CN101864493A - 检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒及其制备和使用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，包括人乳头瘤病毒测序引物溶液。本发明还公开了上述用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒的制备方法和使用方法。本发明的试剂盒可以确定待测样本中是否包含HPV病毒，以及具体病毒亚型。同时通过在待测DNA样本加上用来区分样本来源的身份标签，即可满足一次检测多人的高通量临检要求。本发明的试剂盒超过传统的检测手段，序列差异定位到碱基水平，检测更灵敏准确，同时也规避了假阳性污染的可能。
Description
技术领域
本发明涉及人乳头瘤病毒的检测，具体涉及检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒及其制备和使用。
背景技术
宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，死亡率仅次于乳腺癌，位于妇女癌症死亡的第二位。据世界范围内统计，每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的5％，其中80％在发展中国家。我国每年宫颈癌新发病例约13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的28.8％。此外由于条件限制而漏检的疾患则远不止此数。而研究发现，99.7％的宫颈癌患者都能发现高危型HPV感染。国际癌症研究署(IARC)在2004年明确表示，HPV感染是宫颈上皮内瘤变及宫颈癌发生的必要因素，其中高危型HPV(HR2HPV)与宫颈癌的相关性比吸烟与肺癌还要高，它可引起95％以上的宫颈癌，HR2HPV持续感染是宫颈癌及其癌前病变发生、发展的必要条件。通常，宫颈在HPV感染后发生病变，发展成为宫颈癌一般要经过10年左右，因此治疗HPV感染有足够的时间，如果在病变早期就发现和治疗，治愈率几乎是100％，所以在宫颈病变早期，检测发现HPV病毒，对于宫颈癌的预防和治愈具有极其重要的意义。
HPV生存条件较为严格，因此目前尚无体外培养的成功先例，大多数HPV感染的患者没有显微镜检测的依据。另外血清学检测也不敏感，多数为阴性，且阳性结果中还包含相当数量的假阳性。因此检测HPV感染主要依赖DNA序列的分子水平检测及分型(HPV基因组检测)。HPV病毒的各型基因序列与其生物学行为存在着高度相关性，不同基因型的HPV具有不同的致病危险性。HPV DNA的检测和分型也因此对了解相关病情、判断预后及指导治疗具有重要价值。然而，现有的分子水平检测方法主要是荧光定量PCR法或属于美国Digene公司专利的二代杂交捕获分析法，一次检测覆盖的亚型数目较少，并且前者容易产生假阳性污染，而后者则价格昂贵无法用于大规模临床筛查。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，及其制备和使用方法。
本发明的技术原理：
本发明的检测人乳头瘤病毒的试剂盒的原理是：根据不同亚型所共有的保守区域的特点，设计尽量少的引物对，并确保引物对所对应的目标区域包括所有分型的特有序列信息。然后将引物对扩增出来的片段进行测序，根据测序结构来检测样品的扩增产物中是否含有每种病毒亚型所对应的特异性k-mer片段，并据此判断该扩增产物所对应的样品是否为人乳头瘤病毒阳性，以及阳性样品中所含有的人乳头瘤病毒的具体亚型。
所述k-mer是长度为k的碱基片段，在本发明中，为与人乳头瘤病毒亚型相对应，长度为k的碱基片段。
所述测序方法为454测序法或sanger测序法，优选为454测序法。
所述454测序可使用454生命科学公司(454Life Science，Roche)的454 GS FLX基因组测序仪，具体测序步骤参见产品说明书。
基于上述原理，本发明第一方面提供了一种用于检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，包括：人乳头瘤病毒测序引物溶液。
所述人乳头瘤病毒测序引物溶液中含有一种或多种人乳头瘤病毒亚型的测序引物，所述人乳头瘤病毒亚型选自：HPV10、HPV 11、HPV 12、HPV 13、HPV 14、HPV 15、HPV 16、HPV 17、HPV 18、HPV 19、HPV1a、HPVme、HPV20、RTRX7、HPV21、HPV22、HPV23、HPV24、HPV25、HPV26、HPV27b、HPV27、HPV28、HPV29、HPV2a、HPV30、HPV31、HPV32、HPV33、HPV34、HPV35、HPV36、HPV37、HPV38b、HPV38、HPV39、HPV3、HPV40、HPV41、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV47、HPV48、HPV49、HPV4、HPV50、HPV51、HPV52、HPV53、HPV54、HPV56、HPV57b、HPV57c、HPV57、HPV58、HPV59、HPV5b、HPV5、HPV60、HPV61、HPV62、HPV63、HPV65、HPV66、HPV67、HPV68a、HPV69、HPV6a、HPV6b、HPV70、HPV72、HPV73、HPV7、HPV82、HPV8、HPV94或HPV9。
所述人乳头瘤病毒亚型的测序引物是根据各人乳头瘤病毒亚型的保守区域序列设计的引物。
所述人乳头瘤病毒亚型的测序引物选自SEQ ID NO：1-60中的一种或多种。
更优选的，所述人乳头瘤病毒的测序引物的序列如下表所示：
上述人乳头瘤病毒亚型的测序引物可以混合于同一溶液中包装，也可以每种人乳头瘤病毒亚型的测序引物单独配置溶液包装。
