CN114763374A

CN114763374A - 一种调控落粒性的基因及其应用

Info

Publication number: CN114763374A
Application number: CN202011615292.1A
Authority: CN
Inventors: 韩斌; 吕丹凤; 戴冰馨
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-07-19

Abstract

本发明涉及一种调控落粒性的基因及其应用。本发明提供一种调控植物落粒性的方法，所述方法包括调节植物中SHAT3基因的表达。

Description

一种调控落粒性的基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种落粒性调控基因及其应用。

背景技术

野生稻为了便于种子传播，一般都具有发达的离层，在种子成熟时会自然脱落。虽然落粒性有利于野生稻的种子传播，但在栽培稻中往往带来产量减少等负面影响。在驯化的过程中，经过人类祖先的选择逐渐形成了现在不易落粒便于人类耕种和收获的栽培稻。水稻种子的易于脱落是由于存在一个被为离层区(abscission zone，AZ)的结构，位于种子与支梗的连接处。该结构一至两层形态较小，胞质稠密，并且呈扁平状排列的细胞组成。这些细胞在响应一些促进脱落的生物或非生物信号时表现出与周围细胞不同的生理生化反应。通常促进脱落的信号与植物远端器官的衰老相关。但是一系列环境因素，比如缺水，极端温度，或昆虫和病原菌的入侵等也会造成叶片，花或果实的提前脱落。不合时宜的脱落会造成许多农作物或果树的减产。因此，了解脱落过程在现代农作物中是怎样被调控的具有重要的农业意义。

在水稻落粒的研究中心，被认为与驯化选择最为相关的有两个。其中一个是SH4，编码一个MYB家族转录因子，带有DNA结合结构域。栽培稻sh4的一个单氨基酸突变导致落粒性下降，但并没有导致离层区完全散失。这个突变位点存在于目前大多数栽培稻中，除了一些非洲栽培稻中存在另外一个等位位点的突变，导致离层发育的显著缺失。另一个与脱落相关的基因是qSHl，编码一个BEL1类型的同源异型蛋臼。qSHl是从不落粒的梗稻日本睛和落粒性较好的籼稻(Kasalath)的高世代回交群体克隆到。qSHl基因连同其上游约12Kb的5'UTR内的一个SNP共同决定离层区的分化。

之后也相继报道了一些与离层发育相关的基因。一个通过栽培稻突变体克隆到的OsCPLl，该基因编码CDP磷酸化酶，被认为在水稻离层区发育过程中起着负调控的作用。随后，我们发现了AP2类基因SHAT1参与水稻离层发育的调控，shat1突变体离层完全消失，而且植物会出现一些不良的性状。SHAT1基因不属于驯化基因，但是对离层发育有着重要作用。其小麦中同源基因Q基因被报道影响种子的落粒性。Q基因编码一个AP2的转录因子，与小麦易于脱粒的性状有重要关系，是驯化基因。另外还有SH5和OSH15可以相互作用，抑制木质素的合成而增加落粒性，并且OSH15蛋白可以与SH5和qSH1互作9，10。最近报道SSH1的基因，编码一个AP2类转录因子，正调控qSH1和SH5的表达，进而调控水稻落粒性。

以上基因都与水稻的落粒性相关，有的直接调控离层发育，也有的影响木质素积累，间接影响种子落粒性。目前虽然克隆到了不少落粒相关基因，但是对于水稻离层后期如何降解分离的原理知之甚少。本领域有必要进一步研究调控植物中子落粒性能的基因，以应用于植物优良品种的筛选、育种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种离层区发育相关基因及其应用。

本发明第一方面提供一种物质的用途，所述物质选自下组：SHAT3基因或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，用于调控植物的落粒性、离层细胞解离、和/或减少因落粒带来的产量损失。

在一个或多个实施方案中，所述物质为SHAT3基因或其编码蛋白、或其促进剂，并且所述调控植物的落粒性是促进植物落粒和/或离层细胞解离。

在一个或多个实施方案中，所述物质为SHAT3基因的抑制剂，并且所述调控植物的落粒性是抑制植物落粒和/或离层细胞解离。

在一个或多个实施方案中，所述促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子或其组合。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂是特异性干扰SHAT3基因转录和/或表达的抑制分子(干扰分子)。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以SHAT3基因或其转录本作为抑制靶标。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以SEQ ID NO:1或2作为抑制靶标。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、dsRNA、sgRNA、抗体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以SEQ ID NO:2或其转录本作为沉默靶标的dsRNA或构建物。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂是使SHAT3基因的外显子发生缺失突变的试剂。优选地，所述抑制剂是使SHAT3编码序列(例如SEQ ID NO:2)的第756位碱基缺失的试剂。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂是使用选自ZFN、TALEN和CRISPR的技术敲除SHAT3编码序列(例如SEQ ID NO:2)的第756位碱基的试剂，例如sgRNA。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂是用于敲除SHAT3编码序列(例如SEQ IDNO:2)的第756位碱基的sgRNA。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂还包含Cas酶(例如Cas9)、其编码序列、和/或表达所述Cas酶的核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾谷类作物。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾本科植物。

