CN109666757A - 用于鉴定小麦春化基因vrn-d4的试剂盒及其专用成套引物对 - Google Patents

用于鉴定小麦春化基因vrn-d4的试剂盒及其专用成套引物对 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于鉴定小麦春化基因VRN‑D4的试剂盒及其专用成套引物对。本发明用于鉴定VRN‑D4基因的成套引物对由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；所述引物对乙由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成。本发明针对VRN‑D4基因编码区第367位碱基变异重新设计1个CAPS标记，使扩增的目的片段内只含有一个限制性内切酶的酶切位点，以便达到缩短酶切时长和降低试剂成本的目的。本发明开发了该基因更加简便、快速、可靠、实用的分子标记，对小麦育种、引种和推广具有重要意义。

Description

用于鉴定小麦春化基因VRN-D4的试剂盒及其专用成套引物对
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于鉴定小麦春化基因VRN-D4的试剂盒及其专用成套引物对。
背景技术
近百年来，全球气候正在经历着一次以变暖为主要特征的显著变化，气候变化已成为当今科学界、各国政府和社会公众强烈关注的重大环境问题之一。小麦是我国乃至世界上重要的粮食作物之一，气候变化给小麦的育种和生产工作提出了新的挑战和机遇。培育和推广能够适应外界环境变化、最大限度利用光热资源的品种，是夺取小麦高产和稳产的最经济最有效途径。通过调整小麦生长发育阶段使其更好的适应外界生长环境条件，只有这样才能够最大限度地降低作物减产风险从而确保小麦丰产。研究认为，不同地理气候条件下小麦生长发育适应性主要受春化基因(VRN)、光周期基因(PPD)及早熟基因(EPS)控制，其中春化基因对小麦生长发育适应性影响最大，贡献率约占70-75％。
在冬小麦的生长发育进程中，必须要经历一段时期的低温处理，才能够抽穗开花，这个过程叫春化作用。小麦的春化作用是由四种春化基因VRN1、VRN2、VRN3和VRN4控制。与野生型等位变异相比，春化基因特定区域序列变异的等位变异使小麦品种的冬春习性发生改变，不同春化基因型决定小麦冬春习性强弱程度差异，使得完成春化过程所需低温时间也就不同，造成生长发育的进程不同，具备不同的生长习性，表现出小麦品种不同的抗冻害特性。已有研究表明，不同国家或地区的小麦具有不同春化基因组成类型，不同的春化基因组成类型与不同地区自然环境有关，是小麦适应环境能力的遗传基础，即不同国家或地区推广的小麦品种具备特定春化基因的组成类型。早在2000年Iwaki等就报道，中国小麦存在VRN-D4基因；随后Zhang等(2008)研究也证实我国小麦存在VRN-D4基因。Kippes等(2015)认为VRN-D4是小麦重要的春化基因之一，其可以增加小麦遗传的多样性，增强小麦适应不同生态地区和气候变化能力。
与前三个春化基因VRN1、VRN2和VRN3相比，VRN4的研究相对滞后，近年来在小麦5D染色体上才克隆了VRN4基因，被命名为VRN-D4基因。该基因与SSR的分子标记Xcfd78和Xbarc205紧密连锁，与Xcfd67和BG313707标记存在共分离现象，此共分离标记常被用来作为VRN-D4基因的鉴定标记使用，但在实际检测过程当中发现有些材料却无法使用共分离标记得到有效的鉴别。进一步研究发现，VRN-D4其实是VRN-A1基因的1个拷贝基因，起源于小麦的5AL大片段插入5DS、所插入的片段中恰好包含了1个VRN-A1基因，只是在第一内含子区域和编码区第四外显子区域存在有两个功能结构域的变异。因此，前人对VRN-D4基因进行鉴定的时候，需要同时检测5DS区域是否存在5AL大片段的插入和编码区是否存在特定碱基的变异。与VRN-A1基因序列相比，VRN-D4基因在第1内含子区域存在有3个邻近的特异性SNP(G2780C、T2783C、C2784T)，而此位点区域正好属于一个开花抑制因子TaGRP2识别的保守区域RIP-3，由于该区域SNP多态性的改变使得开花抑制因子TaGRP2无法与该基因结合，导致携带春化基因VRN-D4小麦能够提早抽穗开花。同时，与VRN-A1序列相比，VRN-D4基因在第四外显子上第367位碱基存在有1个单碱基突变(A367C)，该处碱基的变化会导致氨基酸序列的变化(由原来的赖氨酸变成谷氨酰胺)，而此位点属于MADS转录因子的K-Box结构域，与植物生长发育进程密切相关。
