CN116083634A - 一种多重荧光定量pcr引物探针组及其应用 - Google Patents

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CN116083634A CN202310070087.9A CN202310070087A CN116083634A CN 116083634 A CN116083634 A CN 116083634A CN 202310070087 A CN202310070087 A CN 202310070087A CN 116083634 A CN116083634 A CN 116083634A
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Abstract

本发明涉及一种多重荧光定量PCR引物探针组，包括检测大豆疫霉病菌的引物对一和探针一、检测大豆北方茎溃疡病菌的引物对二和探针二、检测北美大豆猝死综合症病菌的引物对三和探针三、检测大豆南方茎溃疡病菌的引物对四和探针四，所述引物探针组应用于同时检测大豆疫霉菌、大豆北方茎溃疡菌、北美大豆猝死综合症病菌及大豆南方茎溃疡病菌四种大豆病原菌的试剂盒，可同时检测四种大豆病原菌的多重荧光定量PCR引物探针组，克服了一次只能检测单个目标病原菌的缺点，大大提高检测效率，并且大幅度提高了检测的特异性，降低了假阳性的现象出现，对于进口大豆中检疫性病原菌的快速检测具有重要的实用价值。

Description

一种多重荧光定量PCR引物探针组及其应用
技术领域
本发明涉及农业有害生物检测技术领域，尤其涉及一种多重荧光定量PCR引物探针组及其应用。
背景技术
大豆是粮油兼用作物，也是人体所需优质蛋白和油脂的重要来源，在我国国民经济地位中占有重要位置。中国大豆的需求量已经超过1.1亿吨，而我国大豆产量在1600万吨左右，约85％的大豆需要进口，仅在2020年进口超过1亿吨。国产大豆供给能力严重不足以及过高的进口依存度，严重影响我国大豆产业安全。大豆病害是影响大豆生产的重要因素。有研究指出，全球已有报道的大豆病害种类达上百种，子囊菌作为真菌中数量最多的类群，其中更有大豆茎溃疡病、大豆猝死综合症等世界范围内的重要大豆病害，对大豆生产造成巨大威胁。近年来，我国进口大豆量逐年上升，国外危险性有害生物随进口大豆传入的风险大为增加，口岸检验检疫工作面临的挑战愈加严峻。
近年来，我国大豆进口呈现大幅度增长趋势，仅在2020年进口超过1亿吨，主要来自美国、巴西、阿根廷、加拿大、乌拉圭等国家，进口大豆虽能满足油脂市场的需求，但携带的疫情异常复杂，容易传播扩散，加大了外来有害生物传入的风险。由于外来有害生物入侵而造成农业生产损失、生态环境破坏甚至危害人类健康的情况屡有发生。
大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌、大豆南方茎溃疡病菌等病原菌是我国重要进境检疫病原菌，常用检测方法有传统分离鉴定、免疫学方法、分子生物学方法等。目前对于大豆检疫性病原菌多目标检测存在许多不足，如传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是它不能满足病害防治中制定最佳防治时期及海关进出境快速检测和鉴定的需求，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。
现在部分病原菌免疫血清学鉴定方法已经建立，但是特异性较差，常常受到相似种的干扰，也受到抗血清质量的影响，血清学检测结果的准确性取决于抗血清的质量。单克隆抗体的专化性太强，主要用于流行学中检测菌系，通常将多种单克隆抗体混合使用，以消除过度专化的问题。目前认为在检测应用方面，多克隆抗体要优于单抗，而多克隆抗体又易与亲缘关系相近的细菌发生交叉反应。因此，常规血清学方法的应用受到了一定的限制。随着分子生物学技术的发展，应用实时荧光PCR技术对多个病原菌进行特异、灵敏快速分子检测的成功例子已越来越多。
随着我国对大豆需求量的增加，进口大豆也在增加，这就造成大豆检疫性病原传入的风险也在不断加大，对我国大豆生产造成潜在的威胁。基于上述情况，寻找采用简便、快速、特异、灵敏的多目标大豆检疫性病原菌的检测方法进行海关口岸进行检测，对阻止检疫性病原传入，保护我国大豆安全生产等成为亟待解决的技术问题。
发明内容
