JP2001333774A - 核酸抽出方法 - Google Patents
核酸抽出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 多糖類を多く含む試料中の核酸を簡便に且つ
効率的に抽出・回収できる方法の提供。 【解決手段】 試料を核酸抽出用溶解液中に懸濁するこ
とによって前記試料から前記溶解液中に核酸を抽出する
方法において、前記試料が多糖類を含有し、前記核酸抽
出用溶解液が前記多糖類を分解可能な糖質関連酵素を含
むものとした。
効率的に抽出・回収できる方法の提供。 【解決手段】 試料を核酸抽出用溶解液中に懸濁するこ
とによって前記試料から前記溶解液中に核酸を抽出する
方法において、前記試料が多糖類を含有し、前記核酸抽
出用溶解液が前記多糖類を分解可能な糖質関連酵素を含
むものとした。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、多糖類を多く含む
試料から核酸を抽出する方法に関するものである。
試料から核酸を抽出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】現在、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ
法）によるＤＮＡの増幅及び検出は、鋭敏かつ正確性が
高いことから、臨床診断や環境化学分析、食品衛生管理
等を中心とした様々な分野で応用されている。このＰＣ
Ｒ法は、試料中から抽出、精製したＤＮＡ又はＲＮＡ等
の核酸を鋳型としてＤＮＡ増幅を行うものであるため、
鋳型用の核酸の抽出には、簡便で効率が良いと共に精製
純度が高い方法が望まれている。
法）によるＤＮＡの増幅及び検出は、鋭敏かつ正確性が
高いことから、臨床診断や環境化学分析、食品衛生管理
等を中心とした様々な分野で応用されている。このＰＣ
Ｒ法は、試料中から抽出、精製したＤＮＡ又はＲＮＡ等
の核酸を鋳型としてＤＮＡ増幅を行うものであるため、
鋳型用の核酸の抽出には、簡便で効率が良いと共に精製
純度が高い方法が望まれている。
【０００３】ＰＣＲ法による鋳型ＤＮＡの増幅は、熱変
性によるＤＮＡ二本鎖の解離、プライマーとのアニーリ
ング、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応、という３段
階の繰り返しにより行うが、ＤＮＡポリメラーゼの酵素
反応阻害物質として、供雑多糖類やポリフェノール、Ｐ
ＣＲ阻害タンパク質等が知られている。
性によるＤＮＡ二本鎖の解離、プライマーとのアニーリ
ング、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応、という３段
階の繰り返しにより行うが、ＤＮＡポリメラーゼの酵素
反応阻害物質として、供雑多糖類やポリフェノール、Ｐ
ＣＲ阻害タンパク質等が知られている。
【０００４】従って、試料から鋳型となる核酸を抽出・
回収する際に、これらの阻害物質を除去しておくことが
望ましい。現在いくつかの方法が報告されており、例え
ば、ポリフェノールをポリビニルピロリドンにより吸着
除去する方法、またＰＣＲ反応を阻害するタンパク質を
フェノール等の有機溶媒に接触させて失活させる方法な
どが挙げられる。
回収する際に、これらの阻害物質を除去しておくことが
望ましい。現在いくつかの方法が報告されており、例え
ば、ポリフェノールをポリビニルピロリドンにより吸着
除去する方法、またＰＣＲ反応を阻害するタンパク質を
フェノール等の有機溶媒に接触させて失活させる方法な
どが挙げられる。
【０００５】一方、種子およびデンプン等は、炭水化物
として人類の食生活に欠くことができない栄養源である
ことから、様々な研究が行われており、特にその由来の
各種植物についての遺伝子研究が精力的に行われてい
る。このためにはまず対象となる試料から核酸を抽出
し、これをＰＣＲ法により増幅して実験に供することが
必要となる。
として人類の食生活に欠くことができない栄養源である
ことから、様々な研究が行われており、特にその由来の
各種植物についての遺伝子研究が精力的に行われてい
る。このためにはまず対象となる試料から核酸を抽出
し、これをＰＣＲ法により増幅して実験に供することが
必要となる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな多くの多糖類を含有する試料から核酸を抽出しよう
とする場合、核酸抽出用溶解液に試料を懸濁すると、多
糖類が液を吸収して膨潤し、溶解液中に核酸が抽出され
てなる核酸抽出液は粘性の高いものとなり、場合によ
り、多糖がゼリー状塊として発生してしまう。従って核
酸抽出液は扱い難く、該抽出液からの核酸の回収操作が
極めて困難となる。
うな多くの多糖類を含有する試料から核酸を抽出しよう
とする場合、核酸抽出用溶解液に試料を懸濁すると、多
糖類が液を吸収して膨潤し、溶解液中に核酸が抽出され
てなる核酸抽出液は粘性の高いものとなり、場合によ
り、多糖がゼリー状塊として発生してしまう。従って核
酸抽出液は扱い難く、該抽出液からの核酸の回収操作が
極めて困難となる。
【０００７】また、試料中の多糖類による含水を見込ん
で溶解液を増やしたとしても、やはり膨潤した多糖類が
核酸の回収率を低下させるだけでなく、全液量の増加が
操作を面倒にする。
で溶解液を増やしたとしても、やはり膨潤した多糖類が
核酸の回収率を低下させるだけでなく、全液量の増加が
操作を面倒にする。
【０００８】従来より、核酸抽出液中に夾雑する多糖類
を除去する目的で、少量の塩又はアルコールを共存させ
た状態で氷上静置することが行われているが、この方法
は、多糖類の析出が不充分であったり、抽出するサンプ
ルの状態により核酸の回収率が減少するなど、試料によ
って回収率にバラツキが生じやすいものであった。この
ような方法では、上記の如き多くの多糖類を含有する試
料に対して実際的な多糖類除去方法とはなり得ない。
を除去する目的で、少量の塩又はアルコールを共存させ
た状態で氷上静置することが行われているが、この方法
は、多糖類の析出が不充分であったり、抽出するサンプ
ルの状態により核酸の回収率が減少するなど、試料によ
って回収率にバラツキが生じやすいものであった。この
ような方法では、上記の如き多くの多糖類を含有する試
料に対して実際的な多糖類除去方法とはなり得ない。
【０００９】また、核酸吸着性物質に核酸抽出液中の核
酸を吸着させて回収するという別の方法も考えられる
が、多糖類は核酸吸着性物質と核酸との結合を妨げた
り、その粘性により操作自体を困難にする等の問題が多
い。
酸を吸着させて回収するという別の方法も考えられる
が、多糖類は核酸吸着性物質と核酸との結合を妨げた
り、その粘性により操作自体を困難にする等の問題が多
い。
【００１０】さらに、以上のような従来の方法では、い
ずれも核酸を抽出しようとする場合、抽出した核酸の量
や純度が、操作する人間の技量や個人差にも左右される
ものであった。このように、簡便で確実に試料からの核
酸の抽出・回収を行える方法は未だ開発されていない。
ずれも核酸を抽出しようとする場合、抽出した核酸の量
や純度が、操作する人間の技量や個人差にも左右される
ものであった。このように、簡便で確実に試料からの核
酸の抽出・回収を行える方法は未だ開発されていない。
【００１１】本発明の目的は、上記問題点に鑑み、多糖
類を多く含む試料中の核酸を簡便に且つ効率的に抽出・
回収できる方法を提供することにある。
類を多く含む試料中の核酸を簡便に且つ効率的に抽出・
回収できる方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、請求項１に記載の発明に係る核酸抽出方法は、試料
を核酸抽出用溶解液中に懸濁することによって前記試料
から前記溶解液中に核酸を抽出する方法において、前記
試料が多糖類を含有し、前記核酸抽出用溶解液が前記多
糖類を分解可能な糖質関連酵素を含むことを特徴とする
ものである。
め、請求項１に記載の発明に係る核酸抽出方法は、試料
を核酸抽出用溶解液中に懸濁することによって前記試料
から前記溶解液中に核酸を抽出する方法において、前記
試料が多糖類を含有し、前記核酸抽出用溶解液が前記多
糖類を分解可能な糖質関連酵素を含むことを特徴とする
ものである。
【００１３】また、請求項２に記載の発明に係る核酸抽
出方法は、請求項１に記載の核酸抽出方法において、前
記糖質関連酵素は、糖質加水分解酵素であることを特徴
とするものである。
出方法は、請求項１に記載の核酸抽出方法において、前
記糖質関連酵素は、糖質加水分解酵素であることを特徴
とするものである。
【００１４】また、請求項３に記載の発明に係る核酸抽
出方法は、請求項２に記載の核酸抽出方法において、前
記糖質加水分解酵素は、α−アミラーゼ、β−アミラー
ゼ、セルラーゼのうちの少なくとも一種であることを特
徴とするものである。
出方法は、請求項２に記載の核酸抽出方法において、前
記糖質加水分解酵素は、α−アミラーゼ、β−アミラー
ゼ、セルラーゼのうちの少なくとも一種であることを特
徴とするものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明においては、試料を懸濁し
て該試料から核酸を抽出するための溶解液中に、試料に
含有される多糖類を分解可能な糖質関連酵素を含むもの
であるため、試料を核酸抽出用溶解液に懸濁すると、酵
素反応により試料中の多糖類が分解され、多糖類が溶解
液を吸収、膨潤してゼリー状塊や粘性を生じることなく
液化される。従って、試料中の核酸は液層中に遊離した
状態とされ、従来の核酸抽出液の回収を困難にしていた
多糖類による悪影響を受けることなく、安定した条件で
粘性の低い核酸抽出液が容易に得られる。
て該試料から核酸を抽出するための溶解液中に、試料に
含有される多糖類を分解可能な糖質関連酵素を含むもの
であるため、試料を核酸抽出用溶解液に懸濁すると、酵
素反応により試料中の多糖類が分解され、多糖類が溶解
液を吸収、膨潤してゼリー状塊や粘性を生じることなく
液化される。従って、試料中の核酸は液層中に遊離した
状態とされ、従来の核酸抽出液の回収を困難にしていた
多糖類による悪影響を受けることなく、安定した条件で
粘性の低い核酸抽出液が容易に得られる。
【００１６】このように、試料が溶解液中の糖質関連酵
素で処理されて核酸が遊離している核酸抽出液は、遠心
分離操作で不要物を沈殿させれば核酸抽出上清が得ら
れ、この上清から容易且つ効率的に核酸を回収できる。
また、シリカ又は陰イオン交換体等のフィルターを用い
る方法でも、多糖類によるフィルターの目詰まりが解消
されるため、良好に抽出上清を回収することができる。
素で処理されて核酸が遊離している核酸抽出液は、遠心
分離操作で不要物を沈殿させれば核酸抽出上清が得ら
れ、この上清から容易且つ効率的に核酸を回収できる。
また、シリカ又は陰イオン交換体等のフィルターを用い
る方法でも、多糖類によるフィルターの目詰まりが解消
されるため、良好に抽出上清を回収することができる。
【００１７】本発明で用いる糖質関連酵素とは、試料に
含まれる多糖類に対する分解能を有するものであれば良
く、産業用に大量生産されている安価な試薬を用いるこ
とができる。従って、本発明の核酸抽出方法によれば、
試料に含まれる多糖類を除去するために特殊な合成ポリ
マーや有機溶媒等を使用する必要がなく、低コストで簡
便に核酸の抽出・回収を行える。
含まれる多糖類に対する分解能を有するものであれば良
く、産業用に大量生産されている安価な試薬を用いるこ
とができる。従って、本発明の核酸抽出方法によれば、
試料に含まれる多糖類を除去するために特殊な合成ポリ
マーや有機溶媒等を使用する必要がなく、低コストで簡
便に核酸の抽出・回収を行える。
【００１８】なお、本発明の糖質関連酵素としては、糖
質加水分解酵素を用いることが望ましい。該酵素は、多
糖類を少糖類にまで分解するものであるため、核酸抽出
液中の多糖類による粘性を確実に低下させて液化する効
果に優れている。また、本発明に用いられる糖質分解酵
素は、抽出した核酸を分解する核酸分解酵素や糖質分解
酵素を分解する蛋白質分解酵素、およびＰＣＲ反応等の
際に擬陽性となりうる糖質分解酵素由来の核酸を含まな
いことが望ましい。
質加水分解酵素を用いることが望ましい。該酵素は、多
糖類を少糖類にまで分解するものであるため、核酸抽出
液中の多糖類による粘性を確実に低下させて液化する効
果に優れている。また、本発明に用いられる糖質分解酵
素は、抽出した核酸を分解する核酸分解酵素や糖質分解
酵素を分解する蛋白質分解酵素、およびＰＣＲ反応等の
際に擬陽性となりうる糖質分解酵素由来の核酸を含まな
いことが望ましい。
【００１９】なお、本発明による核酸抽出方法が用いら
れる試料としては、主に植物の組織や培養細胞が考えら
れるが、これらの試料に専ら含まれる多糖類は、多数の
単糖がグリコシド結合によって脱水縮合した高分子化合
物（通常、構成糖１１以上）であって、貯蔵多糖または
栄養多糖としてのデンプン、グリコーゲン、セルロース
等の構造多糖である。
れる試料としては、主に植物の組織や培養細胞が考えら
れるが、これらの試料に専ら含まれる多糖類は、多数の
単糖がグリコシド結合によって脱水縮合した高分子化合
物（通常、構成糖１１以上）であって、貯蔵多糖または
栄養多糖としてのデンプン、グリコーゲン、セルロース
等の構造多糖である。
【００２０】そこで、これらの多糖類を対象とする場
合、前記糖質加水分解酵素の具体的なものとしては、例
えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、セルラーゼが
挙げられ、これらのうちの少なくとも一種を核酸抽出用
溶解液中に含めることが望ましい。即ち、α−１，４グ
ルコシド結合を有する多糖を加水分解する酵素（アミラ
ーゼ等）および／またはβ−１，４グルコシド結合を有
する多糖を加水分解する酵素（セルラーゼ等）を用いれ
ば上記多糖類をほぼ分解することができる。
合、前記糖質加水分解酵素の具体的なものとしては、例
えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、セルラーゼが
挙げられ、これらのうちの少なくとも一種を核酸抽出用
溶解液中に含めることが望ましい。即ち、α−１，４グ