Kippes等(2015)设计了5对引物用于VRN-D4基因的鉴定，其中4对引物用于鉴定5DS区域是否存在5AL大片段的插入，1对CAPS引物用于鉴定编码区特定SNP位点的鉴定。但在实际生产当中，当有大量样本需要进行检测时，每个样品均需要进行至少5次PCR扩增和1次限制性酶切才能最终确定结果，这为小麦育种工作带来了诸多的不便。另外Kippes等开发的CAPS标记扩增的PCR产物中存在有两个限制性内切酶的酶切位点，实际鉴定过程中需要加倍的酶量及足够多的酶切时长才能够保证鉴定效果，而且多个酶切位点的存在有时候对结果判读也会存在一定的干扰。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何简便、快速、低成本且准确的鉴定小麦春化基因VRN-D4。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了用于鉴定VRN-D4基因的成套引物对。
本发明提供的用于鉴定VRN-D4基因的成套引物对由引物对甲和引物对乙组成；
所述引物对甲由VRND4-in1F和VRND4-in1R组成；
所述引物对乙由dA367C-F和dA367C-R组成；
所述VRND4-in1F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述VRND4-in1R为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述dA367C-F为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述dA367C-R为如下b3)或b4)：
b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了上述成套引物对的新用途。
本发明提供了上述引物对在如下c1)-c6)中任一种中的应用：
c1)制备鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因的产品；
c2)鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因；
c3)制备鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因的产品；
c4)鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因；
c5)制备小麦育种的产品；
c6)小麦育种。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了含有上述成套引物对的试剂盒；
所述试剂盒的功能为如下d1)-d3)中任一种：
d1)鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因；
d2)鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因；
d3)小麦育种。
上述试剂盒还可包括如下试剂：用于提取基因组DNA的试剂、用于PCR扩增的试剂和用于酶切的试剂。具体的，所述用于提取基因组DNA的试剂可包括2×CTAB缓冲液、氯仿异戊醇混合液、异丙醇、乙醇；所述用于PCR扩增的试剂可包括2×EsTaq MasterMix、无菌双蒸水；所述用于酶切的试剂可包括BstNI限制性内切酶、10×Buffer R、Nuclease-free水。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因的方法。
本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因的方法包括如下步骤：
e1)以待测小麦的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1中所述的引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，得到PCR产物甲和PCR产物乙；
e2)用BstNI限制性内切酶酶切所述PCR产物乙，得到酶切产物；
电泳检测所述PCR产物和所述酶切产物判定待测小麦是否携带VRN-D4基因：
若引物对甲PCR扩增得到大小为210bp的目标条带，且所述酶切产物可以被BstNI限制性内切酶酶切产生大小为271bp和50bp的两个片段，则所述待测小麦携带或候选携带VRN-D4基因；否则不携带或候选不携带VRN-D4基因。
上述方法中，所述大小为210bp的目标条带的核苷酸序列如序列5所示。
所述大小为271bp的片段的核苷酸序列如序列6第1-271位所示；
所述大小为50bp的片段的核苷酸序列如序列6第272-321位所示。
