CN103290024B

CN103290024B - 一种植物种子离层区发育调控基因及其应用

Info

Publication number: CN103290024B
Application number: CN201210052938.9A
Authority: CN
Inventors: 韩斌; 周艳; 吕丹凤; 李灿阳; 罗江虹; 朱静洁; 上官颖颖
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for excellence and innovation in molecular plant science, Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2012-03-02
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2032-03-02
Also published as: CN103290024A

Abstract

本发明涉及一种植物种子离层区发育调控基因及其应用。揭示一种对于调节控制禾本科植物落粒性能有用的基因，即SHAT1基因，其可调控植物离层区细胞的发育，从而调控植物落粒性能。所述的基因可应用于植物杂交育种，获得落粒性能改变或品种改良的植物。

Description

一种植物种子离层区发育调控基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种植物种子离层区发育调控基因及其应用。

背景技术

虽然落粒性有利于野生稻的种子传播，但在栽培稻中往往带来产量减少等负面影响。人类的祖先很早就从选择落粒性降低的角度开始对水稻的驯化过程。水稻种子的脱落发生在一个被称为离层区(disarticulationzone；abscissionzone)的地方。该区域由一至两层形态较小，胞质稠密，并且呈扁平状排列的细胞组成。这些细胞在响应一些促进脱落的生物或非生物信号时表现出与周围细胞不同的生理生化反应(Hoekstra，G.J.etal.(2001).Anatomicalfeaturesatthedisarticulationzoneinfloretsoffatuoidandnonfatuoidoat(AvenasativaL.).Can.J.Bot.79：1409-1416)。通常促进脱落的信号与植物远端器官的衰老相关。但是，一系列环境因素，比如缺水，极端温度，或昆虫和病原菌的入侵等也会造成叶片，花或果实的提前脱落(Taghizadeh，M.S.etal.(2009).WaterdeficitchangestheanatomyofthefruitabscissionzoneinRaphanusraphanistrum(Brassicaceae).Aust.J.Bio.57：708-714)。不合时宜的脱落会造成许多农作物或果树的减产。因此，了解脱落过程在现代农作物中是怎样被调控的具有重要的农业意义。

在水稻中，有两个与驯化有关的落粒基因通过图位克隆得到。其中一个是SH4。SH4编码一个MYB家族转录因子，带有DNA结合结构域。栽培稻sh4的一个单氨基酸突变导致落粒性下降，但并没有导致离层区完全散失(Li，C.B.，Zhou，A.L.，andSang，T.(2006).Ricedomesticationbyreducingshattering.Science311：1936-1939)。另一个与脱落相关的基因是qSH1，编码一个BEL1类型的同源异型蛋白。qSH1是从不落粒的粳稻日本晴和落粒性较好的籼稻Kasalath的高世代回交群体克隆到。qSH1基因连同其上游约12Kb的5’UTR内的一个SNP共同决定离层区的分化(Konishi，S.etal.(2006).AnSNPcausedlossofseedshatteringduringricedomestication.Science312：1392-1396)。最近报道的一个通过栽培稻突变体克隆到的OsCPL1，该基因编码CDP磷酸化酶，被认为在水稻离层区发育过程中起着负调控的作用(Ji，Hetal.(2010).InactivationoftheCTDphosphatase-likegeneOsCPL1enhancesthedevelopmentoftheabscissionlayerandseedshatteringinrice.PlantJ.61：96-106)。除了水稻中这三个与落粒相关的基因外，小麦的Q基因也被报道影响种子的落粒性(Simons，K.J.etal.(2006).MolecularcharacterizationofthemajorwheatdomesticationgeneQ.Genetics172：547-555)。Q基因编码一个AP2的转录因子。该转录因子家族被认为参与调控植物许多发育过程。

综上，本领域有必要进一步研究调控植物中子落粒性能的基因，以应用于植物优良品种的筛选、育种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物种子离层区发育调控基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种调节禾本科植物种子落粒性的方法，所述方法包括：调节禾本科植物中SHAT1蛋白的表达。

在一个优选例中，所述的SHAT1蛋白是来源于水稻的SHAT1蛋白。

在另一优选例中，所述的SHAT1蛋白选自：

(a)SEQIDNO：2所示氨基酸序列的多肽；或

(b)将SEQIDNO：2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与SEQIDNO：2所示氨基酸序列具有70％(较佳地80％；更佳地90％；更佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上相同性，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的SHAT1蛋白的编码基因具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，或其互补序列。

在另一优选例中，所述的方法还包括：调节(包括：上调或下调)禾本科植物中SH4和/或qSH1的表达。

在另一优选例中，所述的方法是促进禾本科植物种子落粒的方法，包括：促进禾本科植物中SHAT1蛋白的表达。

在另一优选例中，所述的方法是抑制禾本科植物种子落粒的方法，包括：抑制禾本科植物中SHAT1的表达。

在另一优选例中，包括：将下调SHAT1基因转录、蛋白表达或蛋白活性的下调剂转入禾本科植物中；较佳地，所述的下调剂是特异性干扰SHAT1基因转录的干扰分子。

在另一优选例中，所述的干扰分子是以SHAT1蛋白的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物；较佳地，所述的干扰分子是以SEQIDNO：1或其转录本第1001-1325位作为沉默靶标的dsRNA或构建物。

在另一优选例中，所述的方法包括：

(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有干扰SHAT1基因转录的干扰分子；

(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使干扰SHAT1基因转录的干扰分子转入植物。

在另一优选例中，所述干扰分子含有SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的干扰分子是构建物，含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式(I)，

式(I)中，Seq_正向为SEQIDNO：1中第1001-1325位所示的多核苷酸，Seq_反向为与Seq_正向互补的多核苷酸；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反 _向不互补。

在另一优选例中，所述的禾本科植物是水稻。

在本发明的另一方面，提供一种SHAT1蛋白或其调节剂的用途，用于调节禾本科植物种子落粒性。

在一个优选例中，所述的SHAT1蛋白用于：

促进禾本科植物种子落粒；

调节禾本科植物离层区发育或分化；

保持禾本科植物离层区细胞的薄壁细胞属性；

使得禾本科植物离层区细胞间发生水解；或

调节禾本科植物小花和小枝梗连接处结构。

在另一优选例中，所述的SHAT1蛋白的调节剂是其下调剂，用于：

抑制禾本科植物种子落粒；

抑制禾本科植物离层区发育或分化；

使得禾本科植物离层区不完整或缺失；或

使得禾本科植物离层区细胞壁加厚。

在另一优选例中，所述的SHAT1蛋白的下调剂是下调SHAT1基因转录、蛋白表达或蛋白活性的物质；较佳地，所述的SHAT1蛋白的下调剂是特异性干扰SHAT1基因转录的干扰分子。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、GLA4背景四号染色体单片段替换系SL4的构建。

(A)构建SL4过程的流程图。

(B)两个亲本和SL4的照片。

图2、野生型，shat1突变体，shat2突变体和双突变体shat1shat2离层区形态鉴定和落粒性检测。

(A)套袋收获成熟的穗子。Wt的右下角为袋内自动脱落的种子。标尺＝1cm。

(B)种子在成熟过程中拉力检测。在种子发育过程中，从开花当天(0天)开始，每隔2或3天测一次。误差线以±SD表示。

(C-Z)离层区表型鉴定。从上到下的四排分别代表wt，shat1突变体，shat2突变体和shat1shat2双突变体。第一列表示一朵小花。白色方框包括离层区所在位置。标尺＝1mm。第二列是第一列白色方框位置的放大。标尺＝0.5mm。第三列是是过小花和枝梗连接处纵切的荧光照片。白色方框包括离层区所在位置。标尺＝50μm。第四列是第三列白色方框位置的放大。箭头所指在野生型中为离层区，而在shat1，shat2，shat1shat2突变体中为对应的位置。标尺＝50μm。第五列为枝梗和种子连接处断裂面扫描电镜照片。白色方框包含断裂面的中间部分以及边缘部分。标尺＝100μm。最后一列为第五列白色方框位置的放大。标尺＝50μm。