为解决上述存在的技术问题，本发明提供一种多重荧光定量PCR引物探针组，包括检测大豆疫霉病菌的引物对一和探针一、检测大豆北方茎溃疡病菌的引物对二和探针二、检测北美大豆猝死综合症病菌的引物对三和探针三、检测大豆南方茎溃疡病菌的引物对四和探针四，所述大豆疫霉病菌序列如SEQ ID NO.1所示，所述大豆北方茎溃疡病菌序列如SEQ ID NO.2所示，所述北美大豆猝死综合症病菌序列如SEQ ID NO.3所示，所述大豆南方茎溃疡病菌序列如SEQ ID NO.4，
其中，所述引物对一包括正向引物一和反向引物一，所述正向引物一、反向引物一、探针一序列如下：
正向引物一：5’-TGGTAGTGCAGTCTCTATC-3’，
反向引物一：5’-TGATCCAACCTCATTGAC-3’，
探针一：5’-CATGTTGCCACCTGGATTCGA-3’，
所述引物对二包括正向引物二和反向引物二，所述正向引物二、反向引物二、探针二序列如下：
正向引物二：5’-CAGCGGCTATATAGAGAA-3’，
反向引物二：5’-AACCCTGTTACATCACC-3’，
探针二：5’-CCACCACTCTTACCACACCT-3’，
所述引物对三包括正向引物三和反向引物三，所述正向引物三、反向引物三、探针三序列如下：
正向引物三：5’-GCTCAGGCAGTAAATAGA-3’，
反向引物三：5’-TGACCTCCATACTCGATA-3’，
探针三：5’-CACACGAACAAGACGAGCGA-3’，
所述引物对四包括正向引物四和反向引物四，所述正向引物四、反向引物四、探针四序列如下：
正向引物四：5’-GCGATTTGTGGGATTGAC-3’，
反向引物四：5’-CATGCTGAATAGGAGAGG-3’，
探针四：5’-CCGTCAAGGCTACACTCGTCG-3’。
进一步地，所述正向引物一、反向引物一、探针一5’端标记的荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为BHQ1；
进一步地，所述正向引物二、反向引物二、探针二5’端标记的荧光基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为TAMAR；
进一步地，所述正向引物三、反向引物三、探针三5’端标记的荧光基团为CY5，3’端标记的淬灭基团为BHQ2。
进一步地，所述正向引物四、反向引物四、探针四5’端标记的荧光基团为ROX，3’端标记的淬灭基团为BHQ2。
进一步地，所述引物探针组通过比较基因组学的方法，选取卵菌及大豆病原菌数据库中具有全基因组序列的卵菌及大豆病原菌进行全基因组序列比对，进行特异性筛选后获得大豆疫霉菌、大豆北方茎溃疡菌、北美大豆猝死综合症病菌及大豆南方茎溃疡菌四种大豆病原菌的特异基因。
本发明还提供一种上述引物探针组的应用，所述引物探针组应用于同时检测大豆疫霉菌、大豆北方茎溃疡菌、北美大豆猝死综合症病菌及大豆南方茎溃疡菌四种大豆病原菌的试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括标准阳性模板和阴性对照样品，所述标准阳性模板为含有大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌、大豆南方茎溃疡菌目的片段的阳性质粒标准品，所述阴性对照样品为RNase free H2O。
进一步地，所述试剂盒用于同时检测大豆疫霉菌、大豆北方茎溃疡菌、北美大豆猝死综合症病菌及大豆南方茎溃疡菌四种大豆病原菌，具体检测步骤如下：
(1)以样品DNA为模板，利用引物探针组配制扩增反应体系；
(2)对步骤(1)中的扩增反应体系进行实时荧光定量PCR扩增，通过扩增程序得到扩增曲线；
(3)用扩增曲线的判断原则对样品DNA进行分析判断。
进一步地，所述步骤(1)中所述扩增反应体系包括：10μmol/L的混合正向引物，10μmol/L的混合反向引物，混合探针，样品DNA，10XHA缓冲液，5X Probe qPCR缓冲液，5U/μL的High Affinity HotStart酶，2.5mM dNTP，及双蒸水(ddH2O)。
进一步地，所述混合正向引物包括正向引物一、正向引物二、正向引物三、正向引物四，所述混合反向引物包括反向引物一、反向引物二、反向引物三、反向引物四，所述混合探针包括探针一、探针二、探针三、探针四。
进一步地，所述步骤(2)中扩增程序包括40个循环程序，每一个循环程序依次包括95℃保持3分钟，95℃保持5秒，60℃保持30秒，并且从第一个循环程序温度到达60℃时开始收集荧光信号，获得所述扩增曲线。