在一个或多个实施方案中，所述禾本科植物是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦。

在一个或多个实施方案中，所述水稻包括籼稻、粳稻、或其组合。

在一个或多个实施方案中，所述水稻是日本晴。

在一个或多个实施方案中，所述SHAT3基因包括cDNA序列、基因组序列、或其组合。

在一个或多个实施方案中，所述SHAT3基因来自禾本科植物，优选来自水稻。

在一个或多个实施方案中，所述SHAT3基因的氨基酸序列选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1所示序列经过一个或多个(如1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在一个或多个实施方案中，所述SHAT3基因的核酸序列选自：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(2)如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸或与其具有80％(优选地90％；更优选地95％或98％)以上同源性的多核苷酸；

(3)在SEQ ID NO:2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个优选地1-30，更优选地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明第二方面提供一种调控植物落粒性和/或离层细胞解离的方法，所述方法包括：调节植物中SHAT3基因的表达或活性，从而调控植物落粒性和/或离层细胞解离。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾谷类作物。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾本科植物。

在一个或多个实施方案中，所述水稻是日本晴。

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

在一个或多个实施方案中，所述SHAT3基因的核酸序列选自：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在一个优选实施方案中，所述调控植物落粒性和/或离层细胞解离的方法包括：上调植物中SHAT3基因的表达；从而促进植物落粒和/或离层细胞解离。

在一个或多个实施方案中，所述上调植物中SHAT3基因的表达包括：将SHAT3基因转入植物，获得转化的植物。

在一个或多个实施方案中，所述上调植物中SHAT3基因的表达的方法包括：

(1)提供携带含有SHAT3基因的核酸构建物的农杆菌，

(2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体或重组载体。

在一个或多个实施方案中，所述上调植物中SHAT3基因的表达的方法还包括：

(3)选择出转入了SHAT3基因的植物组织、器官或种子；和

(4)将步骤(3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

在另一优选实施方案中，所述调控植物落粒性和/或离层细胞解离的方法包括：下调植物中SHAT3的表达；从而抑制植物落粒和/或离层细胞解离。

在一个或多个实施方案中，所述下调植物中SHAT3基因的表达包括：将下调SHAT3基因转录、蛋白表达或蛋白活性的抑制剂转入植物中。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂是特异性干扰SHAT3基因转录和/或表达的抑制分子。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂是使用选自ZFN、TALEN和CRISPR的技术敲除SHAT3编码序列(例如SEQ ID NO:2)的第756位碱基的试剂。

在一个或多个实施方案中，所述下调植物中SHAT3基因的表达的方法包括：

(i)提供携带可干扰基因表达的核酸构建物的农杆菌，所述核酸构建物含有或产生所述抑制剂；

(ii)将植物的细胞或组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官。

在一个或多个实施方案中，所述下调植物中SHAT3基因的表达的方法还包括：

(iii)选择出转入了所述核酸构建物的植物组织、器官或种子；和

(iv)将步骤(iii)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

在本发明的另一方面，提供一种SHAT3基因的用途，用于作为鉴定植物落粒性的分子标记。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾谷类作物。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾本科植物。

在一个或多个实施方案中，所述水稻是日本晴。

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

在一个或多个实施方案中，所述SHAT3基因的核酸序列选自：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明还提供一种表达SHAT3基因的表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：5’UTR区、SHAT3基因的ORF序列、和终止子，

在一个或多个实施方案中，所述5’UTR区如SEQ ID NO:9所示。

在一个或多个实施方案中，SHAT3基因的ORF序列编码：

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

在一个或多个实施方案中，所述SHAT3基因的ORF序列包含选自以下的核酸序列：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明还提供核酸构建物，其包含本文所述的表达盒或其互补序列。