图3、野生型，shat1突变体，shat2突变体和shat1shat2突变体的表型比较。

(A)野生型。

(B-D)shat1突变体偶尔出现的畸形小花，(B)箭头表示内稃缺失，(C)箭头所指两片外稃，(D)箭头所指内稃样器官。

(E)shat2突变体。

(F-H)shat1shat2突变体。(F)箭头表示本该形成离层区的位置被畸形的弯钩状小枝梗(cr)所取代。(G)箭头所指内稃缺失。(H)箭头所指两片外稃。

(I)去除内外稃的野生型小花。

(J-K)去掉内外稃的shat1畸形小花。(J)箭头表示三片浆片，星号表示多余的心皮。(K)箭头表示7个雄蕊，红色星号表示畸形的雌蕊。

(L)去掉内外稃的shat1小花。

(M)和(N)去掉内外稃的shat1shat2畸形小花。(M)箭头表示4个雄蕊，星号表示三个雌蕊。(N)箭头表示花丝和柱头融合在一起的器官。

图中标尺＝1mm。

图4、野生型和shat1突变体穗部性状和花器官数目表型鉴定。

(A-C)野生型和shat1突变体穗部性状柱状图。粒长(A)，一级枝梗数(B)，和结实率(C)。粒长性状测量110粒种子，一级枝梗数和结实率测量12株水稻的主穗。所有的测量数据以平均数±SD表示。P值采用t-检验获得。

(D-H)野生型和shat1突变体花器官频数分布图(每个性状检测60朵小花)。

图5、GLA4离层形态鉴定。

(A)过小花和枝梗连接处纵切荧光照片。标尺＝50μm。

(B)种子与枝梗连接处的扫描电镜照片。标尺＝100μm。

图6、SHAT1和SHAT1基因的图位克隆。

(A)SHAT1的精细定位。利用310个隐形纯合个体，将SHAT1位点定位到标记A和标记B之间的一个9-kb区域，并用粉红色箭头表示。水平线下面的数字表示重组子个数。

(B)图示SHAT1基因结构。外显子和内含子分别用黄色矩形框和水平线表示。起始密码子ATG和终止密码子TAA用突出竖线表示。突变位点用竖箭头表示。红色星号表示由于1-bp的缺失导致提前终止的位置。

(C)SHAT2的精细定位。利用907个隐形纯合个体，将SHAT2位点定位到标记M627和标记M636之间的一个9kb区域，并用粉红色箭头表示。水平线下面的数字表示重组子个数。

(D)图示SHAT2基因结构。外显子和内含子分别用黄色矩形框和水平线表示。sh4-1和sh4-2突变位点分别用蓝色竖线和红色竖箭头表示。蓝色S表示sh4-1中发生单碱基替换的位置，红色短线表示sh4-1中发生单碱基插入的位置。

图7、SHAT1基因的遗传鉴定。

(A)图示SHAT1RNAi载体结构。SHAT1基因一段靠近终止密码子附近的426-bp片段被克隆到pTCK303上，用于构建SHAT1RNAi载体。LB和RB，分别指左边界和右边界；Hyg，潮霉素抗性基因；NosT，Nos终止子；ZmUbiP，玉米泛素化启动子；Gus，beta-葡萄糖苷酶报告基因。

(B)对照Kasalath和SHAT1-RNAi转基因植株中SHAT1的表达量和落粒性的对应关系。左侧：实时定量PCR检测SHAT1的相对表达量。使用的材料为开花当天的穗子。误差线为三次生物重复的SD。右侧：开花后30天当种子充分成熟时将种子从枝梗脱落所需拉力。误差线以±SD表示。

(C)Kasalath和RNAi转基因植株过离层区的纵切观察。箭头表示离层区。标尺＝50μm。

(D)图示T-DNA插入突变体，2B70080。阴影框表示编码区，黑框表示AP2结构域，白框表示5’和3’非翻译区(UTR)。三角形表示T-DNA，插入在3’UTR。引物F1和R1用于SHAT1基因的实时定量分析。F2，RB和R2用于鉴定T-DNA插入的基因型。

(E)突变体T2代苗的基因型鉴定。W，野生型亲本Huayong；M，纯合插入；H，杂合子。

(F)Huayong和2B70080突变体植株中SHAT1的表达量和落粒性的对应关系。左侧：实时定量PCR检测SHAT1的相对表达量。误差线为三次生物重复的SD。右侧：分离成熟种子的BTS值。误差线以±SD表示。

(G)Huayong和2B70080突变体过离层区的纵切观察。箭头表示离层区。标尺＝50μm。

图8、SHAT1蛋白的亚细胞定位和酵母中转录激活活性检测。

(A)SHAT1蛋白的亚细胞定位。在烟草花叶病毒35S启动子驱动下，GFP以及SHAT1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。标尺＝50μm。

(B)左侧：pGBKT7-SHAT1，pGBKT7-SHAΔC和pGBKT7-SHAT1ΔN载体质粒结构。pGBKT7空载作为负对照，融合了GAL4BD的已知水稻转录因子OsbZIP72作为正对照。相应载体的激活活性分析分别通过对比在SD/Trp-板以及含0.5mM3AT的SD/Trp-/His-/板上的生长状态来判断。GAL4BD：酵母GAL4DNA结合域；MCS：多克隆位点。

图9、定量RT-PCR和GUS报告基因检测SHAT1的时空表达模式。

(A)定量RT-PCR检测SHAT1的时空表达模式。水稻Ubiquitin基因作为内参。误差线为三次生物重复的SD。

(B-J)SHAT1启动子驱动GUS基因表达模式。(B)叶片。(C)茎。(D)节。(E)叶鞘。(F)幼穗。(G-J)不同发育时期的小花。箭头所指地方为离层区。标尺＝1mm。

图10、小花发育sp6-sp8期SHAT1的原位杂交。

(A-D)SHAT1在野生型小花中的表达。SHAT1表达从sp8e时期开始在离层处积累(C)，并到sp81期表达加强(D)。(D)图中(1)表示贯穿维管束切片；(2)表示远离维管束切片。正义探针对照见图11A。

(E-H)sh4-1突变体。SHAT1的表达在sh4-1突变体中表现出与野生型相似的模式。

(I-L)sh4-2突变体。SHAT1的表达在sh4-2突变体中完全消失。

(M-P)shat1突变体。SHAT1的表达信号在离层消失，但在花药处仍有保留。

图中四列从左至右分别表示小花发育的sp6-sp8期。箭头所指为离层所在位置。Sp8e：earlystagesp8；Sp81：latestagesp8。标尺＝100μm。

图11、小花发育sp6-sp8期SH4的原位杂交。

(A-D)SHAT1在野生型小花中的表达。SHAT1表达从sp6时期开始在离层处积累(A)，并到sp7期表达变得加强(B)。到sp8e(C)和sp81(D)期SH4的信号变得更明显。正义探针对照见图11B。

(E-H)sh4-1突变体。SH4的表达在sh4-1突变体中表现出与野生型相似的模式。

(I-L)sh4-2突变体。SHAT1的表达在sh4-2突变体中完全消失。

(M-P)shat1突变体。SH4在sp6-sp8e时在离层有表达(M-O)，而到sp81时表达消失(P)。图中四列从左至右分别表示小花发育的sp6-sp8期。箭头所指为离层所在位置。Sp8e：earlystagesp8；Sp81：latestagesp8。标尺＝100μm。

图12、SHAT1和SH4原位杂交sense探针对照。

图中为野生型小花的sp81期。Sp81：latestagesp8。

图13、Nipponbare和替换系N52的离层纵切和脱落面的扫描电镜。

(A)和(B)Nipponbare。

(C)和(D)N52。

(A)和(C)中标尺＝50μm；(B)和(D)中标尺＝100μm。

图14、SHAT1和SH4的持续集中表达对离层形成的影响。

(A-D)SHAT1在Nipponbare中的表达。SHAT1在sp8e时在离层有表达(C)而到sp81时表达消失(D)。

(E-H)SH4在Nipponbare中的表达。SH4在sp6期时开始在离层聚集(E)，在sp7(F)和sp8e(G)时期仍然停留在离层，而到sp81时表达消失(H)。

(I-L)SHAT1在N52中的表达。SHAT1的表达在sp8e-sp81期持续在离层表达。

(M-P)SH4在N52中的表达。SH4的表达在sp6-sp81期持续在离层表达。

图15、染色体单片段替换系N52的基因型。红色，表示籼稻93-11的基因型；蓝色，表示粳稻日本晴的基因型；黄色：杂合型。

图16、qSH1的原位杂交。箭头所指为离层区，标尺＝100μm。

(A-D)qSH1在不同发育时期野生型小花中的表达。(A)小花发育的sp8早期。qSH1开始在离层区出现信号。(B)sp8晚期。(C)sp8晚期离层区纵切的放大。(1)过维管束。(2)不过维管束。(D)正义探针作为对照。

