種の遺伝子型のヒトパピローマウイルスを検出できるプライマー対セットを使用し、前記セットには、１対又は多対のプライマー対は縮退プライマー対である。
いくつかの実施形態では、前記システムは、１）サンプルのＤＮＡを得るための装置；２）得られたＤＮＡを、前記少なくとも６５の遺伝子型ヒトパピローマウイルスを検出することができるプライマー対セット中の各ペアのプライマーをそれぞれポリメラーゼ連鎖反応を行うための装置；及び３）ポリメラーゼ連鎖反応の結果に基づいて、サンプルがヒトパピローマウイルスを含むかどうかを判定するための装置を含んでいる。好ましくは、前記セットには、１対又は多対のプライマーは縮退プライマー対である。
本発明はさらに、コンピュータ可読記憶媒体を提供し、前記記憶媒体には、命令又はコンピュータプログラムは格納され、プロセッサによって前記命令又はコンピュータプログラムが実行されると、サンプル中の少なくとも６５種類の遺伝子型ヒトパピローマウィルスの存在を検出するステップは実施される。
いくつかの実施形態では、前記記憶媒体における命令又はコンピュータプログラムがプロセッサによって実行されると、以下のステップが実施される：ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の少なくとも６５種類の遺伝子型ヒトパピローマウイルスの存在を検出するステップ及びポリメラーゼ連鎖反応の結果に基づいてサンプルがヒトパピローマウイルスを含むかどうかを判定するステップ。好ましくは、前記ポリメラーゼ連鎖反応は前記少なくとも６５種の遺伝子型ヒトパピローマウイルスを検出できるプライマー対セットを使用し、前記セット中の１対又は多対のプライマー対は縮退プライマー対である。
いくつかの実施形態で、前記記憶媒体における命令又はコンピュータ・プログラムがプロセッサによって実行されると、以下のステップが実施される：１） サンプルのＤＮＡを取得する；２） ステップ１） で得られたＤＮＡと前記少なくとも６５種類の遺伝子型ヒトパピローマウイルスを検出できるプライマー対セット中の各ペアのプライマーをそれぞれポリメラーゼ連鎖反応させる；３） ポリメラーゼ連鎖反応の結果にもとづいてサンプルがヒトパピローマウイルスを含むかどうかを判定する。好ましくは、前記セットには、１対又は多対のプライマーは縮退プライマー対である。
前記記憶媒体は、コンピュータがアクセス可能な任意の利用可能な媒体であってよい。例えば、前記コンピュータ可読媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ－ＲＯＭ又は他の光ディスクストレージ、ディスクストレージ又は他の磁気記憶装置、又は命令又はデータ構造の形態でコンセンサスプログラムコードを担持又は格納するために使用でき、コンピュータによってアクセス可能な他の任意の媒体を含んでもよい。
本明細書に記載された６５種類の遺伝子型は、ＷＨＯ国際がん研究機関（ＩＡＲＣ）に推奨される１３種類の高リスク遺伝子型と５種類の中間リスク遺伝子型をカバーしており、かつ６５種類の遺伝子型は、すべて系統樹の同じブランチに位置していることから（実施例１～４）、前記６５種類の遺伝子型は進化的に近接し、感染者に子宮頸がんを発症するリスクがあるはずとわかる。
本発明は、少なくとも前述した６５種類の遺伝子型の検出を包括する方法及びツールを提供し、最大限に中高リスクＨＰＶ遺伝子型の検出を可能にし、疾患スクリーニングの効率を向上させることができる。一方、本発明に提供される方法及びツールは、サンプルに対して、中高リスクのＨＰＶウイルスの遺伝子型を包括的なモニターを提供するため、検出漏れを最小限に抑え、細胞製品及び血液製品などのバイオ製品の品質、安全性及び品質管理効率をさらに向上させることができる。
図１は、実施例１における異なる遺伝子型のＨＰＶウイルスのＬ１領域のＤＮＡ配列アラインメントの系統樹と、その一部の拡大図である。 図２は、実施例２における異なる遺伝子型のＨＰＶウイルスのＬ２領域のＤＮＡ配列アラインメントの系統樹と、その一部の拡大図である。 図３は、実施例３における異なる遺伝子型のＨＰＶウイルスのＥ１領域のＤＮＡ配列アラインメントの系統樹と、その一部の拡大図である。 図４は、実施例４における異なる遺伝子型のＨＰＶウイルスのＥ６領域のＤＮＡ配列アラインメントの系統樹と、その一部の拡大図である。
本明細書では、特に明記されていない場合、関係する構成要素又はその好ましい構成要素を互いに組み合わせて、新たな技術的解決策を形成することができる。
本明細書では、特に明記されていない場合、本明細書に記載されたすべての実施形態及び好ましい実施形態は、互いに組み合わされて、新しい技術形態を形成することができる。
本明細書では、特に明記されていない場合、本明細書に記載されたすべての技術的特徴及び好ましい特徴は、互いに組み合わされて、新しい技術スキームを形成することができる。
本明細書で使用する用語「１つ」は、特に断りのない限り「少なくとも１つ」を意味する。
本明細書で開示する「範囲」は、下限値もしくは上限値、又はその両方によって定義される。下限値は１つ以上、上限値は１つ以上あってもよい。例えば、下限値と上限値を選択することで、所定の範囲を定義することができる。選択された下限と上限は、特定の範囲の境界を定義する。このように限定できる範囲はすべて包括的であり、組み合わせ可能である。すなわち、任意の下限値を任意の上限値と組み合わせて範囲を形成することができ、このようにして形成されたすべての範囲は、本明細書及び特許請求の範囲に含まれるものとする。例えば、特定のパラメータについて３０～５０と３５～４５の範囲が記載されている場合、３０～４５と３５～５０の範囲も開示されていると理解されたい。
本明細書では、「ポリメラーゼ連鎖反応」を「ＰＣＲ反応」とも表記する。
具体的には、本発明は、ヒトパピローマウィルスの遺伝子型を検出する方法及びそのバイオテクノロジー分野における応用に関する。本発明者らは、見出されたＨＰＶ遺伝子型のＤＮＡ配列について親族関係解析（系統樹解析）を行うことにより、中国国家食品薬品監督管理局（ＣＦＤＡ）が発行した「ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）核酸検出及びジェノタイピング、試薬技術の審査ガイドライン」で推奨する１８種類の中高リスクＨＰＶ遺伝子型と親族関係近い他のＨＰＶ遺伝子型を探し出し、ただし、以下の６５種類の遺伝子型のヒトパピローマウイルスを含む：ＨＰＶ３２、 ＨＰＶ４２、 ＨＰＶ５４、 ＨＰＶ３、 ＨＰＶ１０、 ＨＰＶ２８、 ＨＰＶ２９、 ＨＰＶ７７、 ＨＰＶ７８、 ＨＰＶ９４、 ＨＰＶ１１７、 ＨＰＶ１２５、 ＨＰＶ１６０、 ＨＰＶ８３、 ＨＰＶ１０２、 ＨＰＶ８９、 ＨＰＶ６１、 ＨＰＶ６２、 ＨＰＶ７２、 ＨＰＶ８１、 ＨＰＶ８４、 ＨＰＶ８６、 ＨＰＶ８７、 ＨＰＶ１１４、 ＨＰＶ２、 ＨＰＶ２７、 ＨＰＶ５７、 ＨＰＶ７１、 ＨＰＶ９０、 ＨＰＶ１０６、 ＨＰＶ２６、 ＨＰＶ５１、 ＨＰＶ６９、 ＨＰＶ８２、 ＨＰＶ３０、 ＨＰＶ５３、 ＨＰＶ５６、 ＨＰＶ６６、 ＨＰＶ１８、 ＨＰＶ４５、 ＨＰＶ９７、 ＨＰＶ３９、 ＨＰＶ６８、 ＨＰＶ７０、 ＨＰＶ５９、 ＨＰＶ８５、 ＨＰＶ７、 ＨＰＶ４０、 ＨＰＶ４３、 ＨＰＶ９１、 ＨＰＶ１６、 ＨＰＶ３１、 ＨＰＶ３５、 ＨＰＶ３３、 ＨＰＶ５８、 ＨＰＶ５２、 ＨＰＶ６７、 ＨＰＶ６、 ＨＰＶ１１、 ＨＰＶ１３、 ＨＰＶ４４、 ＨＰＶ７４、 ＨＰＶ３４、 ＨＰＶ７３、及びＨＰＶ１７７。
