CN101805399A - 一种小麦千粒重相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦千粒重相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白为如下a)或b)的蛋白：a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦千粒重相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明蛋白及其编码基因与小麦千粒重相关，对研究小麦的籽粒发育有重要意义。本发明方法准确、可靠，可用于检测小麦发育早期的千粒重性状，对培育高产、优质的小麦具有重要指导作用，从而优化杂交组合，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，对小麦的遗传育种有重要的意义。

Description

一种小麦千粒重相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种小麦千粒重相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

在高等植物中，细胞分裂素(CK)通过控制细胞分裂与分化而广泛参与了植物生长发育的调控。研究表明，细胞分裂素在植物胚胎发育、根和芽的分化、维管束形成、叶绿体成熟、顶端优势、光信号转导以及延缓衰老等过程中均具有重要的调控作用。细胞分裂素氧化/脱氢酶(CKX)是降解植物体内细胞分裂素的主要酶类，可以通过氧化或还原反应去除细胞分裂素N6上带有的不饱和侧链而使其彻底丧失活性，该降解途径被认为是调节植物体内细胞分裂素动态平衡的一种重要方式，因此，分离克隆农作物中的CKX基因，并深入了解其在作物生长发育以及形态建成中的作用机理，对于作物产量、抗性等重要农艺性状的改良无疑将具有重要的现实意义。

自1999年Houba等和Morris等采用功能克隆的方法首先从玉米中分离出第一个植物CKX基因(ZmCKX1)以来，在拟南芥、兰花、水稻、大麦中也相继分离到了CKX基因。在玉米中的研究发现，CKX活性与玉米籽粒中的CK含量和细胞分裂速率之间明显相关。2005年，日本科学家通过图位克隆策略鉴定出了一个控制水稻穗粒数的主效QTL位点(Gnla，可解释表型变异的20％)，分析发现该位点编码一个细胞分裂素氧化/脱氢酶(OsCKX2)。通过对不同品种中OsCKX2等位变异的比较发现，OsCKX2基因功能的降低或丧失可以导致细胞分裂素在花序分生组织的积累，进而在不同品种中表现出穗粒数不同程度的提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛋白质及其编码基因，该蛋白质及其编码基因与小麦千粒重性状相关。

本发明提供的蛋白和基因来源于小麦，基因记作TaCKX6基因。

本发明提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦千粒重相关的由(a)衍生的蛋白质。

为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR

标签	残基	序列
			Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述编码基因为如下1)、2)、3)、4)或5)的基因：

1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；(此基因为TaCKX6基因的开放读码框的基因组序列，其中第2内含子中具有18bp插入的基因)

2)如下核苷酸序列所示的DNA分子：序列表中序列1缺失了自其5′末端起第3062-3079位核苷酸后得到的序列；(此基因为TaCKX6基因的开放读码框的基因组序列，此基因为第2内含子中具有18bp缺失的基因)

3)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；(此基因为TaCKX6基因的cDNA序列)

4)与1)或2)限定的DNA分子具有98％以上同源性且编码所述小麦千粒重相关蛋白质的DNA分子；(此基因具体可为与1)或2)所述基因序列存在1个或几个碱基突变的基因)

5)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述小麦千粒重相关蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对为如下1)或2)所示：

1)一条引物序列如序列4所示，另一条引物序列如序列5所示；(此为扩增基因全长的引物)

2)一条引物序列如序列6所示，另一条引物序列如序列7所示。(此为鉴定待测小麦18bp插入/缺失变异的In-Del标记引物)

含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

上述任一所述编码基因在鉴别小麦千粒重中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述引物在鉴别小麦千粒重中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的最后一个目的是提供一种鉴别小麦千粒重的方法。

本发明所提供的鉴别小麦千粒重的方法，包括如下步骤：检测待测小麦品种基因组中的上述编码基因(即TaCKX6基因的开放读码框的基因组序列)中的第2个内含子中是否含有如下18bp DNA片段：序列表中序列1自5′末端起第3062-3079位核苷酸所示DNA片段；不含有所述18bp DNA片段的待测小麦品种的千粒重高于含有所述18bpDNA片段的待测小麦品种的千粒重；所述待测小麦品种为2个，其中一个品种含有所述18bpDNA片段且另一个品种不含有所述18bpDNA片段；所述2个待测小麦品种的千粒重是所述2个待测小麦品种在相同环境下生长得到的小麦的千粒重；所述在相同环境下生长为在相同时间和相同地点生长。

所述检测待测小麦品种基因组中的上述编码基因中的第2个内含子中是否含有所述所述18bp DNA片段的方法为如下(1)或(2)所述：

(1)所述方法包括如下步骤：以所述待测小麦品种基因组DNA为模板，用上述2)所示引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述PCR扩增产物在所述聚丙烯酰胺凝胶上显示为108bp-190bp之间的条带的小麦品种的千粒重高于所述PCR扩增产物在所述聚丙烯酰胺凝胶上显示为201-217bp之间的条带的小麦品种的千粒重；

(2)所述方法包括如下步骤：以所述待测小麦品种基因组DNA为模板，用上述1)所示引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序，得到所述待测小麦品种基因组中的上述编码基因的序列，分析所述待测小麦品种基因组中的上述编码基因中的第2个内含子中是否含有所述18bp DNA片段；

所述方法(1)中，所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度为6％。

本发明鉴别小麦千粒重的方法准确、可靠，可用于检测小麦发育早期的千粒重性状，对培育高产、优质的小麦具有重要指导作用，从而优化杂交组合，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，对小麦的遗传育种有重要的意义。本发明的与小麦千粒重相关蛋白及其编码基因，对研究小麦的籽粒发育有重要意义。

