CN102367487B - 一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法 - Google Patents

一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法，每种基因型采用双探针检测，包括一种致癌性早期转录区E6或E7基因区和一种衣壳蛋白晚期转录区L1或L2基因区，该方法以排除PCR扩增产物污染为前提、以双基因探针识别同一基因型为基础、以高灵敏度PCR-质谱联用为平台的高精确度检测和/或鉴定人类乳头状瘤病毒(HPV)基因型的方法。

Description

一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法
技术领域
本发明涉及检测和鉴定病原微生物制剂领域，特别涉及一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法。
背景技术
德国豪森Harald zur Hausen博士于1983年证实人乳头瘤病毒(HPV)的某些型与宫颈癌有关[1]，并于2008年荣获诺贝尔生理或医学奖。该成果开创了宫颈癌研究的新方向，推动了HPV基因型分析和疫苗的研究和开发，使宫颈癌成为目前唯一一个病因明确、可以预防、早期发现并治愈的人类癌症。2003年国际肿瘤研究机构Nubia Munoz博士等公布了由9个国家11个研究机构的分析报告，根据HPV不同型别与宫颈癌的关系，将被检出的30个HPV基因型分为三大类，其中15种致癌高危型：16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82(W13B/MM4亚型和IS39亚型)；3种可能致癌高危型：26，53，66；及12种低危型：6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81(CP8304)和CP6108[2]。从而为HPV基因型分析的方法学研究，提供了可靠依据。此外，还发现高危型与肛门和生殖器癌、口咽癌等有关；低危型与生殖器疣、复发性呼吸道疣状乳头瘤病等有关。
HPV是一类对表皮和黏膜鳞状上皮具有特殊嗜性的小DNA病毒，基因组为双链环状DNA，含有约7900对碱基(bp)。由3个基因区组成，包括早期区(early region，E区)、晚期区(lateregion，L区)区和与非编码区(Uncoding region，UCR)或上游调控区(URR)。E区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7个基因，参与病毒DNA的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。L区主要有衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2，L1高度保守，特异性强；L2编码的衣壳蛋白较小，但变异多。LCR含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV基因表达所必需的调控元件，调控病毒的转录与复制。
美国FDA批准四种HPV检测方法：HC II高危HPV检测(Qiagen)，HC II低危HPV检测(Qiagen)；Cervista HPV 16/18检测和Cervista HPV高危检测(Hologics)。HC II是第二代杂交捕获法(Hybrid Capture II)1999年上市，定性区分13种高危型(16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68)与5种低危型(6/11/42/43/44)，但不能分型。Cervista是应用恒温酶DNA扩增和荧光发光判读法，2009年上市，可定性检测14种高危型(增加了66型)，除16/18可以另外检测，也不能具体分型。
中国SFDA批准上市的国产试剂，主要增添了分型功能。基于芯片和流式两种技术：亚能PCR-反向点杂交芯片法，凯普导流杂交低密度基因芯片法和透景Luminex流式荧光杂交法，分别检测23、21和26种型。
此外，采用PCR-质谱联用技术申报专利的方法有密执安州立大学(2006已批准)和深圳华大基因(2008待批准)。前者针对E6基因区进行13种高危型作分型和定量检测，后者采用通用GP5+/GP6+引物针对L1基因区分析17种型。
上述方法存在的问题是：
1.采用PCR技术为基础加杂交或质谱的方法，虽然灵敏度高达10-100个拷贝。但是均未排除因PCR扩增产物污染，引起的假阳性问题。
2.目前检测HPV的基因区均采用单个目标基因探针，多数为L1区，密执安大学为E6区。而临床标本由于病毒在整合时容易发生目标片段(L1，E1，E2，E6，E7)的缺失或变异，且HPV不同类型，在不同肿瘤和组织中，在潜伏期和活动期的E和L基因的拷贝数也不同，而易造成检测漏诊。也是导致目前采用不同方法，在检测同一样本中HPV类型时，获得结果不一致，造成假阴性问题的主要原因(数据待发表)。
3.检测的HPV型别种类，均未能达到2003年国际肿瘤研究机构提出的30种致病型的要求，其检测结果将使＞1％的人检测漏诊。[2]
4.采用杂交方法检测的灵敏度为5000copies/ml，FDA批准其用于宫颈癌的病毒检测，而对于HPV与其它鳞状上皮癌症关系的研究，以及其它样本，如血液及尿液等体液的检测不适用。
5.采用多重PCR探针混合识别在同一个通用引物扩增区中的相似序列，易产生交叉错配的假阳性问题，导致结果难以重复。
发明内容
本发明提供了一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法，旨在彻底解决现有方法不能排除PCR扩增产物污染，引起的假阳性问题；所有检测方法均以单基因探针为靶向，忽视病毒在整合时发生目标片段缺失或变异，特别是HPV病毒在潜伏期和活动期的E和L基因的拷贝数差异，而造成的假阴性问题；以及目前检测方法均未达到涵盖30种致病HPV基因型，因漏检而引起的假阴性问题。