本発明に記載されたヒトパピローマウイルスの遺伝子型の全長配列及び各分割配列（Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）が構築したＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）、日本ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｅ．ａｃ．ｊｐ）、ヨーロッパＤＮＡデータベース（ＥＭＢＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ）、及びヒトパピローマウィルスマスターデータベース（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｌｏｎｅｓ － ｈｐｖｃｅｎｔｅｒ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｐｖｃｅｎｔｅｒ．ｓｅ／）から得ることができ、又は遺伝子シーケンシングなどの当業者に知られた他の方法によって得ることができる。本発明で用いられる親族関係解析の方法、例えば系統樹解析などは、当業者にはよく知られているである。採用される多重配列アライメント解析ソフトウェアとしては、ＭｅｇＡｌｉｇｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｘ、Ｍｕｓｃｌｅ、Ｐｈｙｌｉｐなどがあり、本発明の具体的な一実施形態においては、ＭｅｇＡｌｉｇｎ解析ソフトウェアが採用される。系統樹の構築方法としては、距離ベースの方法（Ｄｉｓｔａｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ）、特徴ベース方法（Ｃｈａｒａｃｔｅｒ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ）などが選択されるが、距離ベースの方法が好ましいとされる。
本発明に記載された検出方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であってもよく、具体的なステップは、ＤＮＡ変性、アニーリング、延伸とサイクルを含むが、他の本分野の技術者によく知られている検出方法であってもよい。
一実施形態では、前記方法は、以下のステップを含む：
１）サンプルのＤＮＡ抽出；
具体的なステップは、例えば、サンプルから細胞を調製又は分離すること；細胞は、例えば、１×１０５～１×１０７細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳ中の懸濁液として調製してもよい；細胞を溶解してＤＮＡ抽出物を得ること；溶解方法は、機械溶解、化学溶解、酵素溶解及び当該分野で知られている他の細胞溶解方法又はそれらの任意の組み合わせの中から選択してもよい；
２）前記少なくとも６５種類の遺伝子型ヒトパピローマウイルスを検出することができるプライマー対を用いて、前記１）で得られたＤＮＡ抽出物のポリメラーゼ連鎖反応をそれぞれ行う。
一般に、一つのＰＣＲ反応系には、上流プライマー及び下流プライマーを含む１対のプライマーのみを含む；ただし、ポリメラーゼ連鎖反応系は当業者に公知されるものであり、例えば、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液等を含む；各ＰＣＲの反応系は、一般に、例えば２０～５０μＬであり得る；
３）ポリメラーゼ連鎖反応の結果に基づいて、サンプルがヒトパピローマウイルスを含むかどうかを判定する。
別の実施形態では、前記方法は、以下のステップを含む：
１）サンプルのＤＮＡ抽出；
具体的なステップとしては、例えば、子宮頸管ブラシから分泌検体を完全に溶出すること；溶出液を回収し、例えば１３０００ｒｐｍの１０分間遠心で分離すること；上清を廃棄し、管の底に沈殿物を保持すること；得られた沈殿物を溶解してＤＮＡ抽出液を得ること；溶解方法は、機械溶解、化学溶解、酵素溶解及び当該分野で知られている他の細胞溶解方法又はそれらの任意の組み合わせの中から選択してもよい；
２）前記少なくとも６５種類の遺伝子型ヒトパピローマウイルスを検出することができるプライマー対を用いて、前記１）で得られたＤＮＡ抽出物のポリメラーゼ連鎖反応をそれぞれ行う；
ここで、一つのＰＣＲ反応系には、１対のプライマーのみを含む；例えば、複数対のプライマーが同時に検出する際に、それぞれに独立した複数の並列ＰＣＲ反応系が使用されてもよい；具体的なステップは、例えば、プライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ抽出液、反応緩衝系及び二重蒸留水を混合して、総容量が例えば２０～５０μＬであるＰＣＲ反応系になることを含む；任意に、プレートをフィルムで密封し、遠心分離し、増幅・検出ゾーンに移す。
３）ポリメラーゼ連鎖反応の結果に基づいて、サンプルがヒトパピローマウイルスを含むかどうかを判定する。
いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｐｅｒ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＵｌｌｔｒａＰＦ（商標） ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを含み、好ましくはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、前記反応緩衝系は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）及びＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のアニーリング温度は、好ましくは４０℃～６０℃、より好ましくは５０℃～６０℃、最も好ましくは５５℃であり、サイクル数は３０～５０、好ましくは３５～４５、より好ましくは４０であってよい。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応結果によってサンプル中にヒトパピローマウイルスを含むかどうかを判定することは、各ポリメラーゼ連鎖反応の実測Ｃｔ値と設定したＣｔ参照値を比較することを含み、実測Ｃｔ値が参照値より小さく、又はポリメラーゼ連鎖反応産物の溶解曲線が単峰でかつ実測Ｃｔ値が参照値より小さい場合、ポリメラーゼ連鎖反応結果は陽性であり、実測Ｃｔ値が参照値より大きい又は等しい、又は対数増幅曲線がない場合、ポリメラーゼ連鎖反応結果は陰性である；また、いずれかのプライマー対のポリメラーゼ連鎖反応の結果は陽性であれば、サンプルＨＰＶの検査結果も陽性である。前記判定は、当業者に公知の他の判定方法であってもよい。
Ｃｔ参照値の設定は、検出しようとするウイルスＤＮＡの最低コピー数（感度）と関連していることが理解される。例えば、サンプル中のウイルスコピー数が１０６の場合、そのＣｔ測定値は通常１７～１８である；サンプル中のウイルスコピー数が１０５の場合、そのＣｔ測定値は通常２１～２２である；サンプル中のウイルスコピー数が１０４の場合、そのＣｔ測定値は通常２４～２５である；サンプル中のウイルスコピー数が１０３の場合、そのＣｔ測定値は通常２８～２９である；サンプル中のウイルスコピー数が１００の場合、そのＣｔ値の測定値は通常３１～３２である；サンプル中のウイルスコピー数が５０の場合、そのＣｔ値の測定値は通常３２～３３である；サンプル中のウイルスコピー数が５～１０の場合、そのＣｔ値の測定値は通常約３４である。したがって、当業者は、検出の需要に応じて、対応するＣｔ参照値を設定することができる。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、Ｃｔ参照値は、３０～３５、３２～３５、３３～３５、３４又は３５に設定されてもよい。一実施形態では、Ｃｔ参照値は３５である。