ルコシド結合を有する多糖を加水分解する酵素（アミラ
ーゼ等）および／またはβ−１，４グルコシド結合を有
する多糖を加水分解する酵素（セルラーゼ等）を用いれ
ば上記多糖類をほぼ分解することができる。
【００２１】なお、このような加水分解酵素は各種のも
のがあるが、被分解物を特定数のグルコース単位を切り
離していくエキソ型分解様式の酵素（βーアミラーゼは
マルトース単位のエキソ型）と、ほぼランダムに近い分
解様式のエンド型分解酵素とに大別できる。本発明にお
いては、エンド型の酵素の方が、液化力効果の強さから
より望ましい。
のがあるが、被分解物を特定数のグルコース単位を切り
離していくエキソ型分解様式の酵素（βーアミラーゼは
マルトース単位のエキソ型）と、ほぼランダムに近い分
解様式のエンド型分解酵素とに大別できる。本発明にお
いては、エンド型の酵素の方が、液化力効果の強さから
より望ましい。
【００２２】本発明の核酸抽出法を用いるのに適した試
料の例としては、主なものに前述の如き植物の組織や培
養細胞が挙げられるが、具体的には、植物細胞では種
子、根、茎、葉、果実など、培養細胞ではシュート、カ
ルスなどがある。植物としては、一般名称でマツ、イチ
ョウ、オリーブ、カカオ、コーヒーなどの木本性植物
や、コケ・シダ類、あるいはイネ、コムギ、オオムギ、
ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、ナタネ、
タバコ、シロイヌナズナ等の草本性植物が挙げられる。
料の例としては、主なものに前述の如き植物の組織や培
養細胞が挙げられるが、具体的には、植物細胞では種
子、根、茎、葉、果実など、培養細胞ではシュート、カ
ルスなどがある。植物としては、一般名称でマツ、イチ
ョウ、オリーブ、カカオ、コーヒーなどの木本性植物
や、コケ・シダ類、あるいはイネ、コムギ、オオムギ、
ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、ナタネ、
タバコ、シロイヌナズナ等の草本性植物が挙げられる。
【００２３】また、植物以外の動物または微生物の組織
や培養細胞を試料とする場合も、試料中にグリコーゲン
等の多糖が含まれるか、あるいは培養時に炭素源として
デンプンやデキストリン等の多糖類が添加されていたの
であれば、試料にも多糖類が多く混在していることか
ら、本発明の核酸抽出方法が有効である。
や培養細胞を試料とする場合も、試料中にグリコーゲン
等の多糖が含まれるか、あるいは培養時に炭素源として
デンプンやデキストリン等の多糖類が添加されていたの
であれば、試料にも多糖類が多く混在していることか
ら、本発明の核酸抽出方法が有効である。
【００２４】また、本発明に使用する核酸抽出用溶解液
は、核酸と糖質関連酵素を安定した状態で一定に保つこ
とのできる緩衝液をその主要構成成分とする。特に種類
が限定されるものではないが、例えば、トリス・塩酸、
酢酸・酢酸ナトリウム、リン酸・リン酸ナトリウム、リ
ン酸・リン酸カリウム等の従来から一般的に用いられて
いる緩衝液を用いることができる。
は、核酸と糖質関連酵素を安定した状態で一定に保つこ
とのできる緩衝液をその主要構成成分とする。特に種類
が限定されるものではないが、例えば、トリス・塩酸、
酢酸・酢酸ナトリウム、リン酸・リン酸ナトリウム、リ
ン酸・リン酸カリウム等の従来から一般的に用いられて
いる緩衝液を用いることができる。
【００２５】さらに、核酸抽出用溶解液には、試料から
効率的に核酸を遊離させたり、試料に夾雑するタンパク
質を変性させるための界面活性剤や、糖質関連酵素の活
性化や安定性向上のための金属イオン等が適宜加えられ
る。
効率的に核酸を遊離させたり、試料に夾雑するタンパク
質を変性させるための界面活性剤や、糖質関連酵素の活
性化や安定性向上のための金属イオン等が適宜加えられ
る。
【００２６】例えば、セチルトリメチルアンモニウムブ
ロミド等の陽イオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリ
ウム、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム等の陰イ
オン性界面活性剤、トリトンＸ−１００、ツイーン２０
等の非イオン性界面活性剤、Ｎ−ドデシルベタイン等の
両性界面活性剤や、塩化カルシウム等の金属イオンなど
が挙げられる。
ロミド等の陽イオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリ
ウム、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム等の陰イ
オン性界面活性剤、トリトンＸ−１００、ツイーン２０
等の非イオン性界面活性剤、Ｎ−ドデシルベタイン等の
両性界面活性剤や、塩化カルシウム等の金属イオンなど
が挙げられる。
【００２７】また、必要に応じてＤＮＡ分解酵素の活性
を不活化するＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）の様
なキレート試薬や、タンパク質変性剤としてグアニジン
塩酸塩等のカオトロピック塩や、尿素等を加えても良
い。但し、本発明に用いる界面活性剤、キレート剤、タ
ンパク質変性剤は、特に限定されるものではないが、い
ずれも糖質関連酵素の活性を妨げることなく、且つ核酸
抽出液からの核酸の回収操作を妨げないものとする。
を不活化するＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）の様
なキレート試薬や、タンパク質変性剤としてグアニジン
塩酸塩等のカオトロピック塩や、尿素等を加えても良
い。但し、本発明に用いる界面活性剤、キレート剤、タ
ンパク質変性剤は、特に限定されるものではないが、い
ずれも糖質関連酵素の活性を妨げることなく、且つ核酸
抽出液からの核酸の回収操作を妨げないものとする。
【００２８】なお、核酸抽出用溶解液には、核酸抽出液
からの核酸の回収操作を行う際に必要な試薬、例えばカ
オトロピック塩や、エチルアルコール、イソプロピルア
ルコール等のアルコール、塩化ナトリウム等の塩を予め
加えておくことも可能である。
からの核酸の回収操作を行う際に必要な試薬、例えばカ
オトロピック塩や、エチルアルコール、イソプロピルア
ルコール等のアルコール、塩化ナトリウム等の塩を予め
加えておくことも可能である。
【００２９】
【実施例１】以下に、本発明の第１の実施例として、試
料であるコーンスターチから、糖質関連酵素としてα−
アミラーゼを用いてＤＮＡを抽出・回収する場合を説明
する。核酸抽出用溶解液は、枯草菌由来のα−アミラー
ゼ（２００ユニット）、３％塩化ナトリウム、１０ｍＭ
塩化カルシウム、０．５％トリトンＸ−１００、５％ツ
イーン２０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）からなるものとした。
料であるコーンスターチから、糖質関連酵素としてα−
アミラーゼを用いてＤＮＡを抽出・回収する場合を説明
する。核酸抽出用溶解液は、枯草菌由来のα−アミラー
ゼ（２００ユニット）、３％塩化ナトリウム、１０ｍＭ
塩化カルシウム、０．５％トリトンＸ−１００、５％ツ
イーン２０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）からなるものとした。
【００３０】なお、酵素活性はヨウ素呈色法により測定
した。即ち、４０℃、５分間保温した１％可溶性デンプ
ン１ｍＬを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に酵
素液０．１ｍＬを加えて撹拌後、４０℃、１０分間反応
した。この反応液を０．１ｍＬ分注したものに０．１Ｎ
塩酸を１ｍＬ加えて酵素活性を止めた。この液から５０
μＬを分注し、０．００５％Ｉ２ ／０．０５％ ＫＩ
を１ｍＬ加えた際にデンプンが呈色する青紫色を６６０
ｎｍの吸光度で測定した。上記測定条件において、酵素
液に代わって前記緩衝液を加えた以外は同一の行程を経
たデンプン溶液を対照として、青色呈色が１％低下する
酵素量を１ユニットと定義した。
した。即ち、４０℃、５分間保温した１％可溶性デンプ
ン１ｍＬを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に酵
素液０．１ｍＬを加えて撹拌後、４０℃、１０分間反応
した。この反応液を０．１ｍＬ分注したものに０．１Ｎ
塩酸を１ｍＬ加えて酵素活性を止めた。この液から５０
μＬを分注し、０．００５％Ｉ２ ／０．０５％ ＫＩ
を１ｍＬ加えた際にデンプンが呈色する青紫色を６６０
ｎｍの吸光度で測定した。上記測定条件において、酵素
液に代わって前記緩衝液を加えた以外は同一の行程を経
たデンプン溶液を対照として、青色呈色が１％低下する
酵素量を１ユニットと定義した。
【００３１】本実施例１には、試料として性状の異なる
５種類のコーンスターチ、即ち、順にコーンスターチ、
α化コーンスターチ、ワキシーコーンスターチ、α化の
可能性があるワキシーコーンスターチ、α化ワキシーコ
ーンスターチ、を用いた。各コーンスターチを０．１５
ｇ秤量してそれぞれ上記溶解液１．５ｍＬに加え、懸濁
し、９０℃、３０分間保温した。保温後の各溶液は、コ
ーンスターチ由来の夾雑多糖がα−アミラーゼの効果に
より充分に分解されて、完全に液状化したＤＮＡ抽出液
となった。これらＤＮＡ抽出液をそれぞれ遠心分離して
第１〜第５のＤＮＡ抽出上清を得た。
５種類のコーンスターチ、即ち、順にコーンスターチ、
α化コーンスターチ、ワキシーコーンスターチ、α化の
可能性があるワキシーコーンスターチ、α化ワキシーコ
ーンスターチ、を用いた。各コーンスターチを０．１５
ｇ秤量してそれぞれ上記溶解液１．５ｍＬに加え、懸濁
し、９０℃、３０分間保温した。保温後の各溶液は、コ
ーンスターチ由来の夾雑多糖がα−アミラーゼの効果に
より充分に分解されて、完全に液状化したＤＮＡ抽出液
となった。これらＤＮＡ抽出液をそれぞれ遠心分離して
第１〜第５のＤＮＡ抽出上清を得た。
【００３２】本実施例１の対照として、α−アミラーゼ
を含まない以外は本実施例と同組成の溶解液を用いて、
同様に溶解液１．５ｍＬに、コーンスターチ０．１５ｇ
を秤量して加えて懸濁し、９０℃、３０分間保温した。
しかし、保温処理後は液分がほとんど多糖類に含水され
て全体が糊状となり、ＤＮＡ抽出液として回収可能な液
層が得られず、以降の操作は続行不可能となった。
を含まない以外は本実施例と同組成の溶解液を用いて、
同様に溶解液１．５ｍＬに、コーンスターチ０．１５ｇ
を秤量して加えて懸濁し、９０℃、３０分間保温した。
しかし、保温処理後は液分がほとんど多糖類に含水され
て全体が糊状となり、ＤＮＡ抽出液として回収可能な液
層が得られず、以降の操作は続行不可能となった。
【００３３】本実施例１における上記第１から第５の抽
出上清の１．２ｍＬを、それぞれＤＥＡＥ−セルロース
紙を敷いたカラムに供した。該カラムによる濾過で、各
抽出上清中のＤＮＡをそれぞれＤＥＡＥ−セルロース紙
に吸着させた。上清濾過後は、前記核酸抽出用溶解液を
０．６ｍＬずつカラムに供して各ＤＥＡＥ−セルロース
紙の吸着物を２回ずつ洗浄した。
出上清の１．２ｍＬを、それぞれＤＥＡＥ−セルロース
紙を敷いたカラムに供した。該カラムによる濾過で、各
抽出上清中のＤＮＡをそれぞれＤＥＡＥ−セルロース紙
に吸着させた。上清濾過後は、前記核酸抽出用溶解液を
０．６ｍＬずつカラムに供して各ＤＥＡＥ−セルロース
紙の吸着物を２回ずつ洗浄した。
【００３４】次に、１０％塩化ナトリウムを含む３０ｍ
Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．６ｍＬずつを
用いて各ＤＥＡＥ−セルロース紙に吸着したＤＮＡを溶
出し、この各溶出液にぞれぞれ２μＬの高分子キャリア
ー（エタ沈メイト：ニッポンジーン社製）と６０μＬの
３Ｍ酢酸ナトリウム塩、０．６ｍＬのイソプロパノール
を加えて分別沈殿を行った。
Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．６ｍＬずつを
用いて各ＤＥＡＥ−セルロース紙に吸着したＤＮＡを溶
出し、この各溶出液にぞれぞれ２μＬの高分子キャリア
ー（エタ沈メイト：ニッポンジーン社製）と６０μＬの
３Ｍ酢酸ナトリウム塩、０．６ｍＬのイソプロパノール
を加えて分別沈殿を行った。
【００３５】それぞれ遠心分離後、得られた各沈殿物を
１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、風乾した後、２０
μＬのＴＥバッファーに溶解して第１〜第５の抽出ＤＮ
Ａを回収した。アルコール沈殿後のＤＮＡ沈殿物には、
いずれもゼリー状に析出する夾雑多糖は全く観察されな
かった。
１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、風乾した後、２０
μＬのＴＥバッファーに溶解して第１〜第５の抽出ＤＮ
Ａを回収した。アルコール沈殿後のＤＮＡ沈殿物には、
いずれもゼリー状に析出する夾雑多糖は全く観察されな
かった。
【００３６】以上の方法で試料コーンスターチから抽
出、回収した第１〜第５のＤＮＡを鋳型として以下に示
す手順でそれぞれＰＣＲ反応を行ってターゲットＤＮＡ
を増幅させ、抽出ＤＮＡの回収を確認した。このＰＣＲ
反応では、トウモロコシ由来のアミロプラスト特異的通
過蛋白（ Amyloplast-specific transit protein）遺伝
子をターゲットＤＮＡとし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（Gene Taq：ニッポンジーン社製）を用いた。
出、回収した第１〜第５のＤＮＡを鋳型として以下に示
す手順でそれぞれＰＣＲ反応を行ってターゲットＤＮＡ
を増幅させ、抽出ＤＮＡの回収を確認した。このＰＣＲ
反応では、トウモロコシ由来のアミロプラスト特異的通
過蛋白（ Amyloplast-specific transit protein）遺伝
子をターゲットＤＮＡとし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（Gene Taq：ニッポンジーン社製）を用いた。