较佳的，试剂盒中还包括各种人乳头瘤病毒亚型所对应的特异性k-mer序列的数据信息。
所述特异性k-mer序列选自SEQ ID NO：61-144：
优选的，所述人乳头瘤病毒亚型所对应的特异性k-mer序列的数据信息记载在分析系统中。
所述分析系统用于读入测序结果，将测序引物所对应的扩增片段与特异性k-mer序列进行比较分析。
所述分析系统包括：
序列比对模块，用于将输入序列信息与数据库中的特异性k-mer序列信息进行比对；
数据管理模块，用于数据输入和输出；以及
存储特异性k-mer序列的数据库。
本发明也可使用常规的序列比对系统进行序列比对，如：NCBI的BLAST 2 SEQUENCE或者ClustalW等系统。
优选的，在本发明所述的试剂盒中还包括PCR-MIX以及DNA抽提液。
所述PCR-MIX为：含有PCR扩增缓冲液(10×PCR buffer)、Mg2+和dNTP的混合溶液，可以由通用电气医疗集团生命科学部购得，也可自行配制。其中，人乳头瘤病毒的上游引物和下游引物的混合溶液的浓度可由本领域技术人员根据PCR技术所需的常规条件来确定，混合溶液的溶剂为常规的引物溶剂，如Tris-EDTA缓冲液等。
上述PCR-MIX和DNA抽提液均单独包装。
优选的，所述人乳头瘤病毒亚型的测序引物的5’端连有DNA tag。
所述DNA tag为长度为8bp的短DNA片段，DNA tag中的碱基可随机排列，连有DNAtag的目的是在同时检测多个个体时用于区分不同的个体。为达到上述目的，对于同一样本，其扩增时所使用的所有测序引物的5’端均连有相同序列的DNA tag；而不同样本之间，其扩增时所使用的测序引物5’端的DNA tag互不相同。例如：样本1采用AAAAAAAA作为其测序引物的DNA tag，则样本2就采用与该DNA tag至少相差一个碱基的序列作为其测序引物的DNA tag，如AAAAAAAT。
本发明的第二个方面，提供了上述检测人乳头瘤病毒的试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤：
1)抽提样本DNA作为PCR反应模板；
2)PCR扩增：在反应孔中加入人乳头瘤病毒测序引物溶液和步骤1)获得的PCR反应模板，进行PCR扩增反应；
3)扩增产物的测序：将步骤2)扩增出的片段进行测序；
4)测序结果分析：将测序结果与特征k-mer数据进行比较分析。
所述步骤2)中的PCR扩增反应的循环参数设置为：95℃30秒变性，59℃45秒退火，72℃60秒延伸，循环30次。
所述步骤3)中的测序方法可采用常规方法测序，优选高通量的454测序法。
优选的，步骤3)中采用454测序法进行扩增产物的测序，其具体步骤可参考454测序仪的说明书进行。
所述步骤4)中测序结果可以使用Blast或者ClustalW等常规序列比对系统将扩增产物序列数据与特异性k-mer序列数据进行比对，也可以使用自行设计的序列比对系统进行数据对比。
上述用于检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒的使用方法，在定性检测高危型人乳头瘤病毒时，如果通过序列比对，检测出扩增产物中含有相应的特异性k-mer序列，则检测样本为与该特征k-mer相对应类型的HPV病毒阳性样本。
上述用于检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒的使用方法，用于检测多个个体时，可通过在不同样本使用的测序引物的5’端加上不同的DNA tag而达到对不同样本扩增产物进行标记的目的，将样本DNA分别采用测序引物扩增后，可将所有样本的DNA扩增产物混合，同时测序，在最后的测序结果中根据每种DNA tag来确定该样品所对应的个体。
上述样品选自生殖泌尿道分泌物或宫颈细胞或组织活检标本。
本发明的第三个方面，提供了上述检测人乳头瘤病毒的试剂盒的制备方法，该方法包括如下步骤：
a)根据每种人乳头瘤病毒亚型所对应的特异性k-mer序列，设计测序引物，测序引物所对应的扩增片段中含有该病毒所属亚型对应的特异性k-mer序列；
b)将上述测序引物使用Tris-EDTA溶剂制备人乳头瘤病毒测序引物溶液。
本发明的第四个方面，提供了一种鉴定人乳头瘤病毒不同亚型的方法，该方法包括如下步骤：
i通过检测各种亚型人乳头瘤病毒的DNA序列，通过序列比对找出不同亚型病毒所共有的保守区域以及每种亚型所对应的特异性k-mer序列，设计引物对，使得引物对所对应的目标区域包括所有亚型的特有序列信息；
ii以待测病毒DNA为模板，加入步骤i中获取的引物对，进行PCR扩增反应；
iii对步骤ii获得的PCR扩增产物进行测序，并且与每种亚型对应的特异性k-mer序列进行序列比对，根据测序引物所对应的扩增片段中是否含有每种亚型人乳头瘤病毒的特异性k-mer序列来鉴定该人乳头瘤病毒的亚型种类。
本发明的检测人乳头瘤病毒的试剂盒通过使用特异性引物扩增样本中HPV病毒的相应序列区域，以确定待测样本中是否包含HPV病毒，以及包含哪些HPV病毒亚型，可一次检测出样本中是否包含已知的79种HPV病毒，除了对于宫颈癌的筛查有重要意义，对于尖锐湿疣等其他病症的早期发现同样大有裨益。同时通过在待测DNA样本加上用来区分样本来源的身份标签，即可满足一次检测多人的高通量临检要求。本发明的试剂盒解决现有人乳头瘤病毒检测分型不够完全的问题：该试剂盒可分型79种人乳头瘤病毒，比通常的分型20多种有了显著提高，此外，本发明的试剂盒超过传统的检测手段，序列差异定位到碱基水平，检测更灵敏准确，同时也规避了假阳性污染的可能。本发明的试剂盒还可以运用到高通量的水平上，适合针对HPV病毒的大规模临床筛查；由于其使用引物对较少，因此可以有效降低成本并缩短检测时间。
附图说明
图1：本发明的发明原理示意图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1人乳头瘤病毒检测试剂盒的制备方法
