CN112646914A - 一种快速检测桃枝枯病菌的lamp引物组及其快速检测的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物病害防治技术领域，公开了一种用于检测桃枝枯病菌的环介导等温扩增(LAMP)的引物组及其快速检测的方法和试剂盒。引物组合包括一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP。本发明还同时公开了一种用于检测桃枝枯病菌的环介导等温扩增试剂盒，除了包含上述引物组合物之外，还有10×Thermopol Buffer、dNTPs、MgSO₄、甜菜碱、Bst DNA聚合酶。本发明以MTEF1基因保守区片段序列设计LAMP引物，并进行快速分子检测体系和反应条件的优化，能对桃枝枯病菌进行LAMP检测，反应过程简便、检测周期短。特异性强、灵敏度高，可用于肉眼观察检测结果，具有较大的应用前景。

Description

一种快速检测桃枝枯病菌的LAMP引物组及其快速检测的方法 和试剂盒

技术领域

本发明涉及植物病原物检测和植物病害防治技术领域，更具体地，涉及一种检测桃枝枯病菌的引物组及其快速检测的方法和试剂盒。

背景技术

桃枝枯病是危害桃树的一种重要病害，病原为桃拟茎点霉(Phomopsisamygdali)。近年来，该病在我国云南昆明、上海南汇、浙江嘉兴、江苏无锡和常州、四川成都等南方桃产区陆续发生并迅速蔓延，发病桃园平均损失20％～50％，部分发病比较严重的桃园面临绝收的危险。该病害可以通过菌丝在田间病枝、土壤表层和土壤耕作层病枝残体上越冬；3月初平均气温达到10～15℃时病斑部位产生分生孢子器及分生孢子。分生孢子从3月下旬遇开始释放，释放高峰期为月3下旬到5月上旬，分生孢子释放与气温、降水量有关，雨水飞溅有助于分生孢子释放、传播和侵染。

基于该病的扩展和蔓延，桃园枝枯病的监测和病害早期检测工作非常重要，病原确定后，可以采取有效的针对性措施进行病害预防和防控，将能大大减少病害的发生及其危害。因此，桃枝枯病菌的快速检测，对该病的防治特别是预防尤为重要。此外，桃枝枯病菌在桃树上存在“潜伏侵染”状态，一旦潜伏的共生状态转换成致病状态，即可形成肉眼可见的病斑，再采取防治措施，为时已晚，防治效果会很不理想。所以要高效的防治桃枝枯病，在潜伏的共生状态的早期快速检测就非常重要，这也将是建立桃枝枯病预警防治技术的基础。

随着核酸相关的的鉴定方法不断发展，基于普通PCR的方法已经成功用于检测桃枝枯病菌，但PCR特异性等检测耗时偏长，需要3～4h，同时PCR方法需要昂贵的PCR仪，且检测灵敏度偏低，且过程较繁杂。此外，普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩增，这是实验室污染的一个重要来源，而且溴化乙锭(EB)剧毒，可累积致癌，对人体产生巨大危害，长期观察紫外灯也会对实验人员健康造成一定程度的伤害。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有问题，提供一种用于田间快速检测桃枝枯病的试剂盒及其应用，可用于快速检测桃树中的桃枝枯病。所述的方法具有快速、灵敏、特异性强等优势，结果可靠稳定。也在于开发配套使用的试剂盒，使田间技术人员实时掌握桃枝枯病的发生状况，做好预防及治理病害的准备。

为解决现有检测桃枝枯病菌技术存在的不足和缺点，本发明提供了一种桃枝枯病田间快速检测试剂盒，它是在田间快速判断桃枝枯病病菌是否已侵染桃树的试剂盒，可在很快的时间内检测出结果，具有快速、特异、灵敏、高效等特点。

本发明的第一个目的是提供一种用于检测桃枝枯病的靶向序列。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测桃枝枯病特异性LAMP的反应引物组。

本发明的第三个目的是提供一种快速检测桃枝枯病菌的方法。

本发明的第四个目的是提供一种检测桃枝枯病的试剂盒。

本发明针对我国桃枝枯病菌(Phomopsis amygdali)来设计特异性检测LAMP 引物组，通过前期获得的全基因组序列，筛选得到特异性检测基因，具体地，靶标序列如图1所示。