附图说明

图1为用引物组合C19P5/C19P6PCR扩增普通小麦中国春基因组DNA(泳道1和2)和小麦授粉后第6-8天籽粒总mRNA反转录成的cDNA(泳道3和4)的结果；

图2为用In-Del标记进行插入/缺失类型检测；

图3为检测自然群体中66份小麦材料的插入/缺失变异的胶图；

图4为小麦千粒重相关蛋白的编码基因近等基因系与百农3217粒长的差异；

图5为不同年份小麦千粒重相关蛋白的编码基因近等基因系与百农3217千粒重的比较；

图6为小麦千粒重相关蛋白的编码基因(TaCKX6基因)的组织表达特异性；

图7为小麦千粒重相关蛋白的编码基因(TaCKX6基因)在籽粒发育各时期的实时定量PCR。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

下述实施例中所使用的试剂如无特殊说明均可从商业途径得到。

实施例1、小麦蛋白TaCKX6及其编码基因TaCKX6的获得

一、小麦基因TaCKX6的cDNA序列获得

1、小麦cDNA全长库的构建

构建中国春小麦的cDNA全长库，该文库包括幼苗、根、愈伤组织、花药、胚乳等不同组织，插入片段平均为1.5kb左右，克隆的全长比例为93％左右。

2、小麦基因TaCKX6的cDNA序列获得

根据已知的水稻细胞分裂素氧化/脱氢酶基因OsCKX2的cDNA序列(GenBank登录号AB205193)，Blast小麦EST库(TIGR：http://www.tigr.org/tdb/e2k1/tae1/)，获得与其高度同源的小麦EST序列1条，GenBank登录号为BQ235927，长度为512bp。再以小麦EST：BQ235927为探针，Blast步骤1获得的小麦cDNA全长库，获得含有目标EST的cDNA阳性克隆1个，编号为：CWFTAALSCS-19A1-T7_C19_B10，该克隆3’端已经测序815bp，经过中间引物延伸测序获得了阳性克隆的序列全长，共1924bp。

分析阳性克隆CWFTAALSCS-19A1-T7_C19_B10的序列，在其5′端第56位和第62位含有两个同框的起始密码子ATG，其ORF长度分别为1644bp和1638bp，将二者推演的氨基酸序列与水稻OsCKX2蛋白序列比较分析，推测小麦中与水稻细胞分裂素氧化/脱氢酶基因OsCKX2对应的基因的开放读码框长度应为1638bp，起始密码子ATG位于第62位。将小麦中与水稻细胞分裂素氧化/脱氢酶基因OsCKX2对应的基因记作基因TaCKX6。

小麦品种中国春(张磊，张宝石，周荣华，赵光耀，宋彦霞，贾继增.小麦细胞分裂素氧化/脱氢酶基因(TaCKX2)的克隆及其遗传作图.作物学报，2007，33(9)：1419-1425.)

二、小麦基因TaCKX6的基因组DNA序列的获得

根据步骤一的序列比对结果，跨越起始密码子和终止密码子设计基因全长引物C19P5：5’-tagctaagacacacacgcagg-3’(序列4)；C19P6：5’-tgacatttcatgataacaacaggct-3’(序列5)。

以普通小麦品种中国春的基因组DNA为模板，用引物组合C19P5/C19P6进行PCR扩增，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测；以普通小麦品种中国春开花授粉后第6-8天籽粒总mRNA反转录成的cDNA为模板，用引物C19P5和C19P6进行PCR扩增，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测结果如图1所示(其中，M为200bp DNA Ladder；1-2为扩增普通小麦品种中国春基因组DNA的结果，3-4为扩增普通小麦品种中国春授粉后第6-8天籽粒总mRNA反转录成的cDNA的结果)。

将扩增得到的PCR产物进行克隆测序，测序结果表明，该PCR产物中含有基因TaCKX6的开放读码框，C19P5/C19P6位于该开放读码框的上游和下游，该开放读码框的基因组DNA序列(即是小麦细胞分裂素氧化/脱氢酶基因TaCKX6的基因组序列)如序列表中序列1所示，由3747bp个核苷酸组成；获得普通小麦品种中国春中基因TaCKX6的cDNA序列(即是小麦细胞分裂素氧化/脱氢酶基因TaCKX6的cDNA序列)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。

将序列表中序列1与序列表中序列2进行比较，明确了TaCKX6基因的结构，TaCKX6基因包含3个外显子和2个内含子，Exon1＝1～617bp；Intron1＝618～702bp；Exon2＝703～1138bp；Intron2＝1139～3162bp；Exon3＝3163～3747bp；其开放读码框为1638bp，编码545个氨基酸(即是小麦千粒重相关蛋白，也就是小麦细胞分裂素氧化/脱氢酶蛋白TaCKX6)，其序列如序列表中序列3所示，理论分子量为59.0kD，等电点pI值为5.39。

实施例2、TaCKX6基因的等位变异类型的确定

小麦品种偃展1号、内乡188、旱选10号、鲁麦14(张磊，张宝石，周荣华，赵光耀，宋彦霞，贾继增.小麦细胞分裂素氧化/脱氢酶基因(TaCKX2)的克隆及其遗传作图.作物学报，2007，33(9)：1419-1425.)(由中国农业科学院作物科学研究所提供)