本发明实施例是这样实现的，一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法，待检测人类乳头状瘤病毒基因型为30种HPV基因型，包括：HPV6、HPV11、HPV 16、HPV18、HPV 26、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 40、HPV 42、HPV 43、HPV 44、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 53、HPV 54、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 61、HPV 66、HPV 68、HPV 70、HPV 72、HPV 73、HPV 81/CP8304、HPV 82、HPV CP6108和/或HPV 89型中的一种或多种。【注：CP6108(U12478)与89型序列比对，仅有11个碱基区别，因此该型需与89型合并检测，且只有L段序列，故采用单基因序列。】
包括以下步骤：
1、引物设计：涵盖国际肿瘤研究机构2003年提出的全部30种致病HPV类型，包括15种致癌高危型16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82(W1 3B/MM4亚型和IS39亚型)和3种可能致癌高危型26、53和66，以及12种低危型6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81/CP8304及CP6108和/或89型。根据待测HPV基因型全序列，获取E6和E7基因区，以及L1和L2基因区，选择每个型别的特异性保守序列，设计一对PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基(ACGTTGGATG)任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开。各种HPV基因型的扩增引物序列见表1。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少16Da。各种HPV扩增引物序列见表1，其对应的碱基延伸探针见表2。
2、PCR反应：在PCR过程中引入尿嘧啶N糖基化酶(UNG酶)技术，在首次PCR反应体系中，采用以dUTP替代常规PCR的dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG酶处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG酶在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR反应及产物，彻底排除了PCR扩增产物污染引起的假阳性问题。通过第一轮PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
3、虾碱性磷酸酶(SAP)处理：使未结合的剩余核酸(dNTPs)脱磷酸失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。
4、碱基延伸反应：在第二轮扩增中进行单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16Da，
5、树脂脱盐：纯化延伸反应产物。
6、质谱检测：将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MASS)系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测HPV基因型别，软件自动处理报告每个基因型的检测结果和可信程度。
本发明的检测方法，优选的包括以下步骤：
(1)用一对PCR引物，在引物的5’端带有ACGTTGGATG碱基的任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，以区别于探针；在扩增区中的保守序列设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基；
(2)第一次PCR扩增反应，将dUTP/dNTP混合物、UNG酶、Tag酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中，先进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后作45个循环PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物；
(3)用虾碱性磷酸酶处理，使第一轮反应中剩余dNTP脱磷酸失活；
(4)第二次单碱基延伸扩增，将ddNTPs加入反应体系中，使之在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，扩增200个循环，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少16Da；
(5)采用阳离子交换树脂吸附盐离子，纯化延伸反应产物；
(6)纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测，根据分子量标记确定待测HPV基因的类型。
其中所述步骤(1)引物设计中每一种待测HPV基因同时采用两个或两个以上基因区检测，其中一种致癌性早期转录区E6或E7基因区和一种衣壳蛋白晚期转录区L1或L2基因区。
所述步骤(1)中，优选的采用β球蛋白基因作为样品质量控制参照，引物序列为SEQ IDNO.119和SEQ ID NO.120，探针序列为SEQ ID NO.180。
优选的在每次反应中加入阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为去离子双蒸水；阳性对照为HPV16，43，72 L1段重组质粒DNA。