上述引物对甲或引物对乙或序列5所示的DNA分子或序列6所示的DNA分子均属于本发明的保护范围。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了上述引物对甲或上述引物对乙或序列5所示的DNA分子或序列6所示的DNA分子的新用途。
本发明提供了上述引物对甲或上述引物对乙或序列5所示的DNA分子或序列6所示的DNA分子在如下c1)-c6)中任一种中的应用：
c1)制备鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因的产品；
c2)鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因；
c3)制备鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因的产品；
c4)鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因；
c5)制备小麦育种的产品；
c6)小麦育种。
本发明针对VRN-D4基因编码区第367位碱基变异设计了1个CAPS标记，使扩增的目的片段内只含有一个限制性内切酶的酶切位点，以便达到缩短酶切时长和降低试剂成本的目的，同时还针对小麦春化基因VRN-D4第一内含子序列多态性差异设计了1对特异性引物，并基于两对引物建立了VRN-D4基因鉴定方法。通过实验证明：本发明的VRN-D4基因鉴定方法仅需要2对引物就能够实现对VRN-D4基因的鉴定，其中用于编码区鉴定的酶切时长仅需4h，每个样品仅需要添加1μL。本发明的鉴定方法进行结果判读相比于前人标记更加简单明了、而且可以节约限制性内切酶用量、缩短酶切时长。本发明的VRN-D4基因是决定小麦抽穗开花的重要基因之一，开发该基因更加简便、快速、可靠、实用的分子标记，对小麦育种、引种和推广具有重要意义。
附图说明
图1为VRN-D4基因第一内含子区特异性引物设计。
图2为VRN-D4基因编码区第367碱基多态性CAPS引物设计。
图3为前人开发分子标记对VRN-D4基因的鉴别结果。A为利用前人开发的标记对5DS/5AL插入鉴定结果；B为利用前人开发标记对编码区第367位碱基多态性鉴定。M，marker；1，TDF；2，TDC；3，新春10号；4，京红5号；5，京411；6，京冬8号；7，济麦20；8，鲁麦21；9，周麦23；L，上游插入区域；R，下游插入区域。
图4为本发明开发分子标记对VRN-D4基因的鉴别结果。A为利用本发明开发的标记对VRN-D4第一内含子区鉴定结果；B为利用本发明开发标记对编码区第367位碱基多态性鉴定。M，marker；1，TDF；2，TDC；3，新春10号；4，京红5号；5，京411；6，京冬8号；7，济麦20；8，鲁麦21；9，周麦23。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所涉及的小麦材料如下：
TDF：记载于“Yoshida T,Nishida H,Zhu J,et al.Vrn-D4 is a vernalizationgene located on the centromeric region of chromosome 5D in hexaploid wheat[J].Theoretical and Applied Genetics,2010,120(3):543-552.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本实验。
TDC：记载于“Yoshida T,Nishida H,Zhu J,et al.Vrn-D4 is a vernalizationgene located on the centromeric region of chromosome 5D in hexaploid wheat[J].Theoretical and Applied Genetics,2010,120(3):543-552.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本实验。
新春10号：记载于“徐红军,穆培源,相吉山,等.新疆春小麦品种主要性状的主成分及聚类分析[J].西北农业学报,2013,22(7):100-106.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本实验。
京红5号：记载于“北方地区春小麦良种区域联合试验(水地早熟组)天津点总结[J].天津农业科学,1974(02):12-17.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本实验。