【００３７】また、ＰＣＲ用プライマーには、トウモロ
コシ由来のアミロプラスト特異的通過蛋白遺伝子を鋳型
としてＰＣＲ増幅を行った場合、全長１０４ｂｐ、中央
部分にBam HIサイトを含むＤＮＡ断片が得られるように
設計したもの（5'-aaatgcatgctgttctgcaggcag-3'：配列
番号１および、5'-acgaagactgcaactcttaccgtat-3'：配
列番号２）を用いた。これらＰＣＲ用プライマーは、後
述する配列表の配列番号１及び配列番号２として記載し
た。
コシ由来のアミロプラスト特異的通過蛋白遺伝子を鋳型
としてＰＣＲ増幅を行った場合、全長１０４ｂｐ、中央
部分にBam HIサイトを含むＤＮＡ断片が得られるように
設計したもの（5'-aaatgcatgctgttctgcaggcag-3'：配列
番号１および、5'-acgaagactgcaactcttaccgtat-3'：配
列番号２）を用いた。これらＰＣＲ用プライマーは、後
述する配列表の配列番号１及び配列番号２として記載し
た。
【００３８】まず本実施例１で回収された第１〜第５の
抽出ＤＮＡのうちそれぞれ２μＬを用いて、ＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼおよびプライマー、基質ｄＮＴＰ混合液
を含む総量２０μＬの反応系で、９５℃で５分間ホット
スタートを行った後、第一段階として９５℃で２０秒間
（熱変性によるＤＮＡ２本鎖の解離）、第二段階として
７０℃で２０秒間（アニーリング）、第三段階として７
２℃で２０秒間（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる伸長
反応）という３段階のサイクルを４０回繰り返すことに
より、ターゲットＤＮＡを増幅した。
抽出ＤＮＡのうちそれぞれ２μＬを用いて、ＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼおよびプライマー、基質ｄＮＴＰ混合液
を含む総量２０μＬの反応系で、９５℃で５分間ホット
スタートを行った後、第一段階として９５℃で２０秒間
（熱変性によるＤＮＡ２本鎖の解離）、第二段階として
７０℃で２０秒間（アニーリング）、第三段階として７
２℃で２０秒間（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる伸長
反応）という３段階のサイクルを４０回繰り返すことに
より、ターゲットＤＮＡを増幅した。
【００３９】それぞれ増幅したＤＮＡを含む第１〜第５
のＰＣＲ反応液のうち、それぞれ５μＬを３％アガロー
ス２１（商品名：ニッポンジーン社製）ゲルにて電気泳
動を行った。このゲルを臭化エチジウムにより染色して
紫外線下で観察したところ、図１の模式図に示すよう
に、実験に供した５種類全ての試料コーンスターチから
目的の１０４ｂｐにターゲット遺伝子の明瞭なバンド
（レーン１〜５）が確認できた。
のＰＣＲ反応液のうち、それぞれ５μＬを３％アガロー
ス２１（商品名：ニッポンジーン社製）ゲルにて電気泳
動を行った。このゲルを臭化エチジウムにより染色して
紫外線下で観察したところ、図１の模式図に示すよう
に、実験に供した５種類全ての試料コーンスターチから
目的の１０４ｂｐにターゲット遺伝子の明瞭なバンド
（レーン１〜５）が確認できた。
【００４０】なお、このターゲット遺伝子は制限酵素 B
am HI のサイトを含むことから、上記第１〜第５のＰＣ
Ｒ産物を前記制限酵素でそれぞれ処理したもの（レーン
９〜１３）と、陽性コントロールとしてトウモロコシ葉
からＣＴＡＢ法により抽出したＤＮＡ由来のターゲット
遺伝子（レーン７）を前記制限酵素で処理したもの（レ
ーン１４）を、ｐＵＣ１９ＤＮＡを制限酵素ＭspＩで消
化した分子量マーカー（マーカー１１：ニッポンジーン
社製，レーン８）と共に、電気泳動した。
am HI のサイトを含むことから、上記第１〜第５のＰＣ
Ｒ産物を前記制限酵素でそれぞれ処理したもの（レーン
９〜１３）と、陽性コントロールとしてトウモロコシ葉
からＣＴＡＢ法により抽出したＤＮＡ由来のターゲット
遺伝子（レーン７）を前記制限酵素で処理したもの（レ
ーン１４）を、ｐＵＣ１９ＤＮＡを制限酵素ＭspＩで消
化した分子量マーカー（マーカー１１：ニッポンジーン
社製，レーン８）と共に、電気泳動した。
【００４１】図１のレーン９〜１３，およびレーン１４
から明らかなように、レーン１〜５およびレーン７の１
０４ｂｐに認めれらた５種類のコーンスターチＤＮＡ由
来のターゲット遺伝子および陽性コントロールのターゲ
ット遺伝子は、全て制限酵素処理により消失し、新たに
２本のバンドが確認された。これに加えてレーン７に見
られるトウモロコシ葉ＤＮＡ由来のバンドがそれぞれ５
種類のコーンスターチから増幅したレーン１〜５に見ら
れるバンド長と完全に一致したこと、レーン６の鋳型と
なるＤＮＡを含まないでＰＣＲ反応を行った反応液では
１０４ｂｐのバンドが得られなかったことから、各コー
ンスターチからの抽出物を鋳型ＤＮＡとして増幅して得
たＤＮＡはターゲット遺伝子であることが確認された。
から明らかなように、レーン１〜５およびレーン７の１
０４ｂｐに認めれらた５種類のコーンスターチＤＮＡ由
来のターゲット遺伝子および陽性コントロールのターゲ
ット遺伝子は、全て制限酵素処理により消失し、新たに
２本のバンドが確認された。これに加えてレーン７に見
られるトウモロコシ葉ＤＮＡ由来のバンドがそれぞれ５
種類のコーンスターチから増幅したレーン１〜５に見ら
れるバンド長と完全に一致したこと、レーン６の鋳型と
なるＤＮＡを含まないでＰＣＲ反応を行った反応液では
１０４ｂｐのバンドが得られなかったことから、各コー
ンスターチからの抽出物を鋳型ＤＮＡとして増幅して得
たＤＮＡはターゲット遺伝子であることが確認された。
【００４２】
【実施例２】次に、前述の実施例１における試料コーン
スターチから２種、順にコーンスターチ、α化コーンス
ターチを選び、各０．１５ｇずつを秤量し、核酸抽出用
溶解液を用いてスターチに含まれる多糖類を分解した。
核酸抽出用溶解液の組成は、前述の枯草菌由来のα-ア
ミラーゼ（２００ユニット）、５００ｍＭ塩化ナトリウ
ム、１０ｍＭ塩化カルシウム、０．５％トリトンＸ-１
００、５％ツイーン２０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのト
リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）からなるものとした。
スターチから２種、順にコーンスターチ、α化コーンス
ターチを選び、各０．１５ｇずつを秤量し、核酸抽出用
溶解液を用いてスターチに含まれる多糖類を分解した。
核酸抽出用溶解液の組成は、前述の枯草菌由来のα-ア
ミラーゼ（２００ユニット）、５００ｍＭ塩化ナトリウ
ム、１０ｍＭ塩化カルシウム、０．５％トリトンＸ-１
００、５％ツイーン２０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのト
リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）からなるものとした。
【００４３】次いで、コーンスターチのＤＮＡを含む核
酸抽出用溶解液をＤＥＡＥ基を有するシリカ担体を充填
したカラム（Genomic tip １００／Ｇ；キアゲン社製）
に供し、各抽出上清中のＤＮＡを吸着した。これに続く
カラム洗浄、ＤＮＡ溶出及び回収の操作は、Genomic ti
pのマニュアルに基づき、Genomic DNA buffer set（キ
アゲン社製）を用いて行った。具体的には、４ｍＬのバ
ッファーＱＢＴにて平衡化したGenomic tip １００／Ｇ
カラムに、試料コーンスターチのＤＮＡを含む核酸抽出
用溶解液を供した。７．５ｍＬのバッファーＱＣで２度
洗浄した後、５ｍＬのバッファーＱＦにて溶出した。こ
の溶出液に２μＬの高分子キャリアー（エタ沈メイト：
ニッポンジーン社製）と３．５ｍＬのイソプロパノール
を加えて遠心する事によりＤＮＡを沈殿させ、沈殿物を
２ｍＬの７０％冷エタノールで洗浄した。沈殿物を乾燥
後、４０μＬのＴＥバッファーに溶解した。ここでもア
ルコール沈殿後のＤＮＡ沈殿物には、いずれもゼリー状
に析出する夾雑多糖は全く観察されなかった。
酸抽出用溶解液をＤＥＡＥ基を有するシリカ担体を充填
したカラム（Genomic tip １００／Ｇ；キアゲン社製）
に供し、各抽出上清中のＤＮＡを吸着した。これに続く
カラム洗浄、ＤＮＡ溶出及び回収の操作は、Genomic ti
pのマニュアルに基づき、Genomic DNA buffer set（キ
アゲン社製）を用いて行った。具体的には、４ｍＬのバ
ッファーＱＢＴにて平衡化したGenomic tip １００／Ｇ
カラムに、試料コーンスターチのＤＮＡを含む核酸抽出
用溶解液を供した。７．５ｍＬのバッファーＱＣで２度
洗浄した後、５ｍＬのバッファーＱＦにて溶出した。こ
の溶出液に２μＬの高分子キャリアー（エタ沈メイト：
ニッポンジーン社製）と３．５ｍＬのイソプロパノール
を加えて遠心する事によりＤＮＡを沈殿させ、沈殿物を
２ｍＬの７０％冷エタノールで洗浄した。沈殿物を乾燥
後、４０μＬのＴＥバッファーに溶解した。ここでもア
ルコール沈殿後のＤＮＡ沈殿物には、いずれもゼリー状
に析出する夾雑多糖は全く観察されなかった。
【００４４】本実施例２で回収した２種の試料コーンス
ターチ抽出ＤＮＡをそれぞれ、原液、１０倍希釈、１０
０倍希釈したもの全６種について、各２μＬを用いてＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー、基質ｄＮＴ
Ｐ混合液を含む総量２５μＬの反応系を調製した。次
に、９５℃１０分間ホットスタートを行った後、第一段
階として９５℃で３０秒間、第二段階として６０℃で３
０秒間、第三段階として７２℃で３０秒間という３段階
のサイクルを４０回繰り返すことにより、ターゲットＤ
ＮＡを増幅した。
ターチ抽出ＤＮＡをそれぞれ、原液、１０倍希釈、１０
０倍希釈したもの全６種について、各２μＬを用いてＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー、基質ｄＮＴ
Ｐ混合液を含む総量２５μＬの反応系を調製した。次
に、９５℃１０分間ホットスタートを行った後、第一段
階として９５℃で３０秒間、第二段階として６０℃で３
０秒間、第三段階として７２℃で３０秒間という３段階
のサイクルを４０回繰り返すことにより、ターゲットＤ
ＮＡを増幅した。
【００４５】なお、ＰＣＲ用プライマーには、トウモロ
コシ由来のツェイン（zein）遺伝子を増幅した際に９９
ｂｐの増幅ＤＮＡが得られるように設計した２種のもの
（5'-atggcgtgtccgtccctgat-3'：配列番号３、5'-tgaca
tcatgttaggcgtcatc-3'：配列番号４）を用いた。これら
ＰＣＲ用プライマーは、後述する配列表の配列番号３及
び配列番号４として記載した。
コシ由来のツェイン（zein）遺伝子を増幅した際に９９
ｂｐの増幅ＤＮＡが得られるように設計した２種のもの
（5'-atggcgtgtccgtccctgat-3'：配列番号３、5'-tgaca
tcatgttaggcgtcatc-3'：配列番号４）を用いた。これら
ＰＣＲ用プライマーは、後述する配列表の配列番号３及
び配列番号４として記載した。
【００４６】以上の６種のＰＣＲ反応液５μＬを、前記
分子量マーカー１１（レーン５および１０）と共に、そ
れぞれ前述の３％アガロースゲルにて電気泳動した。こ
れを臭化エチジウム染色し、紫外線下で観察したものが
図２である。図２のレーン２〜４（順に、コーンスター
チより抽出・回収したＤＮＡの原液、１０倍希釈、１０
０倍希釈したものを鋳型とした増幅産物）に示すとお
り、レーン２および３に目的の９９bpにターゲット遺伝
子の明瞭なバンドが確認できた。他方、図２のレーン７
〜９（順に、α化コーンスターチより抽出・回収したＤ
ＮＡの原液、１０倍希釈、１００倍希釈したものを鋳型
とした増幅産物）では、レーン７および８に９９bpの明
瞭なバンドが確認できた。レーン１および６に示した鋳
型となるＤＮＡを含まない陰性コントロールでは、ター
ゲット遺伝子のバンドは得られなかった。次に、これら
のＤＮＡ増幅断片をpGEM-Tベクター（プロメガ社製）へ
クローニングし、M１３（-２１）プライマーにより塩基
配列を調べたところ、既知の配列と一致した。これらの
結果、各試料コーンスターチから抽出した鋳型ＤＮＡは
ターゲットＤＮＡであるツェインをコードするＤＮＡ配
列を含むことが示された。
分子量マーカー１１（レーン５および１０）と共に、そ
れぞれ前述の３％アガロースゲルにて電気泳動した。こ
れを臭化エチジウム染色し、紫外線下で観察したものが
図２である。図２のレーン２〜４（順に、コーンスター
チより抽出・回収したＤＮＡの原液、１０倍希釈、１０
０倍希釈したものを鋳型とした増幅産物）に示すとお
り、レーン２および３に目的の９９bpにターゲット遺伝
子の明瞭なバンドが確認できた。他方、図２のレーン７
〜９（順に、α化コーンスターチより抽出・回収したＤ
ＮＡの原液、１０倍希釈、１００倍希釈したものを鋳型
とした増幅産物）では、レーン７および８に９９bpの明
瞭なバンドが確認できた。レーン１および６に示した鋳
型となるＤＮＡを含まない陰性コントロールでは、ター
ゲット遺伝子のバンドは得られなかった。次に、これら
のＤＮＡ増幅断片をpGEM-Tベクター（プロメガ社製）へ
クローニングし、M１３（-２１）プライマーにより塩基
配列を調べたところ、既知の配列と一致した。これらの
結果、各試料コーンスターチから抽出した鋳型ＤＮＡは
ターゲットＤＮＡであるツェインをコードするＤＮＡ配
列を含むことが示された。
【００４７】
【実施例３】次に、本発明の第３の実施例として、試料
に市販されている６種類のコーンスナック菓子を選択
し、これらの試料から、糖質関連酵素としてα−アミラ
ーゼを用いてＤＮＡを抽出・回収する場合を説明する。
用いた第１〜第６のコーンスナック菓子は、順にカール
・サラダ味（商品名：カルビー社製）、黒糖コーン（商
品名：南国製菓社製）、もろこし輪太郎（商品名：菓道
社製）、おじゃる丸コーンスナック・プリン味（商品