本发明的方法，检测浓度低至1拷贝/ul。
本发明还包括，一种检测生物样品中微生物DNA的试剂盒，所述试剂盒中包含一种或多种如表1，表2的合成的多核苷酸试剂。
表1
  序列编号   引物序列   HPV基因型别
  SEQ ID NO.1   ACGTTGGATGCAAACCGCTGDGTGAAGIAG   HPV 6E正向引物
  SEQ ID NO.2   ACGTTGGATGCCTTCCACGDACAATTTHGC   HPV 6E反向引物
  SEQ ID NO.3   ACGTTGGATGTTAGTATGGBCATGCACAIG   HPV 6L正向引物
  SEQ ID NO.4   ACGTTGGATGCCYCCACTCHCTGAABTTTC   HPV 6L反向引物
  SEQ ID NO.5   ACGTTGGATGGACCACCBCAGADATATAIG   HPV 11E正向引物
  SEQ ID NO.6   ACGTTGGATGGCTGCAAAGGBAAAGTTDTC   HPV 11E反向引物
  SEQ ID NO.7   ACGTTGGATGTGATTCATCTSTGTTTGACI   HPV 11L正向引物
  SEQ ID NO.8   ACGTTGGATGACCAACGYCTAAAGGTWGAC   HPV 11L反向引物
  SEQ ID NO.9   ACGTTGGATGACTGCAATGTTWCAGGACCC   HPV 16E正向引物
  SEQ ID NO.10   ACGTTGGAGTTAGTTKTTTGCAGCTVTGTG   HPV 16E反向引物
  SEQ ID NO.11   ACGTTGGATGCTGTTGTTGMTACTACACIC   HPV 16L正向引物
  SEQ ID NO.12   ACGTTGGATGTTTATATGTAGYTTCTVAAG   HPV 16L反向引物
  SEQ ID NO.13   ACGTTGGATGCACTTCACTGCARGACATMG   HPV 18E正向引物
  SEQ ID NO.14   ACGTTGGATGCTGTCTCTWTACACMACAAI   HPV 18E反向引物
  SEQ ID NO.15   ACGTTGGATGAGGTACTATGRGTGACAMTG   HPV 18L正向引物
  SEQ ID NO.16   ACGTTGGATGAGAGGGAGAATACMCACAGI   HPV 18L反向引物
  SEQ ID NO.17   ACGTTGGATGTGCAATTTVTGACCTAHGAG   HPV 26E正向引物
  SEQ ID NO.18   ACGTTGGATGTGTATAGCGTCHATACTCIG   HPV 26E反向引物
  SEQ ID NO.19   ACGTTGGATGAGTABATTATHTGCAGVATC   HPV 26L正向引物
  SEQ ID NO.20   ACGTTGGATGTTCATATTCDTCGCCABGTC   HPV 26L反向引物
  SEQ ID NO.21   ACGTTGGATGCGATTCCWCAACATASGAGG   HPV 31E正向引物
  SEQ ID NO.22   ACGTTGGATGCACWTGGGTTTCARTACGAG   HPV 31E反向引物
  SEQ ID NO.23   ACGTTGGATGCTGCTTACABTAGGCCAICC   HPV 31L正向引物
  SEQ ID NO.24   ACGTTGGATGTGGATCTGGHAAACGAABCC   HPV 31L反向引物
  SEQ ID NO.25   ACGTTGGATGGACACTGAGGVAAAACCABG   HPV 33E正向引物
  SEQ ID NO.26   ACGTTGGATGTTTCTGCATTCHACGCACIG   HPV 33E反向引物
  SEQ ID NO.27   ACGTTGGATGAGGTGGACRATCATTGGSAG   HPV 33L正向引物
  SEQ ID NO.28   ACGTTGGATGAGGTGMACAATCATTGWCAG   HPV 33L反向引物
  SEQ ID NO.29   ACGTTGGATGGAGTGARGTATATGASTTTIC   HPV 35E正向引物
  SEQ ID NO.30   ACGTTGGATGAACASTTCATYCAAACTIC   HPV 35E反向引物
  SEQ ID NO.31   ACGTTGGATGGGGAAAADGCACVCCTTDTA   HPV 35L正向引物
  SEQ ID NO.32   ACGTTGGATGGTCCCCGTHTTGTAGTVCAG   HPV 35L反向引物
  SEQ ID NO.33   ACGTTGGATGACAAATTGCHAGACCTGIGC   HPV 39E正向引物
  SEQ ID NO.34   ACGTTGGATGTACCTCGGTTDGCTGTAGIG   HPV 39E反向引物
  SEQ ID NO.35   ACGTTGGATGCTACCTCTATDGAGTCTICC   HPV 39L正向引物
  SEQ ID NO.36   ACGTTGGATGAATCATACTCCDCCACGIGC   HPV 39L反向引物
  SEQ ID NO.37   ACGTTGGATGCCTGCACVGAAAAGTAAHCC   HPV 40E正向引物
  SEQ ID NO.38   ACGTTGGATGATCCTGTBTCTTCTTCHACG   HPV 40E反向引物
  SEQ ID NO.39   ACGTTGGATGTAACAGGTAHATCTGGTCDG   HPV 40L正向引物
  SEQ ID NO.40   ACGTTGGATGAGAGGTAABCAAGGATCHAC   HPV 40L反向引物
  SEQ ID NO.41   ACGTTGGATGGGCAGAATRTCAGGTMCATC   HPV 42E正向引物