京411：记载于“李法计,肖永贵,金松灿,等.京411及其衍生系苗期氮和磷利用效率相关性状的遗传分析[J].麦类作物学报,2015,35(6):737-746.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本实验。
京冬8号：记载于“韩金玲,杨晴,周印富,王文颇.冀东地区种植密度对小麦京冬8号抗倒伏能力和产量的影响[J].麦类作物学报,2015,35(05):667-673.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本实验。
济麦20：记载于“石玉华,田奇卓.不同栽培技术体系对济麦20产量与水分利用效率的影响[J].安徽农业科学,2016,44(03):25-26.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本实验。
鲁麦21：记载于“宋新颖,邬爽,张洪生,林琪,穆平.土壤水分胁迫对不同品种冬小麦生理特性的影响[J].华北农学报,2014,29(02):174-180.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本实验。
周麦23：记载于“杨丽娟,蒋志凯,盛坤,王映红,赵宗武.节水高效小麦品种筛选与应用研究[J].西北农业学报,2016,25(04):508-517.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本实验。
下述实施例中的第一内含子特有序列位于VRN-D4基因序列第2597-2806位。VRN-D4基因序列的NCBI登录号为KR422424。
下述实施例中的A367C位点位于VRN-D4编码基因序列的第367位，多态性为A/C。VRN-D4编码基因序列如序列表中的序列7所示。
实施例1、用于鉴定春化基因VRN-D4的引物对的设计及鉴定方法
一、用于鉴定春化基因VRN-D4的引物对的设计
第1内含子的保守区域RIP-3是春化基因表达调控的关键部位，是VRN-D4基因促进小麦早抽穗开花主要原因。与隐性vrn-1序列相比，显性等位变异VRN-D4保守区域RIP-3存在有3个邻近的特异性SNP(G2780C、T2783C、C2784T)。为此，基于保守区域RIP-3差异序列处设计下游引物VRND4-in1R；与此同时，在RIP-3的上游区域同样存在有3个邻近的特异性SNP(C2614T、T2617C、G2619T)，基于此处序列差异设计了上游引物VRND4-in1F。最终本发明根据春化基因VRN-D4(KR422424)、vrn-A1(AY747600)、vrn-B1(AY747604)和vrn-D1(AY747606)第一内含子序列多态性差异(图1)，设计了1对特异性引物VRND4-in1F与VRND4-in1R用于VRN-D4基因第一内含子特有序列的鉴定，所有特异性SNP位点均位于引物的3’端，以此增强标记结合的特异性。利用该标记对小麦材料进行检测时，携带有VRN-D4基因第一内含子特异序列的材料均能够扩增得到大小为210bp的目的条带(核苷酸序列如序列5所示)；反之，则无特异性条带的产生。
本发明根据春化基因VRN-D4(KR422424)和VRN-A1(AY747599)编码区第四外显子第367位SNP(A367C位点)所在位置差异序列(图2)，设计了一对引物dA367C-F与dA367C-R用于VRN-D4基因编码区第四外显子第367位SNP(A367C位点)的鉴定，该引物对扩增产物大小为321bp，核苷酸序列如序列6所示。该引物对所扩增的目标片段仅含有一个限制性内切酶的酶切位点，若A367C位点的碱基为C，那么扩增的产物能够被限制性内切酶BstNI所识别，将会产生大小分别为271bp和50bp的两个片段，若A367C位点的碱基为A，那么扩增的产物无法被限制性内切酶BstNI所识别，不会产生两个片段。
所有引物送由上海生工(Sangon Biotech)合成。上述引物的序列如下：
VRND4-in1F：GCAGATCCTATCGACTTTCGCGT(序列1)；
VRND4-in1R：GGTAAAACCCTTTTTGGCATACAGTCG(序列2)；
dA367C-F：GCCTATTTGTAGCATTTCTGTCATT(序列3)；
dA367C-R：GATATGTTTCAGTGAGCTTTCCA(序列4)。
二、春化基因VRN-D4的鉴定方法
1、DNA提取
采用改良的CTAB法(Rogers,S.O.,and A.J.Bendich,1985:Extraction of DNAfrom milligram amounts of fresh,herbarium and mummified plant tissues.Plantmolecular biology 5,69-76.)提取小麦总DNA，其中个别步骤有所调整，具体方法见下：
