CN101967525B

CN101967525B - 博尔纳病病毒p24片段实时荧光定量PCR检测试剂盒

Info

Publication number: CN101967525B
Application number: CN2010105492413A
Authority: CN
Inventors: 谢鹏; 金戈; 张亮; 徐晓艳
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2010-11-18
Filing date: 2010-11-18
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2030-11-18
Also published as: CN101967525A

Abstract

本发明提供了一种使用简单方便，灵敏度和特异性高的荧光定量PCR试剂盒，能够优化提高PCR的扩增效率，降低PCR污染发生率，准确、快速检测标本中的BDV核酸。本发明提供的博尔纳病病毒p24片段实时荧光定量PCR检测试剂盒包括：10×逆转录反应液、AMV逆转录酶、2×荧光定量PCR反应液、Taq聚合酶、标准品、阴性对照。其中荧光定量PCR反应液为经过优化的反应液。能够缩短反应时间和降低PCR污染可能性，还能显著提高定量的准确性和扩增效率。

Description

博尔纳病病毒p24片段实时荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，为一种通过逆转录mRNA样品获得cDNA，结合实时荧光定量PCR技术来检测定量样品中的博尔纳病病毒核酸，具体涉及一种博尔纳病病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

博尔纳病病毒（Borna disease virus，BDV）是一种嗜神经性的单股负链RNA病毒，BDV作为致病因子造成的疾病称为博尔纳病（Borna disease，BD），是一种人畜共患病。近年来，采用间接免疫荧光（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印记（IB）、RT-PCR等方法在精神疾病患者外周血和脑组织中频繁检测出BDV的抗原、抗体和核酸，提示BDV的慢性感染可能与人类精神疾病有关。然而，不同检测方法对检测结果有着较大差异，研究表明使用IFA检测BDV方便迅速敏感，但特异性较差；IB特异性较IFA高但敏感性有所降低；检测特异性抗体ELISA敏感性不高，并且血清学试验阳性并不一定代表受检者正存在BDV感染，BDV抗体阳性不能肯定是存在感染还是曾存在感染；免疫组化的敏感性取决于被检组织和细胞中BDV蛋白的数量以及所使用的BDV抗体与抗原的结合力，特异性则取决于抗体与非BDV蛋白的交叉反应情况；原位杂交的特异性和敏感性均较高，但当BDV RNA浓度过低或细胞中的BDV RNA已经降解时可能会出现假阴性；病毒分离是诊断BDV的金标准，但是普遍用于检验筛选比较困难。综上所述，开发一种简便、灵敏、高效的诊断方法非常重要。

实时荧光定量PCR（Real-Time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction）可用于检测BDV病毒核酸，除了具有常规PCR的高灵敏性外，定量和扩增同步进行，特异性和可靠性更强，并且封闭不易污染，而且方便快捷，普通实验室均可开展检测。我们之前曾开发出BDV套式荧光定量RT-PCR试剂盒（徐平,谢鹏,邹德智，等.博尔纳病病毒荧光定量套式RT-PCR检测方法的建立[J].重庆医科大学学报, 2003, 28(6): 688-691），虽然套式荧光定量PCR特异性较高，但步骤多工作量大，且中间步骤需要处理PCR产物，在检测大量标本时容易出现PCR产物污染造成假阳性，我们在开发新的BDV荧光定量PCR试剂盒时重新设计了引物，并优化了荧光定量PCR反应缓冲液、退火温度、引物探针浓度、dNTPs浓度、镁离子浓度，开发了逆转录后荧光定量一步法检测试剂盒，无需处理第二步PCR产物，减少PCR产物污染的可能性。在该试剂盒与套式荧光定量RTP-CR试剂盒标准曲线比较中，前者相关系数（R²）为0.99989，后者R²为0. 998，故在Ct值和起始模板浓度的线性关系上，前者的定量要更可靠。而开发的新试剂盒扩增效率达到了92.763%，后者扩增效率为88.717%。可见新开发的试剂盒能进一步提高定量的准确性和扩增效率。

发明内容

本发明的目的是开发出一种简单方便，灵敏度和特异性高的荧光定量PCR试剂盒，能够优化提高PCR的扩增效率，降低PCR污染发生率，准确、快速检测标本中的BDV核酸。

为实现上述发明目的，本发明提供的博尔纳病病毒p24片段实时荧光定量PCR检测试剂盒包括：10×逆转录反应液、AMV逆转录酶、2×荧光定量PCR反应液、Taq聚合酶、标准品、阴性对照。