名：亀田製菓社製）、うまい棒・メンタイ味（商品名：
リスカ社製）、チーズビット（商品面：カルビー社
製）、というコーンの加熱調味製品である。
に市販されている６種類のコーンスナック菓子を選択
し、これらの試料から、糖質関連酵素としてα−アミラ
ーゼを用いてＤＮＡを抽出・回収する場合を説明する。
用いた第１〜第６のコーンスナック菓子は、順にカール
・サラダ味（商品名：カルビー社製）、黒糖コーン（商
品名：南国製菓社製）、もろこし輪太郎（商品名：菓道
社製）、おじゃる丸コーンスナック・プリン味（商品
名：亀田製菓社製）、うまい棒・メンタイ味（商品名：
リスカ社製）、チーズビット（商品面：カルビー社
製）、というコーンの加熱調味製品である。
【００４８】用いた核酸抽出用溶解液は、前記実施例１
と同様の枯草菌由来のα−アミラーゼ（２００ユニッ
ト）および５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カ
ルシウム、０．５％トリトンＸ−１００、５％ツイーン
２０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）からなるものとした。
と同様の枯草菌由来のα−アミラーゼ（２００ユニッ
ト）および５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カ
ルシウム、０．５％トリトンＸ−１００、５％ツイーン
２０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）からなるものとした。
【００４９】各試料は、それぞれ細かく砕いたものを
０．８ｇずつ秤量して上記溶解液８ｍＬに加えて懸濁
し、９０℃３０分間保温した後、遠心分離により第１〜
第６のＤＮＡ抽出上清を得た。本実施例２においても、
いずれの試料もα−アミラーゼの効果により多糖が充分
に分解されており、ＤＮＡ抽出液回収操作は容易であっ
た。
０．８ｇずつ秤量して上記溶解液８ｍＬに加えて懸濁
し、９０℃３０分間保温した後、遠心分離により第１〜
第６のＤＮＡ抽出上清を得た。本実施例２においても、
いずれの試料もα−アミラーゼの効果により多糖が充分
に分解されており、ＤＮＡ抽出液回収操作は容易であっ
た。
【００５０】以下、前記実施例２と同一の手順で、４ｍ
ＬのバッファーＱＢＴにて平衡化したGenomic tip １０
０／Ｇカラムに、ＤＮＡを含む核酸抽出用溶解液の上清
６種をそれぞれ供した。７．５ｍＬのバッファーＱＣで
２度洗浄した後、５ｍＬのバッファーＱＦにて溶出し
た。これら各溶出液に２μＬの高分子キャリアーである
エタ沈メイトと３．５ｍＬのイソプロパノールを加えて
遠心する事によりＤＮＡを沈殿させ、この沈殿物を２ｍ
Ｌの７０％冷エタノールで洗浄した。沈殿物を乾燥後、
４０μＬのＴＥバッファーに溶解した。ここでもアルコ
ール沈殿後のＤＮＡ沈殿物には、いずれもゼリー状に析
出する夾雑多糖は全く観察されなかった。
ＬのバッファーＱＢＴにて平衡化したGenomic tip １０
０／Ｇカラムに、ＤＮＡを含む核酸抽出用溶解液の上清
６種をそれぞれ供した。７．５ｍＬのバッファーＱＣで
２度洗浄した後、５ｍＬのバッファーＱＦにて溶出し
た。これら各溶出液に２μＬの高分子キャリアーである
エタ沈メイトと３．５ｍＬのイソプロパノールを加えて
遠心する事によりＤＮＡを沈殿させ、この沈殿物を２ｍ
Ｌの７０％冷エタノールで洗浄した。沈殿物を乾燥後、
４０μＬのＴＥバッファーに溶解した。ここでもアルコ
ール沈殿後のＤＮＡ沈殿物には、いずれもゼリー状に析
出する夾雑多糖は全く観察されなかった。
【００５１】以上の方法で試料コーンスナック菓子から
抽出・回収した第１〜第６のＤＮＡを鋳型としてそれぞ
れＰＣＲ反応を行ってターゲットＤＮＡを増幅させ、抽
出ＤＮＡの回収を確認した。このＰＣＲ反応では、トウ
モロコシ由来のツェイン（zein）遺伝子をターゲットＤ
ＮＡとし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gol
d：ＰＥバイオシステムズジャパン社製）を増幅反応に
用いた。
抽出・回収した第１〜第６のＤＮＡを鋳型としてそれぞ
れＰＣＲ反応を行ってターゲットＤＮＡを増幅させ、抽
出ＤＮＡの回収を確認した。このＰＣＲ反応では、トウ
モロコシ由来のツェイン（zein）遺伝子をターゲットＤ
ＮＡとし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gol
d：ＰＥバイオシステムズジャパン社製）を増幅反応に
用いた。
【００５２】本実施例２で回収した第１〜第６のコーン
スナック抽出ＤＮＡのうち、それぞれ２μＬを用いてＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー、基質ｄＮＴ
Ｐ混合液を含む総量２５μＬの反応系を調製した。次
に、９５℃１０分間ホットスタートを行った後、第一段
階として９５℃で３０秒間、第二段階として６０℃で３
０秒間、第三段階として７２℃で３０秒間という３段階
のサイクルを４０回繰り返すことにより、ターゲットＤ
ＮＡを増幅した。本遺伝子およびＰＣＲ用プライマー
（配列番号３，４）は実施例２のものと同一である。
スナック抽出ＤＮＡのうち、それぞれ２μＬを用いてＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー、基質ｄＮＴ
Ｐ混合液を含む総量２５μＬの反応系を調製した。次
に、９５℃１０分間ホットスタートを行った後、第一段
階として９５℃で３０秒間、第二段階として６０℃で３
０秒間、第三段階として７２℃で３０秒間という３段階
のサイクルを４０回繰り返すことにより、ターゲットＤ
ＮＡを増幅した。本遺伝子およびＰＣＲ用プライマー
（配列番号３，４）は実施例２のものと同一である。
【００５３】第１〜第６のＰＣＲ反応液５μＬを、前記
分子量マーカー１１（レーン７）と共に、それぞれ前述
の３％アガロースゲルにて電気泳動した。これを臭化エ
チジウム染色し、紫外線下で観察したところ、図３のレ
ーン１〜６（順に、カール・サラダ味、黒糖コーン、も
ろこし輪太郎、おじゃる丸コーンスナック・プリン味、
うまい棒・メンタイ味、チーズビットより抽出・回収し
たＤＮＡを鋳型としたもの）に示すとおり、目的の９９
ｂｐにターゲット遺伝子の明瞭なバンドが確認できた。
他方、レーン８に示した鋳型となるＤＮＡを含まない陰
性コントロールでは、ターゲット遺伝子のバンドは得ら
れなかった。これに加えてレーン９に見られるトウモロ
コシ葉ＤＮＡ由来のバンドがそれぞれ５種類のコーンス
ナックから増幅したレーン１〜６に見られるバンド長と
完全に一致した。そこで、カール・サラダ味から得られ
たＤＮＡ増幅断片をpGEM-Tベクター（プロメガ社製）へ
クローニングし、その塩基配列を調べたところ、既知の
配列とほぼ一致した。これらの結果、各試料コーンスナ
ックから抽出した鋳型ＤＮＡはターゲットＤＮＡを含む
ことが示された。
分子量マーカー１１（レーン７）と共に、それぞれ前述
の３％アガロースゲルにて電気泳動した。これを臭化エ
チジウム染色し、紫外線下で観察したところ、図３のレ
ーン１〜６（順に、カール・サラダ味、黒糖コーン、も
ろこし輪太郎、おじゃる丸コーンスナック・プリン味、
うまい棒・メンタイ味、チーズビットより抽出・回収し
たＤＮＡを鋳型としたもの）に示すとおり、目的の９９
ｂｐにターゲット遺伝子の明瞭なバンドが確認できた。
他方、レーン８に示した鋳型となるＤＮＡを含まない陰
性コントロールでは、ターゲット遺伝子のバンドは得ら
れなかった。これに加えてレーン９に見られるトウモロ
コシ葉ＤＮＡ由来のバンドがそれぞれ５種類のコーンス
ナックから増幅したレーン１〜６に見られるバンド長と
完全に一致した。そこで、カール・サラダ味から得られ
たＤＮＡ増幅断片をpGEM-Tベクター（プロメガ社製）へ
クローニングし、その塩基配列を調べたところ、既知の
配列とほぼ一致した。これらの結果、各試料コーンスナ
ックから抽出した鋳型ＤＮＡはターゲットＤＮＡを含む
ことが示された。
【００５４】
【実施例４】次に、本発明の第４の実施例として、試料
に市販されているコーンシリアル、具体的にはモーニン
（商品名：カルビー社製）を選択し、このコーンシリア
ル試料から、糖質関連酵素としてα−アミラーゼを用い
てＤＮＡを抽出・回収した場合を説明する。
に市販されているコーンシリアル、具体的にはモーニン
（商品名：カルビー社製）を選択し、このコーンシリア
ル試料から、糖質関連酵素としてα−アミラーゼを用い
てＤＮＡを抽出・回収した場合を説明する。
【００５５】用いた核酸抽出用溶解液は、前記実施例１
と同様の枯草菌由来のα−アミラーゼ（２００ユニッ
ト）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシ
ウム、０．５％トリトンＸ−１００、５％ツイーン２
０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）からなるものである。
と同様の枯草菌由来のα−アミラーゼ（２００ユニッ
ト）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシ
ウム、０．５％トリトンＸ−１００、５％ツイーン２
０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）からなるものである。
【００５６】試料のコーンシリアルを細かく砕いたもの
を０．８ｇ秤量して上記溶解液８ｍＬに加えて懸濁し、
９０℃３０分間保温した後、遠心分離により得たＤＮＡ
抽出上清を、実施例２と同じ手順でＤＮＡをＤＥＡＥ−
シリカ担体を充填したカラムで濾過して該ＤＥＡＥ−シ
リカ担体に抽出上清中のＤＮＡを吸着させ、GenomicDNA
buffer setのバッファーＱＢＴにより溶出した。次い
で、この溶出液に２μＬのエタ沈メイトと３．５ｍＬの
イソプロパノールを加えて分別沈殿を行い、遠心分離
後、得られた沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、風乾
した後、４０μＬのＴＥバッファーに溶解して抽出ＤＮ
Ａを回収した。ここでもアルコール沈殿後のＤＮＡ沈殿
物には、ゼリー状に析出する夾雑多糖は全く観察されな
かった。
を０．８ｇ秤量して上記溶解液８ｍＬに加えて懸濁し、
９０℃３０分間保温した後、遠心分離により得たＤＮＡ
抽出上清を、実施例２と同じ手順でＤＮＡをＤＥＡＥ−
シリカ担体を充填したカラムで濾過して該ＤＥＡＥ−シ
リカ担体に抽出上清中のＤＮＡを吸着させ、GenomicDNA
buffer setのバッファーＱＢＴにより溶出した。次い
で、この溶出液に２μＬのエタ沈メイトと３．５ｍＬの
イソプロパノールを加えて分別沈殿を行い、遠心分離
後、得られた沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、風乾
した後、４０μＬのＴＥバッファーに溶解して抽出ＤＮ
Ａを回収した。ここでもアルコール沈殿後のＤＮＡ沈殿
物には、ゼリー状に析出する夾雑多糖は全く観察されな
かった。
【００５７】以上の方法で試料コーンシリアルから抽
出、回収したＤＮＡを鋳型としてＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼ（AmpliTaq Gold：ＰＥバイオシステムズジャパン
社製）によるＰＣＲ反応に供し、ターゲットＤＮＡであ
るトウモロコシ由来のツェイン（zeiｎ）遺伝子を検出
した。本遺伝子およびＰＣＲ用プライマー（配列番号
３，４）は実施例２のものと同一である。
出、回収したＤＮＡを鋳型としてＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼ（AmpliTaq Gold：ＰＥバイオシステムズジャパン
社製）によるＰＣＲ反応に供し、ターゲットＤＮＡであ
るトウモロコシ由来のツェイン（zeiｎ）遺伝子を検出
した。本遺伝子およびＰＣＲ用プライマー（配列番号
３，４）は実施例２のものと同一である。
【００５８】即ち、本実施例４で回収したコーンシリア
ル抽出ＤＮＡを２μＬ使用して、ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼおよびプライマー、基費ｄＮＴＰ混合液を含む総量
２５μＬの反応液を調製し、これを９５℃１０分間ホッ
トスタートした後、第一段階として９５℃で３０秒間、
第二段階として６０℃で３０秒間、第三段階として７２
℃で３０秒間という３段階の反応を４０サイクル操り返
すことにより、ターゲットＤＮＡを増幅した。
ル抽出ＤＮＡを２μＬ使用して、ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼおよびプライマー、基費ｄＮＴＰ混合液を含む総量
２５μＬの反応液を調製し、これを９５℃１０分間ホッ
トスタートした後、第一段階として９５℃で３０秒間、
第二段階として６０℃で３０秒間、第三段階として７２
℃で３０秒間という３段階の反応を４０サイクル操り返
すことにより、ターゲットＤＮＡを増幅した。
【００５９】増幅したＤＮＡを含むＰＣＲ反応液のう
ち、５μＬを前述のマーカー１１（レーン３）と共に３
％のアガロース２１ゲルにて電気泳動を行った。このゲ
ルを臭化エチジウムで染色し、紫外線下で検出したもの
を図４に示す。試料コーンシリアルから抽出した鋳型Ｄ
ＮＡ（レーン１）は、コーンミールから抽出した陽性コ
ントロール（レーン２）と同じ１０１ｂｐに明瞭なバン
ドを得た。さらに、ＤＮＡシーケンサ（ABI PRISM ３
７７：ＰＥバイオシステムズジャパン社製）を用いてこ
のバンドの塩基配列を調べたところ、既知のツェイン(z
ein）配列と一致することを確認した。
ち、５μＬを前述のマーカー１１（レーン３）と共に３
％のアガロース２１ゲルにて電気泳動を行った。このゲ
ルを臭化エチジウムで染色し、紫外線下で検出したもの
を図４に示す。試料コーンシリアルから抽出した鋳型Ｄ
ＮＡ（レーン１）は、コーンミールから抽出した陽性コ
ントロール（レーン２）と同じ１０１ｂｐに明瞭なバン
ドを得た。さらに、ＤＮＡシーケンサ（ABI PRISM ３