本願に記載されたプライマー対は、すなわちＰＣＲ反応における上流プライマー（「Ｆ」で示す）と下流プライマー（「Ｒ」で示す）である。ＰＣＲ反応回数を減らすために、縮退プライマー対を使用してもよく、すなわち一つのプライマー対で複数のＨＰＶ遺伝子型を同時に検出することである。
一実施形態では、前記プライマー対は、少なくとも６５種類の遺伝子型のヒトパピローマウイルスを検出できるプライマーを含み、好ましくは、縮退プライマー対である。縮退プライマー対とは、単一アミノ酸をコードするすべての可能な配列を表すプライマーの混合物を指し、一般に等しい割合の混合物である。縮退プライマー対の配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＭはＡ又はＣ、ＫはＧ又はＴ、ＳはＣ又はＧ、ＷはＡ又はＴ、ＨはＡ、Ｃ又はＴ、ＢはＣ、Ｇ又はＴ、ＶはＡ、Ｃ又はＧ、ＤはＡ、Ｇ又はＴ、及びＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを表す。本願では、好ましは、以下の配列を有するプライマー対を含む。
［配１］
いくつかの実施形態では、サンプルは、細胞、血液又は分泌物から選択される。いくつかの実施形態では、サンプルは、細胞であり、例えば幹細胞、特に間葉系幹細胞である。
また、本発明は、少なくとも前述した６５種類の遺伝子型のヒトパピローマウィルスを検出できる試薬を含むヒトパピローマウィルス検出用キットを提供する。前記試薬はプライマー対を含む又はプライマー対からなってもよく、好ましくは縮退プライマー対である。一実施形態において、本発明のキットは、１対又は多対の表１から選択されるプライマーを含んでいる。前記キットは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いるキットであってもよい。例えば、前記キットは、ポリメラーゼ連鎖反応系の他の構成要素も含んで、完全なポリメラーゼ連鎖反応系を形成してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応系は当業者によく知られており、テンプレートとプライマー以外の成分は当業者によく知られ、自由に決定されるものであり、例えば、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファーなどである。前記キットは、さらに陰性対照及び陽性対照を含んでいてもよい。前記キットは、細胞、血液、分泌物から選択されるサンプルを検出するために使用することができる。前記細胞は、幹細胞、例えば、間葉系幹細胞であってもよい。
また、本発明は、ヒトパピローマウイルスを検出するためのプライマー対セットを提供し、それが、１対又は多対の表１から選択されるプライマーを含む。一実施形態は、少なくとも前述した６５種類の遺伝子型ヒトパピローマウイルスを検出可能なプライマー対セットであり、当該セットは、表１に示すプライマー対の全てを含むか、又は、表１に示すプライマー対の全てからなる。
以下、本発明を実施形態に関連してさらに詳細に説明する。しかしながら、これらの実施形態は例示のためにのみ記載されており、本発明の範囲を限定することを意図していないことを理解されたい。
実施例１－異なる遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＬ１領域のＤＮＡ配列における系統樹解析
１）ヒトパピローマウィルスマスターデータベース（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｌｏｎｅｓ － ｈｐｖｃｅｎｔｅｒ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｐｖｃｅｎｔｅｒ．ｓｅ／）、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）が構築したＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）、日本ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）、ヨーロッパＤＮＡデータベース（ＥＭＢＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ）にクエリを実行し、これまでにＤＮＡ配列が確認されているすべての遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＬ１領域の配列を取得し、２２２種類の遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＬ１領域のＤＮＡ配列をダウンロードした。
２）得られた２２２種類の遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＬ１領域ＤＮＡ配列を、系統樹解析に使用するソフトウェアＭｅｇＡｌｉｇｎ （ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ／）に取り込み、Ｌ１領域ＤＮＡ配列の比較を行った。
３）系統樹解析の結果として（結果は図１を参照）、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８を含む高リスクＨＰＶと、ＨＰＶ２６、５３、６６、７３、８２を含む中リスクＨＰＶとをカバーするブランチ及びそれがカバーするすべてのＨＰＶ遺伝子型を見つかり、合計６５種類のＨＰＶ遺伝子型が確認され、それぞれは、ＨＰＶ３２、 ＨＰＶ４２、 ＨＰＶ５４、 ＨＰＶ３、 ＨＰＶ１０、 ＨＰＶ２８、 ＨＰＶ２９、 ＨＰＶ７７、 ＨＰＶ７８、 ＨＰＶ９４、 ＨＰＶ１１７、 ＨＰＶ１２５、 ＨＰＶ１６０、 ＨＰＶ８３、 ＨＰＶ１０２、 ＨＰＶ８９、 ＨＰＶ６１、 ＨＰＶ６２、 ＨＰＶ７２、 ＨＰＶ８１、 ＨＰＶ８４、 ＨＰＶ８６、 ＨＰＶ８７、 ＨＰＶ１１４、 ＨＰＶ２、 ＨＰＶ２７、 ＨＰＶ５７、 ＨＰＶ７１、 ＨＰＶ９０、 ＨＰＶ１０６、 ＨＰＶ２６、 ＨＰＶ５１、 ＨＰＶ６９、 ＨＰＶ８２、 ＨＰＶ３０、 ＨＰＶ５３、 ＨＰＶ５６、 ＨＰＶ６６、 ＨＰＶ１８、 ＨＰＶ４５、 ＨＰＶ９７、 ＨＰＶ３９、 ＨＰＶ６８、 ＨＰＶ７０、 ＨＰＶ５９、 ＨＰＶ８５、 ＨＰＶ７、 ＨＰＶ４０、 ＨＰＶ４３、 ＨＰＶ９１、 ＨＰＶ１６、 ＨＰＶ３１、 ＨＰＶ３５、 ＨＰＶ３３、 ＨＰＶ５８、 ＨＰＶ５２、 ＨＰＶ６７、 ＨＰＶ６、 ＨＰＶ１１、 ＨＰＶ１３、 ＨＰＶ４４、 ＨＰＶ７４、 ＨＰＶ３４、 ＨＰＶ７３、及びＨＰＶ１７７である。
実施例２：異なる遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＬ２領域のＤＮＡ配列における系統樹解析