  SEQ ID NO.42   ACGTTGGATGAAATTCCGSAATGTCAGICC   HPV 42E反向引物
  SEQ ID NO.43   ACGTTGGATGACACAATVTGAATCCHAAC   HPV 42L正向引物
  SEQ ID NO.44   ACGTTGGATGCAGCGAAHAGCTTCTGADTG   HPV 42L反向引物
  SEQ ID NO.45   ACGTTGGATGACCAGTGDAAAAAGTACAVC   HPV 43E正向引物
  SEQ ID NO.46   ACGTTGGATGCAGCAATGTADGCAGTATCI   HPV 43E反向引物
  SEQ ID NO.47   ACGTTGGATGAGGAATACTTGHGGCATGIG   HPV 43L正向引物
  SEQ ID NO.48   ACGTTGGATGCATAACCTCTVGGTTTADCG   HPV 43L反向引物
  SEQ ID NO.49   ACGTTGGATGCAGTTATATVTAGTGTAHCG   HPV 44E正向引物
  SEQ ID NO.50   ACGTTGGATGTCCCGCGTADTTAAAATVCC   HPV 44E反向引物
  SEQ ID NO.51   ACGTTGGATGCTGGAGGTAVGTAGAGDACA   HPV 44L正向引物
  SEQ ID NO.52   ACGTTGGATGTTACCCTVTTATCCTGAHCC   HPV 44L反向引物
  SEQ ID NO.53   ACGTTGGATGGCTACCAGAWTTGTGCASAG   HPV 45E正向引物
  SEQ ID NO.54   ACGTTGGATGTACCTCTRTGCGTTCCMATG   HPV 45E反向引物
  SEQ ID NO.55   ACGTTGGATGGGGCACACTTTDTAAACCIG   HPV 45L正向引物
  SEQ ID NO.56   ACGTTGGATGTCTACCATATBACCATCCIC   HPV 45L反向引物
  SEQ ID NO.57   ACGTTGGATGCATGAAATAGNGGGACGDTG   HPV 51E正向引物
  SEQ ID NO.58   ACGTTGGATGTGGGTTTCDTTACGTTGTCI   HPV 51E反向引物
  SEQ ID NO.59   ACGTTGGATGCCAATACCWAAAACCTMAAC   HPV 51L正向引物
  SEQ ID NO.60   ACGTTGGATGAGGATCTGGTAACWGTACCI   HPV 51L反向引物
  SEQ ID NO.61   ACGTTGGATGGAGCTACAACBAAGAGADG   HPV 52E正向引物
  SEQ ID NO.62   ACGTTGGATGTAGGCACATDATACACACGI   HPV 52E反向引物
  SEQ ID NO.63   ACGTTGGATGGTAGGACATYCCTATTTWTC   HPV 52L正向引物
  SEQ ID NO.64   ACGTTGGATGATTGCAGGYCAGACACSTTG   HPV 52L反向引物
  SEQ ID NO.65   ACGTTGGATGGACCTGCAATSCCATGRGC   HPV 53E正向引物
  SEQ ID NO.66   ACGTTGGATGTCCTGCAGATRGTCTAITTC   HPV 53E反向引物
  SEQ ID NO.67   ACGTTGGATGGCCTCCCASATCCTAATWAG   HPV 53L正向引物
  SEQ ID NO.68   ACGTTGGATGCCTACACAGDCCCATAVAAG   HPV 53L反向引物
  SEQ ID NO.69   ACGTTGGATGTGCAGAAGATSAGACAGYAG   HPV 54E正向引物
  SEQ ID NO.70   ACGTTGGATGTACAACWCACACCTMCACAI   HPV 54E反向引物
  SEQ ID NO.71   ACGTTGGATGGGTGTTTAGDGTGCAACIAC   HPV 54L正向引物
  SEQ ID NO.72   ACGTTGGATGACTAAGCGDTGTGTCTHAGG   HPV 54L反向引物
  SEQ ID NO.73   ACGTTGGATGTTCAACAATHCACAGGADCG   HPV 56E正向引物
  SEQ ID NO.74   ACGTTGGATGACCTCAGCAHGTGTTAGTIC   HPV 56E反向引物
  SEQ ID NO.75   ACGTTGGATGGGACAGTTTTHCTACAGABC   HPV 56L正向引物
  SEQ ID NO.76   ACGTTGGATGTTTGACCTAGTGBCCAGTIG   HPV 56L反向引物
  SEQ ID NO.77   ACGTTGGATGATTTGTGTCAGRCGTTGSAG   HPV 58E正向引物
  SEQ ID NO.78   ACGTTGGATGTACCTCASATCGCTGCARAG   HPV 58E反向引物
  SEQ ID NO.79   ACGTTGGATGCTGTCCCRGATGACMTTTAI   HPV 58L正向引物
  SEQ ID NO.80   ACGTTGGATGTATAGAGCCASTAGGAGTMG   HPV 58L反向引物
  SEQ ID NO.81   ACGTTGGATGTACACCGTATGCMGCGTITC   HPV 59E正向引物
  SEQ ID NO.82   ACGTTGGATGCTCCATACAYGGAATMTCTA   HPV 59E反向引物
  SEQ ID NO.83   ACGTTGGATGCACGTGATAATGTATCTGTGI   HPV 59L正向引物