７７：ＰＥバイオシステムズジャパン社製）を用いてこ
のバンドの塩基配列を調べたところ、既知のツェイン(z
ein）配列と一致することを確認した。
【００６０】
【実施例５】次に、本発明の第５の実施例として、試料
に市販されている米菓、具体的にはおにぎりせんべい
（商品名：マスヤ社製）、ハッピーターン（商品名：亀
田製菓社製）を選択し、これら米菓試料から、糖質関連
酵素としてα−アミラーゼを用いてＤＮＡを抽出・回収
した場合を説明する。
に市販されている米菓、具体的にはおにぎりせんべい
（商品名：マスヤ社製）、ハッピーターン（商品名：亀
田製菓社製）を選択し、これら米菓試料から、糖質関連
酵素としてα−アミラーゼを用いてＤＮＡを抽出・回収
した場合を説明する。
【００６１】本実施例５においても、核酸抽出用溶解液
として、前記実施例２と同様の枯草菌由来のα−アミラ
ーゼ（２００ユニット）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、
１０ｍＭ塩化カルシウム、０．５％トリトンＸ−１０
０、５％ツイーン２０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリ
ス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）からなるものを用いた。
として、前記実施例２と同様の枯草菌由来のα−アミラ
ーゼ（２００ユニット）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、
１０ｍＭ塩化カルシウム、０．５％トリトンＸ−１０
０、５％ツイーン２０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリ
ス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）からなるものを用いた。
【００６２】試料の米菓をそれぞれ細かく砕いたものを
０．８ｇずつ秤量して上記溶解液８ｍＬに加えて懸濁
し、それぞれ９０℃３０分間保温した後、遠心分離によ
り得たＤＮＡ抽出上清を、実施例２と同じ手順でＤＮＡ
をＤＥＡＥ−シリカ担体を充填したカラムで濾過して該
ＤＥＡＥ−シリカ担体に抽出上清中のＤＮＡを吸着さ
せ、Genomic DNA buffer setのバッファーＱＢＴにより
溶出した。次いで、これら２種の溶出液にそれぞれ２μ
Ｌのエタ沈メイトと３．５ｍＬのイソプロパノールを加
えて分別沈殿を行い、遠心分離後、得られた各沈殿物を
７０％エタノールで洗浄し、風乾した後、４０μＬのＴ
Ｅバッファーに溶解して２種類の抽出ＤＮＡを回収し
た。ここでもアルコール沈殿後のＤＮＡ沈殿物には、ど
ちらにもゼリー状に析出する夾雑多糖は全く観察されな
かった。
０．８ｇずつ秤量して上記溶解液８ｍＬに加えて懸濁
し、それぞれ９０℃３０分間保温した後、遠心分離によ
り得たＤＮＡ抽出上清を、実施例２と同じ手順でＤＮＡ
をＤＥＡＥ−シリカ担体を充填したカラムで濾過して該
ＤＥＡＥ−シリカ担体に抽出上清中のＤＮＡを吸着さ
せ、Genomic DNA buffer setのバッファーＱＢＴにより
溶出した。次いで、これら２種の溶出液にそれぞれ２μ
Ｌのエタ沈メイトと３．５ｍＬのイソプロパノールを加
えて分別沈殿を行い、遠心分離後、得られた各沈殿物を
７０％エタノールで洗浄し、風乾した後、４０μＬのＴ
Ｅバッファーに溶解して２種類の抽出ＤＮＡを回収し
た。ここでもアルコール沈殿後のＤＮＡ沈殿物には、ど
ちらにもゼリー状に析出する夾雑多糖は全く観察されな
かった。
【００６３】以上の方法で２種の米菓試料から抽出、回
収した２種のＤＮＡを鋳型としてそれぞれＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（AmpliTaq Gold：ＰＥバイオシステムズ
ジャパン社製）によるＰＣＲ反応に供し、イネ由来のプ
ロラミン（Oryza sativa prolamin）遺伝子をターゲッ
トＤＮＡとして検出した。
収した２種のＤＮＡを鋳型としてそれぞれＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（AmpliTaq Gold：ＰＥバイオシステムズ
ジャパン社製）によるＰＣＲ反応に供し、イネ由来のプ
ロラミン（Oryza sativa prolamin）遺伝子をターゲッ
トＤＮＡとして検出した。
【００６４】なお、ＰＣＲ用プライマーには、イネに由
来するプロラミン遺伝子の配列情報により合成したもの
（5'-caacagctcaggctggtagcgc-3'：配列番号５、5'-gta
gacaacaccgacctgctgcag-3'：配列番号６）を用いた。こ
れらのプライマーはイネ・プロラミン遺伝子を鋳型とし
て増幅した際に１０２bpのバンドが得られるように設計
したものである。また後述する配列表の配列番号５及び
配列番号６として記載した。
来するプロラミン遺伝子の配列情報により合成したもの
（5'-caacagctcaggctggtagcgc-3'：配列番号５、5'-gta
gacaacaccgacctgctgcag-3'：配列番号６）を用いた。こ
れらのプライマーはイネ・プロラミン遺伝子を鋳型とし
て増幅した際に１０２bpのバンドが得られるように設計
したものである。また後述する配列表の配列番号５及び
配列番号６として記載した。
【００６５】まず回収した２種の米菓抽出ＤＮＡをそれ
ぞれ、原液、１０倍希釈、１００倍希釈したもの全６種
について、各２μＬをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。
ＰＣＲ反応液は、それぞれ前述の６種の鋳型ＤＮＡを２
μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー、基
質ｄＮＴＰ混合液を含む総量２５μＬとした。これら６
種の反応液を、９５℃１０分間ホットスタートを行った
後、第一段階として９５℃で３０秒間、第二段階として
６４℃で３０秒間、第三段階として７２℃で３０秒間と
いう３段階のサイクルを４０回操り返すことにより、タ
ーゲットＤＮＡを増幅した。
ぞれ、原液、１０倍希釈、１００倍希釈したもの全６種
について、各２μＬをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。
ＰＣＲ反応液は、それぞれ前述の６種の鋳型ＤＮＡを２
μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー、基
質ｄＮＴＰ混合液を含む総量２５μＬとした。これら６
種の反応液を、９５℃１０分間ホットスタートを行った
後、第一段階として９５℃で３０秒間、第二段階として
６４℃で３０秒間、第三段階として７２℃で３０秒間と
いう３段階のサイクルを４０回操り返すことにより、タ
ーゲットＤＮＡを増幅した。
【００６６】ＰＣＲ反応後、６種の反応液各５μＬをそ
れぞれ前述の３％アガロースゲルにロードし、電気泳動
を行った。このゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線
下に観察したものが図５である。おにぎりせんべいから
抽出・回収したＤＮＡを鋳型として用いたものをレーン
２〜４（順に、原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液）
に示した。他方、ハッピーターンから抽出・回収したＤ
ＮＡを鋳型として用いたものをレーン７〜９（順に、原
液、１０倍希釈液、１００倍希釈液）に、抽出系から鋳
型ＤＮＡのみを除いた陰性コントロールはレーン５およ
びレーン１０に示した。また、レーン１およびレーン６
は、前述の分子量マーカー（マーカー１１）である。そ
の結果、各試料米菓から抽出・回収したＤＮＡを鋳型と
する反応液の全てに、ターゲット遺伝子の明瞭な陽性バ
ンド（１０２ｂｐ）を確認した。また、これら米菓のう
ちハッピーターンから得られたＤＮＡを鋳型として塩基
配列を確認したところ、既報のものと一致した。
れぞれ前述の３％アガロースゲルにロードし、電気泳動
を行った。このゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線
下に観察したものが図５である。おにぎりせんべいから
抽出・回収したＤＮＡを鋳型として用いたものをレーン
２〜４（順に、原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液）
に示した。他方、ハッピーターンから抽出・回収したＤ
ＮＡを鋳型として用いたものをレーン７〜９（順に、原
液、１０倍希釈液、１００倍希釈液）に、抽出系から鋳
型ＤＮＡのみを除いた陰性コントロールはレーン５およ
びレーン１０に示した。また、レーン１およびレーン６
は、前述の分子量マーカー（マーカー１１）である。そ
の結果、各試料米菓から抽出・回収したＤＮＡを鋳型と
する反応液の全てに、ターゲット遺伝子の明瞭な陽性バ
ンド（１０２ｂｐ）を確認した。また、これら米菓のう
ちハッピーターンから得られたＤＮＡを鋳型として塩基
配列を確認したところ、既報のものと一致した。
【００６７】
【実施例６】次に、本発明の第６の実施例として、試料
に市販されているポテトスナック菓子、具体的にはポテ
トチップス・うすしお味（商品名：カルビー社製）、サ
ッポロポテト・ベジタブル（商品名：カルビー社製）を
選択し、これらジャガイモの加熱調味試料から、糖質関
連酵素としてα−アミラーゼを用いてＤＮＡを抽出・回
収した場合を説明する。
に市販されているポテトスナック菓子、具体的にはポテ
トチップス・うすしお味（商品名：カルビー社製）、サ
ッポロポテト・ベジタブル（商品名：カルビー社製）を
選択し、これらジャガイモの加熱調味試料から、糖質関
連酵素としてα−アミラーゼを用いてＤＮＡを抽出・回
収した場合を説明する。
【００６８】本実施例６で用いた核酸抽出用溶解液も、
前記実施例１と同様の枯草菌由来のα−アミラーゼ（２
００ユニット）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
塩化カルシウム、０．５％トリトンＸ−１００、５％ツ
イーン２０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）からなるものである。
前記実施例１と同様の枯草菌由来のα−アミラーゼ（２
００ユニット）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
塩化カルシウム、０．５％トリトンＸ−１００、５％ツ
イーン２０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）からなるものである。
【００６９】試料のポテトスナック菓子をそれぞれ細か
く砕いたものを０．８ｇずつ秤量して上記溶解液８ｍＬ
に加えて懸濁し、９０℃３０分間保温した後、遠心分離
により２種のＤＮＡ抽出上清を得た。これら２種の抽出
上清を実施例２と同じ手順でＤＮＡをＤＥＡＥ−シリカ
担体を充填したカラムで濾過して該ＤＥＡＥ−シリカ担
体に抽出上清中のＤＮＡを吸着させ、Genomic DNA buff
er setのバッファーＱＢＴにより溶出した。次いで、こ
の溶出液に２μＬのエタ沈メイトと３．５ｍＬのイソプ
ロパノールを加えて分別沈殿を行い、遠心分離後、得ら
れた各沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、風乾した
後、４０μＬのＴＥバッファーに溶解して２種の抽出Ｄ
ＮＡを回収した。本実施例６においても、アルコール沈
殿後のＤＮＡ沈殿物には、いずれもゼリー状に析出する
夾雑多糖は全く観察されず、ＤＮＡ抽出・回収操作は容
易であった。
く砕いたものを０．８ｇずつ秤量して上記溶解液８ｍＬ
に加えて懸濁し、９０℃３０分間保温した後、遠心分離
により２種のＤＮＡ抽出上清を得た。これら２種の抽出
上清を実施例２と同じ手順でＤＮＡをＤＥＡＥ−シリカ
担体を充填したカラムで濾過して該ＤＥＡＥ−シリカ担
体に抽出上清中のＤＮＡを吸着させ、Genomic DNA buff
er setのバッファーＱＢＴにより溶出した。次いで、こ
の溶出液に２μＬのエタ沈メイトと３．５ｍＬのイソプ
ロパノールを加えて分別沈殿を行い、遠心分離後、得ら
れた各沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、風乾した
後、４０μＬのＴＥバッファーに溶解して２種の抽出Ｄ
ＮＡを回収した。本実施例６においても、アルコール沈
殿後のＤＮＡ沈殿物には、いずれもゼリー状に析出する
夾雑多糖は全く観察されず、ＤＮＡ抽出・回収操作は容
易であった。
【００７０】以上の方法で２種の試料ポテトスナック菓
子から抽出、回収した２種のＤＮＡを鋳型としてそれぞ
れＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold：ＰＥバ
イオシステムズジャパン社製）によるＰＣＲ反応に供
し、ジャガイモ由来のパタチンクラス１（patatin clas
s1）遺伝子をターゲットＤＮＡとして検出した。
子から抽出、回収した２種のＤＮＡを鋳型としてそれぞ
れＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold：ＰＥバ
イオシステムズジャパン社製）によるＰＣＲ反応に供
し、ジャガイモ由来のパタチンクラス１（patatin clas
s1）遺伝子をターゲットＤＮＡとして検出した。
【００７１】なお、ＰＣＲ用プライマーには、ジャガイ
モパタチンクラス１遺伝子をＰＣＲ増幅することが可能
で、１０３ｂｐのＤＮＡ断片が得られるように設計した
もの（5'-cccttagcgttgcaacgagacttgc-3'：配列番号
７、5'-gtgccagtgcctaatgagagcaac-3'：配列番号８）を
用いた。これらのプライマーは、後述する配列表の配列
番号７および配列番号８として記載した。
モパタチンクラス１遺伝子をＰＣＲ増幅することが可能
で、１０３ｂｐのＤＮＡ断片が得られるように設計した
もの（5'-cccttagcgttgcaacgagacttgc-3'：配列番号