1.1引物对的设计
如图1中所示，通过检测各种亚型人乳头瘤病毒的DNA序列，通过序列比对找出不同亚型病毒所共有的保守区域和多变区，根据这些数据可以设计出下列引物对，然后合成引物序列(引物合成公司为上海生物工程技术服务有限公司)。每种引物对所对应的HPV亚型以及每种亚型对应的k-mer序列如下表所示：
1、引物对1
2、引物对2
3、引物对3
4、引物对4
5、引物对5
6、引物对6
7、引物对7
8、引物对8
9、引物对9
10、引物对10
11、引物对11
12、引物对12
13、引物对13
14、引物对14
1.2人乳头瘤病毒测序引物溶液的制备
1、引物合成公司给出的引物为固态，1OD/管分装，可于室温或者-20℃下长期保存。将固态引物配置成溶液后，4℃下可保存1-2周，-20℃下可长期保存。
2、将装有引物的1.5ml离心管以最快速度室温离心1min。
3、打开管盖，按照以下公式计算加双蒸水体积：加水体积(ul)＝1650000/引物分子量(注：以1OD引物稀释到20uM为例)加水体积一般为100-200uL，而后放置备用。
1.3序列比对系统
序列比对系统包括：序列比对模块，用于将输入序列信息与数据库中的特异性k-mer序列信息进行比对；数据管理模块，用于数据输入和输出；以及存储特异性k-mer序列的数据库。
1.4试剂盒的组配
将上述制备的人乳头瘤病毒测序引物溶液、PCR-MIX(PCR扩增缓冲液(10×PCRbuffer)、Mg2+和dNTP的混合溶液，购自通用电气医疗集团生命科学部)以及DNA抽提液(购自通用电气医疗集团生命科学部)分别独立包装，组配后获得基本试剂盒。
实施例2人乳头瘤病毒检测试剂盒的高通量使用：
标本来源：7个来自于临床医疗单位的组织样本。
采用实施例1的方法制备试剂盒，其不同处在于，合成引物时，在检测不同样本所使用的测序引物的5’端加入不同的DNA tag，DNA tag与样本的关系如下表所列：
| 样本号 | DNA tag序列 |
| 1 | CCAATGCA |
| 2 | CAATGCAT |
| 3 | AATGCATT |
| 4 | ATGCATTG |
| 5 | TGCATTGG |
| 6 | GCATTGGA |
| 7 | CATTGGAA |
2.1检测标本的处理：
1、组织样本加入PBS或生理盐水离心洗涤；
2、加消化裂解液(0.5％NP-40和0.5％tween-20的混合溶液)20-50uL，在95-98摄氏度裂解15-30min；
3、裂解后，置于12000r/min离心5-10min，取上清待用。
2.2样本分别PCR扩增：
在冰浴的0.5ml离心管中依次加入5μl 10XPCR buffer、4μl dNTP mix(2mM)、10种测序引物对各2μl、1μl Taq聚合酶(2U/μl)、样本1μl，最后加ddH2O至50μl。调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃40s→58℃30s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。结束反应后，继续在72℃保温7min。结束后，PCR产物放置于-20℃保存。
2.3454测序：上一步扩增出的HPV DNA片段都是在250bp左右，直接在其两端加上接头后，将样本的扩增产物混合，用454测序(所使用的454测序仪器为454生命科学公司(454 Life Science，Roche)的454 GS FLX基因组测序仪)。
2.4测序结果分型：测序得到的结果输入设计的系统，与下表中每对引物对所对应的HPV亚型及其特征k-mer数据进行比较，得到最终分型结果，各种人乳头瘤病毒亚型所对应的特异性k-mer序列如下表所示：
具体结果如下表所示：
上述检测结果与临床单位检测结果完全一致。
本实施例是基于新一代测序技术的HPV检测分型系统，其原理是用根据不同亚型所共有的保守区域的特点，设计尽量少的引物对，并确保引物对所对应的目标区域包括所有分型的特有序列信息。该系统可用14对引物快速、准确检测人临床样本中79种HPV病毒亚型。通过在待测DNA样本加上用来区分样本来源的身份标签，即可满足一次检测多人的高通量临检要求。对于阳性样本，则最后可以通过身份标签确定提供该样本的患者。
实施例3人乳头瘤病毒检测试剂盒的临床灵敏度和特异性试验
1标本：临床已进行HPV分型的的标本50个
2试剂盒：采用实施例1的方式制备
3标本的处理、试剂配置、加样和PCR扩增同实例2
4检测结果：
人乳头瘤病毒检测试剂盒灵敏度为94％；人乳头瘤病毒检测试剂盒特异性为100％；人乳头瘤病毒检测试剂盒准确性为96％。具体试验结果见下表
序列表
<110>上海生物信息技术研究中心
<120>检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒及其制备和使用
<130>090252
<160>144
<170>PatentIn version 3.5
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tgcagccaat atggcttatt aaa 23
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>引物
<400>50
caatggatta taaacaaaca cagc 24
<210>51
<211>21
<212>DNA
<213>引物
<400>51
tctaccatgt caccatcctg t 21
<210>52
<211>22
<212>DNA
<213>引物
<400>52
tctaccatgt caccatcctg ta 22
<210>53
<211>21
<212>DNA
<213>引物
<400>53
atctaccatg tcaccatcct g 21
<210>54
<211>22