  SEQ ID NO.84   ACGTTGGATGTACAAGCAGTGYCCTTTSTC   HPV 59L反向引物
  SEQ ID NO.85   ACGTTGGATGAGGACGGTCHTTAGCTVAAC   HPV 61E正向引物
  SEQ ID NO.86   ACGTTGGATGACCTGATGHTCCTTTTCCIG   HPV 61E反向引物
  SEQ ID NO.87   ACGTTGGATGAAATTTGBTTTGCCTGAHGG   HPV 61L正向引物
  SEQ ID NO.88   ACGTTGGATGTACCAACCTVAATGCCHCTG   HPV 61L反向引物
  SEQ ID NO.89   ACGTTGGATGCTGCAAAAAVGAACTTAHAAG   HPV 66E正向引物
  SEQ ID NO.90   ACGTTGGATGCCCTACATWCTGCATAIGGC   HPV 66E反向引物
  SEQ ID NO.91   ACGTTGGATGTGGCCATBCTTATTACTCIG   HPV 66L正向引物
  SEQ ID NO.92   ACGTTGGATGCAACCGTAVCCTAAACHCTC   HPV 66L反向引物
  SEQ ID NO.93   ACGTTGGATGCGGTTGACHTTGTATBTCAC   HPV 68E正向引物
  SEQ ID NO.94   ACGTTGGATGTTAACTGCATBGTCGGGTIC   HPV 68E反向引物
  SEQ ID NO.95   ACGTTGGATGGTTGTGGAHACCACTCDCAG   HPV 68L正向引物
  SEQ ID NO.96   ACGTTGGATGCAACATGCCTAAHATATTCC   HPV 68L反向引物
  SEQ ID NO.97   ACGTTGGATGACAAATTVCCTGACCTGIGC   HPV 70E正向引物
  SEQ ID NO.98   ACGTTGGATGCTCTGTTTVCTGTAGCTGIG   HPV 70E反向引物
  SEQ ID NO.99   ACGTTGGATGCTGCTGTTVGTACACADGAC   HPV 70L正向引物
  SEQ ID NO.100   ACGTTGGATGAGGAACABAGCCTATADTAC   HPV 70L反向引物
  SEQ ID NO.101   ACGTTGGATGACAACTGGVCATTTGGADTC   HPV 72E正向引物
  SEQ ID NO.102   ACGTTGGATGTACGTCCAGTVTCGTAGCIC   HPV 72E反向引物
  SEQ ID NO.103   ACGTTGGATGTGAGTATCTTBGCCACACIG   HPV 72L正向引物
  SEQ ID NO.104   ACGTTGGATGCAGGAGTTVAGTGAATTTHAC   HPV 72L反向引物
  SEQ ID NO.105   ACGTTGGATGTAGGCGADATAGACAAICAG   HPV 73E正向引物
  SEQ ID NO.106   ACGTTGGATGGGCATTTTHCGCACCTTDTT   HPV 73E反向引物
  SEQ ID NO.107   ACGTTGGATGCACCGTCABGTACTTTDGAG   HPV 73L正向引物
  SEQ ID NO.108   ACGTTGGATGTTAGGAGGBTGAGGACDTTG   HPV 73L反向引物
  SEQ ID NO.109   ACGTTGGATGGGCAACCDCTTGCACVAATA   HPV 81/CP8304 E正向引物
  SEQ ID NO.110   ACGTTGGATGAGGCCTGBCACAAGATVCTC   HPV 81/CP8304 E反向引物
  SEQ ID NO.111   ACGTTGGATGTTTGGGCGTHGGTACTAVTG   HPV 81/CP8304 L正向引物
  SEQ ID NO.112   ACGTTGGATGACTGGCAGHAGCCAAATVAG   HPV 81/CP8304 L反向引物
  SEQ ID NO.113   ACGTTGGATGCGAGCAATTTRACAGCTMAG   HPV 82E正向引物
  SEQ ID NO.114   ACGTTGGATGTAACACGTATYCTGTCCAKC   HPV 82E反向引物
  SEQ ID NO.115   ACGTTGGATGCCCAACAAATTTRGTCTTMC   HPV 82L正向引物
  SEQ ID NO.116   ACGTTGGATGCCACTAAGRCCAACACSTAA   HPV 82L反向引物
  SEQ ID NO.117   ACGTTGGATGGAGGAAGAHGCTAGGGATIG   HPV 89E正向引物
  SEQ ID NO.118   ACGTTGGATGGTAGTTAHCACCCTAAAVGC   HPV 89E反向引物
  SEQ ID NO.119   ACGTTGGATGCAACCTTDCCATTTGHGCTG   HPV 89/CP6108L正向引物
  SEQ ID NO.120   ACGTTGGATGGTCATATTBCTCAGTGTDTC   HPV 89/CP6108L反向引物
  SEQ ID NO.181   ACGTTGGATGTGTAGCAAGTAGCTAGACTG   β球蛋白正向引物
  SEQ ID NO.182   ACGTTGGATGCTAAAATTCCCCAAGTGAGAC   β球蛋白反向引物
  SEQ ID NO.184   ACGTTGGATGGTTCGTGACGAATACCCATC   In_SD正向引物
  SEQ ID NO.185   ACGTTGGATGCCTTGTACTCAACCCTTTCC   In_SD反向引物
表2.
