CN112226541A - 一种用于检测草莓镶脉病毒的专用引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测草莓镶脉病毒的专用引物、试剂盒及检测方法，所述专用引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列选自如下序列中的一种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3；所述反向引物的核苷酸序列选自如下序列中的一种：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7。本发明利用草莓镶脉病毒专用引物与探针，并通过重组酶聚合酶扩增(RPA)方法，优化恒温扩增条件，在探索病毒核酸DNA现场快提的基础上，实现草莓镶脉病毒简单、快速、高灵敏检测。并将检测所需试剂和器材组装成易于携带和可供现场使用的试剂盒。适用于草莓种苗繁育、脱毒培养、田间调查时的快速检测和生产应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测草莓镶脉病毒的专用引物、试剂盒及检测方法，属于草莓镶脉病毒检测技术领域。
背景技术
草莓(Fragaria×ananassa)为蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)宿根性多年生草本植物。草莓病毒病在世界各地分布广泛，削弱植株生长势，降低产量和品质，危害草莓生产。目前已报道的可浸染草莓的病毒有20多种，其中草莓镶脉病毒(Strawberry veinbanding virus,SVBV)是危害草莓较为严重的一种潜隐性病毒，也是危害草莓生产的4种主要病毒之一。
由于草莓种苗通过匍匐茎营养繁殖而来，一旦母株带毒，繁殖的后代均带毒。植物病毒病害一旦发生难以控制，造成植株的长势减弱，从而增加了其他病害的浸染几率。若从根本上解决病毒病的危害，需提前对草莓组培苗和种苗圃草莓进行病毒病的检测筛选，后及时清除携带病毒种苗，从而可保证在生产中使用无毒种苗栽培。随着分子生物技术的发展，草莓镶脉病毒(SVBV)分离、PCR检测、实时荧光定量PCR检测、特异性片段克隆、序列分析等方面有一些的研究进展。
重组酶聚合酶恒温扩增(Recombinase polymerase amplification，简称RPA)是一种由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换Bsu聚合酶参与的恒温扩增新技术，可在23-45℃下连续进行反应，反应时间只需5-20min，特异性强，灵敏度高，非常适用于现场检测和疾病控制。RPA技术在核酸特异性扩增和检测领域已经显示出强大的威力，具有取代PCR扩增和检测的趋势，但该技术在草莓领域的应用研究较少。
发明内容
发明目的：针对上述技术问题，本发明的第一个目的是提供一种用于检测草莓镶脉病毒的专用引物，其特异性强，灵敏度高。
本发明第二个目的是提供一种包括上述引物的试剂盒，并且其中还包括探针。
本发明第三个目的是提供一种利用上述引物或试剂盒快速检测草莓镶脉病毒的方法，其操作简单、耗时短、灵敏度高。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于检测草莓镶脉病毒的专用引物，包括正向引物和反向引物；
所述正向引物的核苷酸序列选自如下序列中的一种：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3；
所述反向引物的核苷酸序列选自如下序列中的一种：
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7。
优选正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:4。
优选，所述反向引物序列的5′端用Biotin标记。
一种检测草莓镶脉病毒的试剂盒，包括所述的专用引物。
优选，上述试剂盒还包括具有SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的探针。
进一步的，所述探针序列的5′端用FAM标记，3′端用C3 space标记，从5′端开始计算，第31个碱基‘C’用-THF-替代。
所述的专用引物、所述的试剂盒在检测草莓镶脉病毒中的应用。
一种快速检测草莓镶脉病毒的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测草莓样品的总DNA核酸；
(2)以步骤(1)的总DNA为模板，利用权利要求1所述的专用引物进行重组酶聚合酶恒温扩增；
(3)利用琼脂糖凝胶电泳(AGE)方法或者试纸条夹心检测技术对恒温扩增产物进行检测，确定待测草莓样本是否含有草莓镶脉病毒。
优选，步骤(1)中采用改良NaOH裂解核酸直提法或改良擎科生物2x T5 DirectPCR试剂盒法提取待测草莓样品的基因组核酸DNA。