１）ヒトパピローマウィルスマスターデータベース（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｌｏｎｅｓ － ｈｐｖｃｅｎｔｅｒ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｐｖｃｅｎｔｅｒ．ｓｅ／）、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）が構築したＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）、日本ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）、ヨーロッパＤＮＡデータベース（ＥＭＢＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ）にクエリを実行し、これまでにＤＮＡ配列が確認されているすべての遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＬ２領域の配列を取得し、２２１種類の遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＬ２領域のＤＮＡ配列をダウンロードした。
２）得られた２２１種類の遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＬ２領域ＤＮＡ配列を、系統樹解析に使用するソフトウェアＭｅｇＡｌｉｇｎ （ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ／）に取り込み、Ｌ２領域ＤＮＡ配列の比較を行った。
３）系統樹解析の結果として（結果は図２を参照）、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８を含む高リスクＨＰＶと、ＨＰＶ２６、５３、６６、７３、８２を含む中リスクＨＰＶとをカバーするブランチ及びそれがカバーするすべてのＨＰＶ遺伝子型を見つかり、合計６５種類のＨＰＶ遺伝子型が確認され、それぞれは、ＨＰＶ３２、 ＨＰＶ４２、 ＨＰＶ５４、 ＨＰＶ３、 ＨＰＶ１０、 ＨＰＶ２８、 ＨＰＶ２９、 ＨＰＶ７７、 ＨＰＶ７８、 ＨＰＶ９４、 ＨＰＶ１１７、 ＨＰＶ１２５、 ＨＰＶ１６０、 ＨＰＶ８３、 ＨＰＶ１０２、 ＨＰＶ８９、 ＨＰＶ６１、 ＨＰＶ６２、 ＨＰＶ７２、 ＨＰＶ８１、 ＨＰＶ８４、 ＨＰＶ８６、 ＨＰＶ８７、 ＨＰＶ１１４、 ＨＰＶ２、 ＨＰＶ２７、 ＨＰＶ５７、 ＨＰＶ７１、 ＨＰＶ９０、 ＨＰＶ１０６、 ＨＰＶ２６、 ＨＰＶ５１、 ＨＰＶ６９、 ＨＰＶ８２、 ＨＰＶ３０、 ＨＰＶ５３、 ＨＰＶ５６、 ＨＰＶ６６、 ＨＰＶ１８、 ＨＰＶ４５、 ＨＰＶ９７、 ＨＰＶ３９、 ＨＰＶ６８、 ＨＰＶ７０、 ＨＰＶ５９、 ＨＰＶ８５、 ＨＰＶ７、 ＨＰＶ４０、 ＨＰＶ４３、 ＨＰＶ９１、 ＨＰＶ１６、 ＨＰＶ３１、 ＨＰＶ３５、 ＨＰＶ３３、 ＨＰＶ５８、 ＨＰＶ５２、 ＨＰＶ６７、 ＨＰＶ６、 ＨＰＶ１１、 ＨＰＶ１３、 ＨＰＶ４４、 ＨＰＶ７４、 ＨＰＶ３４、 ＨＰＶ７３、及びＨＰＶ１７７である。
実施例３－異なる遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＥ１領域のＤＮＡ配列における系統樹解析
１）ヒトパピローマウィルスマスターデータベース（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｌｏｎｅｓ － ｈｐｖｃｅｎｔｅｒ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｐｖｃｅｎｔｅｒ．ｓｅ／）、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）が構築したＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）、日本ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）、ヨーロッパＤＮＡデータベース（ＥＭＢＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ）にクエリを実行し、これまでにＤＮＡ配列が確認されているすべての遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＥ１領域の配列を取得し、２２０種類の遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＥ１領域のＤＮＡ配列をダウンロードした。
２）得られた２２０種類の遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＥ１領域ＤＮＡ配列を、系統樹解析に使用するソフトウェアＭｅｇＡｌｉｇｎ （ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ／）に取り込み、Ｅ１領域ＤＮＡ配列の比較を行った。
３）系統樹解析の結果として（結果は図３を参照）、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８を含む高リスクＨＰＶと、ＨＰＶ２６、５３、６６、７３、８２を含む中リスクＨＰＶとをカバーするブランチ及びそれがカバーするすべてのＨＰＶ遺伝子型を見つかり、合計６５種類のＨＰＶ遺伝子型が確認され、それぞれは、ＨＰＶ３２、 ＨＰＶ４２、 ＨＰＶ５４、 ＨＰＶ３、 ＨＰＶ１０、 ＨＰＶ２８、 ＨＰＶ２９、 ＨＰＶ７７、 ＨＰＶ７８、 ＨＰＶ９４、 ＨＰＶ１１７、 ＨＰＶ１２５、 ＨＰＶ１６０、 ＨＰＶ８３、 ＨＰＶ１０２、 ＨＰＶ８９、 ＨＰＶ６１、 ＨＰＶ６２、 ＨＰＶ７２、 ＨＰＶ８１、 ＨＰＶ８４、 ＨＰＶ８６、 ＨＰＶ８７、 ＨＰＶ１１４、 ＨＰＶ２、 ＨＰＶ２７、 ＨＰＶ５７、 ＨＰＶ７１、 ＨＰＶ９０、 ＨＰＶ１０６、 ＨＰＶ２６、 ＨＰＶ５１、 ＨＰＶ６９、 ＨＰＶ８２、 ＨＰＶ３０、 ＨＰＶ５３、 ＨＰＶ５６、 ＨＰＶ６６、 ＨＰＶ１８、 ＨＰＶ４５、 ＨＰＶ９７、 ＨＰＶ３９、 ＨＰＶ６８、 ＨＰＶ７０、 ＨＰＶ５９、 ＨＰＶ８５、 ＨＰＶ７、 ＨＰＶ４０、 ＨＰＶ４３、 ＨＰＶ９１、 ＨＰＶ１６、 ＨＰＶ３１、 ＨＰＶ３５、 ＨＰＶ３３、 ＨＰＶ５８、 ＨＰＶ５２、 ＨＰＶ６７、 ＨＰＶ６、 ＨＰＶ１１、 ＨＰＶ１３、 ＨＰＶ４４、 ＨＰＶ７４、 ＨＰＶ３４、 ＨＰＶ７３、及びＨＰＶ１７７である。
実施例４－異なる遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＥ６領域のＤＮＡ配列における系統樹解析
１）ヒトパピローマウィルスマスターデータベース（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｌｏｎｅｓ － ｈｐｖｃｅｎｔｅｒ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｐｖｃｅｎｔｅｒ．ｓｅ／）、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）が構築したＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）、日本ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）、ヨーロッパＤＮＡデータベース（ＥＭＢＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ）ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ）にクエリを実行し、これまでにＤＮＡ配列が確認されているすべての遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＥ６領域の配列を取得し、２１４種類の遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＥ６領域のＤＮＡ配列をダウンロードした。