针对上述目的是通过以下方案实现的：

一种用于检测桃枝枯病菌的靶向序列，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供上述靶向序列在检测桃枝枯病菌或制备桃枝枯病菌的试剂盒中的应用。

本发明针对我国桃枝枯病菌来设计特异性LAMP检测引物组，通过前期获得的桃枝枯病菌全基因组序列，筛选获得特异检测基因，具体靶标如图1所示。

因此图1中所述的靶向序列在检测桃枝枯病菌的试剂盒中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明对桃枝枯病菌的EF1-α(翻译延伸因子)、β-tubulin(维管束蛋白)、 MTEF1(一种线粒体翻译延伸因子基因)等基因设计引物，经过大量的引物筛选，最终从MTEF1基因得到特异性、灵敏性良好的LAMP引物组，包括一对外引物(F3/B3)和一对内引物(FIP/BIP)。

本发明提供一种快速检测桃枝枯病菌的环介导等温扩增引物；LAMP引物组合由上下游外引物、上下游内引物四条引物组成，其序列如下：

上游外引物F3：CGTCCCTTTCTGCTCTTCAC；

下游外引物B3：CTATATCGAGCCGGGAGGA；

上游内引物FIP： ATGGAATTCGGGCCTTCGCCGACTCTCTCAGCATCAGCCT；

下游内引物BIP：TCATCTTATCCACCACGCTGCG-CGCAACCCGTGACTTCTC。

本发明还提供用于检测桃枝枯病菌的环介导等温扩增试剂盒，包含上述 LAMP引物组合。

本发明还提供了用于检测桃枝枯病菌的环介导等温扩增试剂盒，包含上述 LAMP引物组合，10×ThermoPol buffer、10mM dNTPs、5mM甜菜碱、100mM MgSO₄、ddH₂O补足至25μL，反应结束加1μL SYBR Green I核酸荧光染料。试剂盒在检测桃枝枯病的应用，包括如下步骤：

方法一：

(1)在植物组织中提取DNA；

(2)按照反应体系配制溶液，所述反应体系(25μL)包括：10×ThermoPol buffer2.5μL，10mM dNTPs 2μL，5mM甜菜碱3μL，100mM MgSO₄ 1μL， F3(10μM)0.5μL，B3(10μM)0.5μL，FIP(10μM)4μL，BIP(10μM)4μL， DNA模1μL，Bst DNA聚合酶(8U/μL)1μL，去离子水5.5μL；

(3)将经步骤(1)提取的DNA加入经步骤(2)配制的反应体系溶液中进行扩增反应得到扩增产物，在所得的扩增产物中加入1μL SYBR GreenⅠ染料，观察扩增产物颜色反应，判断反应结果。

方法二：

(a)快速提取植物组织DNA，取样品病健组织交界处，将其清洗、消毒，加入适量的400mM NaOH，捣碎，离心，取浸出液上清；

(b)所述反应体系(25μL)包括：10×ThermoPol buffer 2.5μL，10mM dNTPs 2μL，5mM甜菜碱3μL，100mM MgSO4 1μL，F3(10μM)0.5μL，B3(10μM) 0.5μL，FIP(10μM)4μL，BIP(10μM)4μL，DNA模板1μL，Bst DNA聚合酶 (8U/μL)1μL，去离子水5.5μL；

(c)将经步骤(a)提取的DNA加入经步骤方法一中步骤(2)配制的反应体系溶液中进行扩增反应得到扩增产物，在所得的扩增产物中加入1μL SYBR Green I染料，观察扩增产物颜色反应，判断反应结果。

方法一、方法二中，所述LAMP扩增反应的条件均为：水浴65℃，孵育60 min。

方法一的步骤(3)中、方法二的步骤(c)中，根据扩增结果判断待测样品中是否含受桃枝枯病侵染的方法为：利用琼脂糖凝胶电泳检测和荧光染料 SYBR Green I对LAMP扩增产物进行检测，根据检测结果判断待测样品中是否受桃枝枯病病侵染；待检测样品为步骤(1)植物组织中提取的DNA或步骤(a) 中的浸出液上清。