优选，步骤(2)中所述重组酶聚合酶恒温扩增的反应体系，以总体积为50μL计，包括：10μM的正向引物1.5-2.5μL、10μM的反向引物1.5-2.5μL和5μM具有SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的探针0.4-0.8μL。进一步的，还包括恒温扩增反应再水合缓冲液A液28-32μL、恒温扩增反应启动缓冲液B液2-3μL、模板0.5-1.5μL，水11-13μL。
所述恒温扩增反应再水合缓冲液A液和恒温扩增反应启动缓冲液B液可以选自君诺德生物逆转录-nfo RNA恒温快速扩增试剂盒。
优选，步骤(2)中所述重组酶聚合酶恒温扩增的温度为37-42℃，更优选40℃，反应时间为10-20min，更优选15min。
步骤(3)中的具体方法如下：
琼脂糖凝胶电泳(AGE)方法:对扩增产物用水进行10倍稀释后，取5μL扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，成像后能形成220bp的条带；
试纸条夹心检测技术采用Genline Hybridetect-1试纸条显色法：对扩增产物用水进行10倍稀释后，将5μL稀释样本转移至Hybridetect-1试纸条的样本垫上，将点样后的试纸条竖立于加有100μL电泳缓冲液的1.5mL的离心管中，2-5分钟后出现一条有色检测线便表明存在扩增产物。试纸条上更远处应始终出现一条独立的对照线，这表明试纸条是正常有效的。这是一种便捷的试纸条显色做法。
所述试剂盒可以用于草莓镶脉病毒现场快检，优选的，可以包含有如下的组分：
(1)样本采集管；
(2)30mM NaOH溶液、TE buffer和蒸馏水；
(3)电泳缓冲液；
(4)阳性对照模板，草莓镶脉病毒(SVBV)阳性感染样本核酸；
(5)阴性对照模板，不含草莓镶脉病毒(SVBV)感染样本核酸或者蒸馏水；
(6)清洗管：内装无水乙醇；
(7)漂洗管：内装蒸馏水；
(8)样本核酸提取处理和恒温扩增仪器设备：金属浴；
(9)反应酶微球管：恒温扩增用酶，干粉状态；
(10)检测管：PCR管，内装恒温扩增反应液。扩增反应液组成成分：正向引物，反向引物，探针；
(11)A液：恒温扩增反应再水合缓冲液；
(12)B液：恒温扩增反应启动缓冲液；
(13)一次性可视化封闭式核酸检测横向流动试纸条；
(14)纸质包装盒；
(15)使用说明书。
将上述试剂盒用于草莓脱种苗繁育、脱毒培养、田间调查时草莓镶脉病毒(SVBV)快速检测和生产应用等过程中草莓镶脉病毒(SVBV)检测，具体的检测操作步骤如下：
(1)取待检测样本置于样品采集管中，加入NaOH溶液，混合均匀，水浴加热后，将裂解上清用TE缓冲液稀释10倍后，直接当模板进行检测；
(2)在检测管中依次加入稀释后的DNA模板和A液，然后将检测管中的反应液完全加入到反应酶微球管中，混合均匀；
(3)在上一步的反应酶微球管中加入B液，混合均匀，置于水浴中进行恒温扩增；
(4)将恒温扩增产物用水稀释，吸取点样在封闭式核酸检测横向流动试纸条的样本垫上，将试纸条末端的样本垫放入电泳缓冲液中，2-5分钟后读取结果。
(5)结果读取：出现一条有色检测线表明存在扩增产物。试纸条上更远处应始终出现一条独立的对照线，这表明试纸条是正常有效的。
具体的，在试纸条检测线和质控线位置均出现有色检测线，表明该样品的草莓镶脉病毒(SVBV)检测结果为阳性；在试纸条检测线位置无条带，但在质控线位置出现有色检测线，检测结果为阴性；在试纸条质控线位置无有色检测线出现，表明试纸条失效，检测失败。
在上述试剂盒检测步骤中，模板稀释后，将阳性对照和阴性对照分别置于另外的草莓镶脉病毒(SVBV)检测管内，参照采样一同处理，直至检测完成。
本发明通过筛选草莓镶脉病毒(SVBV)特异专用引物，优化适用于草莓镶脉病毒检测的稳定性DNA核酸提取方法，通过恒温扩增各个技术环节条件优化，结合横向流动试纸条可视化分析结果，建立草莓镶脉病毒(SVBV)的现场、高灵敏度、高效率检测方法及试剂盒。该研究为在理论和方法上进一步为草莓镶脉病毒(SVBV)现场可视化检测提供了一条高效途径。
技术效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：
(1)本发明在分析了草莓镶脉病毒(SVBV)基因组序列保守区、已经发表的SVBV检测引物和大量草莓镶脉病毒(SVBV)携带样本的序列保守区分析基础上，经过反复尝试和条件优化，最终确定了多对扩增引物，尤其是扩增引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4，本文中简称F2和R3(C107和C113)，既保证了检测的特异性，又保证了稳定性。
(2)本发明采用等温扩增方法，不需要核酸变性步骤，通过条件优化，在等温条件下实现病毒特异性核酸片段的大量扩增，灵敏度高，适用于田间现场诊断，检测效果好