２）得られた２１４種類の遺伝子型のヒトパピローマウィルスのＥ６領域ＤＮＡ配列を、系統樹解析に使用するソフトウェアＭｅｇＡｌｉｇｎ （ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ／）に取り込み、Ｅ１領域ＤＮＡ配列の比較を行った。
３）系統樹解析の結果として（結果は図４参照）、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８を含む高リスクＨＰＶと、ＨＰＶ２６、５３、６６、７３、８２を含む中リスクＨＰＶとをカバーするブランチ及びそれがカバーするすべてのＨＰＶ遺伝子型を見つかり、合計６５種類のＨＰＶ遺伝子型が確認され、それぞれは、ＨＰＶ３２、 ＨＰＶ４２、 ＨＰＶ５４、 ＨＰＶ３、 ＨＰＶ１０、 ＨＰＶ２８、 ＨＰＶ２９、 ＨＰＶ７７、 ＨＰＶ７８、 ＨＰＶ９４、 ＨＰＶ１１７、 ＨＰＶ１２５、 ＨＰＶ１６０、 ＨＰＶ８３、 ＨＰＶ１０２、 ＨＰＶ８９、 ＨＰＶ６１、 ＨＰＶ６２、 ＨＰＶ７２、 ＨＰＶ８１、 ＨＰＶ８４、 ＨＰＶ８６、 ＨＰＶ８７、 ＨＰＶ１１４、 ＨＰＶ２、 ＨＰＶ２７、 ＨＰＶ５７、 ＨＰＶ７１、 ＨＰＶ９０、 ＨＰＶ１０６、 ＨＰＶ２６、 ＨＰＶ５１、 ＨＰＶ６９、 ＨＰＶ８２、 ＨＰＶ３０、 ＨＰＶ５３、 ＨＰＶ５６、 ＨＰＶ６６、 ＨＰＶ１８、 ＨＰＶ４５、 ＨＰＶ９７、 ＨＰＶ３９、 ＨＰＶ６８、 ＨＰＶ７０、 ＨＰＶ５９、 ＨＰＶ８５、 ＨＰＶ７、 ＨＰＶ４０、 ＨＰＶ４３、 ＨＰＶ９１、 ＨＰＶ１６、 ＨＰＶ３１、 ＨＰＶ３５、 ＨＰＶ３３、 ＨＰＶ５８、 ＨＰＶ５２、 ＨＰＶ６７、 ＨＰＶ６、 ＨＰＶ１１、 ＨＰＶ１３、 ＨＰＶ４４、 ＨＰＶ７４、 ＨＰＶ３４、 ＨＰＶ７３，及び ＨＰＶ１７７である。
実施例５－６５種類のヒトパピローマウイルス遺伝子型の縮退プライマー対の検証
（Ｉ） プライマーの設計と合成
６５種類のヒトパピローマウイルスの全ゲノムをアラインメントすることにより、この６５種類を１８つのグループに分け、同じグループのヒトパピローマウイルス遺伝子型に対して、縮退プライマー対を設計した（表３を参照）。縮退プライマー対を人工的に合成し、縮退プライマー対の感度合格閾値を５－１００コピー数に設定した。
（ＩＩ） 対照群と実験群の設定
陰性対照１：水対照；
陰性対照２：ｇＤＮＡ陰性対照；
陽性対照：ｇＤＮＡ陽性対照；
実験群：ｇＤＮＡテンプレートに加え、人工的に合成されたＨＰＶ遺伝子型を含むフラグメントテンプレートである。ＨＰＶ遺伝子型フラグメントテンプレートの具体的な配列を表２に示す。表中の遺伝子ＩＤは、国際ヒトパピローマウイルスリファレンスセンター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ （ＨＰＶ） Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）に公開されたデータである（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｐｖｃｅｎｔｅｒ．ｓｅ／ｈｕｍａｎ＿ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｃｌｏｎｅｓ／）。
ｇＤＮＡ陽性対照とｇＤＮＡ陰性対照中のテンプレートは、いずれもＨＰＶ感染していないヒト細胞から抽出したゲノムＤＮＡであり、本明細書には、「ｇＤＮＡテンプレート」とも呼ばれ、上海斯信生物科技有限会社から購入し、製品名「ヒト骨髄間葉系幹細胞のゲノムＤＮＡ （ＨＭＳＣ－ｂｍ ｇＤＮＡ）」である。
ｇＤＮＡ陽性対照に加えるプライマーは、ヒトβ－Ｇｌｏｂｉｎプライマー（配列は、Ｆ：ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ、Ｒ：ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ）である。水対照とｇＤＮＡ陰性対照に添加したプライマーは、すべて表３に示したプライマー対であり、各ＰＣＲ系には、それぞれにその中の１対のプライマーを含み、これによって、１８個の異なるプライマー対の水対照を並行するＰＣＲ反応系と、１８個の異なるプライマー対のｇＤＮＡ陰性対照を並行するＰＣＲ反応系を形成した。実験群では、６５個のＨＰＶ遺伝子型テンプレートが、それぞれ表３に示すコピー数に基づき、それに位置するグループのプライマー対と反応し、そして６５個の異なるＨＰＶ遺伝子型テンプレートを並行するＰＣＲ反応系を形成した。
（ＩＩＩ） 核酸増幅準備
１）９６ウェルＰＣＲプレートを氷の上に置いて待機した。
２）以下のような組成の対照群と実験群のＰＣＲシステムを加えた：
［例５－１］
３）フィルムでプレートをシールし、２０００ｒｐｍ、１分間、増幅・検出ゾーンに移した。
（ＩＶ） ＰＣＲ増幅
１）ＰＣＲ増幅パラメーターは、９４℃３０秒間変性した；９４℃５秒、５５℃１５秒、７２℃３５秒のサイクルを４０回繰り返した。
２）７２℃で蛍光値を測定し、蛍光値変化曲線、すなわちＳ字対数増幅曲線にしたがってＣｔの結果を読み取った。
３）品質管理は下表のとおりです。
［例５－２］
（Ｖ） 結果分析
本研究では、Ｃｔ値３５を参照閾値とした。ＰＣＲ産物の溶解曲線が単峰で、かつＣｔ値が３５以下の場合を陽性、Ｃｔ値が３５以上又は対数増幅曲線がない場合を陰性と判定した。
水対照とｇＤＮＡ陰性対照の結果が陰性であり、ｇＤＮＡ陽性対照の結果が陽性であり、かつ実験グループの結果が陽性である場合、当該縮退プライマー対は、その対応グループのＨＰＶ遺伝子型を拡大できると考え、この検証結果を陽性と定義した。６５種類のＨＰＶ遺伝子型の縮退プライマー対の検証結果を表３に示す。
具体的には、水対照とｇＤＮＡ陰性対照のそれぞれ１８個のＰＣＲ反応系では、Ｓ型対数増幅曲線がみられなかったため、結果を陰性となった。ｇＤＮＡ陽性対照のＰＣＲ産物は、単峰性溶解曲線であり、Ｃｔ値が２２となり、３５以下であったため、陽性と判定された。実験群の６５個のＰＣＲ産物は、すべてＣｔ値が３１から３４の間の単峰性溶解曲線であり、いずれも３５以下であった。そして、プライマー対は、すべて陽性であることが検証された。
実施例６ － 細胞サンプル中のヒトパピローマウイルスの検出
（Ｉ） サンプル処理とＤＮＡ抽出
１）毛包から得たＭＳＣを１×１０６／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳに懸濁し、その５～１０μＬを２５０μＬのライセート、すなわちＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ 抽出液に添加した。
２）１５秒間振盪混合、６５℃６分間水浴し、取り出して１５秒間振盪混合し、瞬間遠心分離し、９８℃で２分間の水浴し、取り出して １５ 秒間振盪混合、瞬間遠心分離して細胞溶解上清を得、すぐに使用するか、又は－２０℃で保存した。