(E-F)N52中的表达。

(E)sp8晚期。

(F)sp8晚期过离层区的放大。

(G)shat1突变体的sp8晚期。

(H)shat2突变体的sp8晚期。

图17、包含miR172作用位点的AP2亚家族进化树分析。

水稻基因名称根据TIGR网站水稻注释第7版本命名(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice)。进化分析使用ClustalW和PAUP4.0B10。分析使用全长氨基酸序列。进化树采用NJ法构建，并使用branch-and-branchsearch。分支线上或线下的数值表示bootstap的概率。

图18、野生型和shat1突变体在小花发育早期的离层区解剖学结构比较。

(A)和(B)，过幼嫩小花的花与枝梗连接处纵切片。野生型(A)，shat1突变体(B)。白色矩形框指将来离层区形成的位置，此时在野生型中呈现出一条较暗的带。标尺＝100μm

(C)和(D)，分别代表(B)和(A)中白色矩形框位置的放大。箭头表示靠近维管束但不呈扁平状的离层区细胞。标尺＝50μm。

图19、sh4-1突变体，sh4-2突变体以及sh4-1/sh4-2F1落粒性比较。

图中所示为套袋的成熟种子。sh4-1和F1右下角的种子表示袋子中自动脱落的种子。标尺＝1cm。

图20、SH4和SHAT1基因在野生型和突变体中的定量RT-PCR结果。

(A)SH4。

(B)SHAT1。RNA从1-cm长幼穗中提取。误差线为三次生物重复的SD。

图21、水稻离层发育调控的遗传模型。

长的水平箭头表示时间进程。Sp8e：earlystagesp8；Sp81：latestagesp8。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，揭示一种对于调节禾本科植物落粒性能有用的基因，即SHAT1基因，其可调控植物离层区细胞的发育，从而调控植物落粒性能。所述的基因可应用于植物杂交育种，获得落粒性能改变或品种改良的植物。

本发明中，对于适用于本发明的植物(或作物)没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于本科植物。比如，禾本科的水稻，小麦，大麦，黑麦，高粱，玉米。较佳地，所述的“植物”是水稻。

本发明的SHAT1蛋白(多肽)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括SHAT1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的SHAT1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“SHAT1蛋白”指具有调节禾本科植物落粒性能的功能的SEQIDNO：2序列的多肽。该术语还包括具有调节禾本科植物落粒性能功能的、SEQIDNO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SHAT1蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与SHAT1蛋白的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗SHAT1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含SHAT1蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了SHAT1蛋白的可溶性片段。

本发明还提供SHAT1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然SHAT1蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的SHAT1蛋白并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“SHAT1蛋白保守性变异多肽”指与SEQIDNO：2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lvs
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg

Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明SHAT1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO：2的蛋白质或其衍生蛋白，但与SEQIDNO：1任一所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQIDNO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在80％以上，较好至少90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或SHAT1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

本发明提供了所述的SHAT1蛋白或其编码基因的用途，用于调节禾本科植物种子的落粒性能。在一种方式下，下调SHAT1蛋白的表达或活性可用于抑制禾本科植物种子落粒。

因此，可基于SHAT1蛋白对于植物的上述影响作用来改变植物，从而达到根据实际生产需要改良植物品质的目的。较佳地，所述的植物是禾本科植物；最佳地，所述的植物是水稻。

本发明还涉及SHAT1蛋白或其编码基因的上调剂或下调剂(如反义的SHAT1基因，或siRNA，miRNA，shRNA，反义核苷酸)及其用途。由于SHAT1的上调剂(也称为促进剂或激动剂)或下调剂(也成为抑制剂或拈抗剂)可调节SHAT1的表达和/或调节SHAT1的活性等，因此，所述的SHAT1的上调剂或下调剂可通过对SHAT1的影响来调节植物的性状，从而达到改良植物的目的。

任何可调节SHAT1蛋白的活性、调节SHAT1蛋白的稳定性、促进或抑制SHAT1基因的表达、延长或减少SHAT1蛋白有效作用时间、或促进或降低SHAT1基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调节植物的表型、特别是调节植物种子落粒的有效物质。

一方面，本发明提供了一种抑制禾本科植物种子落粒的方法，所述的方法包括：下调植物中SHAT1蛋白或其编码基因的表达。

在得知了所述的SHAT1蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的SHAT1蛋白的表达。比如可通过一定的途径将携带SHAT1编码基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的SHAT1蛋白。此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低SHAT1蛋白的表达或使之缺失表达，比如将携带反义SHAT1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达SHAT1蛋白。或将下调SHAT1基因转录、蛋白表达或蛋白活性的下调剂转入植物中；例如，所述的下调剂是特异性干扰SHAT1基因转录的干扰分子。

作为本发明的一种实施方式，将SHAT1蛋白的编码基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述SHAT1蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达SHAT1蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达SHAT1蛋白的植物。

优选的，一种抑制禾本科植物种子落粒的方法包括：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有SHAT1基因的干扰分子(包括但不限于dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物)；

(s2)将植物细胞、组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使所述SHAT1基因的干扰分子转入植物细胞；

(s3)选择出转入了SHAT1基因的干扰分子的植物细胞、组织、器官；和

(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物，即为所需的转基因植物。

如本文所用，所述的正向连接是指：SHAT1的编码基因与表达载体的连接是正义的连接，即编码基因按照5’→3’的方向连接于载体上；反向连接则相反。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。其它增加SHAT1表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强SHAT1的表达。或者通过增强子来增强该SHAT1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。

SHAT1蛋白的编码基因的另一个应用作为鉴定禾本科植物落粒性能的分子标记。可通过分析待测植物(如植物的种子或幼苗)中SHAT1蛋白的表达情况，来判断其落粒性能。例如，鉴定到植物中SHAT1蛋白的表达低或无，则该植株可呈现不落粒或较少落粒的表型；而若鉴定到SHAT1蛋白的较高表达(过量表达)，则该植株可呈现落粒的表型。

遗传分析表明，SH4在离层分化过程中起着早期的作用，SHAT1在离层区的表达受SH4正调控。本发明人还发现qSH1作用于SHAT1和SH4的下游，维持二者在离层持续表达，从而推进离层分化。从这些结果本发明人得出了一个水稻离层发育调控的遗传模型：即有功能的SHAT1和SH4在离层的持续稳定表达对于离层的正确分化是必需的。因此，本发明的方法还包括：调节(包括：上调或下调)禾本科植物中SH4和/或qSH1蛋白的表达。维持禾本科植物中SHAT1、SH4和qSH1蛋白的稳定表达，可使得有功能的离层区形成。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料和方法

1、替换系SL4的构建

辐射诱变水稻材料为以常规籼稻品种广陆矮4号(G4)为背景，第4染色体被普野品种(Oryza.rufipogon)W1943替换的替换系，本发明人将其命名为SL4(substitutionline4)，由日本植物基因组中心(PlantGenomeCenter)提供。该材料通过W1943与G4杂交，然后以G4作为轮回亲本进行回交4代，然后自交1代后得到。

2、γ-ray突变体库的构建

(1)取1kg当年收获的SL4种子，先在自来水中稍微清洗，去掉浮粒，然后在纯净水水中浸泡两天，期间更换一次水。

(2)浸好的种子在37℃培养箱催芽11.5小时，至种子刚露白。

(3)露白的种子进行Co⁶⁰辐射诱变。辐射时种子所处位置的辐射强度为2.3Gy/min，辐射总剂量为60Gy。

(4)诱变T1代种子种在上海闵行郊区大田，网袋套袋收获5000株单株。

(5)T2代种植取4800个T1代单株种子，全部混合，种在海南陵水大田。

(6)从T2代中筛选不落粒的突变体保留。

3、不落粒突变体表型鉴定

(1)拉力计检测种子落粒性

充分成熟的水稻穗子平放在桌上，用夹子夹住稻粒稃尖端，采用依思达推拉力计(DS2-20N)记录稻粒被拉脱瞬间的最大力。每个品种检测5个不同的穗子，每个穗子检测约20粒种子。统计时以每穗为单位，统计平均数和方差。