<212>DNA
<213>引物
<400>54
tgtacctgta cagccttctg gt 22
<210>55
<211>22
<212>DNA
<213>引物
<400>55
tttagataca gacacagggg gc 22
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>56
tatggcctta tgttccccac 20
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>57
accttgctgt cattagtgcg 20
<210>58
<211>21
<212>DNA
<213>引物
<400>58
gggcgacttg aaagattact g 21
<210>59
<211>21
<212>DNA
<213>引物
<400>59
catactgggc gacttgaaag a 21
<210>60
<211>17
<212>DNA
<213>引物
<400>60
ccctacccag gaccacg 17
<210>61
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>61
tatgttagca gattgta 17
<210>62
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>62
aatgttagca gattgta 17
<210>63
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>63
acaattggca gacatag 17
<210>64
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>64
cttattagca gacagca 17
<210>65
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>65
acaacgggca gacaggg 17
<210>66
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>66
acaacgtgca gatatag 17
<210>67
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>67
ccaattagca gactgca 17
<210>68
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>68
acaattggca gacacta 17
<210>69
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>69
acaattagct gacagtg 17
<210>70
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>70
taaattagct gatatag 17
<210>71
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>71
acaactagca gacatag 17
<210>72
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>72
ccaacgtgct gacacag 17
<210>73
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>73
acagttagct gacatag 17
<210>74
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>74
gctggacaaa ttgatgaagg aagcatga 28
<210>75
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>75
gcagcacaag ttgatgaggg tagcctaa 28
<210>76
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>76
gcaggacaaa ttgatgaggg tagtatga 28
<210>77
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>77
ggtgagcaaa ttgatgcagg gacctaca 28
<210>78
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>78
gacgcacaaa ttgatgatgg caatatga 28
<210>79
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>79
gacgccagaa ttgataatgg gactttta 28
<210>80
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>80
gcaggacaaa tcgatgaggg aagcatga 28
<210>81
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>81
gcaggacaaa ttgatgaagg tagcatga 28
<210>82
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>82
aatactgctg taggtcagga taacaatt 28
<210>83