本実施形態では、ヒトパピローマウイルスを人工的に添加することで、サンプルがＨＰＶウイルスに感染又は汚染された状況を再現し、そして本方法でサンプル中のＨＰＶ感染状況を検出する可能性を検証する。
（ＩＩ）対照群と実験群の設定
陰性対照：１０μＬ ＰＢＳ＋２５０μＬ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出液
陽性対照：ＭＳＣライセート上清
実験群：人工的に合成したＨＰＶ６１、ＨＰＶ８４、ＨＰＶ２６フラグメントテンプレート入りＭＳＣライセート上清（各１００コピー）
陽性対照に加えたプライマーは、ヒトβ－Ｇｌｏｂｉｎプライマー（配列は、Ｆ：ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ、Ｒ：ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ）である。陰性対照に加えたプライマーは、表４に示した１８個の縮退プライマー対であり、それぞれ１８個のＰＣＲ反応系を形成し、それぞれ増幅させた。実験群に加えたプライマーは表４に示した１８個の縮退プライマー対であり、それぞれ１８個のＰＣＲ反応系を形成し、それぞれ増幅させた。
（ＩＩＩ） 核酸増幅準備
１）９６ウェルＰＣＲプレートを氷の上に置いて待機した。
２）以下のような組成の対照群と実験群のＰＣＲシステムを加えた：
［例６－１］
３） フィルムでプレートをシールし、２０００ｒｐｍ、１分間、増幅・検出ゾーンに移した。
（ＩＶ） ＰＣＲ増幅
１）ＰＣＲ増幅パラメーターは、９４℃３０秒間変性した；９４℃５秒、５５℃１５秒、７２℃３５秒のサイクルを４０回繰り返した。
２）７２℃で蛍光値を測定し、蛍光値変化曲線、すなわちＳ字対数増幅曲線にしたがってＣｔの結果を読み取った。
３）品質管理は下表のとおりです。
［例６－２］
（Ｖ） 結果分析
研究では、３５のＣｔ値を本検出方法の参照閾値とした。ＰＣＲ産物の溶解曲線が単峰で、かつＣｔ値が３５以下の場合を陽性と判定した；Ｃｔ値が３５以上又は対数増幅曲線がない場合を陰性と判定した。
陰性対照の結果が陰性であり、陽性対照の結果が陽性であり、かつ実験群のいずれかプライマー対のＰＣＲ反応が陽性である場合、当該プライマー対に対応するＨＰＶ遺伝子型を検出したことと見なされ、陽性と標記し、同時に、当該サンプルのウイルス検出結果も陽性であり、即ちＨＰＶウイルスに感染されたと見なされる。試験結果を表４に示す。
具体的には、陰性対照の１８個ＰＣＲ反応系は、いずれもＳ字対数増幅曲線を示さず、陰性という結果となった。陽性対照のＰＣＲ反応産物は、単峰性溶解曲線であり、Ｃｔ値が２９で、３５以下であるため、陽性と判定された。実験群の中で、第４、第５と第８グループのプライマー対のＰＣＲ反応産物は、すべて単峰型溶解曲線で、Ｃｔ値は３１と３２の間にあり、すべて３５より小さく、そして検出結果は陽性である；実験群の他のプライマー対には、いずれも対数増幅曲線がなかったため、結果は陰性である。
上記のＰＣＲの結果によれば、細胞サンプルのＨＰＶ検出結果は、陽性である。
実施例７－子宮頸部分泌物サンプル中のヒトパピローマウイルスの検出
（Ｉ） サンプル処理とＤＮＡ抽出
１）子宮頸ブラシから検体を完全に溶出させ、チューブの壁面でブラシを絞り乾燥させた後、ブラシを廃棄する。溶出液全体を １．５ ｍｌのマイクロ遠心チューブに移し、１３０００ ｒｐｍ で １０ 分間遠心して、上清を捨て、チューブの底の沈殿物を保持し、サンプルの沈殿物に５０ μＬ のライセート、すなわちＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標） ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ を添加した。
２） １５ 秒間振盪混合、６５℃６分間で水浴し、取り出して １５ 秒間振盪混合、瞬間遠心し、９８℃２ 分間で水浴し、取り出して１５ 秒間振盪混合し、瞬間遠心して分泌物ライセートの上清を得、直ちに使用するか、又は－２０℃で保存した。
本実施形態では、ヒトパピローマウイルスを人工的に添加することで、サンプルがＨＰＶウイルスに感染又は汚染された状況を再現し、本方法でサンプル中のＨＰＶ感染状況を検出する可能性を検証する。
（ＩＩ） 対照群と実験群の設定
陰性対照：ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標） ＤＮＡ 抽出液
陽性対照：分泌物ライセート上清
実験群：分泌物ライセート上清に人工的に合成したＨＰＶ４２、ＨＰＶ２８、ＨＰＶ１０２フラグメントテンプレート（各１００コピー）を添加したもの
陽性対照に加えたプライマーは、ヒトβ－Ｇｌｏｂｉｎプライマープライマー（配列は、Ｆ：ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ、Ｒ：ＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ）、陰性対照に加えたプライマーは、表５に示した１８個の縮退プライマー対で、それぞれ１８個のＰＣＲ反応系を形成して、それぞれ増幅させた。実験群に加えたプライマーは、表５に示した１８個の縮退プライマー対であり、それぞれ１８個のＰＣＲ反応系を形成し、それぞれ増幅させた。
（ＩＩＩ） 核酸増幅準備
１）９６ウェルＰＣＲプレートを氷の上に置いて待機した；
２）以下のような組成の対照群と実験群のＰＣＲシステムを加えた：
［例７－１］
３）フィルムでプレートをシールし、２０００ｒｐｍ、１分間、増幅・検出ゾーンに移した。
（ＩＶ） ＰＣＲ増幅
１）ＰＣＲ増幅パラメーターは、９４℃３０秒間変性した；９４℃５秒、５５℃１５秒、７２℃３５秒のサイクルを４０回繰り返した。
２）７２℃で蛍光値を測定し、蛍光値変化曲線、すなわちＳ字対数増幅曲線にしたがってＣｔの結果を読み取った。
３） 品質管理は下表のとおりです。
［例７－２］
（Ｖ） 結果分析
研究では、３５のＣｔ値を本検出方法の参照閾値とした。ＰＣＲ産物の溶解曲線が単峰で、かつＣｔ値が３５以下の場合、陽性と判定した；Ｃｔ値が３５以上又は対数増幅曲線がない場合、陰性と判定した。
陰性対照の結果が陰性であり、陽性対照の結果が陽性であり、かつ実験群中のいずれかのプライマー対のＰＣＲ反応が陽性である場合、当該プライマー対に対応するＨＰＶ遺伝子型を検出したことと見なされ、陽性と標記し、同時に当該サンプルのウイルス検出結果も陽性であり、ＨＰＶウイルスに感染したと見なされる。試験結果を表５に示す。
具体的には、陰性対照の１８個のＰＣＲ反応系はいずれもＳ字対数増幅曲線を示さず、陰性と判定された。陽性対照のＰＣＲ産物は単峰型溶解度曲線で、Ｃｔ値は３０であり、３５以下であったため、結果は陽性であった。実験群の中で、第１、第２と第３グループのプライマー対のＰＣＲ産物は、すべて単峰型溶解曲線で、Ｃｔ値は３１から３２までの間であり、すべて３５より小さく、そのため、検出結果は陽性であった；実験群の他のプライマー対には、いずれも対数増幅曲線がなかったため、結果は陰性であった。
上記のＰＣＲ反応結果から、子宮頸部分泌物サンプルはＨＰＶ陽性と判定された。
具体的な実施例を説明したが、本発明の主題及び範囲から逸脱することなく、様々な変形及び変更が可能であることは、当業者にとって明らかであろう。したがって、添付の特許請求の範囲には、本発明の範囲内で、そのようなすべての変形が含まれる。