进一步地，所述扩增曲线的判断原则为：
当荧光通道中Ct≤33，并且荧光通道有扩增曲线时，判断样品DNA为阳性；
当荧光通道中33<Ct≤35时，并且荧光通道有扩增曲线时，重复步骤(1)和步骤(2)，如果荧光通道Ct≤35时，判断样品DNA为阳性，否则判断样品DNA为阴性；
当荧光通道中Ct＞35或无荧光通道有扩增曲线时，判断样品DNA为阴性；
其中，所述阳性为样品DNA含有大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌、大豆南方茎溃疡菌中的一种或多种大豆病原菌，所述阴性为样品DNA不含大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌、大豆南方茎溃疡菌中的任一种大豆病原菌。
本发明的有益效果在于：
1、实现多目标同时检测：本发明可同时检测大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌、大豆南方茎溃疡菌四种大豆病原菌的多重荧光定量PCR引物探针组，克服了一次只能检测单个目标病原菌的缺点，大大提高检测效率；
2、检测特异性高：所述引物探针组通过比较基因组学技术，选取卵菌及疫霉菌数据库中具有全基因组序列的卵菌及疫霉菌进行全基因组序列比对，获得大豆疫霉菌、大豆北方茎溃疡菌、北美大豆猝死综合症病菌及大豆南方茎溃疡菌四种大豆病原菌的特异基因，进行特异性筛选获得，大幅度提高了检测的特异性，降低了假阳性的现象出现，同时选择与大豆疫霉菌近缘种的卵菌进行比较，更容易获得特异性引物；
3、操作简便快速，省时省力：应用本发明包含多重荧光定量PCR引物探针组的试剂盒和检测方法，对大豆的四种病原菌进行荧光定量PCR即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切,一般整个检测过程可在1-2小时内完成，尤其适合用于口岸检疫等时效性要求高的部门使用，对于进口大豆中检疫性病原菌的快速检测具有重要的实用价值，对于大豆的四种病原菌引起病害显症之前进行早期监测，确定病害防治最佳时期及防治方法具有十分重要的意义；
4、检测成本低：利用本发明包含多重荧光定量PCR引物探针组的试剂盒和检测方法可以一次检测多种目标病原菌，不需要多步复杂反应及电泳检测，相应的试剂检测成本低，操作简便。
附图说明
图1为本发明实施例2对大豆疫霉菌、大豆北方茎溃疡菌、北美大豆猝死综合症病菌及大豆南方茎溃疡菌四种大豆病原菌浓度优化曲线；
图2为本发明实施例3中大豆疫霉菌、大豆北方茎溃疡菌、北美大豆猝死综合症病菌及大豆南方茎溃疡菌四种大豆病原菌的标准曲线；
图3为本发明实施例3中目标菌株和供试菌株的特异性试验曲线。
图中的标号为：
1、大豆疫霉菌；2、北美大豆猝死综合症病菌；3、大豆北方茎溃疡病菌；4、大豆南方茎溃疡菌。
具体实施方式
以下实施例种的所述引物探针组包括检测大豆疫霉病菌的引物对一和探针一、检测大豆北方茎溃疡病菌的引物对二和探针二、检测北美大豆猝死综合症病菌的引物对三和探针三、检测大豆南方茎溃疡病菌的引物对四和探针四，所述大豆疫霉病菌序列如SEQ IDNO.1所示，所述大豆北方茎溃疡病菌序列如SEQ ID NO.2所示，所述北美大豆猝死综合症病菌序列如SEQ ID NO.3所示，所述大豆南方茎溃疡病菌序列如SEQ ID NO.4所示。
其中，所述引物对一包括正向引物一和反向引物一，所述正向引物一、反向引物一、探针一序列如下：
正向引物一：5’-TGGTAGTGCAGTCTCTATC-3’，
反向引物一：5’-TGATCCAACCTCATTGAC-3’，
探针一：5’-CATGTTGCCACCTGGATTCGA-3’，
所述引物对二包括正向引物二和反向引物二，所述正向引物二、反向引物二、探针二序列如下：
正向引物二：5’-CAGCGGCTATATAGAGAA-3’，
反向引物二：5’-AACCCTGTTACATCACC-3’，
探针二：5’-CCACCACTCTTACCACACCT-3’，
所述引物对三包括正向引物三和反向引物三，所述正向引物三、反向引物三、探针三序列如下：
正向引物三：5’-GCTCAGGCAGTAAATAGA-3’，
反向引物三：5’-TGACCTCCATACTCGATA-3’，
探针三：5’-CACACGAACAAGACGAGCGA-3’。
所述引物对四包括正向引物四和反向引物四，所述正向引物四、反向引物四、探针四序列如下：