本发明还提供宿主细胞，其(1)包含核酸构建物，所述核酸构建物包含本文所述的表达盒或其互补序列，或(2)染色体中整合有本文所述的表达盒。

在一个或多个实施方案中，所述的宿主细胞为植物细胞，优选为禾本科植物细胞，更优选为水稻细胞。

在本发明的另一方面，提供一种靶向SHAT3基因的抑制剂。

本发明还提供了本文所述的表达盒或抑制剂的用途，用于调节作物的落粒性。

附图说明

图1显示野生型和shat3突变体离区形态鉴定和落性检粒测。

(A)离层区域纵切激光共聚焦观察。箭头所指为离层细胞。WT,wild type；shat3,shat3突变体；

(B)种子在成熟过程中拉力检测。在种子发育过，程从中开花当天(0天)开始，每隔2或3天测一次。误差线以±SD表示；

(C)枝梗和种子连接处断裂面扫描电镜照片。右侧为左侧白色方框位置的放大。

图2是shat3突变体的初定位。shat3突变基因与2号染色体多态标记ST5-2888和ST5-3269共分离。W:Oryza.rufipagan W1943.L55:shat3突变体。所用初定位不落粒隐性个体10株。

图3是SHAT3基因与突变基因结构。

图4显示SHAT3基因遗传互补表型。

(A、D)为野生型植株和穗部表型，完全落粒；

(B、E)为shat3突变体植株和穗部表型；

(C、F)为互补株系T31的植株和穗部表型。

图5是SHAT3互补株系落粒性测定。野生型在15天时已经自然脱落，互补株系在第16天时基本完全脱落。而突变体shat3一直到38天还可以测到拉力。

具体实施方式

本研究发现了一个在离层发育后期影响水稻脱落的基因SHAT3。该基因的突变体可以观察到与野生型一样的完整的离层发育，但是在种子成熟后期落粒性显著降低。因此，发明人首次揭示通过在禾谷类植物(作物)中定向调控SHAT3基因表达水平，可显著调节植物的落粒性、延缓离层细胞解离，进而达到改良禾谷类作物、减少损失、增加产量等目的。

如本文所用，“禾谷类作物”可以是禾本科植物或有芒植物(作物)。优选地，所述禾本科植物是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦。有芒植物是指种子壳上存在针状物植物。如本文所用，术语“农作物”或“作物”没有特别的限制，包括但不限：水稻、小麦、大麦等。

如本文所用，SHAT3基因编码的多肽命名为“SHAT3”。在本发明中，术语“SHAT3”指具有SHAT3活性的SEQ ID NO:1序列的多肽。该术语还包括具有与SHAT3相同功能的、SEQ IDNO:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，优选地1-30个、1-20个、1-10个、1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，优选地为10个以内，更优选地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在本领域中，性能相似的氨基酸往往指具有相似侧链的氨基酸家族，在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乳酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。又比如，在氨基末端和/或羧基末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽或蛋白的功能。对于许多常见已知非遗传性编码氨基酸的保守氨基酸取代本领域已知。其他非编码氨基酸的保守取代可基于其物理性质与遗传上编码的氨基酸的性质的比较来确定。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体。

任何与所述SHAT3同源性高(比如与SEQ ID NO:1所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有SHAT3相似或相同功能的多肽也包括在本发明内。所述“相同或相似功能”主要是指调控农作物(如水稻)的落粒性。

本发明还包括所要求保护的多肽的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO:1差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

此外，任何一种SHAT3的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，SHAT3的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的SHAT3的全部或部分功能。通常情况下，所述生物活性片段至少保持50％的全长SHAT3的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长SHAT3的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明还涉及编码本发明SHAT3或其变体、类似物、衍生物的多核苷酸序列。所述多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。如本文所用，简并变异体在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1的蛋白质，但与SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，优选至少70％，更优选至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:1所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于水稻，但是来源于其它类似的植物(尤其是与水稻属于同一科或属的植物)的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ ID NO:1所示)具有一定同源性(如具有70％以上，如80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的SHAT3的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的SHAT3核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还提供了一种包括本发明的基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

包括本发明基因、表达盒或的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。所述多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。其它增加SHAT3表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强SHAT3的表达。或者通过增强子来增强该SHAT3基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本文所述多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括(但并不限于)：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

用重组DNA转化宿主可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

本发明提供了所述SHAT3基因的用途，用于调控植物落粒性和/或离层细胞解离；或用于筛选对于调控植物落粒性和/或离层细胞解离有用的物质(即：所述物质通过调节SHAT3基因的表达来调节植物落粒性或离层细胞解离)。作为一种优选方式，所述SHAT3基因可用于促进植物落粒和/或离层细胞解离。

本发明还涉及SHAT3上调剂或抑制剂及其用途。由于SHAT3的上调剂或抑制剂可调节SHAT3的表达和/或活性等，因此，所述上调剂或抑制剂也可通过对SHAT3的影响来调控植物落粒性，从而达到改良植物的目的。

在一个方面，任何可提高SHAT3的活性、提高其的稳定性、促进其表达、延长其有效作用时间、或促进其基因转录和翻译的物质均可用于本发明，作为SHAT3基因的“促进剂”，用于调控植物落粒性。例如提高SHAT3基因的转录、表达或活性的表达载体。