所述琼脂糖凝胶电泳检测结果呈现阶梯式条带，则为阳性结果，表示待测样受到桃枝枯病病的侵染；若无阶梯式条带，则为阴性结果，表示待测样未受到桃枝枯病的侵染；所述荧光染料法为将染料SYBR Green I加入到LAMP扩增产物中，观察显示的颜色，若呈现黄绿色则为阳性，表示待测样受到桃枝枯病的侵染；若呈现橙色则为阴性，表示待测样未受到桃枝枯病的侵染。

本发明提供桃桃枝枯病田间快速检测的引物，包括两对引物，分别为外物 F3、B3和内引物FIP、BIP，所述四种反应引物核苷酸序列依次为：

F3:CGTCCCTTTCTGCTCTTCAC

B3：CTATATCGAGCCGGGAGGA

FIP：ATGGAATTCGGGCCTTCGCCGACTCTCTCAGCATCAGCCT

BIP：TCATCTTATCCACCACGCTGCGGCAACCCGTGACTTCTC

本发明还提供一种快速检测桃枝枯病的试剂盒，包含上述4种检测桃枝枯病的LAMP反应引物组。

优选地，所述外引物对和内引物对的终浓度比为1:8，即终浓度分别为0.2 μM和1.6μM。即LAMP引物组合包括：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反内向引物BIP，0.2μM的正外向引物F3，0.2μM的反外向引物B3。

所述试剂盒还包括：10×ThermoPol buffer，10mM dNTPs，5mM甜菜碱3μL， 100mMMgSO₄ 1μL，8U/μL Bst DNA聚合酶，去离子水，显色液(SYBR Green I)，阴性对照液，阳性对照液。

显色液为SYBR Green I。所述阴性对照液为未感染桃枝枯病总核酸，所述阳性对照液为含桃枝枯病总核酸。

优选地，所述试剂盒25μL反应体系为：10×ThermoPol buffer，10mM dNTPs，100mM MgSO₄，5mM甜菜碱，Bst DNA聚合酶，外引物F3和B3，内引物FIP 和BIP。

本发明还提供一种用于检测桃枝枯病的环介导等温扩增方法，所述方法采用以下的反应体系：8U/μL Bst聚合酶1μL、10×ThermoPol buffer 2.5μL、10μM FIP 4μL、10μMBIP 4μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、10mM dNTPs 2μL、 5mM甜菜碱3μL、100mM MgSO₄1μL、ddH₂O补足至25μL，反应结束加1μL SYBR Green I核酸荧光染料。

优选地，利用所述反应体系进行LAMP扩增反应，选择以下任一方法：

方法一：先在扩增后加入SYBR Green I核酸荧光染料作为反应指示剂，以 SYBRGreen I核酸荧光染料颜色变化作为结果判定标准，颜色结果为绿色为阳性，判断检测到桃枝枯病菌；颜色显示橙色，表示阴性，判断指示样品无桃枝枯病菌，或所含的桃枝枯病菌的量未达到最低的检测限浓度；

方法二：取5μL的扩增产物，用1％的琼脂糖胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到桃枝枯病菌；无扩增条带则判断为阴性，即显示没有检测到桃枝枯病菌，或所含桃枝枯病未达到最低检测浓度。

优选地，LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min。

优选地：所述LAMP扩增反应中的最低检测浓度为0.01ng/μL。

更优选地，所述试剂盒的反应条件为水浴65℃反应60min，4℃避光保存。

本发明还请求保护桃桃枝病的LAMP检测方法，包括如下步骤：

方法一：

(1)提取样品病健交界处组织提取DNA；

(2)按照反应体系配制溶液，所述反应体系(25μL)包括：10×ThermoPol buffer2.5μL，10mM dNTPs 2μL，5mM甜菜碱3μL，100mM MgSO₄ 1μL， Bst DNA聚合酶1μL，外引物F3和B3各0.5μL，内引物FIP和BIP各4μL，去离子水补充至25μL。