(3)本发明系统性优化了草莓镶脉病毒(SVBV)等温扩增的反应时间、反应温度、引物和探针比例等条件，可以实现试纸条最低核酸检出限浓度为300fg，琼脂糖凝胶电泳最低检出限为300pg。
(4)本发明分别在SEQ ID NO:4的5’端进行Biotin标记，SEQ ID NO:8的5’端进行FAM标记，3′端用C3 space标记，同时对SEQ ID NO:8的中间第31个碱基和3’端进行替换和标记。
(5)利用横向流试纸条对扩增产物进行特异性检测，比普通的核酸染料染色法更准确、方便，能有效分辨检测。
(6)本发明所提供的检测方法和试剂盒，检测草莓镶脉病毒(SVBV)时从取样到获得检测结果仅需30分钟，快速、方便，适宜于草莓镶脉病毒(SVBV)的田间现场快速检测。
(7)本发明检测试剂盒配套提供了草莓镶脉病毒(SVBV)检测所需的所有试剂且有序排列，使草莓镶脉病毒(SVBV)的检测能方便、快速地有序进行，能在田间现场使用且检测结果可靠。
综上，本发明提供的草莓镶脉病毒(SVBV)的检测方法和试剂盒操作简单、耗时短、灵敏度高，适用于草莓种苗繁育、脱毒培养、田间调查时的草莓镶脉病毒(SVBV)快速检测和监控，具有很高的实用价值和应用前景。
附图说明
图1高扩增效率草莓镶脉病毒(SVBV)特异性引物筛选；
图2上海地区草莓镶脉病毒携带样本病症调查；其中，植株矮化，叶面皱缩黄化(a)；叶片变小，叶面皱缩，不规则黄化成斑(b)；叶片变小，叶面不规则坏死成枯斑图(c)；叶片边缘皱缩有枯褐色(d)；叶片褪绿白化(e)；叶片褪绿黄化(f)；
图3上海地区草莓镶脉病毒携带样本病毒检测分析；其中，-代表阴性对照，+代表阳性对照，1-17代表不同的样品编号；
图4F2/R3引物对恒温扩增反应特异性检测；
图5利用F2/R3引物检测草莓SVBV病毒LF-RPA反应灵敏度；
图6草莓SVBV病毒LF-RPA反应条件优化；
图7草莓SVBV病毒LF-RPA的反应时间优化；
图8草莓样本核酸DNA简易提取方法分析；其中，M1改良NaOH法；M2基于柏雷丁生物试剂盒改良法；M3基于擎科生物试剂盒改良法。
图9基于M1核酸提取法快速检测草莓镶脉病毒携带样本示例；
图10基于M3核酸提取法快速检测草莓镶脉病毒携带样本示例；
图11无设备草莓镶脉病毒nfo-SVBV DNA-RPA检测操作流程；
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1草莓镶脉病毒(SVBV)基因组特异性保守序列分析和高效引物筛选
基于多年对携带草莓镶脉病毒(SVBV)的病样进行检测和收集，测序分析草莓镶脉病毒(SVBV)最新变异情况。结合NCBI数据库中查找草莓镶脉病毒(SVBV)基因组已经发表序列，找出相对特异保守的区域。根据恒温扩增引物要求，利用https://www.genscript.com/tools/pcr-primers-designer/advanced网站，在草莓镶脉病毒(SVBV)基因组特异保守序列上设计恒温扩增引物和探针。
为了筛选草莓镶脉病毒(SVBV)特异性高效恒温扩增引物，依据草莓镶脉病毒(SVBV)基因组序列和目前已经发表的草莓镶脉病毒(SVBV)引物，设计了多对引物并进行普通PCR扩增分析。按照Prime STAR聚合酶扩增体系和反应程序进行普通PCR扩增检测。通过普通PCR扩增结果显示，多对引物均可以从草莓镶脉病毒(SVBV)基因组上扩增出一段特异的序列片段，从多对引物中筛选出M7引物对(F2/R3)扩增条带最亮，效率最高(图1草莓镶脉病毒(SVBV)特异性高效引物筛选)。
实施例2携带镶脉病毒(SVBV)的草莓病样调查与检测分析
通过调查，收集上海各区草莓病毒病疑似样品113份。提取113份样品DNA，利用候选C107/C113高效引物，按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行普通PCR扩增检测。通过普通PCR检测结果显示：在113份收集样品中，检测出6份样品中携带草莓镶脉病毒，检出率为5.3％(图2上海地区草莓镶脉病毒携带样本病毒检测分析)。进一步重点分析草莓镶脉病毒阳性携带样品，发现其主要发病症状特征主要为：植株表现为生长势弱，叶片表现不一，如皱缩、失绿、叶脉褪绿、叶片黄化、白化、大小叶等(图3上海地区草莓镶脉病毒携带样本病症调查分析)。以上检测结果，为本发明后期草镶脉驳病毒快速恒温检测奠定了材料基础。
实施例3草莓镶脉病毒(SVBV)基因组特异保守序列恒温扩增特异高效引物筛选
基于普通PCR筛选的结果，进一步通过恒温扩增进行验证，发现M7引物组合在健康草莓植株不同组织器官均没有检测出草莓镶脉病毒(SVBV)(扩增不出条带)，但是可以在携带草莓镶脉病毒(SVBV)的草莓样本中检测出草莓镶脉病毒(SVBV)(扩增出220bp特异的条带)(图2F2/R3引物对恒温扩增反应特异性检测)。