(2)扫描电镜观察小枝梗表面

取样：取开花后15天的水稻小花枝，用手将种子小心地分离。在保留枝梗断裂面完整的情况下，将多余小枝梗剪去。

固定：小枝梗在无菌水中漂洗2-3次，置于FAA溶液中固定，抽气2-3次。然后更换新鲜FAA溶液，放置4℃24小时以上。

脱水：扫描样品制备前经酒精梯度浓度脱水，脱水剂的乙醇浓度依次为70％-80％-90％-100％乙醇(两次)逐级脱水；样品在每级停留15-30分钟。

干燥：脱水完毕采用常规CO₂临界点干燥，大约需要24小时。

上样：粘贴样品。将双面胶黏贴在铜台上，用镊子轻夹样品侧面，保证观察面向上贴牢在胶上。

镀膜：粘贴好样品后进行真空喷金镀膜。

观察：样品制备好后，使用日本岛津JSM-6360LV型扫描电子显微镜进行观察。

(3)激光共聚焦扫描显微镜观察离层

离层徒手切片：取开花当天的水稻穗子，对枝梗和小花连接处进行纵向徒手切片。

切好的样品放在0.1％的吖啶橙水溶液中染色3-4小时。

样品用水封，制成临时装片。用ZeissLSM510观察。使用488nm激发光，双滤片叠加，505-530短波滤片(代表绿光)和650nm长波滤片(代表红光)。

(4)半薄切片观察离层结构

取样：取开花前5天左右的水稻穗子顶部小花，用剪刀将靠近稃尖段的内外稃减掉。在保留花药完整的情况下，尽量剪得多些，以便固定液渗透。

固定：小花置于FAA溶液中固定，抽气2-3次。然后更换新鲜FAA溶液，放置4℃24小时以上。

材料软化：由于水稻颖壳含有的硅质较多，为了防止材料在切片中碎裂，因此需要软化处理。用50％的HF水溶液浸泡颖壳约两周左右，直至颖壳变软。

脱水：样品经酒精梯度浓度脱水，脱水剂的乙醇浓度依次为70％-80％-90％-100％乙醇(两次)逐级脱水；样品在每级停留15-30分钟。

树脂包埋：将样品小心地放入环氧树脂中，注意样品和切片的方向垂直。

4、SHAT1的图位克隆

shat1突变体与粳稻Nipponbare进行杂交，获得的F₁自交一代得到F₂。从F₂群体中挑选种子与小枝梗处有歪脖子表型的隐性个体用于基因的初定位以及精细定位。定位所用到多态标记序列详情见表1。

高质量快速提取植物基因组DNA方法(CTAB)：取5cm长的水稻叶片放在1.5ml的EP管中，放入液氮中用筷子捣碎后，加750μlCTAB，放65℃烘箱1h，期间震荡混匀一次。用连续加样器加500μl氯仿，震荡混匀后，12,000rpm，10min。准备96孔深孔板，加入500μl异丙醇。将离心后的上清转移到板中，注意转移上清时用移液器顺便将上清和异丙醇混匀。吸好上清的板室温静置15min，然后用平板离心机，4000rpm，30min倒掉异丙醇，加70％乙醇，小心震荡一下，室温放置10min后，平板离心机，4000rpm，10min。倒掉70％乙醇，倒扣离心，最好不要超过500rpm。室温晾干半小时，加200-500μlTE溶液溶解。弃上清，将沉淀干燥，加入30μl1/10TE溶解。PCR反应时取1μl。

5、SHAT1同源蛋白的聚类分析

首先利用SHAT1蛋白序列在NCBI上进行BLASTP，分别挑选拟南芥(Arabidopsis)，金鱼草(Snapdragons)，大麦(Barly)，小麦(Wheat)，玉米(Maize)和水稻(Rice)中最同源的蛋白质序列。然后用ClustalX1.81进行多序列比对，采用缺省参数进行。ClustalX生成的多重比对结果文件*.aln用Genedoc进行排列分析。

6、SHAT1的RNA干扰试验

本实验所使用的RNA干扰载体pTCK303(Wang，M.，Chen，C.，Xu，Y.Y.，Jiang，R.X.，Han，Y.，Xu，Z.H.，andChong，K.(2004).Apracticalvectorforefficientknockdownofgeneexpressioninrice(OryzasativaL.).PlantMol.Biol.Rep.22：409-417)获自北京植物所。

(1)干扰片段的PCR扩增

干扰片段采用SHAT1cDNA序列的第1001-1325位。

用Takara公司的高保真酶KOD扩增SHAT1基因的3’UTR序列，使用接头引物SHAT1-RNAi-F(5’-cggggtaccactagtGGAGCACCAAAGCTAAGTTC-3’(SEQIDNO：3)，KpnI，SpeI)和SHAT1-RNAi-R(5’-cgcggatccgagctcTGAGGCTTGCGTCGCAATGT-3’(SEQIDNO：4)，BamHI，SacI)。目标片段长度为426-bp。

正向连接入pTCK303：PCR产物纯化采用QIAGEN的PCR产物纯化试剂盒，操作步骤如下：加入PCR产物5倍体积的溶液PBI，混匀后过柱，13000rpm，1min；柱子用750μlPE溶液洗一次，13000rpm，1min；柱子空甩2min，再放入新的Eppondorf管中，加入50抽提缓冲液洗脱。

反向连接入pTCK303：PCR产物和前述以正向连接入基因片段的阳性质粒，再使用Kpn1和BamH1进行酶切克隆，得到反向插入PCR片段的重组质粒。

上述获得的RNA干扰载体，最终用于水稻转化。

7、半定量和实时定量PCR

(1)植物组织总RNA的提取、逆转录

将Trizol加到Rnase-free的1ml离心管中(一般每0.2克组织加1mlTrizol，如果组织少则适量少加。新鲜植物组织或者-80℃冷冻的组织在液氮中快速研磨，用药匙将研碎的组织转移到事先加过Trizol的离心管中，立即振荡混匀。此步操作尽可能快速混匀，并且戴好口罩，不能说话，以免带来RNA酶污染。静置10min后，加入0.2倍体积的氯仿，将离心管盖紧，倒转几次混合均匀，室温10min，离心机15℃预冷。15℃条件下13000。离心10分钟将上层水相移至另一Rnase-free的离心管中，向管中加入等体积的异丙醇，混匀，置4℃条件下10分钟。4℃条件下13000g离心10分钟，倒掉上清液。沉淀用70％乙醇洗一遍，4℃条件下13000g离心5分钟稍微晾干后，溶于适量体积(一般0.2克材料200μlDEPC水)DEPC处理的水中。电泳检测后分装(28s∶18s＝2.7∶1)，-70℃低温保存。

取20ug总RNA用DNA酶消化。一般2unitsDNaseI能够消化10μg总RNA中所含的DNA。

之后进行逆转录，所使用的逆转录酶为Invitrogen的SuperScript^TMIIReverseTranscriptase。将逆转录所得cDNA20μl立即稀释至100μl，如果暂时不用就20μl每管分装，冻于-80度保存。

(2)半定量PCR

半定量PCR采用Takara公司的r-Taq聚合酶进行反应，反应配制如下：

一般情况下目的基因扩增30个循环，内参基因Actin25个扩增循环。

对于SH4基因的扩增，需要用到Takara公司的La-Taq聚合酶，反应如下：

PCR反应条件为：

(3)实时定量PCR

实时定量PCR采用Takara公司的PremixExTaqTM试剂盒，在AppliedBiosystems7500realtimePCR仪上进行。反应体系按照说明书配制。

PCR扩增程序为两步法：

本发明人选择UBQ5(GenBankaccessionno.AK061988)和eEF-1α(GenBankaccessionno.AK061464)这两个水稻基因作为内参。用于计算相对表达量时，引物效率设定为2。

8、SHAT1启动子驱动GUS表达

(1)SHAT1::GUS载体构建

应用载体1300GN(获自中科院植物生理生态研究所林鸿宣实验室；Ren.etal.(2005).Aricequantitativetraitlocusforsalttoleranceencodesasodiumtransporter.Nat.Genet.37：1141-1146)来插入SHAT1启动子。日本晴SHAT1基因ATG上游2.3kb的区域(-2393至-66)PCR扩增后(引物序列请见表1中SHAT1prot-F、SHAT1prot-R)，通过SalI和BamHI定向克隆到GUS基因前面。