1、TaCKX6基因的等位变异类型的确定

分别以偃展1号、内乡188、旱选10号、鲁麦14的基因组DNA为模板，用引物组合C19P5/C19P6进行PCR扩增，对扩增产物进行克隆测序，并对测得的序列进行比对。比对结果表明，TaCKX6基因在四个品种中存在18bp插入/缺失的差异：与内乡188和旱选10号二品种相比，在偃展1号和鲁麦14二品种中，TaCKX6基因在第2个内含子接近第3个外显子处存在18bp的缺失，即缺失自序列1的5′末端起第3062-3079位核苷酸。

偃展1号和鲁麦14二品种的TaCKX6基因的基因组序列如下：序列表中序列1缺失了自其5′末端起第3062-3079位核苷酸后得到的序列。

2、设计用于鉴定待测小麦18bp插入/缺失变异的In-Del标记引物

根据小麦TaCKX6基因的18bp插入缺失两侧的保守区域设计了一对In-Del标记，引物序列如下，C19L3：5’-CACGTCGATAGTCTCATGCA-3’；C19L4：5’-CAGGAACTCCACGTAAGACA-3’。分别以偃展1号、内乡188、旱选10号、鲁麦14的基因组DNA为模板，用引物组合C19L3/C19L4进行PCR扩增，以验证此引物组合是否可以用来鉴定小麦变异类型。将PCR扩增产物用浓度为6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，胶联比为丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝49∶1，检测结果如图2所示，所用的marker的条带分别为217bp、201bp、190bp、108bp、结果表明偃展1号和鲁麦14的产物位于108-190bp之间，即为18bp缺失类型；而内乡188和旱选10号的产物位于201-217bp之间，即为18bp插入类型；与步骤1中测序比对结果相符，表明此引物可以用来鉴定待测小麦的插入/缺失变异类型。

实施例3、小麦TaCKX6基因与千粒重性状的关联分析

本实施例中的基因-性状关联分析的方法如下：使用DPS软件对基因的不同变异类型所对应的表型平均值进行t检验(盖均益，2000)，P＜0.05为显著，P＜0.01为极显著。

一、自然群体中小麦TaCKX6基因与千粒重性状的关联分析

1、自然群体中66份小麦的千粒重的测量

将66份小麦品种，于2004-2005年度秋播于北京同一试验田(中国农业科学院试验田)。采用随机区组设计，两次重复，行长2m，行距25cm，每行播种100个籽粒，分行收获、脱粒，种子收获后按下述方法测定千粒重，具体步骤为：随机取两组试样(每组试样中1000粒种子)。然后两组试样分别称重。以克为单位。最后取两组的平均数，求得千粒重。千粒重的测定结果如表1所示。

2、自然群体中66份小麦的TaCKX6基因的变异类型的确定

分别以步骤1中所述66份小麦叶子(叶子和籽粒的基因组DNA相同，但提叶子DNA更容易些)的基因组DNA为模板，用In-Del标记C19L3/C19L4引物组合进行PCR扩增，将PCR扩增产物用浓度为6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，胶联比为丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝49∶1。检测结果如图3所示，结果表明，其中28份材料属于18bp缺失类型，38份材料属于18bp插入类型(表1，A-缺失类型；B-插入类型)。

3、自然群体中66份小麦的TaCKX6基因与千粒重的关联分析

对66份小麦材料中18bp插入/缺失类型个体所对应的千粒重性状平均值进行t检验，结果表明18bp插入类型和18bp缺失类型之间的千粒重差异达到了0.01的极显著水平(表1、2)，缺失类型的平均千粒重高于插入类型的平均千粒重。

表1中的66个品种的小麦均由中国农业科院作物科学研究所和农业部作物品种资源与生物技术重点实验室提供。具体可以登陆“中国作物种质信息网”http://www.cgris.net/query/croplist.php查询和获取。

表1、66份小麦种质资源的千粒重(g)及变异类型

品种名称	插入、缺失变异类型	千粒重(g)
			周91177	A	56.48
陕农7859	A	56.26
			徐9639	A	55.26
郑麦8998	A	53.33
			烟优361	A	49.89
信阳12	A	49.78
			豫麦10号	A	49.5
兰考5号	A	49.26
			鲁麦15	A	48.99
藁城9411	A	48.84
			温麦6号	A	47.76
西农164	A	47.41
			远8444	A	47.38

品种名称	插入、缺失变异类型	千粒重(g)
			鲁麦14	A	47.36
远8427	A	47.05
			偃展1号	A	46.67
小偃54	A	45.07
			济南17	A	45.04
郑大6号	A	44.77
			兰考90(6)21-12	A	44.56
黑小麦	A	43.41
			内江31	A	43.28
百农64	A	42.96
			兰考21-7	A	42.54
冀矮小麦1号	A	41.88
			昌农339-51	A	41.79
冀87观739	A	41.78
			阿夫	A	41.11
PADERNO	B	40.28
			R-spro-27	B	39.95
捷克G377	B	38.9
			RS9701	B	38.71
RAVENNA	B	38.34

品种名称	插入、缺失变异类型	千粒重(g)
			Ac karma	B	36.89
川麦8号	B	36.19
			R-RWA-061(SW659)	B	36.18
pm18	B	35.94
			FRECCIA	B	35.92
Yrsp/6*Auocets	B	35.83
			BICANCIA	B	35.59
COLFIORITO	B	35.35
			Yr10/6*Auocets	B	34.54
Yr17/6*Auocets	B	34.23
			Ser10	B	33.63
Sirmione	B	33.28
			洛夫林10号	B	32.48
Yr26/3*Auocets	B	32.13
			矮粒多	B	31.92
Fr81-12	B	31.43
			金沙江1号	B	31.3
Pm12	B	30.97
			西农6028	B	30.7
红卷芒zm3339	B	30.06