在另一方面，任何可降低SHAT3的活性、降低其稳定性、抑制其表达、减少其有效作用时间、或降低其转录和翻译的物质均可用于本发明，作为SHAT3的下调剂、拮抗剂或抑制剂，如干扰所述SHAT3基因表达的干扰分子(如可形成microRNA的干扰分子)。所述下调剂、拮抗剂或抑制剂可用于调控植物落粒性。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。

此外，为了下调SHAT3基因表达或活性，可在细胞中转入基因敲除载体，和/或采用基因编辑技术如ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9等改变该基因或其片段。适用于本发明的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术为本领域所周知。各技术各自通过DNA识别域与核酸内切酶的共同作用实现靶基因的敲除或编辑。在具体实施方案中，所述基因敲除或基因编辑使SHAT3编码序列(例如SEQ ID NO:2)的第756位碱基缺失。

本发明还涉及一种调控植物落粒性和/或离层细胞解离的方法，该方法包括调节所述植物中SHAT3基因的表达。

一方面，本发明提供了一种调控植物(如作物)落粒性的方法，所述方法包括：使所述植物过量表达SHAT3基因，从而增加植物落粒和/或促进离层细胞解离。在得知了所述SHAT3基因的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述SHAT3基因的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带SHAT3基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的SHAT3。

作为本发明的一种实施方式，将SHAT3基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述带有外源基因的重组载体导入到植物组织或器官中，使所述植物表达SHAT3基因。可通过将所述植物组织或器官再生成植物，获得过量表达SHAT3基因的植物。

另一方面，本发明提供了另一种调控植物(如作物)落粒性的方法，所述方法包括：降低所述植物中SHAT3基因的表达(包括使SHAT3基因不表达或低表达)；从而抑制植物落粒和/或抑制离层细胞解离。

可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低SHAT3基因的表达或使之缺失表达，比如将携带反义SHAT3基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达SHAT3。或者，可通过本领域人员已知的途径敲除SHAT3基因，和/或采用基因编辑技术如ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9等编辑SHAT3基因。在具体实施方案中，所述基因敲除或基因编辑使SHAT3编码序列(例如SEQ ID NO:2)的第756位碱基缺失。

在优选实施方案中，所述上调植物中SHAT3基因的表达的方法包括：

(1)提供携带含有SHAT3基因的核酸构建物的农杆菌；

(2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官；

(3)选择出转入了SHAT3基因的植物组织、器官或种子；和

(4)将步骤(3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

在另一优选实施方案中，所述下调植物中SHAT3基因的表达的方法包括：

(i)提供携带可干扰基因表达的核酸构建物的农杆菌，所述核酸构建物含有或产生本文所述的抑制剂(包括但不限于反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、dsRNA、sgRNA、抗体或其组合，或产生所述反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、dsRNA、sgRNA、抗体的核酸构建物)；

(ii)将植物的细胞或组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官；

(iv)将步骤(iii)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

SHAT3蛋白的编码基因的另一个应用作为鉴定禾本科植物落粒性能的分子标记。可通过分析待测植物(如植物的种子或幼苗)中SHAT3蛋白的表达情况，来判断其落粒性能。例如，鉴定到植物中SHAT3蛋白的表达低或无，则该植株可呈现不落粒或较少落粒的表型；而若鉴定到SHAT3蛋白的较高表达(过量表达)，则该植株可呈现落粒的表型。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

材料和方法

1、替换系SL4的构建

辐射诱变水稻材料为以常规籼稻品种广陆矮4号(GLA4)为背景，第4染色体被普通野生稻(Oryza.rufipogon)W1943替换的替换系，本发明人将其命名为SL4(substitutionline 4)，由日本植物基因组中心(Plant Genome Center)提供。该材料通过W1943与GLA4杂交，然后以G4作为轮回亲本进行回交4代，然后自交1代后得到。

2、γ-ray突变体库的构建

(1)取1kg当年收获的SL4种子，先在自来水中稍微清洗，去掉浮粒，然后在纯净水水中浸泡两天，期间更换一次水。

(2)浸好的种子在37℃培养箱催芽11.5小时，至种子刚露白。

(3)露白的种子进行Co^6o辐射诱变。辐射时种子所处位置的辐射强度为2.3Gy/min，辐射总剂量为60Gy。

(4)诱变Tl代种子种在上海大田，网袋套袋收获5000株单株。

(5)T2代种植取4800个Tl代单株种子，全部混合，种在海南陵水大田。

(6)从T2代中筛选不落粒的突变体保留。

3、不落粒突变体表型鉴定

(1)拉力计检测种子落粒性

抽随后不同时期的水稻穗子平放在桌上，用夹子夹住稻粒稃尖端，采用依思达推拉力计(DS2-20N)记录稻粒被拉脱瞬间的最大力。每个品种检测5个不同的穗子，每个穗子检测约20粒种子。统计时以每穗为单位,统计平均数和方差。