表1

(2)GUS显色反应

取新鲜的材料放入GUS染液中，抽真空5min左右，使材料下沉，然后置于37℃培养箱12小时后观察GUS显色结果。

9、SHAT1的亚细胞定位

(1)SHAT1-GFP融合蛋白构建

为了观察SHAT1的细胞亚定位，本发明人构建了SHAT1-GFP融合蛋白。首先采用KOD高保真酶扩增了SHAT1的全长cDNA，PCR正反向引物在5’端分别加了XhoI和SpeI接头，序列请见表1(upGFP-SHAT1-F、upGFP-SHAT1-R)。PCR产物经XhoI和SpeI双酶切纯化后，在保证不移码的情况下连接到PA7载体(Peng.etal.(2008).OverexpressionoftranscriptionfactorOsLFL1delaysfloweringtimeinOryzasativa.J.Plant.Physiol.165：876-885)的GFP蛋白编码基因的前面，构建SHAT1-GFP融合蛋白。经测序验证正确后，基因枪电击转化洋葱表皮细胞。

(2)基因枪电击转化洋葱表皮细胞

洋葱表皮的准备：取新鲜有活力的洋葱，剥除最外面一层，取里面的一层；

在50μl无水乙醇中加入3mg金粉，震荡1分钟，10000rpm离心10min，弃上清；

加入50μl无菌水，震荡1min，10000rpm离心10s，弃上清；

重复步骤2一次；

依次加入5μl空载PA7质粒或者构建好的质粒(1μg/μl)，50μl的2.5MCaCl2，20μl的0.1M亚精胺，每加完一种试剂，震荡2-3s；

震荡5-10min，冰上静置10min，10000rpm离心10-20s，弃上清；

加入250μl无水乙醇，震荡重悬，10000rpm离心10-20s，弃上清；

重悬沉淀于60μl无水乙醇中；

粒子轰击：把洋葱切成2cm左右的小片，取一片平铺于湿润的MS培养基上；每次取10μl包被质粒的金粉重悬液，点于微粒载膜中央，晾干后，使用BiolisticPDS-1000/He基因枪进行粒子轰击；

定位观察：轰击后的洋葱放在25℃黑暗的环境下培养24小时后，撕下内表皮，使用共聚焦显微镜(Zeiss，LSM510Meta，Germany)观察GFP荧光信号的位置。

10、酵母单杂交验证转录激活活性

本发明人使用Clonetech公司的酵母单杂交系统验证SHAT1的转录激活活性。首先，采用KOD高保真酶扩增了pGBKT7-SHAT1，pGBKT7-SHAT1ΔC(1-326)和pGBKT7-SHAT1ΔN(112-459)，分别代表SHAT1的全长，N-端和C-端蛋白。PCR正反向引物在5’端分别加了EcoRI和BamHI接头，序列请见表1(PGBKT7-SHAT1-F、PGBKT7-SHAT1-R、PGBKT7-SHAT1ΔN-F、PGBKT7-SHAT1ΔN-R、PGBD-SHAT1ΔC-F、PGBD-SHAT1ΔC-R)。PCR产物经EcoRI和BamHI双酶切纯化后，在保证不移码的情况下连接到载体pGBKT7(购自Clonetech公司)上，接到GAL4连接结构域后面，构建成融合蛋白。经测序验证正确的克隆，电击转化酵母菌株感受态AH109，然后涂布色氨酸缺陷型SD平板。平板在30℃放置2天后，挑选长得较大的克隆用蒸馏水稀释至OD₆₀₀约0.5，用移液器分别滴一滴至色氨酸缺陷型SD平板和含0.5Mm的3-AT色氨酸/组氨酸缺陷型SD平板。然后放置28℃，3-4天后观察各平板酵母生长状况。

11、原位杂交

常规方法进行植物材料的固定、包埋和制片。并且，利用地高辛标记RNA探针。之后，进行原位杂交，步骤如下：

每24张片子准备4-5升无菌水，盖玻片(24-30片/24片载玻片)，100mL、500mL量筒各1个，1000mL烧杯1个，铁药勺1把，切片篮2个。以上均需180℃烘5小时。

杂交前切片组织预处理，采用常规方法。之后，探针与样品组织mRNA杂交。杂交完毕冲洗、抗地高辛抗体染色。

II.实施例

实施例1、shat1和shat2突变体的分离和表型鉴定

为了研究落粒途径，本发明人把替换系SL4作为起始材料，它的第四号染色被野生稻W1943替换，其余遗传背景为籼稻广陆矮4(GLA4)(图1A-B)。

SL4表现出极强的落粒性，这是由于一方面获得了来自野生稻的SH4基因，另一方面其自身带有籼稻的落粒性基因qSH1(图2A，WT)。本发明人对SL4进行钴60放射性诱变，从T₁代中筛选不落粒的植株。本发明人分离到了两个极端不落粒的突变体，分别命名为shatteringabortion1(shat1)(图2A，左二)和shatteringabortion2(shat2)(图2A，左三)。

除了不落粒外，shat1还表现出一系列花器官异常表型，其中包括(1)内稃退化或小花有多重外稃和内稃样的结构(图3B-D；图4H)；(2)内部花器官，特别是心皮和雄蕊的数目，大小，形状以及属性发生改变(图3J，3K；图4D-4G)；(3)粒型变长(图4A)；(4)以及分支数目减少(图4B)；以及(5)结实率降低(图4C)。值得注意的是，shat1突变体在护颖和副护颖之间出现了一个伸长的歪脖子结构，该区域原本为离层区所在位置(图2J)。相比之下，除了落粒性丢失，shat2没有表现出其他花器官形态改变(图3E，L)。在本发明中，本发明人重点关注这两个突变体落粒性丢失这一性状。

实施例2、离层的消失是导致shat1和shat2突变体不落粒的原因

shat1和shat2突变体不落粒性状通过种子不同发育阶段的BreakingTensileStrength(BTS)拉力值进行进一步检测。BTS拉力值与种子的落粒性呈负相关，即拉力值越大，种子越难落粒。在开花的前6天中，不同水稻品种的BTS值都无显著变化。在野生型SL4中，在开花后第11天，拉力值迅速降低。在开花后第13天，由于种子和小枝梗的连接已经非常脆弱，BTS值很难被检测。而到开花后第15天，绝大多数野生型的种子都已经自动脱落(图2B)。这些变化主要是离层区细胞的中胶层逐渐水解所导致。随着种子的发育成熟，拉力值也逐渐降低。在GLA4中，BTS值从第9天开始出现下降。GLA4出现BTS下降的时间要早于野生型，这可能是由于GLA种子成熟得更快一些。但是，随后BTS值的下降速率在GLA4中并无显著变化，BTS值始终维持在起始值的三分之一左右，达不到让种子自动脱落的程度(图2B)。相比之下，shat1和shat2突变体的拉力值都没有表现出随着种子发育进行而降低的趋势(图2B)，说明这两个突变体种子与小枝梗间连接处的细胞间从未发生水解。双突变shat1shat2表现出于shat1突变体相似的BTS值变化(图2B)。

为了细致地比较shat1，shat2与野生型离层区细胞解剖结构的差异，本发明人利用激光共聚焦显微镜观察了三者跨小花和枝梗连接处的纵切片。在野生型中，本发明人观察到在护颖下方有一条明显区别于周围细胞的由一直两层小的等径扁平细胞所组成的离层区细胞带(图2E，F)。在GLA4中，离层带并不完整——靠近维管束部分的离层消失，取而代之的是类似于枝梗细胞的厚壁细胞(图5A)。在shat1突变体(图2K，L)和shat1shat2双突变体(图2W，X)中，这样一条离层区细胞带不存在，取而代之的是类似于皮层细胞的花生状长条细胞。而在shat2突变体中，虽然这样一层小而扁平的细胞带仍然存在，但是它们已经不再保持离层区细胞的薄壁细胞属性，出现了木质素加厚(图2H，I)。这从他们的细胞壁被吖啶橙染成了绿色就可以看出。吖啶橙在488-nm的激发光下，可以将有木质素加厚的细胞壁染成绿色。这些结果说明，shat1和shat2突变体都无法形成有正确功能的离层区细胞。