(1)称取约0.5-1.0g小麦叶片放入到2.0mL离心管中，加入液氮并快速研磨成粉末状。或者选取一粒饱满小麦籽粒，利用外力作用砸至粉末状。然后加入2×CTAB缓冲液700mL，放入65℃水浴锅中1h，每隔20min混匀一次。
(2)从水浴锅中取出离心管，12000×g离心10min。吸取上清液转移至1.5mL新离心管。
(3)加入700mL氯仿异戊醇混合液{三氯甲烷：异戊醇(V/V)＝24：1}，颠倒混匀至分层明显。12000×g离心10min，取600mL上清液移至1.5mL新离心管。
(4)重复步骤(3)。
(5)在上清液中加入等体积预冷的异丙醇。将离心管轻轻颠倒混匀约1min后，-20℃冰箱中沉降至少2h。
(6)取出后，12000×g离心10min。弃上清液，白色沉淀用70％乙醇洗涤后再用95％乙醇洗涤。
(7)风干后，加200mL已灭菌的双蒸水，现用或-20℃冰箱保存。
2、PCR反应
以步骤1提取的基因组DNA为模板，分别采用特异性引物VRND4-in1F/VRND4-in1R、dA367C-F/dA367C-R进行PCR扩增。
扩增反应在0.2mL PCR反应管中进行，反应液总体积为20μL，包括以下试剂：10μL2×EsTaq MasterMix(康为世纪，北京，中国)，0.8μL鉴别上游引物F(10pmol)，0.8μL鉴别下游引物R(10pmol)，1.4μL模板DNA(50-100ng/μL)，7μL无菌双蒸水。
PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，进行如下反应：预变性温度94℃，时间5min，循环内变性温度94℃，时间30s，退火温度(VRND4-in1标记用65℃；dA367C标记用60℃)，时间30s，复性温度72℃，时间为30s，34个循环后72℃延伸，时间为5min。
3、酶切与电泳检测
(1)第一内含子特有序列的鉴定
提前制备1.5％琼脂糖凝胶(每100mL琼脂糖中需添加8μL的由上海生工所生产的4S Green Plus无毒核酸染料)。待PCR扩增反应结束后，吸取8μL VRND4-in1F/VRND4-in1R扩增产物进行检测。在电压140V下电泳20min，电泳结束后在凝胶成像系统扫描后统计结果。
若VRND4-in1F/VRND4-in1R扩增得到大小为210bp的目标条带，则待测小麦中携带VRN-D4基因第一内含子的特有序列；若VRND4-in1F/VRND4-in1R无目标条带出现，则待测小麦无VRN-D4基因第一内含子特有序列。
(2)A367C位点鉴定
dA367C-F/dA367C-R扩增结束后，吸取5μL dA367C-F/dA367C-R扩增产物使用BstNI限制性内切酶进行酶切反应，得到酶切产物。酶切体系如下：PCR产物5μL、Nuclease-free水9μL、10×Buffer R 1μL、BstNI(Thermo，美国)1μL。轻柔混合酶切体系，短暂离心后在PCR仪器上37℃孵育4h。酶切结束后，吸取3.4μL酶切产物在8％的聚丙烯酰胺凝胶中进行检测。在电压1000V下电泳1h，电泳结束后经染色、显影步骤后统计结果。
若酶切产物含有大小为271bp和50bp的两个片段，则说明待测小麦中携带VRN-D4基因编码区特定的SNP位点，VRN-D4基因A367C位点为碱基C；若酶切产物仅含有一个大小为321bp的片段，则说明待测小麦不携带VRN-D4基因编码区特定的SNP位点，VRN-D4基因A367C位点为碱基A。
(3)VRN-D4基因鉴定
若VRND4-in1F/VRND4-in1R扩增得到大小为210bp的目标条带，且酶切产物含有大小为271bp和50bp的两个片段，则待测小麦携带VRN-D4基因，否则待测小麦不携带VRN-D4基因。
实施例2、用于鉴定春化基因VRN-D4的引物对的应用
一、实验材料
以表1中的小麦材料作为待测小麦。
表1、所用的小麦材料
二、利用前人开发分子标记检测小麦材料是否含有VRN-D4基因