实施例1所设计恒温引物进行PCR扩增效率筛选，结果发现恒温扩增正向引物(F2：5'-CAACTCTAACAAATTCGTTTTATACTATATTTG-3'和反向引物R3：5'-CTAATATATTCTTCAATATATTTGGGCCATTCTTC-3')，以草莓镶脉病毒(SVBV)携带病样或标准品质粒为模板，进行普通PCR扩增和恒温扩增效率最高，克隆获得草莓镶脉病毒(SVBV)核酸特异性保守序列片段，其核酸序列如SEQ ID NO:9所示。
按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行普通PCR，F2和R3引物在普通PCR中的扩增模板最低检出限线是300pg；按照
nfo恒温扩增体系和反应程序进行恒温扩增，F2和R3引物在恒温扩增中模板最低检出限线是300fg(图5利用F2/R3引物检测草莓镶脉病毒LF-RPA反应灵敏度)。
实施例4草莓镶脉病毒(SVBV)恒温扩增条件优化
为了获得草莓镶脉病毒(SVBV)LF-RPA恒温扩增检测的最佳反应体系，分别对反应参数进行测试，包括引物的浓度、探针的浓度、反应温度、上样量(添加在LF试纸条上RPA扩增产物的体积)。摸索最适合草莓镶脉病毒(SVBV)恒温扩增检测的条件。
由于扩增产物带有反向引物的Biotin标记和探针的FAM荧光标记，所以首先，本发明优化反向引物和探针的浓度，使扩增时引物和探针的效率最大化。利用LF试纸条对6种不同比例、不同浓度的反向引物和探针组合进行测试(如表1)。
| 组合 | 反向引物和探针浓度比例 |
| Group 1 | 10μM&10μM |
| Group 2 | 5μM&10μM |
| Group 3 | 2.5μM&10μM |
| Group 4 | 10μM&5μM |
| Group 5 | 5μM&5μM |
| Group 6 | 2.5μM&5μM |
分析结果发现，第1组，第2组和第4组的引物和探针组合进行恒温扩增，T band处产生明显条带或清晰，说明RPA反应的扩增产物量非常高，而第3组，第5组和第6组T band处呈现较为浅的条带，说明RPA反应的扩增产物量比较低。在考虑反向引物、探针成本和检测效果的因素下，本发明发现，第4组反向引物和探针浓度分别是10μM和5μM时，草莓镶脉病毒(SVBV)LF-RPA恒温扩增效率和引物探针用量组合最佳(图6A草莓SVBV病毒LF-RPA反应条件优化)。
其次，对草莓镶脉病毒(SVBV)检测的RPA恒温扩增产物的最佳上样量进行分析。本发明将恒温扩增产物稀释10倍后进行不同梯度的上样分析，设置了4种不同体积的上样量，分别为1、2、5和10μL。1μL的上样量T band处呈现较为浅的条带颜色，2μL的上样量产生的Tband条带不稳定，可能造成假阴性的结果。10μL上样量产生的T band条带虽然明显，但是Cband条带淡、不稳定。由此可见，以上4组上样量，均能在试纸条上观察到T band条带，而5μL上样量在T band条带清晰同时，C band条带也很稳定(图6B草莓SVBV病毒LF-RPA反应条件优化)，所以选择5μL的扩增产物作为后续研究的最佳用量。
RPA恒温扩增通常温度为37-42℃进行(Lobato and O’sullivan,2017)，然而，田间植物病原物的检测环境复杂多变。为了评价RPA反应温度的实用性，本发明分别测试了25-50℃的反应温度对草莓镶脉病毒(SVBV)LF-RPA恒温扩增的影响。在最低(25℃)的反应温度下有非常不稳定的条带，在最高(50℃)的反应温度下均未能产生扩增产物。在30℃、35℃、40℃和45℃这四个反应温度下，试纸条上均可以看到T band条带(图6C草莓SVBV病毒LF-RPA反应条件优化)，这表明LF-RPA恒温检测方法，针对本发明草莓镶脉病毒(SVBV)特异专用引物，可以在30到45℃这一温度范围内检测出条带来。此外，在40℃时，RPA的扩增效果最好。因此，为了保证LF-RPA恒温检测高效地进行，本发明选择了40℃作为最佳反应温度。
实施例5草莓镶脉病毒(SVBV)LF-RPA恒温扩增反应时间优化
我们对草莓镶脉病毒(SVBV)LF-RPA恒温扩增时间进行了优化分析。整个LF-RPA恒温快速检测反应时间包括RPA扩增时间和LF试纸条孵育时间。我们的实验表明，2-5min LF试纸条孵育时间足以显示清晰的T band，这与之前的文献报道的一致(Poulton&Webster,2018)。为了确定合适草莓镶脉病毒(SVBV)的RPA 扩增反应时间，在40℃反应温度下，分别进行不同时长的RPA扩增，随后添加5μL RPA稀释产物到LF试纸条上，室温下在电泳缓冲液中孵育2-5min后观察显色结果。结果发现，草莓镶脉病毒(SVBV)的RPA扩增反应在5min时Tband处没有条带，说明反应5分钟后没有扩增产物的积累。随着扩增时间延长至10分钟或更长时间，扩增产物不断积累，T band变得更清晰。试验结果表明10-20min的反应时间就足以达到检测草莓镶脉病毒(SVBV)的量(图7草莓镶脉病毒LF-RPA的反应时间优化)。