本发明人然后利用扫描电镜观察了成熟种子自然脱落或被人工拉落后，种子与小枝梗的断裂面情况。与拉力测试一致，野生型由于离层区细胞间发生了水解，种子自然脱落后本发明人观察到了光滑的小枝梗断面(图2G，H)。并且，断面上填满了胼胝质，这可以充当抵挡病原菌入侵的屏障(图2H)。在GLA4中，断裂面的中间区域粗糙而周围区域光滑，这与GLA4的离层不连续，在靠近维管束部分离层消失的结果相一致(图5B)。与之对比的是，shat1突变体(图2M，N)，shat2突变体(图2S，T)和shat1shat2双突变体(图2Y，Z)的成熟种子在被人为拉落后，其小枝梗断面非常粗糙，而且十分不规则。断面也无胼胝质填充。以上两项测试都说明水解过程在shat1和shat2突变体中都没有发生。

实施例3、SHAT1和SHAT2基因的图位克隆

本发明人采用图位克隆的方法分离SHAT1和SHAT2基因。经过遗传杂交发现，shat1和shat2为非等位突变体。由于小花和小枝梗连接处的弯脖子结构易于观察和鉴定，因此本发明人把这个性状作为shat1突变体的典型表型。shat1突变体和wt杂交所得的F₁都表现出与野生型一样正常的表型，即非常容易落粒并且没有弯脖子结构。在F₂群体中，落粒与不落粒植株按3∶1比例分离(314∶104，χ²＝0.006，P＝0.936)，并且不落粒性状总是与弯脖子性状连锁，这说明一个单一隐性位点是造成shat1突变体弯脖子与不落粒这两个突变性状的原因。为了构建作图群体，shat1突变体与粳稻Nipponbare做了杂交。从F₂群体中本发明人选了300株有弯脖子表型的隐性个体用于图位克隆分析。SHAT1位点被初定位在四号染色体的长臂末端，限定在两个插入缺失多态标记M1056和M6026之间。接下来的精细定位将SHAT1锁定在两个物理距离为9kb的单核苷酸多态标记A和B之间(图6A)。在这个候选区段里，根据TIGR的基因注释(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，只有一个编码APETALA2(AP2)类转录因子的基因(图6B)，全长459个氨基酸。比对shat1突变体和野生型该基因核苷酸序列发现，在shat1突变体中，该基因第一外显子在+41和+42之间发生了一处单碱基缺失，从而造成移码突变。

利用与日本晴构建的F₂群体，SHAT2被初定位在四号染色体长臂末端，范围为1000kb。然后本发明人利用另一套与GLA4构建的F₂群体，将SHAT2定位到9.7kb的范围内，包含两个预测基因(图6C)。通过比较shat2突变体与野生型这9.7kb的序列发现，在第一个基因的第二个外显子处发生了一处单碱基插入，导致该基因读码框改变。令人吃惊的是，该基因就是已知的落粒基因SH4(图6D)。与之前报道的栽培稻中sh4基因突变类型不同，shat2突变造成更严重的离层区缺陷表型。为了区分SH4不同的等位突变，本发明人将栽培稻的sh4等位命名为sh4-1，shat2等位命名为sh4-2。

实施例4、SHAT1的RNAi植株落粒性显著下降

由于shat1突变体在组培中不能分化出幼苗，因此本发明人无法对shat1突变体直接进行互补转化。为了从遗传上验证SHAT1与离层区的分化有关，本发明人构建了SHAT1RNA干扰载体(图7A)，并转化入有离层区的籼稻品种Kasalath。8个独立的SHAT1-RNAiTO代转基因植株与Kasalath野生型对比，表现出不同程度的落粒性下降。通过BTS检测，落粒性下降的程度与SHAT1mRNA被下调表达的程度极其相关(图7B)。本发明人对其中两个干扰程度不同的株系进行离层区切片观察。结果发现8号株系比2号株系表现出更严重的离层区缺失表型(图7C)。这与SHAT1在8号株系中仅保留野生型17％的表达量而2号株系保留51％的表达量的检测结果是一致的(图7B)。

此外，通过搜索韩国突变体库(Jeon，J.Setal.(2000).T-DNAinsertionalmutagenesisforfunctionalgenomicsinrice.PlantJ.22：561-570)，本发明人找到了SHAT1的一个T-DNA插入突变体，2B70080。PCR鉴定表明，该突变体在SHAT1基因靠近终止密码子TAA的3’UTR区域发生T-DNA插入(图7D，E)。与野生型华永(Huayong)相比，SHAT1基因的表达量在2B70080突变体中被极大地下调，并且与2B70080的BTS值增加非常相关(图7F)。进一步的离层区切片研究表明，2B70080突变体的离层区细胞虽然小而扁平的形态还存在，但已经出现了细胞壁加厚，与野生型离层区细胞的薄壁属性形成鲜明对比(图7G)。

综上，这些结果验证了shat1突变体落粒性丧失与SHAT1基因功能丢失相关。

实施例5、SHAT1的亚细胞定位和转录激活活性鉴定

通过PSORT网站对SHAT1蛋白的亚定位预测发现(http://psort.hgc.jp/)，SHAT1有明显的核定位信号。为了验证这一预测结果，本发明人将SHAT1的全长cDNA接在GFP基因的起始密码子上游，构建了SHAT1:GFP融合蛋白。将该融合蛋白在洋葱表皮细胞中短暂表达，发现GFP信号只集中在细胞核表达，说明SHAT1蛋白确实为核定位(图8A)。

尽管SHAT1被预测为转录因子并且具有核定位信号，但其是否具有转录激活活性尚未得知。本发明人利用酵母单杂交系统来验证SHAT1的转录激活活性。SHAT1蛋白的不同区段与酵母GAL4的DNA结合结构域进行融合(图8B)。水稻全长bZip72作为阳性对照(Lu，G.etal.(2009).IdentificationofOsbZIP72asapositiveregulatorofABAresponseanddroughttoleranceinrice.Planta229：605-615)。所有的转化子在SD/Trp-培养基上长势良好(图8B)。然后每个转化挑选一些克隆同时分别转移到SD/Trp-/Ade-双缺培养板和包含0.5mM3AT的SD/Trp-/His-双缺培养板上。在Trp-/Ade-双缺培养板上，除了正对照，其他所有克隆都没长。而在0.5mM3AT的TRP-/His-双缺培养板上，正对照，pGBKT7-SHAT1和pGBKT7-SHAT1ΔC长势良好，而pGBKT7-SHAT1ΔN和负对照基本不长(图8B)。

结果表明，包含AP2结构域的SHAT1蛋白的N端具有较弱的转录激活活性。

实施例6、SHAT1的表达分析

本发明人首先利用定量RT-PCR和启动子驱动GUS报告基因表达的方式来检测SHAT1基因的时空表达模式。定量RT-PCR结果显示，SHAT1的转录本在所有被检测的营养器官和繁殖器官中都有表达，从苗期开始直至孕穗期(图9A)。GUS染色结果与半定量表达分析结果一致。GUS信号不仅出现在叶片，茎，节和叶鞘中(图9B-E)，也出现在幼穗中(图9F)。此外，在2mm长的小花中，GUS在离层区和内轮花器官中有强烈的表达信号(图9G)。当小花到5mm长时，在稃尖以及内外稃出现较弱的GUS信号(图9H)。随着小花发育的进行，GUS信号逐渐减弱(图9I，J)并最终消失。

实施例7、SHAT1在离层发育过程中受SH4正调控

为了进一步研究SHAT1在调控离层发育中的作用，本发明人利用原位杂交技术检测了SHAT1在小花发育早期的表达模式。在本研究中，水稻花序和小花发育各时期的分类标准参考现有技术(Itoh，J.etal.(2005).Riceplantdevelopment：fromzygotetospikelet.PlantCellPhysiol.46：23-47)。在野生型中，SHAT1转录本早期广泛分布于整个花分生组织中，并且逐渐集中在花器官原基上。当达到内外稃原基首次出现的sp6期时，SHAT1的mRNA在内外稃原基上有较高表达(图10A)。接着，当到达心皮原基开始分化的sp7期时，SHAT1的信号在内外稃上逐渐减弱，并且开始转移到内轮花器官上，如雄蕊和心皮(图10B)。当到达胚珠出现的sp8早期时，SHAT1的转录本则集中在离层区和花药中表达(图10C)。接下来在sp8晚期时，SHAT1的表达在离层区逐渐加强，超过sp8早期的表达(图10D)。本发明人也检测了SHAT1在GLA4中的表达模式。GLA4的遗传背景与野生型非常接近，但它的sh4-1基因为栽培稻类型。SHAT1在GLA4中的表达模式与在野生型中非常一致，都从sp8早期开始在离层区和雄蕊处集中表达(图10E-H)。相比之下，sh4-2突变彻底破坏了SHAT1在离层的表达(图10I-L)，从sp6-sp8晚期都检测不到信号，与shat1突变体中SHAT1的表达相似(图10M-P)。