品种名称	插入、缺失变异类型	千粒重(g)
			Ac Nanda	B	28.4
咸83	B	28.34
			中国春	B	28.18
Pm13	B	26.71
			松花江1号	B	26.32
R-spro37	B	25.79
			YN3	B	25.73
复壮30	B	24.59
			TIBET	B	24.24
Hussar	B	24.14
			德8661	B	21.85
pm20	B	21.7
			Pm16	B	14.06

表2、自然群体中TaCKX6基因与小麦千粒重性状的关联分析

基因型	样本数	千粒重(g)	t-value	P
					缺失类型(A)	28	47.12±4.37	11.9415	0.0001**
插入类型(B)	38	31.34±5.90

P值：*，P＜0.05；**，P＜0.01。

二、小麦的近等基因系中TaCKX6基因与小麦千粒重性状的关联分析

1、筛选TaCKX6基因的近等基因系

从已经构建的高代回交材料中进行了千粒重相关蛋白编码基因近等基因系的筛选，结果筛选获得了不同世代的以百农3217为轮回亲本，以R43为供体亲本的3套近等基因系：R43/百农3217⁵F5(2004年)、R43/百农3217⁶F1(2000年)、R43/百农3217⁷F1(2001年)。

R43/百农3217⁵F5株系、R43/百农3217⁶F1株系、R43/百农3217⁷F1株系、R43、百农3217均在文献(Ronghua Zhou，Zhendong Zhu，Xiuying Kong，Naxin Huo，Qingzhen Tian，Pei Li，Cuiyun Jin，Yuchen Dong and Jizeng Jia。2005.Developmentof wheat near-isogenic lines for powdery mildew resistance。TAG，110：640-648)中公开过。(由中国农业科学院作物科学研究所提供)

从回交世代来看，最高代近等基因系经历了7次回交，5次自交，理论上轮回亲本的背景回复率达到99％以上(R43/百农3217⁷F1)，并且近等基因系在不同世代中表现稳定，因此可以认为近等基因系与轮回亲本表现型的差异主要是由于TaCKX6基因插入/缺失变异而造成的。

R43/百农3217⁵F5株系：用百农3217与R43连续回交4次再自交5次获得。R43/百农3217⁵F5株系与百农3217的遗传背景一致，仅基因TaCKX6位点不同。

2、近等基因系籽粒性状的测量

将R43/百农3217⁵F5株系和百农3217分别在2004年10月份种植于北京同一试验田(中国农业科学院试验田)，2005年7月份收获。按照实验一中1所述方法进行种植、测定千粒重，并测定粒长和粒宽。

将R43/百农3217⁶F1株系和百农3217分别在2000年10月份种植于北京同一试验田(中国农业科学院试验田)，第二年7月份收获。按照实验一中1所述方法进行种植、测定千粒重，并测定粒长和粒宽。

将R43/百农3217⁷F1株系和百农3217分别在2001年10月份种植于北京同一试验田(中国农业科学院试验田)，第二年7月份收获。按照实验一中1所述方法进行种植、测定千粒重，并测定粒长和粒宽。

3、近等基因系TaCKX6基因插入/缺失变异类型的确定

近等基因系基因型的测定使用的方法是：使用引物组合C19P5/C19P6分别对每份材料进行PCR扩增，将扩增产物挖胶回收直接测序，使用的测序引物为C19P6；将测得序列与序列1进行比较，得出各近等基因系和百农3217的插入/缺失变异类型。

结果表明，该3套近等基因系的基因为缺失类型，轮回亲本百农3217基因为插入类型。

4、近等基因系中TaCKX6基因与籽粒性状的关联分析

对近等基因系(缺失类型)和轮回亲本百农3217(插入类型)所对应的表型性状平均值进行t检验，试验涉及到的主要农艺性状包括：粒长、粒宽、千粒重。每份材料的样本容量分别为：(2004年)R43/百农3217⁵F5＝11株，百农3217＝10株；(2000年)R43/百农3217⁶F1＝10株，百农3217＝7株；(2001年)R43/百农3217⁷F1＝16株，百农3217＝15株。结果表明，回交5代又自交5代的近等基因系R43/百农3217⁵F5(2004年)与轮回亲本百农3217相比，在千粒重和粒长上差异显著(表3，图4，图5；图4中A为近等基因系R43/百农3217⁵F5中小麦籽粒，B为轮回亲本百农3217中小麦籽粒)，但在粒宽和长/宽比上差异不显著(表3)；回交6代(R43/百农3217⁶F1，2000年)和7代(R43/百农3217⁷F1，2001年)的近等基因系的千粒重同样显著高于轮回亲本百农3217(表4，图5)。表明近等基因系(缺失类型)的平均粒长与千粒重高于轮回亲本百农3217(插入类型)的平均粒长与千粒重。粒长与千粒重有明显的正相关关系，推测TaCKX6基因可能通过控制粒长间接影响千粒重。

说明：NIL-gw3D表示R43/百农3217⁵F5(2004年)、R43/百农3217⁶F1(2000年)、R43/百农3217⁷F1(2001年)株系，为缺失类型；其中，gw是粒重的缩写，表示是百农3217的近等基因系；百农3217为插入类型。

表3、TaCKX6基因的近等基因系籽粒性状的考查(2004年，北京)

	千粒重(g)	粒长(mm)	粒宽(mm)	长/宽比
					R43/百农32175F5(缺失)	40.57±4.10	7.23±0.15	3.36±0.14	2.16±0.07
百农3217(插入)	36.81±3.55	7.08±0.11	3.34±0.13	2.12±0.09
					t值	2.2383*	2.6676*	0.3664	0.9257
P	0.0374	0.0152	0.7181	0.3662

P值；*，P＜0.05；**，P＜0.01.