一般而言，样品中模板DNA的含量越高，达到用于检测的扩增产物的时间就会缩短，而如果样品中模板的DNA含量比较少，理论上延长反应的时间就可以增加产物的积累量。但是如图5所示，当反应时间延长至30min，50min时，条带消失。造成以上结果的原因有可能是，随着反应时间的延长酶的活力逐步减弱，也可能是反应时间越长，影响探针和试纸条上胶体金标记结合的特异性。
由以上分析发现，草莓镶脉病毒(SVBV)LF-RPA恒温扩增的最佳反应时间为10-20min，为了满足田间快速检测的目标，本发明选择15min作为之最佳反应时间进行后续研究。
实施例6草莓样本现场核酸DNA快速提取方法研究
为了实现草莓镶脉病毒(SVBV)田间现场快速检测的目标，本发明探索了M1、M2和M3三种不同方法提取草莓样本中草莓基因组和病毒基因组DNA。M1法是改良NaOH裂解法，用30mM NaOH裂解0.2mg或者2mm大小新鲜草莓叶片，在95℃水浴中裂解10min后，用TE缓冲液稀释10倍后直接当检测模板用；M2法是基于柏雷丁生物公司研发的免提取核酸释放剂进行优化，用50μL核酸释放剂溶液A裂解0.2mg或者2mm大小新鲜草莓叶片，用核酸释放剂溶液B将裂解后的上清稀释5倍后直接当模板进行检测；M3法是基于擎科生物公司的植物核酸直提(T5 Direct PCR kit)进行优化，用50μL Lysis Buffer A裂解0.2mg或者2mm大小新鲜草莓叶片之后，上清液用Dilution Buffer B稀释50倍后直接当模板用。
本发明用过琼脂糖凝胶电泳比较发现，三种简易快速提取草莓样本核酸方法中，只有M3可以通过琼脂糖凝胶电泳的方法检测到核酸DNA(图6草莓样本核酸DNA简易提取方法分析)。此外，本发明将三种核酸快提方法所提核酸分别10倍稀释，稀释1-5个梯度之后，利用草莓内参基因(Act)检测，结果如图所示，M1法在模板稀释10倍时有非常清晰明显的条带，稀释100、1000倍时条带比较模糊，稀释10000倍时检测不到条带(图8草莓样本核酸DNA简易提取方法分析)；M2法在模板稀释10、100、1000和10000倍时均检测不到条带，所以该方法不适合草莓样本中核酸DNA快速抽提；M3法在模板稀释10、100、1000倍时均能通过脂糖凝胶电泳的方法观察到明显的条带，并且随着模板梯度稀释，条带亮度逐步减弱。综上所述，以上三种方法，M1和M3均可以快速提取草莓样本中核酸DNA，并满足恒温检测需求，但是考虑到检测成本问题，本发明推荐用M1方法进行草莓样本核酸DNA提取并用于草莓镶脉病毒(SVBV)田间现场快速检测。
实施例7本发明草莓镶脉病毒现场快速高灵敏检测方法在草莓镶脉病毒侵染样本中检测应用
为了验证本发明草莓镶脉病毒(SVBV)田间现场快速检测方法的效果，本发明进一步利用草莓镶脉病毒(SVBV)侵染样本验证检测方法的灵敏度和可行性。
首先，基于M1核酸直提方法，将模板梯度稀释10、100、1000、10000倍后进行恒温扩增，通过琼脂糖凝胶电泳和试纸条方法观察恒温扩增结果，结果发现M1法提取核酸DNA梯度稀释10、100、1000和1000倍时，通过琼脂糖凝胶电泳在第一个梯度中可以检测到电泳条带，随着模板稀释梯度的增加，电泳条带消失；同时通过试纸条可以在前三个梯度扩增产物的检测区中检测到条带，第三个梯度开始条带比较淡，第四个梯度检测不到条带(图9基于M1核酸提取法快速检测草莓镶脉病毒携带样本示例)。
M3法提取核酸进行10倍梯度稀释，稀释6个梯度后当模板分别进行草莓镶脉病毒(SVBV)恒温扩增检测，通过琼脂糖凝胶电泳检测到逐步消弱的条带，其中第一到第三个梯度可以检查到电泳条带，随着模板稀释梯度的增加，电泳条带越来越不明显，越来越弥散；同时通过试纸条检测，在第5个稀释梯度样品中还可以检测到条带，但是到第6个稀释梯度检测不到条带(图10基于M3核酸提取法快速检测草莓镶脉病毒携带样本示例)。
综上所述，M1核酸提取法和M3核酸提取法均可以满足草莓镶脉病毒(SVBV)恒温扩增现场快速检测的需求，但是考虑到检测成本问题，本发明推荐利用基于M1法提取核酸进行草莓镶脉病毒(SVBV)恒温扩增检测，同时结合试纸条观察检测结果(图11无设备草莓镶脉病毒nfo-SVBV DNA-RPA检测操作流程)。试纸条的检测灵敏度和效率均比琼脂糖凝胶电泳高，操作方面，适合田间快速观察检测结果。
实施例9现场快速检测草莓镶脉病毒(SVBV)的方法示例
一、草莓样本DNA核酸现场快提，选自如下两种方法中的一种：
(1)基于NaOH裂解改良的草莓样本DNA核酸现场快提的方法，包括如下步骤：
1)取10mg或者2mm新鲜叶片，于1.5ml离心管中；
2)加入30mM NaOH 100μL，震荡混匀；
3)置95℃水浴中10min；
4)混合均匀后，上清用TE buffer稀释10倍后，直接当检测模板用。
(2)基于擎科生物2x T5 Direct PCR kit改良的草莓样本DNA核酸现场快提的方法，包括如下步骤：