其中上述10×逆转录反应液包括：逆转录缓冲液；Oligo(dT)₁₅引物；dNTPs；氯化镁；DEPC-H₂O。

其中上述2×荧光定量PCR反应液配方为：20mmol/L Tris-H₂SO₄（PH值8.3）；100 mmol/L KCL；6 mmol/L MgCL₂；12 mmol/L (NH₄)₂SO₄；1.6mol/L甜菜碱；0.3%Triton X-100；16 mmol/L TMAC；0.2 mmol/L dNTPs；上下游引物和荧光探针各1 μmol/L。

其中上述标准品为将p24片段插入pET41a载体所构建的重组质粒（1×10⁸拷贝/μl），标准品序列见SEQ ID NO1（不包括载体序列）。

其中上述阴性对照由不加入任何模板的荧光定量PCR反应液和Taq酶组成。

其中上述上下游引物序列为：

上游引物序列为SEQ ID NO2；

下游引物序列为SEQ ID NO3；

所扩增的特异性序列（p24片段303bp～501bp，总长199bp）为SEQ ID NO4。

其中上述荧光探针的序列为SEQ ID NO5。

本试剂盒的使用方法：每次检测均需加入标准品建立标准曲线，同时设置阴性对照。标准品使用灭菌去离子水按10倍依次稀释至1×10³～10⁸拷贝/μl。

1、逆转录反应：

10×逆转录缓冲液 2μl

AMV逆转录酶 1μl

RNA样品 5μl

DEPC-H₂O 12μl

总反应体积 20μl

反应条件为：42℃ 15min，95℃ 5min。

2、荧光定量PCR反应：

2×荧光定量PCR反应液 10μl

Taq酶 0.5μl

标准品/cDNA/阴性对照 1μl/5μl/0μl

去离子水 8.5μl/4.5μl/9.5μl

总反应体积 20μl

反应条件为：93℃ 3min，93℃ 45min、55℃ 60min，后两步反应40个循环，设置在55℃退火和延伸时收集荧光信号。

本发明建立了使用Taqman探针荧光定量PCR来检测BDV核酸的方法，Taqman探针的使用可以明显提高荧光定量PCR的特异性和准确性，使得检测的结果更为可靠。同时在逆转录反应后，使用一步法荧光定量PCR来检测cDNA，较之套式PCR缩短了反应时间，无需处理第二步的PCR产物，降低了PCR产物污染导致假阳性的风险。Taqman探针原理为：该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，标记在5’端者为荧光报告基团（Report dyes，R），标记在3’端者为荧光淬灭基团（Quencher dyes，Q），当探针保持完整时，3’端荧光淬灭基团抑制或吸收5’端荧光报告基团发出的荧光。探针自身的3’端羟基已经被去除或封闭，不具有延伸的能力，探针在无特异性PCR扩增时，荧光信号无变化。当发生特异性扩增，复性期探针与模板DNA杂交，延伸期Taq酶从5’→3’方向延伸，当移动到探针与模板结合位置时发挥5’→3’外切酶活性，将探针切断，5’端荧光报告基团被切下释放于反应体系中，从而荧光淬灭基团对报告基团的抑制作用被解除，通过荧光定量PCR仪可以检测到荧光。于是模板每复制一次，就会有相同数量的探针被切断释放出荧光，可见荧光值和PCR产物的量是一对一关系，因此相对于常规PCR后对PCR产物进行电泳更为精确，特异性也更高。当荧光信号增强到某一阈值，此时的循环数被称为Ct值，根据标准品的Ct值和拷贝数的相关性可以建立标准曲线，由此可以根据样本已知的Ct值来计算未知的DNA起始拷贝数。