表4、TaCKX6基因近等基因系千粒重的考查(2000年和2001年，北京)

P值；*，P＜0.05；**，P＜0.01.

综上研究表明，在自然群体、近等基因系二种不同的群体中，TaCKX6基因均与小麦千粒重性状相关，表明TaCKX6基因是与小麦千粒重相关的基因，该基因可以用来鉴别小麦千粒重性状。

总结上述鉴别小麦千粒重的方法如下：分别检测2个待测小麦品种基因组中的TaCKX6基因开放读码框中的第2个内含子中是否含有如下18bp DNA片段：序列表中序列1自5′末端起第3062-3079位核苷酸所示DNA片段；不含有所述18bp DNA片段的待测小麦品种为缺失类型，含有所述18bp DNA片段的待测小麦品种为插入类型，缺失类型千粒重高于插入类型千粒重；每次比较2个品种，2个被检测的小麦品种中，其中一个品种含有所述18bpDNA片段且另一个品种不含有所述18bpDNA片段；2个被检测的小麦品种的千粒重是如下前提下的千粒重：2个被测小麦品种在相同时期和相同环境下生长后得到的小麦的千粒重。

实施例4、普通小麦千粒重相关蛋白编码基因的表达模式

1、分别提取普通小麦品种中国春幼穗、发育时期籽粒、一叶一心期的根、叶的总RNA，并反转录合成第一链cDNA，对千粒重相关蛋白编码基因进行了RT-PCR分析。

其中，用于小麦不同组织部位总RNA提取的材料按照如下方法采集：中国春的种子表面消毒后浸泡在蒸馏水中12小时，露白后转入培养皿中，室温条件下生长至一叶一心时采集叶片和根，立即用液氮处理后，置于-70℃冰箱中保存备用；于幼穗尚未抽出叶鞘时采集幼穗；授粉开始后6-8天采集籽粒，液氮处理后于-70℃冰箱中保存备用。

结果如图6所示，表明，千粒重相关蛋白编码基因TaCKX6是在发育时期籽粒中特异表达的基因，所以千粒重相关蛋白编码基因在小麦籽粒发育过程中行使功能。

2、使用实时荧光定量PCR检测千粒重相关蛋白编码基因在不同发育阶段的籽粒中的表达情况。

实时荧光定量PCR的方法如下：

相对定量法测定基因在幼穗与籽粒不同发育时期的表达模式，使用天为时代公司Quant SYBR Green PCR试剂盒，实时荧光定量PCR在美国ABI PRISM 7000SDS上进行，Tubulin基因的表达作为内参，2^-ΔΔCt法统计分析实验结果(Livak and Schmittgen，2001)。

1)反应体系(20μl)：将20×SYBR溶液在室温下平衡并彻底混匀。

2)反应程序：

分别提取授粉后第0天、3天、8天、14天、18天、22天籽粒的总RNA，反转录成cDNA，用Tubulin作组成型基因的标记，对千粒重相关蛋白编码基因进行实时荧光定量PCR分析。结果如图7所示(其中，0d、3d、8d、14d、18d、22d分别代表授粉后第0天、3天、8天、14天、18天、22天的籽粒)。表明，千粒重相关蛋白编码基因从授粉开始到授粉后第8天在籽粒中的表达量逐渐增强，第8天以后逐渐减弱，籽粒形成前8天正是决定粒长的关键时期，表明，千粒重相关蛋白编码基因与粒长形成有关，基因的表达分析结果与在近等基因系中所得结论是一致的。

本研究通过同源克隆获得了与水稻OsCKX2基因直向同源的小麦千粒重相关蛋白编码基因(TaCKX6基因)，同时使用由66份材料组成的自然群体以及一对背景回复率在99％以上的近等基因系证明了小麦千粒重相关蛋白编码基因在第2内含子处存在18bp的缺失/插入的差异，且与千粒重相关显著，并且在近等基因系之间粒长差异显著，通过表达分析发现小麦千粒重相关蛋白编码基因在授粉之后到籽粒形成0-6天表达逐渐增强，此阶段正是决定粒长的关键时期，因此推测小麦中的千粒重相关蛋白编码基因通过控制粒长间接影响千粒重。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种小麦千粒重相关蛋白及其编码基因与应用

<160>7

 

<210>1

<211>3747

<212>DNA

<213>小麦属普通小麦(Triticum aestivum L.)