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>83
gatggtactg tcaatcaaaa tcataatt 28
<210>84
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>84
ggagcacagg ttggcaatgg taatatga 28
<210>85
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>85
ggtgcacaaa ttgacaatgg tacataca 28
<210>86
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>86
gatggtactg tcaaccaaaa tcataatt 28
<210>87
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>87
cgtgcacaaa ttgacaatgg tacataca 28
<210>88
<211>28
<212>DNA
<213>k-mer
<400>88
gacgcatata ttgatgatgg caatatga 28
<210>89
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>89
attaacaagt aaa 13
<210>90
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>90
ttttgcaagc ccg 13
<210>91
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>91
attaacaaca caa 13
<210>92
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>92
cttcgcaagc cca 13
<210>93
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>93
agtgacaaca caa 13
<210>94
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>94
ttttgcaagt ccg 13
<210>95
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>95
attaactaca caa 13
<210>96
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>96
cttcgcaagt ccc 13
<210>97
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>97
agtgacagca caa 13
<210>98
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>98
caaaatcctg tgccaag 17
<210>99
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>99
cagtctcctg tacctgg 17
<210>100
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>100
acatcatctc tttcaga 17
<210>101
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>101
tcttctagtg acagtac 17
<210>102
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>102
caatcgccca caccaac 17
<210>103
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>103
tccacgcagg atagctt 17
<210>104
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>104
gcagcatctg catccac 17
<210>105
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>105
acttcttcta ttcctaa 17
<210>106
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>106
actacatctt ccacata 17
<210>107
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>107
cagtccccca caccaac 17
<210>108
<211>17
<212>DNA
<213>k-mer
<400>108
actagtgaca gtacata 17
<210>109
<211>12
<212>DNA
<213>k-mer
<400>109
agtggaaatc gc 12
<210>110
<211>12
<212>DNA
<213>k-mer
<400>110
accccaggca gt 12
<210>111
<211>12
<212>DNA
<213>k-mer
<400>111
tccggtaata ct 12
<210>112
<211>12
<212>DNA
<213>k-mer
<400>112
agtaatggca gg 12
<210>113
<211>12
<212>DNA
<213>k-mer
<400>113