(3)在所得的扩增产物中加入1μL SYBR Green I染料，观察颜色反应，得出结果。

方法二：

(1)快速提取植物组织DNA，取样品病健组织交界处，将其清洗、消毒，加入适量的NaOH，碾碎，取浸出液上清。

(2)按照反应体系配制溶液，所述反应体系(25μL)包括：10×ThermoPol buffer2.5μL，10mM dNTPs 2μL，5mM甜菜碱3μL，100mM MgSO₄ 1μL，Bst DNA聚合酶1μL，外引物F3和B3各0.5μL，内引物FIP和BIP各4μL，去离子水补充至25μL。

(3)在所得的扩增产物中加入1μL SYBR Green I染料，观察颜色反应，判断反应结果。

优选地，所述LAMP扩增反应的条件均为：水浴65℃，孵育60min。

优选地，利用琼脂糖凝胶电泳检测和荧光染料SYBR Green I对LAMP扩增产物进行检测，根据检测结果判断待测样品中是否受桃枝枯病侵染。

所述琼脂糖凝胶电泳检测结果呈现阶梯式条带，则为阳性结果，表示待测样品受到桃枝枯病病的侵染。若无阶梯式条带，则为阴性结果，表示待测样未受到桃枝枯病的侵染；所述荧光染料法为将染料SYBR Green I加入到LAMP扩增产物中，观察显示的颜色，若呈现黄绿色则为阳性，表示待测样受到桃枝枯病的侵染，若呈现橙色则为阴性，表示待测样未受到桃桃枝枯病病的侵染。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的试剂盒能在发生病症前就准确判断出桃树是否已感染桃枝枯病菌，该试剂盒可以在很快的时间内，不需要复杂的实验条件下，通过颜色反应指示出是否存在桃枝枯病菌，对及时展开病害的防治工作，保证桃产量质量有重要的意义。本发明克服传统技术中检测桃桃枝病菌耗时，工作量大，难以早起发现病菌侵染的存在的问题。同时也克服了PCR技术检测的不足，如仪器昂贵，技术要求高，难以普及的问题，能在田间，快速，准确检测病菌，对及时展开病害的防治工作，保证桃产量质量有重要的意义。本发明桃枝枯病田间快速检测试剂盒和现有其他技术相比，具有如下优点：

本发明在已知桃枝枯病菌的特异基因片段的基础上，应用环介导恒温扩增技术，使检测桃枝枯病菌不需要昂贵的仪器，在田间就能快速准确检测，使在病害出现症状前快速诊断成为可能。环介导等温扩增具有操作简单、快速、灵敏、特异性高、成本低等优点，能够在恒温条件下快速扩增DNA片段，成为可以代替PCR的新的核酸扩增技术。此方法利用针对靶序列中6个基因区段的2 对引物及Bst DNA polymerase在延伸DNA链的同时所具有的链置换活性，对目的片段进行链置换扩增，不需经过PCR反应时双链模板DNA的变性、退火及循环变温过程，扩增反应在恒温条件(61～65℃)下几十分钟即可完成。相比普通PCR，LAMP反应只需要在恒温的水浴锅就可以完成反应，扩增结束后加入SYBR Green I核酸荧光染料作为指示剂，以SYBR Green I核酸荧光染料的颜色变化做为结果判断即可达到检测的目的。

本发明提供可以特异性和桃枝枯病菌基因片段相结合的四对环化引物，及检测试剂盒和扩增条件。应用试剂盒可快速检测桃枝枯病菌，比普通分子检测更简单高效，其步骤简单易操作，不需要PCR仪等实验室高级仪器。使用特异性引物和环介导恒温扩增反应，准确率和灵敏度高。

附图说明

图1为桃枝枯病菌桃拟茎点霉的特异性靶向序列图，其中标注了六个区域用于引物的设计。

图2为桃枝枯病菌LAMP反应的特异性检测产物结果图；其中，第1为阴性对照；第2为桃拟茎点霉(Phomopsis amygdali)；第3为抗多菌灵桃拟茎点霉菌株(Phomopsisamygdali)；第4为枫香拟茎点霉(Phomopsis liquidambaris)；第5为拟茎点霉复合种(Phomopsis eres)；第6为菜豆拟茎点霉(Phomopsis phaseoli)；第7为灰霉菌(Botrytiscinerea)；第8为褐腐(Monilinia fructicola)；第9为杏链格孢(Alternariaarmeniacae)；第10为镰刀菌(Fusarium solani)；第11为匍匐根霉(Rhizopusstolonifer)；第12为苹果炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；第13为附球菌(Epicoccum sp.)；第14为拟盘多孢(Pestalotiopsis disseminate)；第15为短梗霉(Aureobasidium pullulans)；第16为叶点霉 (Phyllosticta capitalensis)；第17为球毛拟壳菌(Chaetomium globosum)。