正向引物四：5’-GCGATTTGTGGGATTGAC-3’，
反向引物四：5’-CATGCTGAATAGGAGAGG-3’，
探针四：5’-CCGTCAAGGCTACACTCGTCG-3’。
所述正向引物一、反向引物一、探针一5’端标记的荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为BHQ1；
所述正向引物二、反向引物二、探针二5’端标记的荧光基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为TAMAR；
所述正向引物三、反向引物三、探针三5’端标记的荧光基团为CY5，3’端标记的淬灭基团为BHQ2。
所述正向引物四、反向引物四、探针四5’端标记的荧光基团为ROX，3’端标记的淬灭基团为BHQ2。
所述引物探针组通过比较基因组学的方法，选取卵菌及大豆病原菌数据库中具有全基因组序列的卵菌及大豆病原菌进行全基因组序列比对，进行特异性筛选后获得大豆疫霉菌、大豆北方茎溃疡菌、北美大豆猝死综合症病菌及大豆南方茎溃疡菌四种大豆病原菌的特异基因。
所述引物探针组应用于同时检测大豆疫霉菌、大豆北方茎溃疡菌、北美大豆猝死综合症病菌及大豆南方茎溃疡菌四种大豆病原菌的试剂盒。
所述试剂盒还包括标准阳性模板和阴性对照样品，所述标准阳性模板为含有大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌、大豆南方茎溃疡菌目的片段的阳性质粒标准品，所述阴性对照样品为RNase free H2O。
实例1四种大豆病原菌单重荧光定量PCR(qPCR)扩增及特异性试验
应用上述含有引物探针组的试剂盒对样品进行检测，具体检测步骤如下：
(1)以样品DNA为模板，利用引物探针组配制扩增反应体系；
(2)对步骤(1)中的扩增反应体系进行实时荧光定量PCR扩增，通过扩增程序得到扩增曲线；
(3)用扩增曲线的判断原则对样品DNA进行分析判断。
步骤(1)中所述样品DNA为目标菌株和供试菌株的基因组DNA，
其中，目标菌株包括大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌、大豆南方茎溃疡菌，供试菌株包括大豆疫霉、荔枝霜疫霉、西瓜疫霉、黄瓜疫霉、草莓疫霉、芋疫霉、寄生疫霉、致病疫霉、辣椒疫霉、樟疫霉、豇豆疫霉、柑桔褐腐疫霉、恶疫霉、隐地疫霉、掘氏疫霉、大豆北方茎溃疡病菌、层生镰刀菌、多丝镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄镰刀菌、胶孢炭疽菌、荔枝炭疽菌、禾谷炭疽、枇杷炭疽菌、果生刺盘孢菌、毛豆炭疽菌。
所述步骤(1)中所述扩增反应体系包括：10μmol/L的混合正向引物2μL，10μmol/L的混合反向引物2μL，混合探针2μL，DNA模板1μL，10XHA缓冲液2μL，5X Probe qPCR缓冲液4μL，5U/μL的High Affinity HotStart酶0.2μL,2.5mM dNTP 1.6μL，ddH2O补足至20μL。
所述混合正向引物包括正向引物一、正向引物二、正向引物三、正向引物四，所述混合反向引物包括反向引物一、反向引物二、反向引物三、反向引物四，所述混合探针包括探针一、探针二、探针三、探针四。
所述步骤(2)中扩增程序包括40个循环程序，每一个循环程序依次包括95℃保持3分钟，95℃保持5秒，60℃保持30秒，并且从第一个循环程序温度到达60℃时开始收集荧光信号，获得所述扩增曲线。
其中以双蒸水(ddH2O)为阴性对照。
实例2多重荧光定量PCR(qPCR)体系的建立和优化
对大豆疫霉菌、大豆北方茎溃疡菌、北美大豆猝死综合症病菌及大豆南方茎溃疡菌四种大豆病原菌目标菌株的引物和探针的使用量进行优化：
以实施例1为基础，对样品DNA和引物探针组的使用量进行优化，采用四个引物浓度0.25μmol/L，0.2μmol/L，0.125μmol/L，0.1μmol/L进行多重PCR优化，确认最优多重荧光定量PCR反应体系。其中，最优所述扩增反应体系包括：10μmol/L的混合正向引物2μL(0.25μmol/L)，10μmol/L的混合反向引物2μL(0.25μmol/L)，混合探针2μL(0.25μmol/L)，样品DNA4μL，10XHA缓冲液2μL，5X Probe qPCR缓冲液4μL，5U/μL的High Affinity HotStart酶0.2μL,2.5mM dNTP 1.6μL，ddH2O补足至20μL。