采取同时检测5DS区域是否存在5AL大片段的插入和编码区是否存在特定SNP位点的策略鉴定待测小麦中是否含有VRN-D4基因。检测步骤参照文献：Kippes,N.,J.M.Debernardi,H.A.Vasquez-Gross,B.A.Akpinar,H.Budak,K.Kato,S.Chao,E.Akhunov,and J.Dubcovsky,2015:Identification of the VERNALIZATION 4 gene reveals theorigin of spring growth habit in ancient wheats from South Asia.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America 112,E5401-E5410.中的方法。具体方法如下：Kippes等设计了5对引物对VRN-D4基因进行鉴定，其中4对引物用于5DS区域是否存在5AL大片段的插入的鉴定，具体来说，VRND4-ins.F4/VRND4-ins.R3引物对用于鉴定大片段插入的上游区域；BJ315664F/BJ315664R引物对用于小麦5D染色体短臂上一段内参序列的鉴定；VRND4-ins2.F1/VRND4-ins2.R1引物对用于鉴定大片段插入的下游区域；BE606654F/BE606654R引物对用于5A染色体长臂上一段内参序列的鉴定；1对CAPS引物用于鉴定VRN-D4基因编码区从ATG开始第367位碱基的多态性。
按照前人PCR扩增条件及酶切条件对9个小麦品种(系)进行检测，结果发现：TDF材料(阳性对照)、新春10号和京红5号中均能够扩增得到大小为1440bp片段插入的上游区域目标产物和大小为1283bp片段插入的下游区域目标产物，说明这些材料中均有大片段的插入；TDC材料(阴性对照)、京411、京冬8号、济麦20、鲁麦21和周麦23中均无插入区域目标产物的扩增，说明这些材料中无大片段插入的产生；所有材料均能正常扩增得到大小为687bp的小麦5DS染色体上的内参序列产物和大小为534bp的位于5AL染色体上的内参序列产物(图3A)。
9个小麦品种(系)经过限制性内切酶BstNI酶切后发现：TDF材料、新春10号和京红5号中均存在有271bp、57bp和118bp大小的片段，说明这些材料中携带VRN-D4基因编码区特异性SNP位点，即第367位碱基均是C；TDC材料、京411、京冬8号、济麦20、鲁麦21和周麦23材料中只存在有328bp和118bp条带，说明这些材料中无VRN-D4基因编码区特异性SNP位点，因此无法被限制性内切酶BstNI的酶切位点所识别(图3B)。
依据大片段的插入和编码区变异的检测结果，9个小麦品种(系)中VRN-D4基因鉴定结果如下：TDF材料(阳性对照)、新春10号和京红5号中携带VRN-D4基因，而TDC材料(阴性对照)、京411、京冬8号、济麦20、鲁麦21和周麦23材料中均不携带VRN-D4基因。
三、本发明分子标记检测小麦材料是否含有VRN-D4基因
使用实施例1步骤一中设计的引物对VRND4-in1F和VRND4-in1R鉴定待测小麦是否含有VRN-D4基因第一内含子区域特有序列。具体方法同实施例1的步骤二。
利用该标记对9个小麦品种(系)进行PCR扩增和电泳检测(图4A)，新春10号、京红5号与TDF材料(阳性对照)均能够扩增得到一条210bp大小的特异性目标产物，说明这些材料携带有VRN-D4基因第一内含子特有序列；而在京411、京冬8号、济麦20、鲁麦21、周麦23和TDC材料(阴性对照)中并无特异性目标条带的产生，说明这些材料中无VRN-D4基因第一内含子特异序列的存在。
使用实施例1步骤一设计的另外1对引物dA367C-F和dA367C-R鉴定待测小麦编码区第367位碱基(A367C位点)的多态性。具体方法同实施例1的步骤二。
利用该标记对9个小麦品种(系)进行PCR扩增然后进行酶切检测(图4B)，新春10号、京红5号与TDF材料(阳性对照)均存在有大小为271bp和50bp的两个多态性条带。说明这些材料中携带VRN-D4基因编码区特定的SNP位点，即在编码区第367位碱基为C，因此能够被限制性内切酶BstNI的CC”wGG酶切位点所识别；而在京411、京冬8号、济麦20、鲁麦21、周麦23和TDC材料(阴性对照)中均只有一条大小位321bp的条带，说明在这些材料中无VRN-D4基因编码区特定的SNP位点，即在编码区第367位碱基为A，因此无法被限制性内切酶的酶切位点所识别。
依据VRN-D4基因第一内含子特有序列和编码区变异的检测结果，9个小麦品种(系)中VRN-D4基因的组成最终结果如下：TDF材料(阳性对照)、新春10号和京红5号中均携带VRN-D4基因，而TDC材料(阴性对照)、京411、京冬8号、济麦20、鲁麦21和周麦23材料中均不携带VRN-D4基因，其鉴定结果与前人开发标记的检测结果完全一致。
综上所述，本发明开发的标记既能够保证VRN-D4基因鉴定的准确性而且具有简便高效、节约时间、降低成本等优势。与前人鉴定方法的对比情况可以看出：利用本发明开发的标记对9个小麦品种(系)VRN-D4基因的鉴定结果与前人检测结果一致。前人方法鉴定VRN-D4基因需要用到5对引物，其中用于编码区鉴定的酶切时长需要8h，每个样品需要添加内切酶2μL；而本发明的方法仅需要2对引物就能够实现对VRN-D4基因的鉴定，其中用于编码区鉴定的酶切时长仅需4h，每个样品仅需要添加1μL(表2)。本发明的鉴定方法进行结果判读相比于前人标记更加简单明了、而且可以节约限制性内切酶用量、缩短酶切时长。