  序列编号   基因型别   碱基延伸探针序列   延伸碱基
  SEQ ID NO.121   HPV 6E   gggttagtAACCGTGCCTTGGTT   A
  SEQ ID NO.122   HPV 6L   accctATGTCCACTTAC   A
  SEQ ID NO.123   HPV 11E   ACACAACCTTTAGGTTCTT   A
  SEQ ID NO.124   HPV 11L   caccgGTTTGACCCCACTA   C
  SEQ ID NO.125   HPV 16E   AGGACCCACAGGAG   C
  SEQ ID NO.126   HPV 16L   tgtgatcCTACACGCAGTACAAATA   T
  SEQ ID NO.127   HPV 18E   gtaTGTGTATATTGCAAGAC   A
  SEQ ID NO.128   HPV 18L   gattTTATATATTAAAGGCACAG   G
  SEQ ID NO.129   HPV 26E   GAGATAGGAGTCCGTATG   C
  SEQ ID NO.130   HPV 26L   ccccactcAGCATCTGCATCCA   C
  SEQ ID NO.131   HPV 31E   ttgGGTGGACAGGAC   G
  SEQ ID NO.132   HPV 31L   AATAGTTGTACCAAAGGTGTC   A
  SEQ ID NO.133   HPV 33E   accgtCGCACTGTAGTTCAAT   G
  SEQ ID NO.134   HPV 33L   ggggAGGTGTTGCTTGTACTAAT   G
  SEQ ID NO.135   HPV 35E   ggctatGAGGTATATGACTTTGCAT   G
  SEQ ID NO.136   HPV 35L   CTTGTAATGCTAACCAGG   T
  SEQ ID NO.137   HPV 39E   ccctcgtctTTGCTGTAGTGGTC   G
  SEQ ID NO.138   HPV 39L   actAGTCTTCCATACCTTCT   A
  SEQ ID NO.139   HPV 40E   aacgcAATACAGAAACTTTAGAT   A
  SEQ ID NO.140   HPV 40L   gaACTTGGTGTGGAGTAATAAATA   C
  SEQ ID NO.141   HPV 42E   acCAGCCCAAATTCCTT   A
  SEQ ID NO.142   HPV 42L   tggAGGAGTGGAATGT   T
  SEQ ID NO.143   HPV 43E   tgtaACGCTATGTATTTTAAAGAAT   T
  SEQ ID NO.144   HPV 43L   CGTTATTATGCATAATTGAAATATAAA   C
  SEQ ID NO.145   HPV 44E   agaccttGCCTAAATTGATTG   A
  SEQ ID NO.146   HPV 44L   aGTAGAGGACAGCCCTT   A
  SEQ ID NO.147   HPV 45E   TCACTACAAGACGTATCTATT   G
  SEQ ID NO.148   HPV 45L   cTCAATAATGGTGTTTTTAAGTT   C
  SEQ ID NO.149   HPV 51E   gttCGTTGTCGTGTAC   G
  SEQ ID NO.150   HPV 51L   ttcccgACCCTGTATTGAAATGCAGA   T
  SEQ ID NO.151   HPV 52E   ctCGCCATATGGATTATTGT   C
  SEQ ID NO.152   HPV 52L   gACACCAGTAGTGGTAAT   G
  SEQ ID NO.153   HPV 53E   TGCCATGAGCAATTGAA   C
  SEQ ID NO.154   HPV 53L   tccCATACAAGCCGC   T
  SEQ ID NO.155   HPV 54E   cccccgtttACACCTTAAATGCTT   G
  SEQ ID NO.156   HPV 54L   gcggtaaacTGTGTCTCAGGATTATA   T
  SEQ ID NO.157   HPV 56E   atTCTAAGATCAATTAAAGGTATTTCTA   A
  SEQ ID NO.158   HPV 56L   cacccTGCATTAAAAATTTTCT   A
  SEQ ID NO.159   HPV 58E   gaagCGAATTGAAATGCGTTG   A
  SEQ ID NO.160   HPV 58L   taactATGCACTACTTTGGA   T
  SEQ ID NO.161   HPV 59E   cttTCTATAATATCTTAATTCTCTTACT   C
  SEQ ID NO.162   HPV 59L   cccctggcCTCAGCTGTGTATTAT   T
  SEQ ID NO.163   HPV 61E   ccctggCCTGTATACTTAACGGTTT   G
  SEQ ID NO.164   HPV 61L   GCCTGATGGCACCTT   G
  SEQ ID NO.165   HPV 66E   gaagtgATATAGGTTTGCATGTATT   G
  SEQ ID NO.166   HPV 66L   gtcTCCTTATTACTCTGTTTCTAAA   T
  SEQ ID NO.167   HPV 68E   ccctgtctGTTCATCTATTTCATC   G