actgacatac gt 12
<210>114
<211>12
<212>DNA
<213>k-mer
<400>114
tcaggaacta ct 12
<210>115
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>115
aaaatttccc tat 13
<210>116
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>116
gaagtttcct tac 13
<210>117
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>117
caaatataga tat 13
<210>118
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>118
aagatacaga tat 13
<210>119
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>119
acgatacaga ttt 13
<210>120
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>120
aaggtataga tat 13
<210>121
<211>13
<212>DNA
<213>k-mer
<400>121
aaagtacaaa tat 13
<210>122
<211>19
<212>DNA
<213>k-mer
<400>122
tgtatctgca caatctgca 19
<210>123
<211>19
<212>DNA
<213>k-mer
<400>123
aaccacacaa acgttatcc 19
<210>124
<211>19
<212>DNA
<213>k-mer
<400>124
tgccatatct acttcagaa 19
<210>125
<211>19
<212>DNA
<213>k-mer
<400>125
tacagcatcc acgcaggat 19
<210>126
<211>19
<212>DNA
<213>k-mer
<400>126
attatctgca gcatctgca 19
<210>127
<211>19
<212>DNA
<213>k-mer
<400>127
tgaggttaaa aaggaaagc 19
<210>128
<211>19
<212>DNA
<213>k-mer
<400>128
ctgcaccgaa acggccata 19
<210>129
<211>12
<212>DNA
<213>k-mer
<400>129
ctgctgg aa 9
<210>130
<211>12
<212>DNA
<213>k-mer
<400>130
tatgtgg at 9
<210>131
<211>12
<212>DNA
<213>k-mer
<400>131
gaacagttaa gt 12
<210>132
<211>12
<212>DNA
<213>k-mer
<400>132
caaacgttat cc 12
<210>133
<211>11
<212>DNA
<213>k-mer
<400>133
tctattcaga a 11
<210>134
<211>12
<212>DNA
<213>k-mer
<400>134
actccatcag tt 12
<210>135
<211>12
<212>DNA
<213>k-mer
<400>135
aaatcagagg ct 12
<210>136
<211>12
<212>DNA
<213>k-mer
<400>136
cagtctatgt ct 12
<210>137
<211>19
<212>DNA
<213>k-mer
<400>137
tgcgaatgac aaggcggcc 19
<210>138
<211>19
<212>DNA
<213>k-mer
<400>138
tgcctcgggt agcgacagg 19
<210>139
<211>19
<212>DNA
<213>k-mer
<400>139
cactgacata cgtgacagt 19
<210>140
<211>19
<212>DNA
<213>k-mer
<400>140
gggtaataac agatcatct 19
<210>141
<211>21
<212>DNA
<213>k-mer
<400>141
tgtgccttgc aacgcatcag g 21
<210>142
<211>21
<212>DNA
<213>k-mer
<400>142
cacgccatgt acttcacaaa c 21
<210>143
<211>15
<212>DNA
<213>k-mer
<400>143
tttagggcaa agaaa 15
<210>144
<211>15
<212>DNA
<213>k-mer
<400>144
aacagagcta gagtt 15
Claims (19)
1.一种检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，包括：人乳头瘤病毒测序引物溶液。