1)取1-2mm大小的新鲜叶片，置于50μL Lysis Buffer A中，95℃水浴中10min；
2)混合均匀后将上清用Dilution Buffer B稀释50倍，直接当检测模板用。
其中，所述的核酸直提Lysis Buffer A和Dilution Buffer B均来自擎科生物的试剂盒2x T5 Direct PCR。
二、以步骤一的基因组DNA为模板，用上述的专用引物(F2引物和R3引物)进行恒温快速扩增，反应体系包括：A buffer 29.5μL；10μM F2引物和10μM R3引物分别2.1μL，5μM探针(SEQ ID NO:8所示)0.6μL，模板1μL，B buffer 2.5μL，水12.2μL，扩增体系总体积为50μL；反应条件为40℃，15分钟。
其中，A buffer和B buffer分别来自
DNA试剂盒。
三、恒温扩增产物可以采用如下方法中的一种检测：
(1)琼脂糖凝胶电泳(AGE)方法:对扩增产物用水进行10倍稀释后，取5μL扩增产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，成像后能形成220bp的条带；
(2)Genline Hybridetect-1试纸条显色法：对扩增产物用水进行10倍稀释后，将5μL稀释样本转移至Hybridetect-1试纸条的样本垫上，将点样后的试纸条竖立于加有100μL电泳缓冲液的1.5mL的离心管中，2-5分钟后出现一条有色检测线便表明存在扩增产物。试纸条上更远处应始终出现一条独立的对照线，这表明试纸条是正常有效的。
实施例9本发明试剂盒用于草莓脱种苗繁育、脱毒培养、田间调查时草莓镶脉病毒(SVBV)快速检测和生产应用等过程中草莓镶脉病毒(SVBV)检测示例
一、一种草莓镶脉病毒(SVBV)现场快检的剂盒，包含有如下的组分：
(1)样本采集管：采样用1.5ml离心管；
(2)30mM NaOH溶液、TE buffer和蒸馏水；
(3)电泳缓冲液；
(4)阳性对照模板，草莓镶脉病毒(SVBV)阳性感染样本核酸；
(5)阴性对照模板，不含草莓镶脉病毒(SVBV)感染样本核酸或者蒸馏水；
(6)清洗管：内装无水乙醇；
(7)漂洗管：内装蒸馏水；
(8)样本核酸提取处理和恒温扩增仪器设备：金属浴；
(9)反应酶微球管：恒温扩增用酶，干粉状态(君诺德公司)；
(10)检测管：0.2ml PCR管，内装恒温扩增反应液。扩增反应液组成成分：2.1μL F2引物(10μM)，2.1μL R3引物(10μM)，0.6μL P探针(SEQ ID NO:8)(5μM)；
(11)A液：恒温扩增反应再水合缓冲液，由君诺德公司提供；
(12)B液：恒温扩增反应启动buffer，由君诺德公司提供；
(13)一次性可视化封闭式核酸检测横向流动试纸条(由君诺德公司提供)；
(14)纸质包装盒：将上述材料和物品统一装在一个大小适当的长方形纸盒内，适合上表面覆盖有试剂盒名称的不粘胶贴纸，纸盒内具有若干可以放置1.5mL离心管和0.2mLPCR管的孔洞纸质块1个；
(15)使用说明书。
(16)试剂盒储存条件：储存温度≤-20℃，避光保存，避免重压、反复冻融；产品有效期：12个月。
二、现场快速检测方法：
(1)取待检测样本约2mg或者2mm新鲜叶片置于样品采集管中，加入100μL 30mM的NaOH，混合均匀，95℃水浴10分钟后，将裂解上清用TE缓冲液稀释10倍后直接当模板进行检测；
(2)在检测管中加入1μL模板和A液，然后将检测管中的反应液完全加入到反应酶微球管中，混合均匀；
(3)在上一步的反应酶微球管中加入2.5μL B液，混合均匀；
(4)将上一步酶微球管置于40℃水浴15-20分钟，进行恒温扩增；
(5)将恒温扩增产物用水稀释10倍；
(6)将上一步稀释的扩增产物吸取5μL点样在封闭式核酸检测横向流动试纸条的样本垫上。
(7)将试纸条末端的样本垫放入100μL电泳缓冲液中，2-5分钟后读取结果。
(8)结果读取：出现一条有色检测线便表明存在扩增产物。试纸条上更远处应始终出现一条独立的对照线，这表明试纸条是正常有效的，
具体的，在试纸条检测线和质控线位置均出现有色检测线，表明该样品的草莓镶脉病毒(SVBV)检测结果为阳性；在试纸条检测线位置无条带，但在质控线位置出现有色检测线，检测结果为阴性；在试纸条质控线位置无有色检测线出现，表明试纸条失效，检测失败。
在上述试剂盒检测步骤中，从第5步开始将阳性对照和阴性对照分别置于另外的草莓镶脉病毒(SVBV)检测管内，参照采样一同处理，直至检测完成。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种用于检测草莓镶脉病毒的专用引物、试剂盒及检测方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 正向引物/C107(Artificial Sequence)
<400> 1
caactctaac aaattcgttt tatactatat ttg 33