其中，浓度优化结果如图1所示，其中，A1为大豆疫霉病菌(Diaporthe aspalathi)浓度优化曲线；B1为大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe caulivora)浓度优化曲线；C1为北美大豆猝死综合症病菌(Fusarium virguliforme)浓度优化曲线；D1为大豆南方茎溃疡菌(Phytophthora sojae)浓度优化曲线。
所述混合正向引物包括正向引物一、正向引物二、正向引物三、正向引物四，所述混合反向引物包括反向引物一、反向引物二、反向引物三、反向引物四，所述混合探针包括探针一、探针二、探针三、探针四。
所述扩增程序包括40个循环程序，每一个循环程序依次包括95℃保持3分钟，95℃保持5秒，60℃保持30秒，并且从第一个循环程序温度到达60℃时开始收集荧光信号，获得所述扩增曲线。
其中以双蒸水(ddH2O)为阴性对照。
实例3
提取各目标菌株的样品DNA模板并用ddH2O按照倍比稀释法稀释为浓度104-109copies/μL，104-109copies/μL每个稀释度等量混匀并3个重复，按优化后的qPCR反应体系，分别对大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌及大豆南方茎溃疡菌和供试菌种进行多重qPCR扩增，构建标准曲线，四种大豆病原菌的标准曲线如图2所示。其中，A2为大豆疫霉病菌(Diaporthe aspalathi)标准曲线，计算公式为y＝-3.893x+47.66，相关系数R2＝0.998；B2为大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe caulivora)标准曲线，计算公式为y＝-3.519x+45.28，相关系数R2＝0.998；C2为北美大豆猝死综合症病菌(Fusarium virguliforme)标准曲线，计算公式为y＝-5.145x+57.91，相关系数R2＝0.998；D2为大豆南方茎溃疡菌(Phytophthora sojae)标准曲线，计算公式为y＝-3.415x+43.18，相关系数R2＝0.996。
如图3所示，为目标菌株和供试菌株的特异性试验曲线，结果显示仅有大豆疫霉病菌(曲线1)、大豆北方茎溃疡病菌(曲线2)、北美大豆猝死综合症病菌(曲线3)、大豆南方茎溃疡病菌(曲线4)阳性样品即阳性质粒标准品检测结果有扩增曲线，为阳性，其余对照检测样品(供试菌株)无扩增曲线，均为阴性，说明该方法特异性好，可同时检测大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌、大豆南方茎溃疡菌四种大豆病原菌，对于大豆的四种病原菌引起病害显症之前进行早期监测，确定病害防治最佳时期及防治方法具有十分重要的意义。
应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的内容，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (10)

1.一种多重荧光定量PCR引物探针组，其特征在于，包括检测大豆疫霉病菌的引物对一和探针一、检测大豆北方茎溃疡病菌的引物对二和探针二、检测北美大豆猝死综合症病菌的引物对三和探针三，大豆南方茎溃疡病菌的引物对四和探针四，
其中，所述引物对一包括正向引物一和反向引物一，所述正向引物一、反向引物一、探针一序列如下：
正向引物一：5’-TGGTAGTGCAGTCTCTATC-3’，
反向引物一：5’-TGATCCAACCTCATTGAC-3’，
探针一：5’-CATGTTGCCACCTGGATTCGA-3’，
所述引物对二包括正向引物二和反向引物二，所述正向引物二、反向引物二、探针二序列如下：
正向引物二：5’-CAGCGGCTATATAGAGAA-3’，
反向引物二：5’-AACCCTGTTACATCACC-3’，
探针二：5’-CCACCACTCTTACCACACCT-3’，
所述引物对三包括正向引物三和反向引物三，所述正向引物三、反向引物三、探针三序列如下：
正向引物三：5’-GCTCAGGCAGTAAATAGA-3’，
反向引物三：5’-TGACCTCCATACTCGATA-3’，
探针三：5’-CACACGAACAAGACGAGCGA-3’，