2.如权利要求1所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述人乳头瘤病毒测序引物溶液中含有一种或多种人乳头瘤病毒亚型的测序引物，所述人乳头瘤病毒亚型选自：HPV10、HPV 11、HPV 12、HPV 13、HPV 14、HPV 15、HPV 16、HPV 17、HPV 18、HPV 19、HPV1a、HPVme、HPV20、RTRX7、HPV21、HPV22、HPV23、HPV24、HPV25、HPV26、HPV27b、HPV27、HPV28、HPV29、HPV2a、HPV30、HPV31、HPV32、HPV33、HPV34、HPV35、HPV36、HPV37、HPV38b、HPV38、HPV39、HPV3、HPV40、HPV41、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV47、HPV48、HPV49、HPV4、HPV50、HPV51、HPV52、HPV53、HPV54、HPV56、HPV57b、HPV57c、HPV57、HPV58、HPV59、HPV5b、HPV5、HPV60、HPV61、HPV62、HPV63、HPV65、HPV66、HPV67、HPV68a、HPV69、HPV6a、HPV6b、HPV70、HPV72、HPV73、HPV7、HPV82、HPV8、HPV94或HPV9。
3.如权利要求2所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述人乳头瘤病毒亚型的测序引物是根据各人乳头瘤病毒亚型的保守区域序列设计的引物。
4.如权利要求2所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述人乳头瘤病毒亚型的测序引物选自SEQ ID NO：1-60。
5.如权利要求1-4中任一权利要求所述的检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括各种人乳头瘤病毒亚型所对应的特异性k-mer序列的数据信息。
6.如权利要求5所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述人乳头瘤病毒亚型所对应的特异性k-mer序列选自SEQ ID NO：61-144。
7.如权利要求5所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述人乳头瘤病毒亚型所对应的特异性k-mer序列的数据信息记载在分析系统中。
8.如权利要求7所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述分析系统用于读入测序结果，将测序引物所对应的扩增片段与特异性k-mer序列进行比较分析。
9.如权利要求8所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述分析系统包括：序列比对模块，用于将输入序列信息与数据库中的特异性k-mer序列信息进行比对；数据管理模块，用于数据输入和输出；以及
存储特异性k-mer序列的数据库。
10.如权利要求1所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括PCR-MIX以及DNA抽提液。
11.如权利要求1所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述人乳头瘤病毒亚型的测序引物的5’端连有DNA tag。
12.如权利要求11所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA tag为长度为8bp的短DNA片段。
13.如权利要求1-12中任一权利要求所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒的使用方法，包括下列步骤：
1)抽提样本DNA作为PCR反应模板；
2)PCR扩增：在反应孔中加入人乳头瘤病毒测序引物溶液和步骤1)获得的PCR反应模板，进行PCR扩增反应；
3)扩增产物的测序：将步骤2)扩增出的片段进行测序；
4)测序结果分析：将测序结果与特异性k-mer序列进行比较分析。
14.如权利要求13所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤2)中的PCR扩增反应的循环参数设置为：95℃30秒变性，59℃45秒退火，72℃60秒延伸，循环30次。
15.如权利要求13所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤3)中采用454测序法进行扩增产物的测序。
16.如权利要求13所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述样本DNA来自生殖泌尿道分泌物或宫颈细胞或组织活检标本。
17.如权利要求1-12中任一权利要求所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒的制备方法，包括下列步骤：
a)根据每种人乳头瘤病毒亚型所对应的特异性k-mer序列设计测序引物，测序引物所对应的扩增片段中含有该病毒所属亚型对应的特异性k-mer序列；
b)将上述测序引物使用Tris-EDTA溶剂制备人乳头瘤病毒测序引物溶液。
18.如权利要求17所述检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤a)中，所述测序引物所对应的扩增片段中含有至少一种人乳头瘤病毒亚型的特异性k-mer序列。
19.一种鉴定人乳头瘤病毒不同亚型的方法，包括如下步骤：
i通过检测各种亚型人乳头瘤病毒的DNA序列，通过序列比对找出不同亚型病毒所共有的保守区域以及每种亚型所对应的特异性k-mer序列，设计引物对，使得引物对所对应的目标区域包括所有亚型的特有序列信息；
ii以待测病毒DNA为模板，加入步骤i中获取的引物对，进行PCR扩增反应；
iii对步骤ii获得的PCR扩增产物进行测序，并且与每种亚型对应的特异性k-mer序列进行序列比对，根据测序引物所对应的扩增片段中是否含有每种亚型人乳头瘤病毒的特异性k-mer序列来鉴定该人乳头瘤病毒的亚型种类。
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