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 正向引物/xhvir0062(Artificial Sequence)
<400> 2
attcgtttta tactatattt gttggaacta actac 35
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 正向引物/xhvir0060(Artificial Sequence)
<400> 3
acaactctaa caaattcgtt ttatactata tttgt 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 反向引物/c113(Artificial Sequence)
<400> 4
ctaatatatt cttcaatata tttgggccat tcttc 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 反向引物/xhvir0061(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtattttcc taatatattc ttcaatatat ttggg 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 反向引物/c108(Artificial Sequence)
<400> 6
taggtaactt cagaagattg gtttcatagt cacag 35
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 反向引物/c110(Artificial Sequence)
<400> 7
caatatattt gggccattct tctataggta act 33
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 探针(Artificial Sequence)
<400> 8
agctgtgcaa gaagctagaa acaggttagt caaattacaa atttgc 46
<210> 9
<211> 220
<212> DNA
<213> 克隆片段(Artificial Sequence)
<400> 9
caactctaac aaattcgttt tatactatat ttgttggaac taactatctt acacagggaa 60
ctcgcgagaa agagaaagct gtgcaagaag ctagaaacag gttagtcaaa ttacaaattt 120
gcaatctatg ttcactagaa agctttttct gtgactatga aaccaatctt ctgaagttac 180
ctatagaaga atggcccaaa tatattgaag aatatattag 220
Claims (9)
1.一种用于检测草莓镶脉病毒的专用引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物；
所述正向引物的核苷酸序列选自如下序列中的一种：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3；
所述反向引物的核苷酸序列选自如下序列中的一种：
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7。
2.根据权利要求1所述的检测草莓镶脉病毒的专用引物，其特征在于，所述反向引物序列的5′端用Biotin标记。
3.一种检测草莓镶脉病毒的试剂盒，包括权利要求1所述的专用引物。
4.根据权利要求3所述的检测草莓镶脉病毒的试剂盒，其特征在于，还包括具有SEQ IDNO:8所示核苷酸序列的探针。
5.根据权利要求4所述的检测草莓镶脉病毒的试剂盒，其特征在于，所述探针序列的5′端用FAM标记，3′端用C3 space标记，从5′端开始计算，第31个碱基‘C’用-THF-替代。
6.权利要求1所述的专用引物、权利要求3所述的试剂盒在检测草莓镶脉病毒中的应用。
7.一种快速检测草莓镶脉病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测草莓样品的总DNA核酸；
(2)以步骤(1)的总DNA为模板，利用权利要求1所述的专用引物进行重组酶聚合酶恒温扩增；
(3)利用琼脂糖凝胶电泳(AGE)方法或者试纸条夹心检测技术对恒温扩增产物进行检测，确定待测草莓样本是否含有草莓镶脉病毒。
8.根据权利要求7所述的快速检测草莓镶脉病毒的方法，其特征在于，步骤(2)中所述重组酶聚合酶恒温扩增的反应体系，以总体积为50μL计，包括：10μM的正向引物1.5-2.5μL、10μM的反向引物1.5-2.5μL和5μM具有SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的探针0.4-0.8μL。