在开发试剂盒过程中，优化了荧光定量PCR缓冲液（含有20mmol/L Tris-H₂SO₄，PH值8.3；100 mmol/L KCL；6 mmol/L MgCL₂；12 mmol/L (NH₄)₂SO₄；1.6mol/L甜菜碱；0.3%Triton X-100；16 mmol/L TMAC），构成PCR缓冲液的这些成分价格不高，可以降低试剂盒的成本。此外还优化了退火温度（最佳为55℃）、引物探针浓度（最佳为0.5μmol/L）、dNTPs浓度（最佳为0.1mmol/L）和镁离子浓度(最佳为3mmol/L)，通过对反应体系的优化减少PCR过程中的非特异性扩增和提高扩增效率，结果可见荧光定量PCR标准曲线及扩增曲线均良好，在该试剂盒与以前套式荧光定量RTP-CR试剂盒标准曲线的比较中，前者相关系数（R²）为0.99989，后者R²为0. 998，故在Ct值和起始模板浓度的线性关系上，前者由于R²更接近1，所以定量要更可靠。而开发的新试剂盒扩增效率达到了92.763%，后者扩增效率为88.717%，可见新开发的试剂盒不仅缩短反应时间和降低PCR污染可能性，而且还能进一步提高定量的准确性和扩增效率。使用该试剂盒可以对动物样本进行大规模筛选，通过流行病调查来了解该病毒在我国的分布及流行特征，为防治将来可能出现大规模的暴发流行提供基础，此外在临床检验中可以进一步分析BDV和人类精神疾病的相关性。

附图说明

图1为退火温度的优化，Marker为DL2000，1～8分别代表退火温度依次为54.8℃、55.5℃、56.6℃、57.9℃、59.4℃、60.7℃、61.7℃和62.3℃。

图2为引物和探针浓度的优化，其中1～10分别代表引物和探针终浓度依次为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μmol/L。

图3为dNTPs浓度的优化，其中1～7分别代表dNTPs终浓度依次为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mmol/L。

图4为镁离子浓度的优化，其中1～4分别代表镁离子终浓度依次为2、3、4、5mmol/L。

图5为使用Takara公司商品化热启动PCR缓冲液对标准品的扩增曲线，该图的横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，其中1～6分别代表标准品质粒拷贝数依次为1×10³～1×10⁸拷贝/μl, 7为阴性对照。

图6为使用Takara公司商品化热启动PCR缓冲液扩增建立的标准曲线，该图的横坐标为模板的起始拷贝数，纵坐标为Ct值。

图7为本发明标准品的扩增曲线，该图的横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，其中1～6分别代表标准品质粒拷贝数依次为1×10³～1×10⁸拷贝/μl, 7为阴性对照。

图8为本发明扩增建立的标准曲线，该图的横坐标为模板的起始拷贝数，纵坐标为Ct值。

图9为本发明标准品扩增后PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，Marker为DL2000，1～6分别代表标准品质粒拷贝数依次为1×10³～1×10⁸拷贝/μl, 7为阴性对照。

图10为使用本发明建立标准曲线来定量BDV所感染的OL细胞中核酸的起始拷贝数，其中1～4分别代表样本1、样本2、样本3和样本4。

具体实施方式

一、试剂盒的制备

1、荧光定量PCR引物和探针的设计，扩增目的片段长度为199bp，均由上海英(Invitrogen)生物技术有限公司合成和标记。

上游引物序列为SEQ ID NO2；

下游引物序列为SEQ ID NO3；

荧光探针序列为为SEQ ID NO5。

2、标准品的制备

标准品为插入p24片段的重组质粒，由本实验室构建。根据质粒浓度可以换算成拷贝数，将质粒稀释至1×10⁸拷贝/μl，-20℃保存，使用前按10倍梯度稀释。

3、退火温度的优化

上下游引物的Tm值分别为57.8℃和57.3℃，根据Tm值将退火温度分贝分别设置为54.8℃、55.5℃、56.6℃、57.9℃、59.4℃、60.7℃、61.7℃和62.3℃，使用普通PCR扩增，选出效果最好的退火温度，结果见图1，可见55℃左右为最佳退火温度。

4、引物和探针浓度的优化

在其他条件不变的情况下，将引物和探针的终浓度分别设置为0.1、0.2、0.3、0.4…0.9、1.0μmol/L这10个梯度，使用荧光定量PCR进行扩增，从扩增曲线质量上选取最佳的引物和探针浓度。结果见图2，可见引物探针在终浓度为0.5μmol/L时较佳。

5、dNTPs浓度的优化

在其他条件不变的情况下，将dNTPs终浓度分别设置为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mmol/L这7个梯度，使用荧光定量PCR进行扩增，从扩增曲线质量、荧光强度和Ct值上选取最佳的dNTPs终浓度，结果见图3，可见最佳的dNTPs终浓度为0.1mmol/L。