  SEQ ID NO.168   HPV 68L   tagccTCTACTACTACTGAA   T
  SEQ ID NO.169   HPV 70E   ccccgtgCAGTCTATTGTAATGT   C
  SEQ ID NO.170   HPV 70L   ACAATGTGTCTGTGGA   C
  SEQ ID NO.171   HPV 72E   tCCTCACTTTAGTTGCTCTT   G
  SEQ ID NO.172   HPV 72L   gaccatttgcCACTGAGGAATTTG   A
  SEQ ID NO.173   HPV 73E   gggtagTGTTAGTTAAATTTTCTAACG   T
  SEQ ID NO.174   HPV 73L   ggTGAGGACGTTGGCAACTAATA   G
  SEQ ID NO.175   HPV 81/CP8304E   agcGGTATGTTAACGGTTTAT   A
  SEQ ID NO.176   HPV 81/CP8304L   acccTAGGTACTAGTGGTC   A
  SEQ ID NO.177   HPV 82E   acgcATGCGTGACC   A
  SEQ ID NO.178   HPV 82L   ccctacTCCTAATTTGTTTAATCCAG   A
  SEQ ID NO.179   HPV 89E   gggttgttCTGTGCTCGTTCTGCCA   G
  SEQ ID NO.180   HPV 89/CP6108L   ccgTTGTGCTGCTTCCC   A
  SEQ ID NO.183   β球蛋白   tctccAGTGAGACATTTTAGCAA   T
  SEQ ID NO.186   In_SD_Arab   ACCCTTTCCTTTTTGTTTAC   G
与现有检测HPV的其它技术和同类技术相比，本发明技术方案充分发挥了PCR-质谱联用检测病毒基因型的优势，对大于20重以上PCR反应产物，作一次性质谱检测，不需要荧光染料标记、不需要洗涤、反应在微量体系中进行，使试剂耗材成本与检测PCR重数成反比，从而实现以E/L双基因探针检测30种致病HPV类型的目标。首轮PCR扩增区域为60-120bp的基因型特异性片段，第二轮PCR采用特异性探针末端单点法扩增，可以允许使用更多循环，最大限度地提高了检测灵敏度和特异性，使检测灵敏度达到1aM级单个拷贝水平，避免了检测漏诊造成的假阴性问题。同时采用UNG酶技术和基因型特异性片段扩增设计技术，彻底排除了PCR产物污染和同源序列探针错配引起的假阳性问题。为多种肿瘤病因学研究和HPV疫苗的研制和应用提供了可靠的临床实验依据。
另外，本设计特有的CP6108型和81/CP8304型，在本方法的验证中发现，它们在许多肿瘤组织和血液中的阳性率极高，具有极高的潜在研究价值，而目前的商业化检测方法中均未包括这些类型。
附图说明
图1、62Plex HPV基因型碱基延伸探针质谱峰图(1-3)
图2、表示HPV6分析结果图；
图3、表示HPV11分析结果图；
图4、表示HPV16分析结果图；
图5、表示HPV18分析结果图；
图6、表示HPV26分析结果图；
图7、表示HPV31分析结果图；
图8、表示HPV33分析结果图；
图9、表示HPV35分析结果图；
图10、表示HPV39分析结果图；
图11、表示HPV40分析结果图；
图12、表示HPV42分析结果图；
图13、表示HPV43分析结果图；
图14、表示HPV44分析结果图；
图15、表示HPV45分析结果图；
图16、表示HPV51分析结果图；
图17、表示HPV52分析结果图；
图18、表示HPV53分析结果图；
图19、表示HPV54分析结果图；
图20、表示HPV56分析结果图；
图21、表示HPV58分析结果图；
图22、表示HPV59分析结果图；
图23、表示HPV61分析结果图；
图24、表示HPV66分析结果图；
图25、表示HPV68分析结果图；
图26、表示HPV70分析结果图；
图27、表示HPV72分析结果图；
图28、表示HPV73分析结果图；
图29、表示HPV81(CP8304)分析结果图；
图30、表示HPV82(W13B/MM4亚型和IS39亚型)分析结果图；
图31、表示HPV89或CP6108分析结果图；
具体实施方式
本发明包括同时检测30种已知致病HPV类型中的一种或多种，每种基因型同时采用包括但不限于针对两个或两个以上基因作检测。此处所描述的具体实施方式仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施方式提供的高精确度检测和/或鉴定人类乳头状瘤病毒基因型的方法，待检测HPV基因型包括HPV类型6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、70、72、73、81/CP8304、82、CP6108和/或89型中的一种或几种。每种基因型同时采用包括但不限于两个或两个以上基因检测。包括如下步骤：
(1)根据待测HPV基因型全序列，获取E6和E7基因区，以及L1和L2基因区，选择每个型别的特异性保守序列，设计一对PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基(ACGTTGGATG)任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开。各种HPV基因型的扩增引物序列见表1。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少16Da。各种HPV扩增引物序列见表1，其对应的碱基延伸探针见表2。
(2)通过PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物。
PCR反应体系配制见表3.