<400>1

atggctgctc tcttcgtgct cggctgcttc ctgcggaccg tccagaccgc acgggctgac     60

gccgacgcgc tcgcgtggac gccggcctcc cctttccgcg acgagctccg cgacctcggc    120

gtcgccgcgc tgatccgcga cgacgccgag gccaccgcgc tcgcgtccac tgacttcggc    180

aacgtgacgg tcgcgccggc ggcggccgtg ctctatccgt cgtgccccgc agacattgcc    240

gcgctgctgc gcgcctcgtg cgcgcgctcg tccccgttcc cggtgtccgc ccggggacgc    300

ggccactccg tacgtggcca ggcggccgcg accgacggcg tcgtcgtcga catgccgtcg    360

ctcggacgcc tcggcggagg ctccactgcg tcccgcctct ccgtgtcggt tgaaggccag    420

tacatagacg ccggcggcga acagctctgg gtggacgtgc tgcacgccgc cctcgcgcac    480

ggcctaacgc cgcgttcgtg gaccgactac ctccacctca ccgtcggcgg cacgctctcc    540

aacgccggca tcagcggcca ggccttccgc tacggccccc agatttccaa cgtccaagaa    600

ctggacgtca tcaccggtga gtacgctgcg tacatgcacg cttcatactt cattgatgac    660

agcacgttca cttacgttct tgaccacttg taaatatgta gggctcggag agatggtgac    720

gtgttcgaag gggaggaact ccgacctatt cgacgccgtg ctgggcgggc ttgggcagtt    780

cggcgtcata acgcgagcgc gcataccgct cgtgcccgcg ccgacgaggg cgcgctgggt    840

gcgcctcctg tacacgggcg ccgcctcact caccggcgac caggagcagc tcatagacgt    900

cgagcgtgcc aacgcgctgt ccgggctcat ggactacgtc gagggcacgg tcctcgcgga    960

caagggcctg atcgggagct ggcgctcgcc gtcgccgtcg tcatcgtcct tctgctcgga   1020

gcccgacgcc gcagcgcgcg tcgccaagct cgccgaggag gcaggcggcg tcctctactg   1080

ccttgaggga gcgctatact acggcggaac ggccggcggc gagcctgacg tcgaaaaggt   1140

aataaacgac cacctttgtc ggtgcgggtg cccgtcgtgt agcgctggta aaggtaaact   1200

acatgggacc catcgagtca tgggatcgtg acttttggcc tcctatgacg tggatgcatg   1260

cgtgcatggc tcaagcttgc atgcagatcc gtgcaccacc aacgtcgtag tacgtacttg   1320

gcctaccctc tgcccgccct tggaaatgcg catctcactg ccttttccgt cgggaaaata   1380

tttttttgtt gctttctcac tgttttccaa acttcataaa aaacacaggt aaaaattgca   1440

gtacagcaca tgtggcattt taaaaaacgt gtgcaggcta tttatataga gagatgacgg   1500

gagctaaaat aaaacaatgc caatctatga ttagatttct ggtaacaaat ttattaggaa   1560

tccgctaagt tccacatcat cgaaactgct ttttttgttg aggatcaatg ccgctgcttt    1620

atttcacctt aaccgaaact aggaatgtcg tccgaaagaa actccagaat gtgctctggg    1680

gtacagaaaa ccaaacttta caaagacgct cacctaaacc taacttagct agcttatcag    1740

cggctctatt ggcatcacga ccattccacg ccactttaac ttccaagaaa ggaaggagca    1800

agttttaaaa ttcctggaca tgagggccga atcatcgaga ctgctaaggt ggtacaaatc    1860

atatgtgcag aaacttttct tttagttacc tataaaaaac ttttctttta gccgaaaaca    1920

ataaagcagc atgcacacaa tttcccattc taaatttata attgcgcaat ggtaaatgca    1980

cactcgtttt ggcattgagt tgatccaaag gctcaccaga atgaccagtg tgagttgtga    2040

gtttatatta tgagatccat aagcctctca caacagtaga aaatatacct ttgccagaat    2100

tatataagtg catccatgtc gacatataag cttttcagca tcgatcaaca gtatttccat    2160

ggagtgttat atctgttagc cagtcaccta gtaggctagc gcacgaacaa gctagatccg    2220

atgtatggga tgggacaggg accttacatg cagatgcctg gcctacatgc tctaccactt    2280

ccatgcatat acacgacaca ctgtgcccgc caccaattgc tcaaaaagta aaactcgctc    2340

gttcacctta taataatttg tacggtattt gtcctggtct cttgcggagt agatggctgg    2400

aaaggtcagc ataatggtgg cgcgtccata tttttcataa cagttttgtt aagtcactgt    2460

cgactgatac tttgttatgt ctcagtccat gctatcttcc aaacatacat ggaaattcgt    2520

acgaaaattc tatttttggc cttttctttt tcttcttgca tactagtata tcacttgacc    2580

tacacccgga ggcagattta tggtctatgg ggacatctac accctatatg aaaaaaaaac    2640

atttagtaat tcaacaaaaa gtcagaaatt cctgaaaata tttttgaaat aaacttgacc    2700

ttttattgta ctcgtgagaa aaaattcaca aaaagaaaat ctccctttga cttcttttca    2760

aaaaaacaca atttttggct aaaatagtga gagtagtgac ctataatagc aaataaattt    2820

tgtgtttttt gctgtgaagt caactttgtt tttttcatga aaatttgtat acttgtgcaa    2880

aagtaagtca agttttttgt caaaatagtt cttacctatt ttgacctttt attaaaatat    2940

taaaaaaatc tccatatagg gagcatatat aaccaagaac caaagtgtac tttccctaga    3000

cacacccttt tcataatgta gtactactac tttgacacgt cgatagtctc atgcatatgc    3060

atatgcatgc atgcatgcgt aaaactgttc accgtgaaaa gttaattttt tttagggaaa    3120

cagtgtgaaa agttattgac tggtgcatgc atatacatgc agaggctgga gacgctactg    3180

cgtgagctgc ggtacgagcg gggcttcgcg tccgtgcatg acgtgtctta cgtggagttc    3240

ctggaccgcg tgcgcgacgg cgagctcaag ctccgcgccg ccggtcaatg ggacgtgccg    3300

cacccctggc tcattctctt cctcccgcgc tcccgcgtcc tggacttcgc cgccggcgtc    3360

ttccatggca tcctccgccg cggcgtcacc ggcgccaagg gacccatcct cgtctacccc    3420

atgaaccgga acaggtggga cagcgacctg tcggcggtgt tcccggagga ggaagagatg    3480

ttctacacgg tgggaatcct ccggccggcc gtgtccgacg gcgaccttgg gcgcctggag    3540

gagcagaacg acgagatctt acggttctgc gaggaggcca ggatacggtg cgtggagtac    3600

ctgtcgtact accccgacca ggccgggtgg gagaagaagc actttggtcc ggccaagtgg    3660

gccaggttcg tggagcggaa gaggaagtat gatcccaagg cgatcctgtc ccgtggccag    3720

agaattttcg catcctcgct ggcttga                                        3747

 

<210>2

<211>1638

<212>DNA

<213>小麦属普通小麦(Triticum aestivum L.)