图3为桃枝枯病LAMP反应的灵敏度检测产物结果图；其中，1：6.30×10²； 2：6.30×10¹；3：6.30×10⁰；4：6.30×10^-1；5：6.30×10^-2；6：6.30×10^-3； 7：6.30×10^-4；8：6.30×10^-5；9：阴性对照。单位(μg/mL)。

图4为感病组织的LAMP检测。1：健康组织；2：健康组织；3：接种桃枝枯病菌组织；4:接种桃枝枯病菌组织；5：接种桃枝枯病菌组织；6；接种桃枝枯病菌组织；7：接种桃枝枯病菌组织。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

以下实施例中使用的主要试剂及仪器：

Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)、MgSO₄(New England Biolabs)、 10×ThermoPol buffer(New England Biolabs)，dNTPs(Takara)、甜菜碱(Solarbio)、去离子水、DNAMaker(TSINGKE生物科技公司)、常州市国旺仪器制造有限公司数显恒温水浴锅，超微量分光光度计(Genova plus 198-1000nm)。

以下所用的所有病原菌，均已事先检测证明了其定性的正确性。

实施例1：一种桃枝枯病的LAMP环介导等温扩增试剂盒。

所述的试剂盒优选包括Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)、MgSO₄(NewEngland Biolabs)、10×ThermoPol buffer(New England Biolabs)、10mM dNTPs(Takara)、5mM甜菜碱(Solarbio)、Bst DNA聚合酶，外引物F3和B3，内引物 FIP和BIP，SYBRGreen I。靶向基因片段见图1，各引物序列具体如下：

正向外引物F3:CGTCCCTTTCTGCTCTTCAC

反向外引物B3：CTATATCGAGCCGGGAGGA

正向内引物FIP： ATGGAATTCGGGCCTTCGCCGACTCTCTCAGCATCAGCCT

反向内引物BIP：TCATCTTATCCACCACGCTGCGCGCAACCCGTGACTTCTC

其中，正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3 构成用于检测桃枝枯病病的LAMP检测引物组合物。

实施例2：桃枝枯病病LAMP反应的特异性试验。

为了验证LAMP方法的特异性，以16种病原菌为供试材料，LAMP检测结果显示桃枝枯病菌株均可观察到荧光绿的阳性反应或者琼脂糖凝胶电泳出现 LAMP阶梯状的条带，其余14种病原菌菌显色结果为橙色的阴性反应或者琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。选择与枝枯病不同菌的DNA作为模板，取1μL DNA溶液，按实施例1体系进行LAMP反应，反应程序为：65℃，60min。结果显示基于反应体系颜色反应做为结果判定标准，以桃枝枯病的DNA模板时，呈现荧光绿；扩增与桃枝枯病不同种的DNA模板和阴性对照都呈现橙色(图2)；用LAMP引物扩增桃枝枯病的DNA模板时，都扩增出典型的阶梯状条带；而与桃枝枯病不同种、不同属的菌和阴性对照都没有能够扩增出目的条带(图2)。

实施例3：桃枝枯病LAMP反应的灵敏度试验。

为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的桃枝枯病的DNA用超微量分光光度计后用DEPC水进行10倍比稀释，-20℃保存作为备用。分别取梯度稀释后的各浓度DNA稀释液作为模板，实施例1体系进行LAMP反应，反应程序为：水浴℃孵育60min。取1μL扩增产物上样，在1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果显示LAMP方法可以检测到浓度是6.30×10^-3μgDNA；SYBR Green I 显色反应表明LAMP反应的灵敏度也达到6.30×10^-3μg(图3)。分别取梯度稀释后的各浓度DNA稀释液作为模板进行PCR，结果显示PCR检出浓度为 6.30×10^-1μg。