７、5'-gtgccagtgcctaatgagagcaac-3'：配列番号８）を
用いた。これらのプライマーは、後述する配列表の配列
番号７および配列番号８として記載した。
【００７２】回収した２種のポテトスナック菓子抽出Ｄ
ＮＡをそれぞれ、原液、１０倍希釈、１００倍希釈した
もの全６種について、各２μＬをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮ
Ａとし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、基質
ｄＮＴＰ混合液を混合してそれぞれ総量２５μＬの反応
系を調製し、これらをそれぞれ９５℃１０分間ホットス
タートをした後、第一段階として９５℃で３０秒間、第
二段階として６３℃で３０秒間、第三段階として７２℃
で３０秒間という３段階の反応を４０回繰り返すことに
より、ターゲットＤＮＡを増幅した。
ＮＡをそれぞれ、原液、１０倍希釈、１００倍希釈した
もの全６種について、各２μＬをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮ
Ａとし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、基質
ｄＮＴＰ混合液を混合してそれぞれ総量２５μＬの反応
系を調製し、これらをそれぞれ９５℃１０分間ホットス
タートをした後、第一段階として９５℃で３０秒間、第
二段階として６３℃で３０秒間、第三段階として７２℃
で３０秒間という３段階の反応を４０回繰り返すことに
より、ターゲットＤＮＡを増幅した。
【００７３】上記６種のＰＣＲ反応液について、それぞ
れ５μＬを前述の３％アガロースゲルで電気泳動後、臭
化エチジウム染色し、紫外線下で観察した。図６のレー
ン２〜レーン３は、ポテトチップスうすしお味から抽出
した鋳型ＤＮＡ（順に、原液、１０倍希釈液、１００倍
希釈液）の増幅産物を示したものである。他方、ハッピ
ーターンから抽出・回収した鋳型ＤＮＡ（順に、原液、
１０倍希釈液、１００倍希釈液）の増幅産物をレーン７
〜９に、抽出系から鋳型ＤＮＡのみを除いた陰性コント
ロールはレーン５およびレーン１０に示す。また、レー
ン１および６は、前述のマーカー１１である。その結
果、ポテトスナック菓子から抽出・回収したＤＮＡを含
む反応液は、全てターゲット遺伝子（１０３ｂｐ）の明
瞭なバンドを確認した。これらのうちポテトチップスう
すしお味については、ＤＮＡシークエンサーによりＰＣ
Ｒ増幅バンドの塩基配列を調べたところ、ジャガイモ
パタチンクラス１遺伝子の一部であることを確認した。
れ５μＬを前述の３％アガロースゲルで電気泳動後、臭
化エチジウム染色し、紫外線下で観察した。図６のレー
ン２〜レーン３は、ポテトチップスうすしお味から抽出
した鋳型ＤＮＡ（順に、原液、１０倍希釈液、１００倍
希釈液）の増幅産物を示したものである。他方、ハッピ
ーターンから抽出・回収した鋳型ＤＮＡ（順に、原液、
１０倍希釈液、１００倍希釈液）の増幅産物をレーン７
〜９に、抽出系から鋳型ＤＮＡのみを除いた陰性コント
ロールはレーン５およびレーン１０に示す。また、レー
ン１および６は、前述のマーカー１１である。その結
果、ポテトスナック菓子から抽出・回収したＤＮＡを含
む反応液は、全てターゲット遺伝子（１０３ｂｐ）の明
瞭なバンドを確認した。これらのうちポテトチップスう
すしお味については、ＤＮＡシークエンサーによりＰＣ
Ｒ増幅バンドの塩基配列を調べたところ、ジャガイモ
パタチンクラス１遺伝子の一部であることを確認した。
【００７４】
【実施例７】さらに、本発明の第７の実施例として、試
料に市販されている小麦スナック菓子であるおっとっと
（商品名：森永製菓社製）、ベビースターラーメン（商
品名：おやつカンパニー社製）を選択し、これら小麦の
加熱調味試料から、糖質関連酵素としてα−アミラーゼ
を用いてＤＮＡを抽出・回収した場合を説明する。
料に市販されている小麦スナック菓子であるおっとっと
（商品名：森永製菓社製）、ベビースターラーメン（商
品名：おやつカンパニー社製）を選択し、これら小麦の
加熱調味試料から、糖質関連酵素としてα−アミラーゼ
を用いてＤＮＡを抽出・回収した場合を説明する。
【００７５】用いた核酸抽出用溶解液は、前記実施例２
と同様の枯草菌由来のα−アミラーゼ（２００ユニッ
ト）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシ
ウム、０．５％トリトンＸ−１００、５％ツイーン２
０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）からなるものである。
と同様の枯草菌由来のα−アミラーゼ（２００ユニッ
ト）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシ
ウム、０．５％トリトンＸ−１００、５％ツイーン２
０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）からなるものである。
【００７６】試料の小麦スナック菓子をそれぞれ細かく
砕いたものを０．８ｇずつ秤量して上記溶解液８ｍＬに
加えて懸濁し、９０℃３０分間保温した後、遠心分離に
より２種のＤＮＡ抽出上清を得た。これら２種の抽出上
清を実施例２と同じ手順でＤＮＡをＤＥＡＥ−シリカ担
体を充填したカラムで濾過して該ＤＥＡＥ−シリカ担体
に抽出上清中のＤＮＡを吸着させ、Genomic DNA buffer
setのバッファーＱＣにより洗浄し、バッファーＱＢＴ
により溶出した。次いで、この溶出液に２μＬのエタ沈
メイトと３．５ｍＬのイソプロパノールを加えて分別沈
殿を行い、遠心分離後、得られた各沈殿物を７０％エタ
ノールで洗浄し、風乾した後、４０μＬのＴＥバッファ
ーに溶解して２種の抽出ＤＮＡを回収した。本実施例７
においても、アルコール沈殿後のＤＮＡ沈殿物には、い
ずれもゼリー状に析出する夾雑多糖は全く観察されず、
ＤＮＡ抽出・回収操作は容易であった。
砕いたものを０．８ｇずつ秤量して上記溶解液８ｍＬに
加えて懸濁し、９０℃３０分間保温した後、遠心分離に
より２種のＤＮＡ抽出上清を得た。これら２種の抽出上
清を実施例２と同じ手順でＤＮＡをＤＥＡＥ−シリカ担
体を充填したカラムで濾過して該ＤＥＡＥ−シリカ担体
に抽出上清中のＤＮＡを吸着させ、Genomic DNA buffer
setのバッファーＱＣにより洗浄し、バッファーＱＢＴ
により溶出した。次いで、この溶出液に２μＬのエタ沈
メイトと３．５ｍＬのイソプロパノールを加えて分別沈
殿を行い、遠心分離後、得られた各沈殿物を７０％エタ
ノールで洗浄し、風乾した後、４０μＬのＴＥバッファ
ーに溶解して２種の抽出ＤＮＡを回収した。本実施例７
においても、アルコール沈殿後のＤＮＡ沈殿物には、い
ずれもゼリー状に析出する夾雑多糖は全く観察されず、
ＤＮＡ抽出・回収操作は容易であった。
【００７７】以上の方法で２種の試料小麦スナック菓子
からそれぞれ抽出、回収した２種のＤＮＡを鋳型とし
て、それぞれＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gol
d：ＰＥバイオシステムズジャパン社製）によるＰＣＲ
反応に供し、小麦由来の低分子量グルテニン（low mole
cular weight glutenin）遺伝子をターゲットＤＮＡと
して検出した。
からそれぞれ抽出、回収した２種のＤＮＡを鋳型とし
て、それぞれＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gol
d：ＰＥバイオシステムズジャパン社製）によるＰＣＲ
反応に供し、小麦由来の低分子量グルテニン（low mole
cular weight glutenin）遺伝子をターゲットＤＮＡと
して検出した。
【００７８】なお、ＰＣＲ用プライマーには、コムギグ
ルテニン遺伝子の配列情報を基に設計し、ＰＣＲ増幅に
よって９９ｂｐのＤＮＡ断片が得られるもの２種（5'-c
cattgcactccgtaccctgcc-3'：配列番号９、5'-caccaactc
cgatgccaacgcc-3'：配列番号１０）を用いた。これらの
プライマーは、後述する配列表に配列番号９および配列
番号１０として記載した。
ルテニン遺伝子の配列情報を基に設計し、ＰＣＲ増幅に
よって９９ｂｐのＤＮＡ断片が得られるもの２種（5'-c
cattgcactccgtaccctgcc-3'：配列番号９、5'-caccaactc
cgatgccaacgcc-3'：配列番号１０）を用いた。これらの
プライマーは、後述する配列表に配列番号９および配列
番号１０として記載した。
【００７９】まず、回収した２種の小麦スナック菓子抽
出ＤＮＡをそれぞれ、原液、１０倍希釈、１００倍希釈
したもの全６種について、各２μＬをＰＣＲ反応の鋳型
ＤＮＡとし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびプライマ
ー、基質ｄＮＴＰ混合液を含む総量２０μＬの反応系
で、９５℃で５分間ホットスタートを行った後、第一段
階として９５℃で２０秒間、第二段階として６４℃で２
０秒間、第三段階として７２℃で２０秒間という３段階
のサイクルを４０回繰り返すことにより、ターゲットＤ
ＮＡを増幅した。
出ＤＮＡをそれぞれ、原液、１０倍希釈、１００倍希釈
したもの全６種について、各２μＬをＰＣＲ反応の鋳型
ＤＮＡとし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびプライマ
ー、基質ｄＮＴＰ混合液を含む総量２０μＬの反応系
で、９５℃で５分間ホットスタートを行った後、第一段
階として９５℃で２０秒間、第二段階として６４℃で２
０秒間、第三段階として７２℃で２０秒間という３段階
のサイクルを４０回繰り返すことにより、ターゲットＤ
ＮＡを増幅した。
【００８０】ＰＣＲ反応後、それぞれ６種の反応産物５
μＬを前述の３％アガロースゲルで電気泳動した。この
ゲルを臭化エチジウム染色し、紫外線下で観察した結果
を図７に示す。図７のレーン２〜レーン４は、おっとっ
とから抽出・回収された鋳型ＤＮＡを反応液に含むもの
であり、それぞれ順に、原液、１０倍希釈、１００倍希
釈の鋳型ＤＮＡを使用したものについて示した。他方、
ベビースターラーメンから抽出・回収された鋳型ＤＮＡ
が原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液の濃度で反応液
に含まれたものを、順にレーン７〜レーン９に泳動し
た。また、抽出系から鋳型ＤＮＡのみを除いた陰性コン
トロールはレーン５およびレーン１０に、前述の分子量
マーカ（マーカー１１）は、レーン１およびレーン６で
泳動した。その結果、試料小麦スナック菓子から抽出・
回収した鋳型ＤＮＡを増幅した反応液を含むレーン（レ
ーン２〜４および７〜９）の全てに９９ｂｐのターゲッ
ト遺伝子のバンドを確認した。これら試料小麦スナック
菓子のうち、ベビースターラーメンから得られたＰＣＲ
増幅バンドの塩基配列を調べたところ、既知の配列とほ
ぼ一致することを確認した。
μＬを前述の３％アガロースゲルで電気泳動した。この
ゲルを臭化エチジウム染色し、紫外線下で観察した結果
を図７に示す。図７のレーン２〜レーン４は、おっとっ
とから抽出・回収された鋳型ＤＮＡを反応液に含むもの
であり、それぞれ順に、原液、１０倍希釈、１００倍希
釈の鋳型ＤＮＡを使用したものについて示した。他方、
ベビースターラーメンから抽出・回収された鋳型ＤＮＡ
が原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液の濃度で反応液
に含まれたものを、順にレーン７〜レーン９に泳動し
た。また、抽出系から鋳型ＤＮＡのみを除いた陰性コン
トロールはレーン５およびレーン１０に、前述の分子量
マーカ（マーカー１１）は、レーン１およびレーン６で
泳動した。その結果、試料小麦スナック菓子から抽出・
回収した鋳型ＤＮＡを増幅した反応液を含むレーン（レ
ーン２〜４および７〜９）の全てに９９ｂｐのターゲッ
ト遺伝子のバンドを確認した。これら試料小麦スナック
菓子のうち、ベビースターラーメンから得られたＰＣＲ
増幅バンドの塩基配列を調べたところ、既知の配列とほ
ぼ一致することを確認した。
【００８１】
【実施例８】次に、本発明の第８の実施例として、市販
の乾燥麺を含む食品から、どん兵衛（カップ麺：日清食
品社製）と中華三昧・広東風拉麺（袋入りインスタント
麺：明星食品社製）を試料に選択し、これら試料乾燥麺
から糖質関連酵素としてα-アミラーゼを用いてＤＮＡ
を抽出・回収した場合を説明する。
の乾燥麺を含む食品から、どん兵衛（カップ麺：日清食
品社製）と中華三昧・広東風拉麺（袋入りインスタント
麺：明星食品社製）を試料に選択し、これら試料乾燥麺
から糖質関連酵素としてα-アミラーゼを用いてＤＮＡ
を抽出・回収した場合を説明する。
【００８２】用いた核酸抽出用溶解液は、前記実施例２
と同様の枯草菌由来のα-アミラーゼ（２００ユニッ
ト）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシ
ウム、０．５％トリトンＸー１００、５％ツイーン２
０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）からなるものである。
と同様の枯草菌由来のα-アミラーゼ（２００ユニッ
ト）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシ
ウム、０．５％トリトンＸー１００、５％ツイーン２
０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）からなるものである。
【００８３】試料の乾燥麺をそれぞれ細かく砕いたもの
を０．８ｇずつ秤量して上記溶解液８ｍＬに加えて懸濁
し、９０℃、３０分間保温した後、遠心分離により得た
２種の抽出上清を実施例２と同じ手順でＤＮＡをＤＥＡ
Ｅ−シリカ担体を充填したカラムで濾過して該ＤＥＡＥ
−シリカ担体に抽出上清中のＤＮＡを吸着させ、Genomi
c DNA buffer setのバッファーＱＣにより洗浄し、バッ
ファーＱＢＴにより溶出した。ついで、この溶出液に２