表3
  试剂   最终浓度   体积(1×)
  Water，HPLC grade   N/A   0.3μL
  10X Buffer w/20mM MgCl2   2mM MgCl2   0.5μL
  25mM MgCl2   2mM   0.4μL
  25mM dUTP/dNTP Mix   500mM   0.1μL
  UNG Enzyme(1U/ul)   0.5U   0.5μL
  0.5mM Primer mix   0.1mM   1.0μL
  5U/ml PCR enzymea   1Unit   0.2μL
  Template DNA(5-20ng/μL)   2.0μL
  Total   5.0μL
先用37℃-50℃ 2分钟，进行dUTP的消化，然后94℃ 4分钟灭活，(同时这一步也达到预变性的效果)，随后作PCR扩增。反应条件为95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共45个循环；最终72℃延伸5分钟，完成后恒温于4℃。
(3)通过虾碱性磷酸酶(SAP)处理，使未结合的剩余核酸(dNTPs)脱磷酸失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。SAP消化酶反应体系见表4。
表4
  试剂   体积/反应
  Water，HPLC grade   1.53μL
  10×SAP buffer   0.17μL
  SAP enzyme(1.7U/ml)   0.3μL
  Total   2.0μL
反应条件为37℃孵育40分钟，去除剩余dNTPs；然后用85℃5分钟使SAP酶失活。
(4)通过碱基延伸反应，在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16Da，延伸反应体系见表5。
表5
  试剂   体积/反应
  Water，HPLC grade   0.619μL
  10×iPLEX buffer plus   0.2μL
  iPLEX terminator mix   0.2μL
  Primer mix*   0.94μL
  iPLEX enzyme   0.041μL
  Total   2.0μL
*延伸反应探针mix的浓度，按照各型分子量大小进行线性关系调节，总浓度约为8-15M，最终浓度约为0.84-1.57M。
循环反应为200个短阶梯程序，包含两个循环嵌合，开始为94℃变性30秒，随后在94℃ 5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共40个循环中，每个插入退火和延伸5个小循环；最终72℃延伸3分钟。
(5)采用树脂脱盐纯化延伸反应产物。
(6)将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测HPV基因型别。图1-31中，横坐标为分子量，纵坐标为峰强度。图中纵行虚线同色为该基因型延伸探针的分子量位置，如果不存在该型别探针峰不变；如果被检出型别拷贝数大于10，探针可被完全消耗，左侧峰消失转至右侧；右侧的同色虚线表示延伸产物分子量位置。用TYPE4.0软件阅读谱图，自动分析和报告结果，导出数据。数据解释为，每一型HPV和内参HBB的延伸探针在质谱图不同的质量处有相应分子量峰，在探针发现目标基因工作时出现单碱基延伸产物，探针分子量峰发生转移为产物分子量峰，分析结果报告为阳性。阳性结果分为四种：A、结果可靠；B、中度可靠；C、一般可靠；D、低度可靠。前三种视为延伸反应有效，有相应HPV感染，第四种需要人工辅助判断，观察探针是否消耗，判断为可疑感染或阴性结果。对可疑感染样品，在必要时可作重复性验证试验。
Figure IDA0000119765280000021
Figure IDA0000119765280000031
Figure IDA0000119765280000041
Figure IDA0000119765280000051
Figure IDA0000119765280000061
Figure IDA0000119765280000071
Figure IDA0000119765280000081
Figure IDA0000119765280000091
Figure IDA0000119765280000101
Figure IDA0000119765280000111
Figure IDA0000119765280000121
Figure IDA0000119765280000131
Figure IDA0000119765280000141
Figure IDA0000119765280000151
Figure IDA0000119765280000171
Figure IDA0000119765280000181
Figure IDA0000119765280000191
Figure IDA0000119765280000201
Figure IDA0000119765280000211
Figure IDA0000119765280000231
Figure IDA0000119765280000241
Figure IDA0000119765280000251
Figure IDA0000119765280000261
Figure IDA0000119765280000271
Figure IDA0000119765280000281
Figure IDA0000119765280000291
Figure IDA0000119765280000301
Figure IDA0000119765280000311
Figure IDA0000119765280000321
Figure IDA0000119765280000331
Figure IDA0000119765280000341
Figure IDA0000119765280000351
Figure IDA0000119765280000361
Figure IDA0000119765280000381
Figure IDA0000119765280000401
Figure IDA0000119765280000411
Figure IDA0000119765280000421
Figure IDA0000119765280000441
Figure IDA0000119765280000461
Figure IDA0000119765280000471
Figure IDA0000119765280000481
Figure IDA0000119765280000491
Figure IDA0000119765280000521
Figure IDA0000119765280000531

Claims (1)

1.一种检测生物样品中病原体DNA的试剂盒，所述试剂盒中包含合成的多核苷酸试剂，所述多核苷酸为HPV基因型的双基因E6和L1基因的正向和反向引物序列SEQ ID NO.1 -SEQ ID NO.120；碱基延伸探针SEQID NO.121- SEQ ID NO.180；引物序列为SEQ ID NO.181和SEQ ID NO.182，探针序列SEQ ID NO.183；引物序列SEQ ID NO.184和SEQ ID NO.185，探针序列SEQ ID NO.186。
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