实施例4：感病组织浸出液的LAMP检测

采集健康桃树枝条表面经冲洗消毒后伤口接种桃枝枯病菌，7天后，取病健交界位置，加入100μL 400mM NaOH用无菌研磨棒磨碎后悬浮于适量无菌水中，室温离心5min后取悬浮液上清为模板，以无菌水为空白对照，进行LAMP 检测。结果如图4所示，桃病叶组织浸出液产生阳性反应，而空白对照及其他样品仍为橙色。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种快速检测桃枝枯病菌的LAMP引物组及其快速检测的方法和试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 380

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagaatgt ttcggcgtta caacgaatgt gaacctgtcc gtccctttct gctcttcacg 60

attgactctc tcagcatcag cctcggagaa cccattcttg actgtcgcgg cgaaggcccg 120

aattccatca atcaggacct cgcctcctcc tccccagatc atcatcttat ccaccacgct 180

gcgggctatg tcagcccacc actcggccgg agaagtcacg ggttgcgagt attgatcatg 240

ctgtcctccc ggctcgatat aggcgttgga cgctcgcctc aatgcccttg gcgtcagata 300

gtcggattcg gcgttactgg agacagatgg ctcattgact tggaaggata cccacggcga 360

gatcaggagg gcggcatgta 380

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtccctttc tgctcttcac 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctatatcgag ccgggagga 19

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggaattcg ggccttcgcc gactctctca gcatcagcct 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcatcttatc caccacgctg cgcgcaaccc gtgacttctc 40

Claims (10)

1.一种用于检测桃枝枯病菌的靶向序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的靶向序列在检测桃枝枯病菌或制备桃枝枯病菌的试剂盒中的应用。

3.根据权利要求1所述的用于检测桃枝枯病菌的环介导等温扩增引物，其特征在于：LAMP引物组合由以下四条引物组成：

F3：CGTCCCTTTCTGCTCTTCAC；

B3：CTATATCGAGCCGGGAGGA；

FIP：ATGGAATTCGGGCCTTCGCCGACTCTCTCAGCATCAGCCT；

BIP：TCATCTTATCCACCACGCTGCGCGCAACCCGTGACTTCTC。

4.用于检测桃枝枯病菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含由权利要求3所述的LAMP引物组合。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：LAMP引物组合包括：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反内向引物BIP，0.2μM的正外向引物F3，0.2μM的反外向引物B3。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包含：8U/μL Bst聚合酶、10×ThermoPol buffer、dNTPs、甜菜碱(Betaine)、MgSO₄、SYBR Green I核酸荧光染料、ddH₂O。

7.用于检测桃枝枯病的环介导等温扩增方法，其特征在于：所述方法采用以下的反应体系：8U/μL Bst聚合酶1μL、10×ThermoPol buffer 2.5μL、10μM FIP4μL、10μM BIP 4μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 0.5μL、10mM dNTPs 2μL、5mM甜菜碱3μL、100mM MgSO₄ 1μL、ddH₂O补足至25μL，反应结束加1μL SYBR Green I核酸荧光染料。

8.根据权利要求7所述的用于检测桃枝枯病的环介导等温扩增方法，其特征在于，利用所述反应体系进行LAMP扩增反应，选择以下任一方法：

方法一：先在扩增后加入SYBR Green I核酸荧光染料作为反应指示剂，以SYBR GreenI核酸荧光染料颜色变化作为结果判定标准，颜色结果为绿色为阳性，判断检测到桃枝枯病菌；颜色显示橙色，表示阴性，判断指示样品无桃枝枯病菌，或所含的桃枝枯病菌的量未达到最低的检测限浓度；

方法二：取5μL的扩增产物，用1％的琼脂糖胶电泳检测，如果出现梯形条带判断为阳性，即显示检测到桃枝枯病菌；无扩增条带则判断为阴性，即显示没有检测到桃枝枯病菌，或所含桃枝枯病未达到最低检测浓度。

9.根据权利要求7所述的用于检测桃枝枯病的环介导等温扩增方法，其特征在于，LAMP扩增反应程序为：65℃扩增60min。

10.根据权利要求8所述的用于检测桃枝枯病的环介导等温扩增方法，其特征在于：所述LAMP扩增反应中的最低检测浓度为0.01ng/μL。

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