6、镁离子浓度的优化

在其他条件不变的情况下，将镁离子终浓度分别设置为2、3、4、5mmol/L这4个浓度梯度，使用荧光定量PCR进行扩增，从扩增曲线质量、荧光强度和Ct值上选取最佳的镁离子终浓度，结果见图4，可见各个镁离子终浓度差别不大，以终浓度为3mmol/L时较佳。

7、荧光定量PCR缓冲液的优化

首先确定缓冲液适合扩增目的片段的滴定酸，分别使用盐酸、磷酸和硫酸在室温下滴定缓冲液，使用这3种缓冲液分别进行常规PCR，结果可见硫酸滴定的缓冲液扩增效果最佳，产量最多。在PCR添加剂的选择上首先选取(NH₄)₂SO₄的最佳浓度，然后依次选择甜菜碱、Triton X-100、TMAC（四甲基氯化铵）、DMSO（二甲基亚砜）的最佳工作浓度，并将后4种添加剂分别进行组合，最终选择甜菜碱、Triton X-100和TMAC进行组合的扩增效果最好。最终优化出的荧光定量PCR缓冲液主要包含以下成分：20mmol/L Tris-H₂SO₄，PH值8.3；100 mmol/L KCL；6 mmol/L MgCL₂；12 mmol/L (NH₄)₂SO₄；1.6 mol/L甜菜碱；0.3%Triton X-100；16 mmol/L TMAC。将优化后的荧光定量PCR缓冲液同Takara公司商品化的热启动PCR缓冲液进行比较，可见不论从扩增曲线上还是标准曲线质量上均要优于后者（图5-6）。

8、荧光定量PCR缓冲液（2×）的配制方法

①称取0.242g Tris（三羟甲基氨基甲烷）溶于90ml双蒸水中，使用硫酸在室温下滴定直至PH达8.3；

②称取0.745g KCL溶于上述液体中；

③称取0.057g MgCL₂溶于上述液体中；

④称取0.159g (NH₄)₂SO₄溶于上述液体中；

⑤称取18.744g 甜菜碱溶于上述液体中；

⑥加入0.3ml Triton X-100分析纯（浓度＞99%）；

⑦称取0.175g TMAC溶于上述液体中，均匀搅拌直至全部溶解，最后使用双蒸水定容至100ml；

⑧使用孔径为0.22μm的滤膜对缓冲液进行过滤除菌。

9、使用博尔纳病病毒p24片段实时荧光定量PCR检测试剂盒建立标准曲线

标准品使用灭菌去离子水按10倍依次稀释至1×10³～10⁸拷贝/μl，在优化后的反应体系及反应条件下进行荧光定量PCR扩增。

荧光定量PCR反应体系：

2×荧光定量PCR反应液 10μl

Taq酶 0.5μl

标准品 1μl

去离子水 8.5μl

总反应体积 20μl

标准品的扩增曲线见图7；标准曲线见图8；将扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，见图9。从图5～7可见扩增曲线质量良好，PCR产物电泳呈现明显的梯度。阴性对照曲线呈水平状态，电泳无明显条带出现，无明显非特异性扩增，特异性较理想。标准曲线根据软件计算出斜率为-3.508，R²=0.99989，扩增效率为92.763%，表明标准曲线的线性关系良好，定量可信度高，扩增效率也很理想。

二、实施例

使用博尔纳病病毒p24片段实时荧光定量PCR检测试剂盒检测样本中的BDV核酸

1、仪器和试剂

荧光定量PCR仪为澳大利亚Corbett Research公司生产的Rotor-Gene 6000，常规PCR仪购自美国BIO-RAD公司，Trizol试剂盒购自Takara公司，BDV感染的OL细胞由德国柏林自由大学Hanns Ludwig教授惠赠。

2、样本总RNA的提取

取4份BDV感染的OL细胞，分别标记为样本1～4，使用Trizol试剂盒提取总RNA，步骤按试剂盒说明书进行操作，提取完毕后可进行琼脂糖凝胶电泳验证RNA提取质量。