所述引物对四包括正向引物四和反向引物四，所述正向引物四、反向引物四、探针四序列如下：
正向引物四：5’-GCGATTTGTGGGATTGAC-3’，
反向引物四：5’-CATGCTGAATAGGAGAGG-3’，
探针四：5’-CCGTCAAGGCTACACTCGTCG-3’。
2.根据权利要求1所述引物探针组，其特征在于，所述正向引物一、反向引物一、探针一5’端标记的荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为BHQ1，或所述正向引物二、反向引物二、探针二5’端标记的荧光基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为TAMAR，或所述正向引物三、反向引物三、探针三5’端标记的荧光基团为CY5，3’端标记的淬灭基团为BHQ2，或所述正向引物四、反向引物四、探针四5’端标记的荧光基团为ROX，3’端标记的淬灭基团为BHQ2。
3.根据权利要求1所述引物探针组，其特征在于，所述引物探针组通过比较基因组学的方法，选取卵菌及大豆病原菌数据库中具有全基因组序列的卵菌及大豆病原菌进行全基因组序列比对，进行特异性筛选后获得大豆疫霉菌、大豆北方茎溃疡、北美大豆猝死综合症病菌及大豆南方茎溃疡病菌四种大豆病原菌的特异基因。
4.一种权利要求1-4任一项所述引物探针组的应用，其特征在于，所述引物探针组应用于同时检测大豆疫霉、大豆北方茎溃疡菌、北美大豆猝死综合症病菌及大豆南方茎溃疡病菌四种大豆病原菌的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板和阴性对照样品，所述标准阳性模板为含有大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌、大豆南方茎溃疡菌目的片段的阳性质粒标准品，所述阴性对照样品为RNase freeH2O。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的具体检测步骤如下：
(1)以样品DNA为模板，利用引物探针组配制扩增反应体系；
(2)对步骤(1)中的扩增反应体系进行实时荧光定量PCR扩增，通过扩增程序得到扩增曲线；
(3)用扩增曲线的判断原则对样品DNA进行分析判断。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中所述扩增反应体系包括：10μmol/L的混合正向引物，10μmol/L的混合反向引物，混合探针，样品DNA，10XHA缓冲液，5XProbe qPCR缓冲液，5U/μL的High Affinity HotStart酶，2.5mM dNTP，及ddH2O。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述混合正向引物包括正向引物一、正向引物二、正向引物三、正向引物四，所述混合反向引物包括反向引物一、反向引物二、反向引物三、正向引物四，所述混合探针包括探针一、探针二、探针三、探针四。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中扩增程序包括40个循环程序，每一个循环程序依次包括95℃保持3分钟，95℃保持5秒，60℃保持30秒，并且从第一个循环程序温度到达60℃时开始收集荧光信号，获得所述扩增曲线。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述扩增曲线分析判断的原则为：
当荧光通道中Ct≤33，并且荧光通道有扩增曲线时，判断样品DNA为阳性；
当荧光通道中33<Ct≤35时，并且荧光通道有扩增曲线时，重复步骤(1)和步骤(2)，如果荧光通道Ct≤35时，判断样品DNA为阳性，否则判断样品DNA为阴性；
当荧光通道中Ct＞35或无荧光通道有扩增曲线时，判断样品DNA为阴性；
其中，所述阳性为样品DNA含有大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌、大豆南方茎溃疡菌中的一种或多种大豆病原菌，所述阴性为样品DNA不含大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、北美大豆猝死综合症病菌、大豆南方茎溃疡菌中的任一种大豆病原菌。
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