<400>2

atggctgctc tcttcgtgct cggctgcttc ctgcggaccg tccagaccgc acgggctgac     60

gccgacgcgc tcgcgtggac gccggcctcc cctttccgcg acgagctccg cgacctcggc    120

gtcgccgcgc tgatccgcga cgacgccgag gccaccgcgc tcgcgtccac tgacttcggc    180

aacgtgacgg tcgcgccggc ggcggccgtg ctctatccgt cgtgccccgc agacattgcc    240

gcgctgctgc gcgcctcgtg cgcgcgctcg tccccgttcc cggtgtccgc ccggggacgc    300

ggccactccg tacgtggcca ggcggccgcg accgacggcg tcgtcgtcga catgccgtcg    360

ctcggacgcc tcggcggagg ctccactgcg tcccgcctct ccgtgtcggt tgaaggccag    420

tacatagacg ccggcggcga acagctctgg gtggacgtgc tgcacgccgc cctcgcgcac    480

ggcctaacgc cgcgttcgtg gaccgactac ctccacctca ccgtcggcgg cacgctctcc    540

aacgccggca tcagcggcca ggccttccgc tacggccccc agatttccaa cgtccaagaa    600

ctggacgtca tcaccgggct cggagagatg gtgacgtgtt cgaaggggag gaactccgac    660

ctattcgacg ccgtgctggg cgggcttggg cagttcggcg tcataacgcg agcgcgcata    720

ccgctcgtgc ccgcgccgac gagggcgcgc tgggtgcgcc tcctgtacac gggcgccgcc    780

tcactcaccg gcgaccagga gcagctcata gacgtcgagc gtgccaacgc gctgtccggg    840

ctcatggact acgtcgaggg cacggtcctc gcggacaagg gcctgatcgg gagctggcgc    900

tcgccgtcgc cgtcgtcatc gtccttctgc tcggagcccg acgccgcagc gcgcgtcgcc    960

aagctcgccg aggaggcagg cggcgtcctc tactgccttg agggagcgct atactacggc   1020

ggaacggccg gcggcgagcc tgacgtcgaa aagaggctgg agacgctact gcgtgagctg   1080

cggtacgagc ggggcttcgc gtccgtgcat gacgtgtctt acgtggagtt cctggaccgc   1140

gtgcgcgacg gcgagctcaa gctccgcgcc gccggtcaat gggacgtgcc gcacccctgg   1200

ctcattctct tcctcccgcg ctcccgcgtc ctggacttcg ccgccggcgt cttccatggc   1260

atcctccgcc gcggcgtcac cggcgccaag ggacccatcc tcgtctaccc catgaaccgg   1320

aacaggtggg acagcgactt gtcggcggtg ttcccggagg aggaagagat gttctacacg   1380

gtgggaatcc tccggccggc cgtgtccgac ggcgaccttg ggcgcctgga ggagcagaac   1440

gacgagatct tacggttctg cgaggaggcc aggatacggt gcgtggagta cctgtcgtac   1500

taccccgacc aggccgggtg ggagaagaag cactttggtc cggccaagtg ggccaggttc   1560

gtggagcgga agaggaagta tgatcccaag gcgatcctgt cccgtggcca gagaattttc   1620

gcatcctcgc tggcttga                                                 1638

 

<210>3

<211>545

<212>PRT

<213>小麦属普通小麦(Triticum aestivum L.)

<400>3

Met Ala Ala Leu Phe Val Leu Gly Cys Phe Leu Arg Thr Val Gln Thr

1               5                   10                  15

Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala Leu Ala Trp Thr Pro Ala Ser Pro Phe

            20                  25                  30

Arg Asp Glu Leu Arg Asp Leu Gly Val Ala Ala Leu Ile Arg Asp Asp

        35                  40                  45

Ala Glu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Thr Asp Phe Gly Asn Val Thr Val

    50                  55                  60

Ala Pro Ala Ala Ala Val Leu Tyr Pro Ser Cys Pro Ala Asp Ile Ala

65                  70                  75                  80

Ala Leu Leu Arg Ala Ser Cys Ala Arg Ser Ser Pro Phe Pro Val Ser

                85                  90                  95

Ala Arg Gly Arg Gly His Ser Val Arg Gly Gln Ala Ala Ala Thr Asp

            100                 105                 110

Gly Val Val Val Asp Met Pro Ser Leu Gly Arg Leu Gly Gly Gly Ser

        115                 120                 125

Thr Ala Ser Arg Leu Ser Val Ser Val Glu Gly Gln Tyr Ile Asp Ala

    130                 135                 140

Gly Gly Glu Gln Leu Trp Val Asp Val Leu His Ala Ala Leu Ala His

145                 150                 155                 160

Gly Leu Thr Pro Arg Ser Trp Thr Asp Tyr Leu His Leu Thr Val Gly

                165                 170                 175

Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala Phe Arg Tyr Gly

            180                 185                 190

Pro Gln Ile Ser Asn Val Gln Glu Leu Asp Val Ile Thr Gly Leu Gly

        195                 200                 205

Glu Met Val Thr Cys Ser Lys Gly Arg Asn Ser Asp Leu Phe Asp Ala

    210                 215                 220

Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Val Ile Thr Arg Ala Arg Ile

225                 230                 235                 240

Pro Leu Val Pro Ala Pro Thr Arg Ala Arg Trp Val Arg Leu Leu Tyr

                245                 250                 255

Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Gly Asp Gln Glu Gln Leu Ile Asp Val