9.根据权利要求7所述的快速检测草莓镶脉病毒的方法，其特征在于，步骤(2)中所述逆转录-重组酶聚合酶恒温扩增的温度为37-42℃，优选40℃，反应时间为10-20min，优选15min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011313325.7A CN112226541A (zh) | 2020-11-20 | 2020-11-20 | 一种用于检测草莓镶脉病毒的专用引物、试剂盒及检测方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011313325.7A CN112226541A (zh) | 2020-11-20 | 2020-11-20 | 一种用于检测草莓镶脉病毒的专用引物、试剂盒及检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112226541A true CN112226541A (zh) | 2021-01-15 |
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|---|---|---|---|
| CN202011313325.7A Pending CN112226541A (zh) | 2020-11-20 | 2020-11-20 | 一种用于检测草莓镶脉病毒的专用引物、试剂盒及检测方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN112226541A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117512220A (zh) * | 2023-12-06 | 2024-02-06 | 湖北省农业科学院经济作物研究所 | 一种草莓白化相关病毒的检测方法及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667525A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-03-26 | 北京农学院 | 草莓镶脉病毒的快速检测试剂盒及方法 |
| CN105463137A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-04-06 | 兰州理工大学 | 检测草莓是否感染草莓镶脉病毒的引物、检测试剂盒及其方法 |
| JP6436598B1 (ja) * | 2017-12-22 | 2018-12-12 | 国立大学法人宇都宮大学 | イチゴの病原ウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットおよびイチゴの病原ウイルスの検出方法 |
-
2020
- 2020-11-20 CN CN202011313325.7A patent/CN112226541A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667525A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-03-26 | 北京农学院 | 草莓镶脉病毒的快速检测试剂盒及方法 |
| CN105463137A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-04-06 | 兰州理工大学 | 检测草莓是否感染草莓镶脉病毒的引物、检测试剂盒及其方法 |
| JP6436598B1 (ja) * | 2017-12-22 | 2018-12-12 | 国立大学法人宇都宮大学 | イチゴの病原ウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットおよびイチゴの病原ウイルスの検出方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BINOY BABU等: "Recombinase Polymerase Amplification applied to plant virus detection and potential implications", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117512220A (zh) * | 2023-12-06 | 2024-02-06 | 湖北省农业科学院经济作物研究所 | 一种草莓白化相关病毒的检测方法及其应用 |
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