SHAT1在sh4-2突变体的离层表达消失提示SHAT1可能作用于SH4的下游，或者说受到SH4正调控。为了验证猜想，本发明人比较了SH4在野生型和shat1突变体中的表达。在野生型中，从sp6早期开始，在护颖和副护颖的中间地带就有微弱的SH4集中表达，而此处也是将来要形成离层区的地方(图11A)。值得注意的是，SH4在离层区的表达要早于SHAT1。到sp7期时，SH4的表达逐渐在离层区和花药处积累(图11B)，并且到sp8期时变得越来越明显(图11C，D)。sh4-1突变并没有改变SH4的表达模式——SH4在sh4-1突变体中表现出与在野生型中相似的表达模式(图11E-H)。相比之下，sh4-2彻底破坏了SH4在离层的表达(图11I-L)。这个结果也进一步证明了sh4-1和sh4-2这两个等位突变是不同的。sh4-1仍然保留SH4部分的正常功能，而sh4-2是一个功能完全缺失的突变。本发明人然后检测了SH4在shat1中的表达。SH4在shat1突变体中的表达在sp7期以前并未与野生型有太大差别(图11M-O)。但是，到sp8后期，SH4在shat1的离层区表达消失(图11P)。SH4在shat1突变体中sp8后期表达消失说明SHAT1有维持SH4在sp8晚期稳定表达的作用。

实施例8、SHAT1和SH4在离层的持续稳定表达对于离层的正确分化是必需的

为了进一步揭示SHAT1和SH4对于离层分化所起作用，本发明人检测了一系列栽培的SHAT1和SH4基因型以及它们的离层结构。SH4在栽培稻中极为保守，绝大多数栽培稻都拥有sh4-1基因型(Zhang，L.B.etal.(2009).Selectionongrainshatteringgenesandratesofricedomestication.NewPhytol.184：708-720)。类似地，SHAT1在栽培稻中也非常保守。根据本发明人对944个不同水稻品种的高通量测序结果，SHAT1的基因组序列拥有很少的功能变异(http://www.ncgr.ac.cn/RiceHapMap)。但是，在考察落粒性性状的时候，本发明人发现仍然有一些水稻品种没有离层，即使它们拥有SHAT1和sh4-1的基因型。例如，粳稻Nipponbare和籼稻GLA4拥有一样的SHAT1和sh4-1基因(表2)，但Nipponbare没有离层(图13A，B)而GLA4有离层(图5A)。这些结果说明，拥有SHAT1和sh4-1基因型的水稻品种并不一定形成离层。

表2、SHAT1、sh4-1和qSH1的表达与离层区形态的关系

最左侧一列表示品种名称，第二列表示基因型，第三至第六列表示各个基因在不同小花发育时期的表达。Sp8e：earlystagesp8；Sp81：latestagesp8；-表示无信号；+表示中等强度信号；++表示强信号；最后一列表示各品种在种子充分成熟时的BTS值，误差线以±SD表示。

为了研究Nipponbare离层的消失是否由于SHAT1和sh4-1时空表达模式的改变，本发明人用原位杂交检测了Nipponbare中这两个基因的表达。SHAT1在sp8早期在Nipponbare的离层表现出明显信号，虽然这些信号看起来不如像在野生型中那样集中(图14C)。但是，到sp8晚期，SHAT1的信号消失(图14D)。SH4也表现出类似的情况，从sp6期到sp8早期有正常表达(图14E-G)，但到sp8晚期消失(图14H)。根据这种情况，本发明人提出了两个问题：离层的分化是否需要SHAT1和SH4在离层的持续表达？在Nipponbare中，是否维持SHAT1和SH4持续表达的遗传因子的功能受到破坏？以前的研究表明，qSH1基因与离层的形成相关。那Nipponbare中qsh1功能的缺失会不会是导致SHAT1和SH4无法持续表达的原因？为了验证这一假设，本发明人将籼稻93-11中包含有功能的qSH1基因的染色体片段导入到Nipponbare中，构建成一个qSH1的近等基因系N52(图15)。qSH1在N52中表现出与在野生型中相似的表达模式(图16H)，与Nipponbare中无表达的情况形成鲜明对比(Konishi，S.etal.(2006).AnSNPcausedlossofseedshatteringduringricedomestication.Science312：1392-1396)。本发明人然后检测了SHAT1和SH4在N52中的表达。与预期的一致，这两个基因在sp8后期都在离层持续表达，这也使得N52最终形成了有功能的离层(图13C，D)。这些结果说明有功能离层的形成，不仅需要SHAT1和sh4-1的基因型，也需要这两个基因在离层的持续稳定表达。qSH1起到维持二者在离层表达的作用，从而促进离层的分化形成。

实施例9、SHAT1和SH4作用于qSH1上游

qSH1有维持SHAT1和SH4在离层持续表达的功能使本发明人推测qSH1的功能是否依赖于SHAT1和SH4。为了探索这个问题，本发明人比较了qSH1在野生型，shat1突变体和shat2突变体中的表达。在野生型中，qSH1最早在离层区出现信号是sp8早期(图16A-C)。到sp8晚期，qSH1的信号在离层区和花药处加强(图16D)。这个表达模式与SHAT1在野生型中的表达极为类似。相比之下，qSH1在shat1(图16F)或shat2(图16G)离层区都未检测到信号。这些结果说明，qSH1作用于SHAT1和SH4的下游，维持二者的持续表达。

讨论

1、SHAT1基因属于AP2家族成员

AP2结构域是植物特有的一类DNA结合蛋白，属于大的AP2/ERF基因家族。AP2/ERF家族根据AP2结构域数量和其他结构域的不同，又可以分为5大类亚家族。AP2亚家族拥有两个AP2结构域，并且有一个miR172的结合位点。进化树分析表明SHAT1是AP2亚家族成员，与大麦的Cleistogamy1(Cly1)和拟南芥的APETALA2基因有极高的同源性(图17)。Cly1控制大麦的浆片发育。现代栽培大麦cly1基因在MiR172作用位点发生了一个同义核苷酸替换，导致MiR172不再作于cly1，从而浆片不能正常发育，颖壳不能打开，形成闭花授粉。在shat1突变体，本发明人经常观察到浆片的数目增加或体积膨大的现象(图3J；图4E)，偶尔也观察到浆片伸长，变成外稃或内稃样的结构(图3M)。因此，这些带有畸形浆片的小花颖壳不能正常关闭，最终形成裸露的种子。这种情况以前在水稻miR172b过表达的植株中也观察到。这些结果说明miR172介导的SHAT1基因的剪切在水稻小花的开闭过程中也十分重要。但是，本发明人在shat1突变体中观察到的落粒缺陷在cly1突变体中并未被观察到。类似的，在拟南芥中，APETALA2被报道控制繁殖器官形态建成的许多重要方面，比如调节茎尖分生组织干细胞区域大小，花器官的决定以及控制胚珠和种子的发育开花时间的调节，但并没有任何报道与细胞分离过程有关，如花瓣的脱落和果荚的开裂。

据本发明人所知，迄今为止唯一一个被报道的参与调控种子脱落的基因是小麦的Q基因——它影响一系列与驯化有关的重要性状，比如种子落粒性，颖壳的形状和坚硬度等。虽然Q基因与水稻SHAT1基因的同源关系比较远，但是小麦q突变体所产生的离层区表型与shat1非常相似。小麦的一个小穗包含三朵可育的小花和一对颖片。离层区位于颖片的基部。小麦q突变体的小穗也包含三朵小花和一对颖片，但是离层区消失了，离层区原本的位置被伸长的小枝梗所取代。水稻的小穗与小麦相似。不同的是，水稻的第二和第三朵小花退化为护颖，而原始的颖片退化为副护颖。水稻的离层位于护颖和副护颖之间。在shat1突变体中，原本为离层位置被伸长的，弯钩状的小枝梗所代替。同源基因shat1和q所产生的类似离层区表型说明水稻和小麦离层发育中过程可能有相似的调控机制。