            260                 265                 270

Glu Arg Ala Asn Ala Leu Ser Gly Leu Met Asp Tyr Val Glu Gly Thr

        275                 280                 285

Val Leu Ala Asp Lys Gly Leu Ile Gly Ser Trp Arg Ser Pro Ser Pro

    290                 295                 300

Ser Ser Ser Ser Phe Cys Ser Glu Pro Asp Ala Ala Ala Arg Val Ala

305                 310                 315                 320

Lys Leu Ala Glu Glu Ala Gly Gly Val Leu Tyr Cys Leu Glu Gly Ala

                325                 330                 335

Leu Tyr Tyr Gly Gly Thr Ala Gly Gly Glu Pro Asp Val Glu Lys Arg

            340                 345                 350

Leu Glu Thr Leu Leu Arg Glu Leu Arg Tyr Glu Arg Gly Phe Ala Ser

        355                 360                 365

Val His Asp Val Ser Tyr Val Glu Phe Leu Asp Arg Val Arg Asp Gly

    370                 375                 380

Glu Leu Lys Leu Arg Ala Ala Gly Gln Trp Asp Val Pro His Pro Trp

385                 390                 395                 400

Leu Ile Leu Phe Leu Pro Arg Ser Arg Val Leu Asp Phe Ala Ala Gly

                405                 410                 415

Val Phe His Gly Ile Leu Arg Arg Gly Val Thr Gly Ala Lys Gly Pro

            420                 425                 430

Ile Leu Val Tyr Pro Met Asn Arg Asn Arg Trp Asp Ser Asp Leu Ser

        435                 440                 445

Ala Val Phe Pro Glu Glu Glu Glu Met Phe Tyr Thr Val Gly Ile Leu

    450                 455                 460

Arg Pro Ala Val Ser Asp Gly Asp Leu Gly Arg Leu Glu Glu Gln Asn

465                 470                 475                 480

Asp Glu Ile Leu Arg Phe Cys Glu Glu Ala Arg Ile Arg Cys Val Glu

               485                 490                 495

Tyr Leu Ser Tyr Tyr Pro Asp Gln Ala Gly Trp Glu Lys Lys His Phe

            500                 505                 510

Gly Pro Ala Lys Trp Ala Arg Phe Val Glu Arg Lys Arg Lys Tyr Asp

        515                 520                 525

Pro Lys Ala Ile Leu Ser Arg Gly Gln Arg Ile Phe Ala Ser Ser Leu

    530                 535                 540

Ala

545

 

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

tagctaagac acacacgcag g                                                    21

 

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

tgacatttca tgataacaac aggct                                                25

 

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

cacgtcgata gtctcatgca                                            20

 

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

caggaactcc acgtaagaca                                            20

Claims (10)

1.一种蛋白，为如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦千粒重相关的由(a)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)、2)、3)、4)或5)的基因：

1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)如下核苷酸序列所示的DNA分子：序列表中序列1缺失了自其5′末端起第3062-3079位核苷酸后得到的序列；

3)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA分子具有98％以上同源性且编码所述小麦千粒重相关蛋白质的DNA分子；

5)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述小麦千粒重相关蛋白质的DNA分子。

4.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任意片段的引物对。

5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于：所述引物对为如下1)或2)所示：

1)一条引物如序列4所示，另一条引物如序列5所示；

2)一条引物如序列6所示，另一条引物如序列7所示。

6.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。

7.权利要求2或3所述编码基因在鉴别小麦千粒重中的应用。

8.权利要求5中所示引物在鉴别小麦千粒重中的应用。

9.一种鉴别小麦千粒重的方法，包括如下步骤：检测待测小麦品种基因组中的权利要求2或3所述编码基因中的第2个内含子中是否含有如下18bp DNA片段：序列表中序列1自5′末端起第3062-3079位核苷酸所示DNA片段；不含有所述18bp DNA片段的待测小麦品种的千粒重高于含有所述18bp DNA片段的待测小麦品种的千粒重；所述待测小麦品种为2个，其中一个品种含有所述18bpDNA片段且另一个品种不含有所述18bpDNA片段；所述2个待测小麦品种的千粒重是所述2个待测小麦品种在相同环境下生长得到的小麦的千粒重；所述在相同环境下生长为在相同时间和相同地点生长。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦品种基因组中的权利要求2或3所述编码基因中的第2个内含子中是否含有所述所述18bp DNA片段的方法为如下(1)或(2)所述：

(1)所述方法包括如下步骤：以所述待测小麦品种基因组DNA为模板，用权利要求5中2)所示引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述PCR扩增产物在所述聚丙烯酰胺凝胶上显示为108bp-190bp之间的条带的小麦品种的千粒重高于所述PCR扩增产物在所述聚丙烯酰胺凝胶上显示为201-217bp之间的条带的小麦品种的千粒重；

(2)所述方法包括如下步骤：以所述待测小麦品种基因组DNA为模板，用权利要求5中1)所示引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序，得到所述待测小麦品种基因组中的权利要求2或3所述编码基因的序列，分析所述待测小麦品种基因组中的权利要求2或3所述编码基因中的第2个内含子中是否含有所述18bp DNA片段；

所述方法(1)中，所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度为6％。

Images