3、逆转录反应，反应体系如下

10×逆转录缓冲液 2μl

AMV逆转录酶 1μl

RNA样品 5μl（1μg左右）

DEPC-H₂O 12μl

总反应体积 20μl

反应条件为：42℃ 15min，95℃ 5min。

4、荧光定量PCR扩增建立标准曲线，标准品为1×10²～10⁸拷贝/μl，反应体系如下

2×荧光定量PCR反应液 10μl

Taq酶 0.5μl

标准品/cDNA 1μl/5μl

去离子水 8.5μl/4.5μl

总反应体积 20μl

标准曲线见图10，根据Ct值使用软件计算出这4个样本BDV mRNA的起始拷贝数，结果见下表：

样本号	病毒核酸起始拷贝数
		1	2.90×10³
2	3.89×10³
		3	8.06×10³
4	3.07×10⁵

<110> 重庆医科大学

<120> 博尔纳病病毒p24片段实时荧光定量PCR检测试剂盒

<160> 5

<210> 1

<211> 606

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO1)

<400> 1

ATGGCAACGC GACCATCGAG TCTGGTCGAC TCCCTGGAGG ACGAAGAAGA TCCCCAGACA 60

CTACGACGGG AACGACCGGG GTCACCAAGA CCACGGAAGG TCCCAAGGAA TGCATTGACC 120

CAACCAGTAG ACCAGCTCCT GAAGGACCTC AGGAAGAACC CCTCCATGAT CTCAGACCCA 180

GACCAGCGAA CCGGAAGGGA GCAGCTGTCG AATGATGAGC TAATCAAGAA GTTAGTGACG 240

GAGCTGGCCG AGAATAGCAT GATCGAGGCT GAGGAGGTGC GGGGCACTCT TGGAGACATC 300

TCGGCTCGTA TCGAGGCAGG GTTTGAGTCC CTGTCCGCCC TCCAAGTGGA AACCATCCAG 360

ACAGCTCAGC GGTGCGATCA CTCCGACAGC ATCAGGATCC TCGGCGAGAA CATCAAGATA 420

CTAGATCGCT CCATGAAGAC AATGATGGAG ACAATGAAGC TCATGATGGA GAAGGTGGAT 480

CTCCTCTACG CATCAACCGC CGTTGGGACC TCTGCACCCA TGTTGCCCTC CCATCCTGCA 540

CCTCCGCGCA TTTATCCCCA GCTCCCAAGT GCCCCGACAA CGGATGAATG GGACATCATA 600

CCATAA 606

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO2)

<400> 2

5'-GGCTCGTATCGAGGCAGGGT-3' 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO3)

<400> 3

5'-GGCGGTTGATGCGTAGAGGA-3’ 20

<210> 4

<211> 199

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO4)

<400> 4

GGCTCGTATC GAGGCAGGGT TTGAGTCCCT GTCCGCCCTC CAAGTGGAAA CCATCCAGAC 60

AGCTCAGCGG TGCGATCACT CCGACAGCAT CAGGATCCTC GGCGAGAACA TCAAGATACT 120

AGATCGCTCC ATGAAGACAA TGATGGAGAC AATGAAGCTC ATGATGGAGA AGGTGGATCT 180

CCTCTACGCA TCAACCGCC 199

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(SEQ ID NO5)

<400> 5

5'-(FAM)TCAGCGGTGCGACCACTCCGATAGC(TAMRA)-3' 25

Claims

1.博尔纳病病毒p24片段实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征是该试剂盒包括：

（1）10×逆转录反应液；

（2）AMV逆转录酶；

（3）2×荧光定量PCR反应液；

（4）Taq聚合酶；

（5）标准品；

（6）阴性对照；

其中，2×荧光定量PCR反应液包括：荧光定量PCR缓冲液，0.2 mmol/L dNTPs；上、下游引物和荧光探针各1 μmol/L；所述荧光定量PCR缓冲液的组成为：20mmol/L Tris-H₂SO₄，PH值8.3；100 mmol/L KCL；6 mmol/L MgCL₂；12 mmol/L (NH₄)₂SO₄；1.6mol/L甜菜碱；0.3%Triton X-100；16 mmol/L TMAC；

10×逆转录反应液包括：逆转录缓冲液；Oligo(dT)₁₅引物；dNTPs；氯化镁；DEPC-H₂O；

标准品为将p24片段插入pET41a载体所构建的重组质粒，其中，不包括载体序列的标准品的序列为SEQ ID NO1；

阴性对照由不加入任何模板的荧光定量PCR反应液和Taq酶组成；

上游引物的DNA序列为SEQ ID NO2；

下游引物的DNA序列为SEQ ID NO3；

所扩增的特异性p24片段的DNA序列为SEQ ID NO4；

荧光探针的序列为SEQ ID NO5。