Claims (20)

  1. サンプル中のヒトパピローマウイルスの存在を検出する方法であって、
    少なくとも６５種類の遺伝子型のヒトパピローマウイルスを検出するステップを含み、
    前記６５種類の遺伝子型は：ＨＰＶ３２、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ５４、ＨＰＶ３、ＨＰＶ１０、ＨＰＶ２８、ＨＰＶ２９、ＨＰＶ７７、ＨＰＶ７８、ＨＰＶ９４、ＨＰＶ１１７、ＨＰＶ１２５、ＨＰＶ１６０、ＨＰＶ８３、ＨＰＶ１０２、ＨＰＶ８９、ＨＰＶ６１、ＨＰＶ６２、ＨＰＶ７２、ＨＰＶ８１、ＨＰＶ８４、ＨＰＶ８６、ＨＰＶ８７、ＨＰＶ１１４、ＨＰＶ２、ＨＰＶ２７、ＨＰＶ５７、ＨＰＶ７１、ＨＰＶ９０、ＨＰＶ１０６、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、ＨＰＶ８２、ＨＰＶ３０、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ９７、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７０、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ８５、ＨＰＶ７、ＨＰＶ４０、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ９１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ６７、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ７４、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ７３、及びＨＰＶ１７７であり、
    前記サンプルは、バイオ製品であり、
    前記方法は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記遺伝子型の存在を検出し、かつ、ポリメラーゼ連鎖反応の結果に基づいてサンプル中にヒトパピローマウイルスが含まれているか否かを判定する、
    ことを特徴とするサンプル中にヒトパピローマウイルスの存在を検出する方法。
  2. 前記ポリメラーゼ連鎖反応は、前記少なくとも６５種の遺伝子型のヒトパピローマウイルスを検出できるプライマー対セットを採用し、前記セット中の１つ又は複数のプライマー対は縮退プライマー対であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記方法は、以下のステップを含む：
    １）サンプルのＤＮＡ取得；
    ２）ステップ１）で得られたＤＮＡと前記少なくとも６５種類の遺伝子型ヒトパピローマウイルスを検出できるプライマー対セット中の各ペアのプライマーをそれぞれポリメラーゼ連鎖反応させる；
    ３）ポリメラーゼ連鎖反応の結果に基づいて、サンプルがヒトパピローマウイルスを含むかどうかを判定する
    ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
  4. 前記セットの１つ又は複数のプライマー対は縮退プライマー対であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
  5. 前記ポリメラーゼ連鎖反応結果に基づいて、サンプルがヒトパピローマウイルスを含むかどうかを判定することが、各ポリメラーゼ連鎖反応の測定Ｃｔ値を設定されたＣｔ参照値と比較することを含み、測定Ｃｔ値が参照値より小さい場合、又はポリメラーゼ連鎖反応生成物の溶解度曲線が単峰でかつ測定Ｃｔ値が参照値より小さい場合、ポリメラーゼ連鎖反応の結果が陽性となり、測定Ｃｔ値が参照値以上であるか、又は対数増幅曲線がない場合、ポリメラーゼ連鎖反応結果は陰性である；同時に、いずれかプライマー対のポリメラーゼ連鎖反応結果が陽性である場合、サンプルのＨＰＶ検出結果は陽性であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
  6. 前記Ｃｔ参照値は３０～３５、３２～３５、３３～３５、３４又は３５から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 前記プライマー対セットは、以下の表１から選択される１つ又は複数のプライマー対を含み、Ｆ及びＲはそれぞれプライマー対におけるフォワードプライマー及びリバースプライマーを表すことを特徴とする請求項２に記載の方法。
    [表１]
    Figure 0007463513000021
    ただし、ＲはＡ又はＧを表し、ＹはＣ又はＴを表し、ＭはＡ又はＣを表し、ＫはＧ又はＴを表し、ＳはＣ又はＧを表し、ＷはＡ又はＴを表し、ＨはＡ、Ｃ又はＴを表し、ＢはＣ、Ｇ又はＴを表し、ＶはＡ、Ｃ又はＧを表し、ＤはＡ、Ｇ又はＴを表す。
  8. 要件（ａ）および（ｂ）のうち、一つ又は二つを満たすことを特徴とする、請求項２に記載の方法であって、前記要件（ａ）および（ｂ）は、
    （ａ）前記ポリメラーゼ連鎖反応のアニーリング温度は、それぞれ４０℃～６０℃、５０℃～６０℃、および５５℃、から選択される；
    （ｂ）前記ポリメラーゼ連鎖反応は、それぞれのサイクル数が、３０～５０、３５～４５、および４０、から選択される、
    であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  9. 前記バイオ製品は、細胞製品又は血液製品から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  10. 前記バイオ製品は細胞製品である、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
  11. 前記バイオ製品は幹細胞製品である、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
  12. 前記バイオ製品は間葉系幹細胞製品である、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
  13. 少なくとも６５種類の遺伝子型ヒトパピローマウイルスの存在を検出することができる試薬を含むキットであって、
    前記６５種類の遺伝子型は：ＨＰＶ３２、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ５４、ＨＰＶ３、ＨＰＶ１０、ＨＰＶ２８、ＨＰＶ２９、ＨＰＶ７７、ＨＰＶ７８、ＨＰＶ９４、ＨＰＶ１１７、ＨＰＶ１２５、ＨＰＶ１６０、ＨＰＶ８３、ＨＰＶ１０２、ＨＰＶ８９、ＨＰＶ６１、ＨＰＶ６２、ＨＰＶ７２、ＨＰＶ８１、ＨＰＶ８４、ＨＰＶ８６、ＨＰＶ８７、ＨＰＶ１１４、ＨＰＶ２、ＨＰＶ２７、ＨＰＶ５７、ＨＰＶ７１、ＨＰＶ９０、ＨＰＶ１０６、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、ＨＰＶ８２、ＨＰＶ３０、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ９７、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７０、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ８５、ＨＰＶ７、ＨＰＶ４０、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ９１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ６７、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ７４、ＨＰＶ３４， ＨＰＶ７３、及びＨＰＶ１７７であり、
    前記キットは、ポリメラーゼ連鎖反応用キットであり、
    前記試薬は、前記少なくとも６５種類のヒトパピローマウイルス遺伝子型を検出できるプライマー対セットを含むか、又は前記少なくとも６５種類のヒトパピローマウイルス遺伝子型を検出できるプライマー対セットからなる、
    ことを特徴とする、バイオ製品におけるヒトパピローマウイルスの存在を検出するためのキット。
  14. 前記セット中の１つ又は複数のプライマー対は縮退プライマー対である、
    ことを特徴とする請求項1３に記載のキット。
  15. 前記プライマー対セットは、以下の表２から選択される１つ又は複数のプライマー対を含み、そのうちＦとＲはそれぞれプライマー対のフォワードプライマーとリバースプライマーを表す、
    ことを特徴とする請求項1３に記載のキット。
    [表２]
    Figure 0007463513000022
    ただし、ＲはＡ又はＧを表し、ＹはＣ又はＴを表し、ＭはＡ又はＣを表し、ＫはＧ又はＴを表し、ＳはＣ又はＧを表し、ＷはＡ又はＴを表し、ＨはＡ、Ｃ又はＴを表し、ＢはＣ、Ｇ又はＴを表し、ＶはＡ、Ｃ又はＧを表し、ＤはＡ、Ｇ又はＴを表す。
  16. 前記バイオ製品は、細胞製品又は血液製品から選択される、ことを特徴とする請求項１３に記載のキット。
  17. 前記バイオ製品は、細胞製品である、ことを特徴とする請求項１３に記載のキット。
  18. 前記バイオ製品は、幹細胞製品である、ことを特徴とする請求項１３に記載のキット。
  19. 前記バイオ製品は、間葉系幹細胞製品である、ことを特徴とする請求項１３に記載のキット。
  20. 以下の表３のプライマー対を含み、ただし、Ｆ及びＲは、それぞれプライマー対におけるフォワードプライマー及びリバースプライマーを表すことを特徴とする、バイオ製品におけるヒトパピローマウイルスの存在を検出するためのプライマー対。
    [表３]
    Figure 0007463513000023
    ただし、ＲはＡ又はＧを表し、ＹはＣ又はＴを表し、ＭはＡ又はＣを表し、ＫはＧ又はＴを表し、ＳはＣ又はＧを表し、ＷはＡ又はＴを表し、ＨはＡ、Ｃ又はＴを表し、ＢはＣ、Ｇ又はＴを表し、ＶはＡ、Ｃ又はＧを表し、ＤはＡ、Ｇ又はＴを表し；
    前記検出は、少なくとも６５種類の遺伝子型のヒトパピローマウイルスを検出するステップを含み、
    前記６５種類の遺伝子型は：ＨＰＶ３２、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ５４、ＨＰＶ３、ＨＰＶ１０、ＨＰＶ２８、ＨＰＶ２９、ＨＰＶ７７、ＨＰＶ７８、ＨＰＶ９４、ＨＰＶ１１７、ＨＰＶ１２５、ＨＰＶ１６０、ＨＰＶ８３、ＨＰＶ１０２、ＨＰＶ８９、ＨＰＶ６１、ＨＰＶ６２、ＨＰＶ７２、ＨＰＶ８１、ＨＰＶ８４、ＨＰＶ８６、ＨＰＶ８７、ＨＰＶ１１４、ＨＰＶ２、ＨＰＶ２７、ＨＰＶ５７、ＨＰＶ７１、ＨＰＶ９０、ＨＰＶ１０６、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ６９、ＨＰＶ８２、ＨＰＶ３０、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ９７、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７０、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ８５、ＨＰＶ７、ＨＰＶ４０、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ９１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ６７、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ７４、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ７３、及びＨＰＶ１７７である。
JP2022534410A 2019-12-13 2020-12-11 ヒトパピローマウィルス（ｈｐｖ）の検出方法及び検出用キット Active JP7463513B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911283675.0 2019-12-13
CN201911283675.0A CN112961938B (zh) 2019-12-13 2019-12-13 检测人类乳头瘤病毒的方法和试剂盒
PCT/CN2020/135565 WO2021115406A1 (zh) 2019-12-13 2020-12-11 检测人类乳头瘤病毒的方法和试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023505510A JP2023505510A (ja) 2023-02-09
JP7463513B2 true JP7463513B2 (ja) 2024-04-08