(2)扫描电镜观察小枝梗表面

取样：取开花后15天的水稻小花枝，用手将种子小心地分离，保持断面完整。

固定：小枝梗在无菌水中漂洗2-3次，置于FAA溶液中固定，抽气2-3次。然后更换新鲜FAA溶液，放置4℃ 24小时以上。

脱水：扫描样品制备前经酒精梯度浓度脱水，脱水剂的乙醇浓度依次为70％-80％-90％-100％乙醇(两次)逐级脱水，样品在每级停留10分钟。

干燥：脱水完毕采用CO₂临界点干燥。

上样：粘贴样品，将双面胶黏贴在铜台上，用镊子轻夹样品侧面，保证观察面向上贴牢在胶上。

镀膜：粘贴好样品后进行真空喷金镀膜。

观察：样品制备好后，使用日本岛津JSM—6360LV型扫描电子显微镜进行观察。

(3)激光共聚焦扣描显微镜观察离层。离层徒手切片：取开花当天的水稻穗子，对枝梗和小花连接处进行纵向徒手切片。切好的样品放在0.1％的吖啶橙水溶液中染色3-4小时。样品用水封，制成临时装片。用Zeiss LSM880观察。使用488nm激发光，双滤片叠加，505-530短波滤片(代表绿光)和650nm长波滤片(代表红光)。

4、SHAT3的图位克隆

shat3突变体与野生稻W1943进行杂交，获得的F1自交一代得到F2。从群体中挑选不落粒的隐性个体用于基因的初定位以及精细定位。

高质量快速提取植物基因组DNA方法(CTAB)：取5cm长的水稻叶片放在1.5ml的EP管中，放入液氮中用筷子捣碎后，加750μ1CTAB，放65℃烘箱1h，期间震荡混匀一次。用连续加样器加500μl氯仿，震荡混匀后，12,000rpm、10min。准备96孔深孔板，加入500μl异丙醇。将离心后的上清转移到板中，注意转移上清时用移液器顺便将上清和异丙醇混匀。吸好上清的板室温静置15min，然后用平板离心机，4000rpm、30min。倒掉异丙醇，加70％乙醇，小心震荡一下，室温放置10min后，平板离心机，4000rpm、10min。倒掉70％乙醇，倒扣离心，最好不要超过500r pm。室温晾干半小时，加200-500μl TE溶液溶解。

实施例1，突变体shat3表型

取野生型和shat3突变体抽穗时期小花，将基部离层区域切片后用1％吖啶橙溶液染色的方法，在激光共聚焦显微镜下观察到shat3突变体位于小花和枝梗连接处，有一条狭窄的被染成深红色的带状结构，这就是离层组织。与对照类似，shat3突变体的离层也是完整而连续，从皮层直达维管束，并且保留薄壁细胞属性(图1，A)。其次观察了shat3突变体在种子成熟过程中落粒性的变化。在开花当天我们对野生型和shat3突变体的穗子进行标记，随后每隔2天用电子拉力计检测将种子拉下所需要的力，直至种子完全成熟。我们观察到野生型在开花后的第11天拉落种子的拉力值显著下降，到第13天时，种子自动脱落，不需要额外的人工拉力。而shat3突变体在开花后的第11天仍然保留较大的拉力值，并且直到开花后的第21天，仍然需要约0.3N的拉力才能将种子拉落(图1，B)

我们也用扫描电镜观察shat3突变体种子成熟脱落后小枝梗断裂面的光滑程度。与对照类似，shat3突变体种子成熟脱落后，其断面也是平整而光滑(图1，C)。说明shat3突变体离层细胞正常发育，但是可能是离层细胞的解离有所滞后。

实施例2，图位克隆

将不落粒突变体shat3与野生稻W1943杂交，获得F1代种子后，得到8000株F2代单株，进行SHAT3基因的初定位。我们从F2群体中挑选了10株不落粒的隐性个体进行初定位，全基因组一共使用106个标记。初定位结果显示，SHAT3基因与5号染色体上ST5-2888，ST5-3269(图2)这两个标记发生共分离，物理距离为3.81Mb。