表2、前人标记与本发明标记的比对结果

Claims (9)

1.用于鉴定VRN-D4基因的成套引物对，由引物对甲和引物对乙组成；
所述引物对甲由VRND4-in1F和VRND4-in1R组成；
所述引物对乙由dA367C-F和dA367C-R组成；
所述VRND4-in1F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述VRND4-in1R为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述dA367C-F为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述dA367C-R为如下b3)或b4)：
b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。
2.权利要求1所述的成套引物对在如下c1)-c6)中任一种中的应用：
c1)制备鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因的产品；
c2)鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因；
c3)制备鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因的产品；
c4)鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因；
c5)制备小麦育种的产品；
c6)小麦育种。
3.含有权利要求1所述的成套引物对的试剂盒；
所述试剂盒的功能为如下d1)-d3)中任一种：
d1)鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因；
d2)鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因；
d3)小麦育种。
4.一种鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因的方法，包括如下步骤：
e1)以待测小麦的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1中所述的引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，得到PCR产物甲和PCR产物乙；
e2)用BstNI限制性内切酶酶切所述PCR产物乙，得到酶切产物；
电泳检测所述PCR产物和所述酶切产物判定待测小麦是否携带VRN-D4基因：
若引物对甲PCR扩增得到大小为210bp的目标条带，且所述酶切产物可以被BstNI限制性内切酶酶切产生大小为271bp和50bp的两个片段，则所述待测小麦携带或候选携带VRN-D4基因；否则不携带或候选不携带VRN-D4基因。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述大小为210bp的目标条带的核苷酸序列如序列5所示。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述大小为271bp的片段的核苷酸序列如序列6第1-271位所示；
所述大小为50bp的片段的核苷酸序列如序列6第272-321位所示。
7.权利要求1中所述的引物对甲或权利要求1中所述的引物对乙。
8.序列5所示的DNA分子或序列6所示的DNA分子。
9.权利要求1中所述的引物对甲或权利要求1中所述的引物对乙或序列5所示的DNA分子或序列6所示的DNA分子在如下c1)-c6)中任一种中的应用：
c1)制备鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因的产品；
c2)鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因；
c3)制备鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因的产品；
c4)鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因；
c5)制备小麦育种的产品；
c6)小麦育种。
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