μＬにエタ沈メイトと３．５ｍＬのイソプロパノールを
加えて分別沈殿を行い、遠心分離後、得られた沈殿物を
７０％エタノールで洗浄し、風乾した後、４０μLのＴ
Ｅバッファーに溶解して２種の抽出ＤＮＡを回収した。
本実施例８においても、アルコール沈殿後のＤＮＡ沈殿
物には、いずれもゼリー状に析出する夾雑多糖は全く観
察されず、ＤＮＡ抽出・回収操作は容易であった。
を０．８ｇずつ秤量して上記溶解液８ｍＬに加えて懸濁
し、９０℃、３０分間保温した後、遠心分離により得た
２種の抽出上清を実施例２と同じ手順でＤＮＡをＤＥＡ
Ｅ−シリカ担体を充填したカラムで濾過して該ＤＥＡＥ
−シリカ担体に抽出上清中のＤＮＡを吸着させ、Genomi
c DNA buffer setのバッファーＱＣにより洗浄し、バッ
ファーＱＢＴにより溶出した。ついで、この溶出液に２
μＬにエタ沈メイトと３．５ｍＬのイソプロパノールを
加えて分別沈殿を行い、遠心分離後、得られた沈殿物を
７０％エタノールで洗浄し、風乾した後、４０μLのＴ
Ｅバッファーに溶解して２種の抽出ＤＮＡを回収した。
本実施例８においても、アルコール沈殿後のＤＮＡ沈殿
物には、いずれもゼリー状に析出する夾雑多糖は全く観
察されず、ＤＮＡ抽出・回収操作は容易であった。
【００８４】以上の方法で試料乾燥麺から抽出・回収し
たＤＮＡを鋳型としてAmpliTaq GoldによるＰＣＲ反応
に供し、ターゲットＤＮＡであるコムギ由来のグルテニ
ン遺伝子を検出した。本遺伝子およびプライマー（配列
番号９，１０）は実施例７のものと同じである。
たＤＮＡを鋳型としてAmpliTaq GoldによるＰＣＲ反応
に供し、ターゲットＤＮＡであるコムギ由来のグルテニ
ン遺伝子を検出した。本遺伝子およびプライマー（配列
番号９，１０）は実施例７のものと同じである。
【００８５】まず、回収した２種の乾燥麺抽出ＤＮＡを
それぞれ原液、１０倍希釈、１００倍希釈したもの全６
種について、各２μＬをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとし
た。ＰＣＲ反応液は、それぞれ前述の６種の鋳型ＤＮＡ
を２μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびプライマ
ー、基質ｄＮＴＰ混合液を含む総量２５μＬとした。こ
れら６種の反応液を９５℃、３０分間ホットスタートを
行った後、第一段階として９５℃で３０秒間、第二段階
として６４℃で３０秒間、第三段階として７２℃で３０
秒間という３段階のサイクルを４０回繰り返すことによ
り、ターゲットＤＮＡを増幅した。
それぞれ原液、１０倍希釈、１００倍希釈したもの全６
種について、各２μＬをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとし
た。ＰＣＲ反応液は、それぞれ前述の６種の鋳型ＤＮＡ
を２μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびプライマ
ー、基質ｄＮＴＰ混合液を含む総量２５μＬとした。こ
れら６種の反応液を９５℃、３０分間ホットスタートを
行った後、第一段階として９５℃で３０秒間、第二段階
として６４℃で３０秒間、第三段階として７２℃で３０
秒間という３段階のサイクルを４０回繰り返すことによ
り、ターゲットＤＮＡを増幅した。
【００８６】ＰＣＲ反応後、６種の反応液各５μＬをそ
れぞれ前述の３％アガロースゲルにロードし、電気泳動
を行った。このゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線
下に観察したものが図７である。どん兵衛から抽出・回
収したＤＮＡを鋳型として用いたレーン２〜４（順に、
原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液）に示した。他
方、中華三昧・広東風拉麺から抽出・回収したＤＮＡを
鋳型として用いたレーン７〜９（順に、原液、１０倍希
釈液、１００倍希釈液）に、抽出系から鋳型ＤＮＡのみ
を除いた陰性コントロールはレーン１およびレーン６に
示した。また、レーン５は前述のマーカー１１である。
その結果、各試料乾燥麺から抽出・回収したＤＮＡを鋳
型とする反応液の全てに、ターゲット遺伝子の明瞭な陽
性バンド（９９bp）を確認した。また、これら２種の乾
燥麺試料からＰＣＲ増幅したバンドの塩基配列を確認し
たところ、共に既報の配列と一致した。
れぞれ前述の３％アガロースゲルにロードし、電気泳動
を行った。このゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線
下に観察したものが図７である。どん兵衛から抽出・回
収したＤＮＡを鋳型として用いたレーン２〜４（順に、
原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液）に示した。他
方、中華三昧・広東風拉麺から抽出・回収したＤＮＡを
鋳型として用いたレーン７〜９（順に、原液、１０倍希
釈液、１００倍希釈液）に、抽出系から鋳型ＤＮＡのみ
を除いた陰性コントロールはレーン１およびレーン６に
示した。また、レーン５は前述のマーカー１１である。
その結果、各試料乾燥麺から抽出・回収したＤＮＡを鋳
型とする反応液の全てに、ターゲット遺伝子の明瞭な陽
性バンド（９９bp）を確認した。また、これら２種の乾
燥麺試料からＰＣＲ増幅したバンドの塩基配列を確認し
たところ、共に既報の配列と一致した。
【００８７】
【実施例９】次に、本発明の第９の実施例として、試料
に、市販の糖質を多く含む製品から生麺を選択し、さぬ
きうどん（ゆでうどん：株式会社加ト吉製）と焼きそば
（むし中華めん：東洋水産社製）を対象とし、これら試
料生麺から糖質関連酵素としてα-アミラーゼを用いて
ＤＮＡを抽出・回収した場合を説明する。
に、市販の糖質を多く含む製品から生麺を選択し、さぬ
きうどん（ゆでうどん：株式会社加ト吉製）と焼きそば
（むし中華めん：東洋水産社製）を対象とし、これら試
料生麺から糖質関連酵素としてα-アミラーゼを用いて
ＤＮＡを抽出・回収した場合を説明する。
【００８８】本実施例９で用いた核酸抽出用溶解液は、
前記実施例２と同様の枯草菌由来のα-アミラーゼ（２
００ユニット）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
塩化カルシウム、０．５％トリトンＸー１００、５％ツ
イーン２０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩
衝液（pH ８．０）からなる。
前記実施例２と同様の枯草菌由来のα-アミラーゼ（２
００ユニット）、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
塩化カルシウム、０．５％トリトンＸー１００、５％ツ
イーン２０、５Ｍ尿素を含む３０ｍＭのトリス・塩酸緩
衝液（pH ８．０）からなる。
【００８９】試料の各生麺を凍結乾燥してから細かく砕
いたものを０．８ｇずつ秤量して上記溶解液８ｍＬに加
えて懸濁し、９０℃、３０分間保温した後、遠心分離に
より得た２種の抽出上清を実施例２と同じ手順で、ＤＮ
ＡをＤＥＡＥ−シリカ担体を充填したカラムで濾過して
該ＤＥＡＥ−シリカ担体に抽出上清中のＤＮＡを吸着さ
せ、Genomic DNA buffer setのバッファーＱＣにより洗
浄し、バッファーＱＢＴにより溶出した。ついで、この
溶出液に２μＬのエタ沈メイトと３．５ｍＬのイソプロ
パノールを加えて分別沈殿を行い、遠心分離後、得られ
た沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、風乾した後、４
０μＬのＴＥバッファーに溶解して２種の抽出ＤＮＡを
回収した。本実施例９においても、アルコール沈殿後の
ＤＮＡ沈殿物には、いずれもゼリー状に析出する夾雑多
糖は全く観察されず、ＤＮＡ抽出・回収操作は容易であ
った。
いたものを０．８ｇずつ秤量して上記溶解液８ｍＬに加
えて懸濁し、９０℃、３０分間保温した後、遠心分離に
より得た２種の抽出上清を実施例２と同じ手順で、ＤＮ
ＡをＤＥＡＥ−シリカ担体を充填したカラムで濾過して
該ＤＥＡＥ−シリカ担体に抽出上清中のＤＮＡを吸着さ
せ、Genomic DNA buffer setのバッファーＱＣにより洗
浄し、バッファーＱＢＴにより溶出した。ついで、この
溶出液に２μＬのエタ沈メイトと３．５ｍＬのイソプロ
パノールを加えて分別沈殿を行い、遠心分離後、得られ
た沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、風乾した後、４
０μＬのＴＥバッファーに溶解して２種の抽出ＤＮＡを
回収した。本実施例９においても、アルコール沈殿後の
ＤＮＡ沈殿物には、いずれもゼリー状に析出する夾雑多
糖は全く観察されず、ＤＮＡ抽出・回収操作は容易であ
った。
【００９０】以上の方法で２種の試料生麺から抽出・回
収したＤＮＡを鋳型として前述のAmpliTaq Goldによる
ＰＣＲ反応に供し、ターゲットＤＮＡであるコムギ由来
のグルテニン遺伝子を検出した。本遺伝子およびプライ
マー（配列番号９，１０）は実施例７のものと同じであ
る。
収したＤＮＡを鋳型として前述のAmpliTaq Goldによる
ＰＣＲ反応に供し、ターゲットＤＮＡであるコムギ由来
のグルテニン遺伝子を検出した。本遺伝子およびプライ
マー（配列番号９，１０）は実施例７のものと同じであ
る。
【００９１】まず回収した２種の生麺抽出ＤＮＡをそれ
ぞれ原液、１０倍希釈、１００倍希釈したもの全６種に
ついて、各２μＬをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。Ｐ
ＣＲ反応液は、それぞれ前述の６種の鋳型ＤＮＡを２μ
Ｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー、基質
ｄＮＴＰ混合液を含む総量２５μＬとした。これら６種
の反応液を９５℃、３０分間ホットスタートを行った
後、第一段階として９５℃で３０秒間、第二段階として
６４℃で３０秒間、第三段階として７２℃で３０秒間と
いう３段階のサイクルを４０回繰り返すことにより、タ
ーゲットＤＮＡを増幅した。
ぞれ原液、１０倍希釈、１００倍希釈したもの全６種に
ついて、各２μＬをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。Ｐ
ＣＲ反応液は、それぞれ前述の６種の鋳型ＤＮＡを２μ
Ｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー、基質
ｄＮＴＰ混合液を含む総量２５μＬとした。これら６種
の反応液を９５℃、３０分間ホットスタートを行った
後、第一段階として９５℃で３０秒間、第二段階として
６４℃で３０秒間、第三段階として７２℃で３０秒間と
いう３段階のサイクルを４０回繰り返すことにより、タ
ーゲットＤＮＡを増幅した。
【００９２】ＰＣＲ反応後、６種の反応液各５μＬをそ
れぞれ前述の３％アガロースゲルにロードし、電気泳動
を行った。このゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線
下に観察したものが図９である。さぬきうどんから抽出
・回収したＤＮＡを鋳型として用いた増幅産物をレーン
２〜４（順に、原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液）
に示した。他方、焼きそばから抽出・回収したＤＮＡを
鋳型として用いた増幅産物をレーン７〜９（順に、原
液、１０倍希釈液、１００倍希釈液）に、抽出系から鋳
型ＤＮＡのみを除いた陰性コントロールはレーン１およ
びレーン６に示した。また、レーン５およびレーン１０
は前述のマーカー１１である。その結果、各試料生麺か
ら抽出・回収したＤＮＡを鋳型とする反応液の全てに、
ターゲット遺伝子の明瞭な陽性バンド（９９bp）を確認
した。また、これら２種の生麺試料からＰＣＲ増幅した
バンドの塩基配列を確認したところ、共に既報の配列と
一致した。
れぞれ前述の３％アガロースゲルにロードし、電気泳動
を行った。このゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線
下に観察したものが図９である。さぬきうどんから抽出
・回収したＤＮＡを鋳型として用いた増幅産物をレーン
２〜４（順に、原液、１０倍希釈液、１００倍希釈液）
に示した。他方、焼きそばから抽出・回収したＤＮＡを
鋳型として用いた増幅産物をレーン７〜９（順に、原
液、１０倍希釈液、１００倍希釈液）に、抽出系から鋳
型ＤＮＡのみを除いた陰性コントロールはレーン１およ
びレーン６に示した。また、レーン５およびレーン１０
は前述のマーカー１１である。その結果、各試料生麺か
ら抽出・回収したＤＮＡを鋳型とする反応液の全てに、
ターゲット遺伝子の明瞭な陽性バンド（９９bp）を確認
した。また、これら２種の生麺試料からＰＣＲ増幅した
バンドの塩基配列を確認したところ、共に既報の配列と
一致した。
【００９３】以上の実施例の結果から、本核酸抽出方法
は、低コストで簡便な手法でありながらも多糖類を多く
含む様々な試料において、後のＰＣＲ法によるＤＮＡ増
幅が支障無く行える鋳型ＤＮＡとして、純度の高いＤＮ
Ａを効率よく試料から抽出、回収できるものであると言
える。
は、低コストで簡便な手法でありながらも多糖類を多く
含む様々な試料において、後のＰＣＲ法によるＤＮＡ増
幅が支障無く行える鋳型ＤＮＡとして、純度の高いＤＮ
Ａを効率よく試料から抽出、回収できるものであると言
える。
【００９４】なお、上記実施例においては、試料に含ま
れる多糖類としてデンプン関連糖質を対象とし、核酸抽
出用溶解液に含まれる糖質関連酵素としてα−アミラー
ゼを用いた場合を示したが、本発明による核酸抽出方法
においては、試料中の多糖類の種類に応じて適宜酵素を
選択し、また組み合わせて用いれば良い。
れる多糖類としてデンプン関連糖質を対象とし、核酸抽
出用溶解液に含まれる糖質関連酵素としてα−アミラー
ゼを用いた場合を示したが、本発明による核酸抽出方法
においては、試料中の多糖類の種類に応じて適宜酵素を
選択し、また組み合わせて用いれば良い。