在获得SHAT3基因初定位的信息后，我们结合高通量测序和混合群体分离分析方法(BSA,bulked segregant analysis)，从野生型和shat3突变体构建的F2群体中取50株不落粒隐性个体，单独提取DNA后等量混合，构建子代DNA池后再建库测序。测序仪用的是illumina公司的HiSeq 2500。亲本测序深度≥100×，子代混合池测序深度≥100×。拿到测序数据后进行比对分析，通过精细分析，我们发现一个编码类豆科节瘤蛋白的基因在shat3突变体中发生了一个单碱基的缺失突变。并且这个缺失发生在外显子中，导致SHAT3蛋白移码并提前终止。为了进一步确认shat3突变体中这一单碱基缺失与不落粒表型是紧密关联，我们又从野生型与shat3突变体构建的F2群体中重新取了50个不落粒的隐性突变体。对这50个个体单独提取DNA，并用一代测序的方法对每个个体的该位点进行验证，结果表明，这50个隐性个体在这个位点都发生了一个单碱基C的缺失。一代测序和二代测序结果的完全重合，再次验证了该突变位点的准确性。

实施例3，SHAT3基因序列和结构

SHAT3位于5号染色体，基因编号为LOC_Os05g39800(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)，编码一个UNCHARACTERIZED NODULIN-LIKEPROTEIN类豆科节瘤蛋白，具有跨膜结构域，预计为一个膜定位蛋白。编码区1686个碱基，两个外显子。SHAT3蛋白有561个氨基酸，预测有个跨膜结构域。突变体在第一个外显子756位缺少一个C碱基，导致移码突变蛋白编码提前终止(图3)。经分析发现野生稻W1943和栽培稻GLA4中的SHAT3的碱基序列有几个碱基的差异，但是氨基酸序列一致，可能存在保守性。

实施例4，遗传互补与互补表型

所用的野生型克隆亲本SL4是四号染色完全被野生稻替换的替换系，但是其落粒性接近于野生稻，成熟后即自然脱落。但是定位的SHAT3基因位于5号染色体，为栽培稻的基因序列。说明该基因参与了水稻种子的脱落过程，并且在野生稻和栽培稻中都存在功能。于是我们截取栽培稻GLA4的SHAT3基因上游2k到下游0.9k之间的基因组序列转化突变体shat3，结果基本互补了表型。说明我们确实克隆到了一个影响水稻种子落粒的基因。

总结，我们通过对一个具有野生型落粒性单片段替换系进行辐射诱变，找到了一个落粒性下降的突变体。经过表型观察，发现其仍有与野生稻一样发达完整的离层，但是在种子成熟后期落粒性下降，可能是离层的解离过程受到了阻碍。通过图位克隆，我们将基因定位在了5号染色体，通过高通量测序的方法最终定位到了一个类豆科节瘤蛋白(LOC_Os05g39800)，并通过基因互补验证了定位的正确性。通过对该基因后续的深入研究，可以发掘水稻离层解离启动的内在原理，并且有希望运用到水稻育种中，帮助改良一些落粒性过高但是其他品质优良的品种。

本文所涉序列

SHAT3蛋白	SEQ ID NO:1
		SHAT3编码序列	SEQ ID NO:2
ST5-2888-F	SEQ ID NO:3
		ST5-2888-R	SEQ ID NO:4
ST5-3269-F	SEQ ID NO:5
		ST5-3269-R	SEQ ID NO:6
SHAT3-1300BamH1-ProF	SEQ ID NO:7
		SHAT3-1300BamH1-geR	SEQ ID NO:8
5’UTR	SEQ ID NO:9

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 一种调控落粒性的基因及其应用

<130> 20A636

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 561

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Pro Ser Pro Ser Ser Ala His Trp Leu Ser Leu Val Gly Ser Val

1 5 10 15

Trp Leu Gln Thr Ile Asn Gly Pro Asn Ala Asp Phe Pro Val Tyr Ser

20 25 30

Ser Gln Leu Lys Glu Val Lys Gly Ile Ser Gln Val Gln Leu Asn Phe

35 40 45

Leu Ala Phe Ala Ser Asp Ala Gly Lys Leu Phe Gly Trp Phe Ala Gly

50 55 60

Val Ala Ala Leu Tyr Leu Pro Leu Trp Leu Val Ala Val Val Gly Ala

65 70 75 80

Ser Phe Gly Leu Val Gly Tyr Gly Val Gln Phe Leu Phe Leu Glu Arg

85 90 95

Pro Gly Leu Ala Tyr Trp His Leu Phe Leu Leu Thr Ser Leu Ala Gly

100 105 110

Asn Gly Ile Cys Trp Ile Asn Thr Val Cys Tyr Leu Leu Cys Ile Lys

115 120 125

Asn Phe Pro Ser Asp Ser Arg Val Ala Val Ser Leu Ala Thr Ser Tyr

130 135 140

Leu Gly Leu Ser Ala Lys Leu Tyr Thr Thr Met Ala Glu Lys Met Pro

145 150 155 160

Arg Gly Ala Thr Ala Arg Tyr Ser Lys Glu Lys Val Tyr Leu Leu Leu

165 170 175

Asn Ala Val Val Pro Met Leu Val Thr Leu Val Ala Ala Pro Ser Leu

180 185 190

Arg Val Val Glu Leu Thr Ser His Arg Arg Thr Asp Pro Ala Phe Leu

195 200 205

Ala Met Phe Ala Ile Thr Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ala Val Val Gly