Family

ID=76270780

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022534410A Active JP7463513B2 (ja) 2019-12-13 2020-12-11 ヒトパピローマウィルス（ｈｐｖ）の検出方法及び検出用キット

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230022218A1 (ja)
EP (1) EP4074843B1 (ja)
JP (1) JP7463513B2 (ja)
CN (2) CN112961938B (ja)
WO (1) WO2021115406A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105603121A (zh) 2016-01-15 2016-05-25 艾康生物技术(杭州)有限公司 用于检测高危型hpv的方法、寡核苷酸和试剂盒
US20170107582A1 (en) 2014-07-07 2017-04-20 Institut Pasteur Broad range gene and genotype papillomavirus transcriptome as a biomarker of papillomavirus-associated cancer stages
CN107119147A (zh) 2017-05-08 2017-09-01 韩林志 人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒及其应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2678284B1 (fr) * 1991-06-28 1993-10-08 Pasteur Institut Sequences d'adn derivees du genome du papillomavirus hpv42, application de ces sequences au diagnostic in vitro d'infection par ce papillomavirus et a la production de compositions immunogenes.
CN101017141A (zh) * 2006-02-09 2007-08-15 港龙生物技术（深圳）有限公司 诊断人类乳头状病毒（hpv）感染的荧光聚合酶链式反应（pcr）的方法和试剂盒
CN101851630A (zh) * 2009-03-30 2010-10-06 白向阳 人乳头瘤病毒dna片段、特异性引物及其应用
CN101864493B (zh) * 2009-04-17 2012-11-28 上海生物信息技术研究中心 检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒及其制备和使用
WO2011103159A2 (en) * 2010-02-16 2011-08-25 Becton, Dickinson And Company Assay for detecting closely- related serotypes of human papillomavirus (hpv)
CN103725792A (zh) * 2012-10-12 2014-04-16 江苏默乐生物科技有限公司 人类乳头瘤病毒（24型）检测（荧光pcr法）试剂盒及其检测方法
CN102994651B (zh) * 2012-11-28 2014-04-30 英科新创(厦门)科技有限公司 用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光pcr检测的引物和探针及其试剂盒
CN104293974A (zh) * 2013-07-19 2015-01-21 浦艳 人乳头瘤病毒核酸检测方法和试剂盒
CN104560962B (zh) * 2013-10-25 2017-07-21 博奥生物集团有限公司 用于检测人乳头瘤病毒的荧光pcr试剂盒及其专用引物组
CN104630384A (zh) * 2013-11-08 2015-05-20 江苏默乐生物科技有限公司 人乳头瘤病毒检测的方法
CN105506173B (zh) * 2014-09-25 2019-03-12 苏州新波生物技术有限公司 人乳头瘤病毒的核酸检测试剂盒及其使用方法和应用
GB201511470D0 (en) * 2015-06-30 2015-08-12 Cellcall Kft HPV detection method
CA3067868A1 (en) * 2017-06-20 2018-12-27 Ulisse Biomed S.P.A Molecular fingerprinting methods to detect and genotype dna targets through polymerase chain reaction

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170107582A1 (en) 2014-07-07 2017-04-20 Institut Pasteur Broad range gene and genotype papillomavirus transcriptome as a biomarker of papillomavirus-associated cancer stages
CN105603121A (zh) 2016-01-15 2016-05-25 艾康生物技术(杭州)有限公司 用于检测高危型hpv的方法、寡核苷酸和试剂盒
CN107119147A (zh) 2017-05-08 2017-09-01 韩林志 人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BZHALAVA D. et al.，International standardization and classification of human papillomavirus types，Virology, 2015, vol. 476, p. 341-344

Also Published As

Publication number Publication date
CN114929901A (zh) 2022-08-19
EP4074843C0 (en) 2026-03-11
CN112961938A (zh) 2021-06-15
US20230022218A1 (en) 2023-01-26
EP4074843A4 (en) 2024-01-17
WO2021115406A1 (zh) 2021-06-17
JP2023505510A (ja) 2023-02-09
EP4074843B1 (en) 2026-03-11
CN112961938B (zh) 2022-06-07
EP4074843A1 (en) 2022-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ekström et al. Diversity of human papillomaviruses in skin lesions
Mandishora et al. Intra-host sequence variability in human papillomavirus
Nejo et al. Molecular characterisation of genital human papillomavirus among women in Southwestern, Nigeria
CN101151379A (zh) 检测生物样品中的人乳头瘤病毒的系统、方法和组合物
Flores-Miramontes et al. Human papillomavirus genotyping by Linear Array and Next-Generation Sequencing in cervical samples from Western Mexico
Pérez et al. Prevalence of HPV 16 and HPV 18 lineages in Galicia, Spain
Militello et al. Accurate human papillomavirus genotyping by 454 pyrosequencing
Yu et al. Genetic variability and oncogenic risk association of human papillomavirus type 58 E6 and E7 genes in Taizhou area, China
Sait et al. Genetic diversity and phylogenetic analysis of HPV 16 & 18 variants isolated from cervical specimens of women in Saudi Arabia
Ding et al. Distribution of human papillomavirus 58 and 52 E6/E7 variants in cervical neoplasia in Chinese women
Mobini Kesheh et al. Genetic diversity and bioinformatic analysis in the L1 gene of HPV genotypes 31, 33, and 58 circulating in women with normal cervical cytology
Tachezy et al. Human papillomavirus genotype distribution in Czech women and men with diseases etiologically linked to HPV
Wu et al. Evaluation of high-risk human papillomaviruses type distribution in cervical cancer in Sichuan province of China
Correnti et al. Human papillomavirus in ameloblastoma
KR101761701B1 (ko) Hpv 특이적 프로브 및 이를 포함하는 hpv 유전자형 검사용 dna 칩
Plesa et al. Molecular variants of human papilloma virus 16 E2, E4, E5, E6 and E7 genes associated with cervical neoplasia in Romanian patients
Castro et al. Prevalence of human papillomavirus (HPV) type 16 variants and rare HPV types in the central Amazon region
Aggarwal HPV Infection: pathogenesis and detection
JP7463513B2 (ja) ヒトパピローマウィルス（ｈｐｖ）の検出方法及び検出用キット
Rhouma et al. The E6 gene polymorphism of Human papillomavirus 16 in relation to the risk of cervical cancer in Tunisian women
Pérot et al. Broad-range papillomavirus transcriptome as a biomarker of papillomavirus-associated cervical high-grade cytology
KR101413702B1 (ko) 이중­다중 역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 종양원성 인유두종 바이러스 유형 동정 방법
Park et al. Comparison of the analytical and clinical performances of Abbott RealTime High Risk HPV, Hybrid Capture 2, and DNA Chip assays in gynecology patients
Chranioti et al. Performance evaluation of manual and automated (MagNA pure) nucleic acid isolation in HPV detection and genotyping using Roche Linear Array HPV Test
Tadokoro et al. Comparative quantitative analysis of 14 types of human papillomavirus by real-time polymerase chain reaction monitoring Invader reaction (Q-Invader assay)

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220607

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230620

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230920

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20231010

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240201

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240207

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20240227

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20240319

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240327

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7463513

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150