【００９５】
【発明の効果】以上説明したとおり、本発明の核酸抽出
方法においては、試料に多くの多糖類が含まれている場
合でも、試料が懸濁される核酸抽出用溶解液にその多糖
類を分解可能な糖質関連酵素を含有させることにより、
多糖類が分解されて粘性の低い核酸抽出液が得られるた
め、低コストで簡便な方法でありながらも効率的に且つ
容易に核酸を回収できるという効果があり、従来は困難
であった多糖類を多く含む様々な試料からの効率的な核
酸の抽出・回収を実現できる。
方法においては、試料に多くの多糖類が含まれている場
合でも、試料が懸濁される核酸抽出用溶解液にその多糖
類を分解可能な糖質関連酵素を含有させることにより、
多糖類が分解されて粘性の低い核酸抽出液が得られるた
め、低コストで簡便な方法でありながらも効率的に且つ
容易に核酸を回収できるという効果があり、従来は困難
であった多糖類を多く含む様々な試料からの効率的な核
酸の抽出・回収を実現できる。
【００９６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NIPPON GENE CO.,LTD. <120> 核酸抽出方法 <130> PJ23775 <150> JP 2000-77871 <151> 2000-03-21 <160> 10
【００９７】 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 1 aaatgcatgc tgttctgcag gcag 24
【００９８】 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 2 acgaagactg caactcttac cgtat 25
【００９９】 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 3 atggcgtgtc cgtccctgat 20
【０１００】 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 4 tgacatcatg ttaggcgtca tc 22
【０１０１】 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 5 caacagctca ggctggtagc gc 22
【０１０２】 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 6 gtagacaaca ccgacctgct gcag 24
【０１０３】 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 7 cccttagcgt tgcaacgaga cttgc 25
【０１０４】 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 8 gtgccagtgc ctaatgagag caac 24
【０１０５】 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 9 ccattgcact ccgtaccctg cc 22
【０１０６】 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : Primer <400> 10 caccaactcc gatgccaacg cc 22
【図１】本発明の第１実施例において試料コーンスター
チから抽出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法に
よるターゲットＤＮＡ（トウモロコシ由来アミロプラス
ト特異的通過蛋白遺伝子）増幅後の電気泳動パターンの
模式図である。
チから抽出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法に
よるターゲットＤＮＡ（トウモロコシ由来アミロプラス
ト特異的通過蛋白遺伝子）増幅後の電気泳動パターンの
模式図である。
【図２】本発明の第２実施例において試料コーンスター
チから抽出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法に
よるターゲットＤＮＡ（トウモロコシ由来ツェイン遺伝
子）増幅後の電気泳動パターンの模式図である。
チから抽出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法に
よるターゲットＤＮＡ（トウモロコシ由来ツェイン遺伝
子）増幅後の電気泳動パターンの模式図である。
【図３】本発明の第３実施例において試料コーンスナッ
ク菓子から抽出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
法によるターゲットＤＮＡ（トウモロコシ由来ツェイン
遺伝子）増幅後の電気泳動パターンの模式図である。
ク菓子から抽出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
法によるターゲットＤＮＡ（トウモロコシ由来ツェイン
遺伝子）増幅後の電気泳動パターンの模式図である。
【図４】本発明の第４実施例において試料コーンシリア
ルから抽出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法に
よるターゲットＤＮＡ（トウモロコシ由来ツェイン遺伝
子）増幅後の電気泳動パターンの模式図である。
ルから抽出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法に
よるターゲットＤＮＡ（トウモロコシ由来ツェイン遺伝
子）増幅後の電気泳動パターンの模式図である。
【図５】本発明の第５実施例において試料米菓から抽出
・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によるターゲ
ットＤＮＡ（イネ由来プロラミン遺伝子）増幅後の電気
泳動パターンの模式図である。
・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によるターゲ
ットＤＮＡ（イネ由来プロラミン遺伝子）増幅後の電気
泳動パターンの模式図である。
【図６】本発明の第６実施例において試料ポテトスナッ
ク菓子から抽出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
法によるターゲットＤＮＡ（ジャガイモ由来パタチンク
ラス１遺伝子）増幅後の電気泳動パターンの模式図であ
る。
ク菓子から抽出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
法によるターゲットＤＮＡ（ジャガイモ由来パタチンク
ラス１遺伝子）増幅後の電気泳動パターンの模式図であ
る。
【図７】本発明の第７実施例において試料小麦スナック
菓子から抽出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法
によるターゲットＤＮＡ（コムギ由来グルテニン遺伝
子）増幅後の電気泳動パターンの模式図である。
菓子から抽出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法
によるターゲットＤＮＡ（コムギ由来グルテニン遺伝
子）増幅後の電気泳動パターンの模式図である。
【図８】本発明の第８実施例において試料乾燥麺から抽
出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によるター
ゲットＤＮＡ（コムギ由来グルテニン遺伝子）増幅後の
電気泳動パターンの模式図である。
出・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によるター
ゲットＤＮＡ（コムギ由来グルテニン遺伝子）増幅後の
電気泳動パターンの模式図である。
【図９】本発明の第９実施例において試料生麺から抽出
・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によるターゲ
ットＤＮＡ（コムギ由来グルテニン遺伝子）増幅後の電
気泳動パターンの模式図である。
・回収されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によるターゲ
ットＤＮＡ（コムギ由来グルテニン遺伝子）増幅後の電
気泳動パターンの模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (72)発明者 平野 久夫 富山県富山市問屋町１−29 株式会社ニッ ポンジーン酵素研究所内 (72)発明者 古井 聡 富山県富山市問屋町１−29 株式会社ニッ ポンジーン酵素研究所内 (72)発明者 齋藤 里衣 富山県富山市問屋町１−29 株式会社ニッ ポンジーン酵素研究所内 (72)発明者 浅野 秀徳 富山県富山市問屋町１−29 株式会社ニッ ポンジーン酵素研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】 試料を核酸抽出用溶解液中に懸濁するこ
とによって前記試料から前記溶解液中に核酸を抽出する
方法において、 前記試料が多糖類を含有し、前記核酸抽出用溶解液が前
記多糖類を分解可能な糖質関連酵素を含むことを特徴と
する核酸抽出方法。 - 【請求項２】 前記糖質関連酵素は、糖質加水分解酵素
であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方
法。 - 【請求項３】 前記糖質加水分解酵素は、α−アミラー
ゼ、β−アミラーゼ、セルラーゼのうちの少なくとも一
種であることを特徴とする請求項２に記載の核酸抽出方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001080564A JP2001333774A (ja) | 2000-03-21 | 2001-03-21 | 核酸抽出方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000-77871 | 2000-03-21 | ||
| JP2000077871 | 2000-03-21 | ||
| JP2001080564A JP2001333774A (ja) | 2000-03-21 | 2001-03-21 | 核酸抽出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001333774A true JP2001333774A (ja) | 2001-12-04 |
Family
ID=26587931
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001080564A Pending JP2001333774A (ja) | 2000-03-21 | 2001-03-21 | 核酸抽出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001333774A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007512811A (ja) * | 2003-11-10 | 2007-05-24 | インベスチゲン， インコーポレイテッド | 検出のための核酸を調製する方法 |
| JP2008500066A (ja) * | 2004-05-21 | 2008-01-10 | エムオー バイオ ラボラトリーズ インコーポレイテッド | 環境サンプルおよび生物学的サンプル中の核酸から夾雑物を除去するためのキットおよび方法 |
| RU2453605C2 (ru) * | 2007-09-14 | 2012-06-20 | Игорь Эдуардович Грановский | Дифференцирующий и специфический олигонуклеотиды для идентификации последовательностей днк трансгенных растений в пищевых продуктах, способ идентификации трансгенных продуктов, биочип, комбинация олигонуклеотидов (варианты) и набор для осуществления этого способа |
| KR20200102830A (ko) * | 2019-02-22 | 2020-09-01 | (주)모아캠 | 알로에 속 식물 유래 dna의 제조방법, 및 알로에 속 식물 유래 dna를 유효성분으로 포함하는 항노화 및 항염증용 조성물 |
| CN114657172A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-06-24 | 嘉兴市农业科学研究院 | 一种从少量稻米中提取基因组dna的方法及应用 |
-
2001
- 2001-03-21 JP JP2001080564A patent/JP2001333774A/ja active Pending
Cited By (7)
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| KR102237543B1 (ko) * | 2019-02-22 | 2021-04-07 | (주)모아캠 | 알로에 속 식물 유래 dna의 제조방법, 및 알로에 속 식물 유래 dna를 유효성분으로 포함하는 항노화 및 항염증용 조성물 |
| CN114657172A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-06-24 | 嘉兴市农业科学研究院 | 一种从少量稻米中提取基因组dna的方法及应用 |
| CN114657172B (zh) * | 2022-02-28 | 2024-03-26 | 嘉兴市农业科学研究院 | 一种从少量稻米中提取基因组dna的方法及应用 |
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