210 215 220

Ser Ile Gly Ser Lys Ser Ile Gly Leu Ser Thr Ser Glu His Met Ile

225 230 235 240

Ser Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu Ile Pro Ala Ala Leu

245 250 255

Lys Val Arg Glu Ser Met Asp Lys Leu Arg Glu Ala Lys Arg Glu Asn

260 265 270

Arg Val His Asp Val Ala Ala Ala Thr Asp Val Pro Glu Thr Ala Val

275 280 285

Ser Val Leu Glu Val Ala Glu Ala Ala Glu Asn Lys Glu Glu Asp Asp

290 295 300

Ala Ala Ala Gly Glu Ser Gly Gly Gln Asp Glu Val Gly Gly Ile Arg

305 310 315 320

Leu Leu Arg Arg Leu Asp Phe Trp Leu Tyr Phe Leu Ser Tyr Met Phe

325 330 335

Ser Gly Thr Leu Gly Leu Val Phe Leu Asn Asn Leu Gly Gln Ile Ala

340 345 350

Glu Ser Arg Gly Leu Ser Asp Pro Ser Thr Leu Val Ser Leu Ser Ser

355 360 365

Ser Phe Gly Phe Phe Gly Arg Leu Leu Pro Ala Phe Leu Asp Tyr Tyr

370 375 380

Thr Ala Lys Ser Gly Tyr Ser Leu Ser Arg Thr Ala Ser Met Ala Ala

385 390 395 400

Leu Met Ala Pro Met Ala Gly Ala Phe Phe Leu Leu Leu Asp Pro Arg

405 410 415

Asp Met Phe Leu Tyr Thr Ser Thr Ala Val Val Gly Thr Cys Thr Gly

420 425 430

Ala Ile Thr Ser Val Ala Val Ser Ala Thr Gly Glu Leu Phe Gly Arg

435 440 445

Lys Asn Phe Gly Val Asn His Asn Val Leu Val Ala Asn Ile Pro Val

450 455 460

Gly Ser Leu Cys Phe Gly Tyr Leu Ala Ala Phe Leu Tyr Gln Arg Glu

465 470 475 480

Ala Arg Gly Ala Ser Arg Cys Ala Gly Ala Ala Cys Tyr Arg Gly Thr

485 490 495

Phe Leu Val Trp Gly Ala Thr Cys Ala Val Gly Thr Ala Leu Cys Thr

500 505 510

Val Leu Tyr Ala Arg Ser Arg Gly Phe Ala Gly Arg Leu Pro Pro Pro

515 520 525

Ala Arg Ser Thr Thr Met Pro Cys Ala Gly Gln Arg Pro Ala Thr Asn

530 535 540

Leu Gly Asp Asp Asn Lys Gly Pro Glu Pro Glu Val Ser Ser Thr Ala

545 550 555 560

Val

<210> 2

<211> 1685

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgccttctc cttcctcagc tcattggctg agcttggtcg gaagcgtctg gctccagacc 60

atcaacggcc cgaacgccga cttcccggtg tactcgtcgc agctcaagga ggtgaagggc 120

atctcccagg tgcagctcaa cttcctcgcc ttcgcctccg acgccgggaa gctcttcggc 180

tggttcgccg gcgtcgccgc cctgtacctg cccctgtggc tcgtcgccgt cgtcggcgcg 240

tcgttcgggc ttgtcgggta tggcgtccag ttcctcttct tggagaggcc cgggctcgcg 300

tactggcacc tgttcctgct cacctccctc gccggcaacg gcatctgctg gatcaacacg 360

gtgtgctacc tcctctgcat caagaacttc ccgtcggaca gccgcgtcgc ggtgagcctc 420

gcgacgagct acctcggcct gagcgccaag ctctacacca ccatggccga gaagatgccc 480

cggggcgcca cggcgaggta ctccaaggag aaggtgtacc tcctcctcaa tgccgtcgtg 540

ccgatgctcg tcaccctcgt ggcggcgccg tcgctccggg tggtggagct caccagccac 600

cgccggaccg acccggcgtt cctcgccatg ttcgcgatta ccctcgccac cggagcctgc 660

gccgtcgtcg gcagcatcgg ctccaagtcc atcgggctct cgaccagcga gcacatgatc 720

agcctctaca tcctgctcgc cctcccggtg ctcatcccgg cggcgctcaa ggtgcgggag 780

agcatggaca agctacggga ggcgaagcgg gagaacagag tgcacgacgt cgccgccgcc 840

accgacgtgc cggagacggc cgtgtcggtg ctcgaggtgg ccgaggcggc ggagaacaag 900

gaggaggacg acgccgccgc cggcgagagc ggcggccaag acgaggtcgg cggcatccgg 960

ctgctgcggc ggctcgactt ctggctctac ttcctgagct acatgttcag tggcacgctg 1020

gggttggtct tcctcaacaa cctggggcag atcgccgagt cccgcgggct cagcgacccg 1080

tccactctcg tctccctgtc gtcctccttc ggattcttcg gccgcctcct tcccgccttc 1140

ttggattact acaccgcaag agtggctact cgctgtcaag gacggcgtcc atggcggcgc 1200

tgatggcgcc gatggcgggg gcgttcttcc tgctgctgga cccgagggac atgttcctgt 1260

acaccagcac ggcggtggtc gggacctgca ccggcgccat cacgtcggtg gcggtgtcgg 1320

cgacggggga gctgttcggg aggaagaact tcggggtgaa ccacaacgtg ctcgtcgcca 1380

acatccccgt cggctcgctc tgcttcggct acctcgccgc gttcctctac cagcgggagg 1440

cccgcggcgc cagccgctgc gccggcgccg cctgctaccg gggcaccttc ctcgtctggg 1500

gcgccacgtg cgccgtcggg acggcgctct gcaccgtgct gtacgcgagg tcgcgcggct 1560

tcgccgggag gctaccgccg ccggcgaggt cgacgacgat gccatgcgcc ggccagcggc 1620

cagcgactaa cttaggagat gataacaagg gaccagaacc agaagtttct agtacagcag 1680

tttaa 1685

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tgggttctac ccatatccat 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ttgaggcatg agatctagaa tg 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aaatagacgg ttaaaagtgg g 21

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tacgtgacgt gtccgtgt 18

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tgtacagacg cttacctaac ccgctctg 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cctaaccatc aataagtgat ggatgtcg 28

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

aggctgtagg tagctagaga ggaaaaatcc acgctagct 39

Claims

1.物质在调控植物的落粒性和/或离层细胞解离中的用途，所述物质选自下组：SHAT3基因或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，

优选地，所述植物是禾谷类作物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，

所述SHAT3基因编码的氨基酸序列选自：

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1所示序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)的多肽序列有90％以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

和/或，

所述SHAT3基因的核酸序列选自：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(2)如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸或与其具有80％以上同源性的多核苷酸；

(3)在SEQ ID NO:2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个核苷酸的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，

所述促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子或其组合；

所述抑制剂是特异性干扰SHAT3基因转录或表达的抑制分子，优选地，所述抑制分子以SHAT3基因或其转录本作为抑制靶标，更优选地，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、dsRNA、sgRNA、抗体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述抑制剂是使SHAT3的编码序列的第756位碱基缺失的试剂。

5.一种调控植物落粒性和/或离层细胞解离的方法，所述方法包括：调节植物中SHAT3基因的表达或活性，从而调控植物落粒性和/或离层细胞解离，

优选地，所述调控植物落粒性和/或离层细胞解离的方法包括：上调植物中SHAT3基因的表达；从而促进植物落粒和/或促进离层细胞解离；更优选地，所述上调植物中SHAT3基因的表达包括：将SHAT3基因转入植物，获得转化的植物，

优选地，所述调控植物落粒性和/或离层细胞解离的方法包括：下调植物中SHAT3的表达；从而抑制植物落粒和/或延缓离层细胞解离；更优选地，所述下调植物中SHAT3基因的表达包括：将下调SHAT3基因转录、蛋白表达或蛋白活性的抑制剂转入植物中。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抑制剂是特异性干扰SHAT3基因转录或表达的抑制分子，

优选地，所述抑制分子以SHAT3基因或其转录本作为抑制靶标，

更优选地，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、dsRNA、sgRNA、抗体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。

7.一种SHAT3基因的用途，用于作为鉴定植物落粒性的分子标记。

8.一种表达SHAT3基因的表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：5’UTR区、SHAT3基因的ORF序列、和终止子。

9.一种核酸构建物，其包含权利要求7所述的表达盒或其互补序列，

优选地，所述核酸构建物是表达载体或重组载体。

10.权利要求7所述的表达盒的用途，用于调节植物的落粒性和/或离层细胞解离。