2、SHAT1的表达和离层区的分化

以前关于水稻离层区发育的解剖学研究表明，当穗长在20至30mm而小花长在2mm左右时，离层区细胞的形态就能与周围已经发生伸长的枝梗细胞区分开。而另一种单子叶植物油椰子离层区的解剖学研究也表明，早在细胞发生分离前，细胞壁将来要发生水解的位置早已确定。在本发明人的研究中，通过原位杂交分析发现SHAT1mRNA从sp8期开始就聚集在离层区表达，这个时期心皮原基才刚刚开始分化。但是，并不确定在sp8期时离层区细胞的形态是否已经开始分化，因为至少从外形上看这时期的离层区细胞与周围细胞区别不大。本发明人观察到，离层区细胞首次大致可以同旁邻细胞区分开的时间大约在抽穗前15天左右(图18A，D)。在此时，小穗的长度大约是2-3mm。而在同时期的shat1突变体中，这样一至两层的小而扁平状的离层区细胞从未出现(图18B，C)。另外一个有趣的现象是SHAT1在离层区的表达随着小花的发育而逐渐增强(图16A)。该现象一个可能的解释是SHAT1可能受到其自身基因产物的正调节。由于拟南芥的APETALA2曾被报道通过负调控其上游抑制因子miR172的表达，从而反馈调节自身的表达，类似的分子机制可能存在于水稻中。

本发明人观察到SHAT1广泛表达，不仅在种子的离层区，在花药，根，茎和叶片中都有表达。这些结果与其他脱落相关基因(比如SH4)的高度特异表达形成强烈对比。由于细胞分离过程并不局限发生于种子脱落处，水稻中其他一些地方，比如小孢子的分离，花药的开裂，种子的萌发以及根冠细胞的脱落等也涉及到细胞分离。所以本发明人查看了SHAT1是否也参与到其他器官的细胞分离过程。但结果显示除了种子的离层区外，SHAT1并没有在其他组织要发生细胞分离的地方表达。SHAT1在花药处虽然有表达，但shat1突变体的花药开裂率并未受到显著影响。这些结果提示引发不同组织中的细胞分离过程本质可能不完全相同，细胞分离发生具有很严格的时空特异性。

此外，尽管SHAT1在营养组织中也有广泛表达，但shat1突变体在标准的生长条件下并未表现出营养发育异常。有几种可能性假设来解释这一现象。首先，SHAT1可能对于营养生长和发育不是必需的，其次，考虑到SHAT1属于一个大的基因家族，可能有其他遗传冗余来替代SHAT1在茎和叶中的功能。最后，shat1突变体在营养发育方面的缺陷可能被正常生长条件所掩盖。与该推测一致的是，拟南芥的APETALA2基因功能曾被报道过与生长温度有关。总而言之，SHAT1是一类复杂的基因，它不仅调控离层区的发育，也调控其他花器官的发育。与水稻其他花分生组织基因或器官决定基因不同，SHAT1贯穿表达于水稻发育的各个阶段。

3、对SH4调控离层发育功能的新认识

SH4以前被报道不仅影响离层区的形成，也影响离层区细胞的水解。现在，本发明人鉴定到了SH4的一个新的等位突变，sh4-2。通过激光共聚焦和扫描电镜的观察，本发明人发现sh4-2突变体的离层区同sh4-1突变体的离层区非常不一样。sh4-1突变体离层区细胞呈等径扁平状，并且为薄壁细胞，尽管它们在靠近维管束的部分不连续(图5A)。相比之下，sh4-2突变体离层区细胞虽然呈扁平状，但并不是薄壁细胞，并不具备水解功能(图2R)。此外，原位杂交结果还表明，SH4在sh4-2突变体中的表达完全消失了(图11L)，而在sh4-1中的表达与野生型中几乎一样(图11H)。因此，本发明人认为sh4-2是SH4一个功能完全缺失的突变体。此外，本发明人十分意外地发现sh4-2突变能抑制sh4-1突变所导致的表型。也就是说，同时拥有sh4-1和sh4-2两个突变基因的植株表现出与野生型一样非常容易落粒的性状(图19)。这也是为什么本发明人一开始认为sh4-2是不同于sh4-1的新突变体。由于sh4-2是在SH4基因的第二外显子发生一个单碱基插入而sh4-1是在第一外显子中发生一个单碱基替换，SH4蛋白可能通过形成同源多聚体来弥补任意一个蛋白的突变，从而行使正常功能。SH4蛋白经过预测有一个螺旋-螺旋结构，该结构被认为能形成同源多聚体。这一发现也支持了本发明人前面的假设。通过形成同源多聚体而实现基因内互补的一个例子是人类的ArgininosuccinateLyase(ASL)基因。但是，本发明人由此想到另外一个问题：既然原位杂交在sh4-2突变体中并没有检测到SH4的表达，那么这个同源蛋白又是如何在sh4-2等位没有mRNA表达的情况下形成呢？由于原位杂交技术并不能定量检测基因的表达水平，本发明人又采用了定量PCR来检测sh4-1和sh4-2突变体中SH4的表达(图20A)。与野生型相比，SH4在sh4-1和sh4-2中的表达都有所下降，但在sh4-2中下降得更多一些。SH4在sh4-2的低表达看起来似乎与原位杂交结果不符。本发明人解释这可能是由于这两种技术本身存在差异：原位杂交技术有利于对基因表达的定位而定量PCR有利于基因表达的定量。因此，结合这些结果，本发明人认为sh4-2中仍然有SH4的表达，只是这种表达不局限在离层。

4、SHAT1，SH4，qSH1三者在控制离层区发育中各自的作用

水稻离层区的正常形成需要SHAT1，SH4和qSH1三者的共同作用。本发明人概括了三者的表达与离层区解剖结构形成的关系(表2)。SH4在离层区形成过程中起着较早的作用。SH4在离层区的最早表达以及在sh4-2突变体中检测不到SHAT1和qSH1的表达，这两点证据提示SH4作用于SHAT1和qSH1上游(图21)。SH4在离层区的高表达可能会赋予离层区细胞一些区别于旁临细胞不同的属性，从而为SHAT1和qSH1在离层区细胞中的富集提供线索。正如本发明人从原位杂交结果中所看到的情况，只有当SH4在离层区集中表达后，SHAT1和qSH1的表达范围才逐渐集中在离层区，并且随着小穗的发育而加强(图10D；图11A，B；图16D)。本发明人的结果与前人报道的qSH1相对于SH4具有遗传上位性以及qSH1在控制落粒方面比sh4具有更强效应的结论形成鲜明对比。本发明人认为导致结论差异的原因在于SH4的不同等位突变所造成表型的不同。由于栽培稻的sh4-1等位突变仍然具有功能，因此在栽培稻的背景下很难评价SH4同其他落粒基因的关系。相比之下，sh4-2是一个功能丧失的等位突变，因此为鉴定SH4在落粒调控途径中的网络关系提供了很好的材料。

SHAT1在离层区分化过程似乎起着双重作用：一作用于SH4的下游激活qSH1的表达；二维持SH4在离层的表达(图21)。shat1突变体中检测不到qSH1的表达说明qSH1是被SHAT1激活而不是被SH4。因为在shat1突变体中，SH4在sp8e期仍然有表达，而此时qSH1在野生型中是有表达(表2)。但是，本发明人并不确定SHAT1可以单独激活qSH1的表达还是仍然需要在SH4的帮助下才能实现这一功能。需要进一步的实验观察qSH1在有SHAT1表达而没有SH4表达情况下的表达。另一方面，SH4在shat1突变体sp81期表达消失说明SHAT1有维持SH4在离层持续表达的作用。SH4的表达依赖于SHAT1这一点本发明人从shat1突变体，sh4-2突变体和shat1sh4-2双突变体的表型比较可以看出。shat1sh4-2双突变的离层结构类似于shat1突变体，有一个弯钩状的小枝结构(图2V)和花生状的位于离层区位置的厚壁细胞(图2W，X)，并且shat1sh4-2双突变的BTS变化值也类似于shat1突变体(图2B)。虽然shat1和sh4-2都没有离层，但观察到二者BTS值的变化存在差异。sh4-2突变体在13天前有着较高的BTS值。本发明人认为造成这种差异的原因在于弯钩状的结构可能最大只能承受150g左右的拉力，否则就会断裂。因此，shat1突变体和shat1sh4-2双突变在9天前的BTS值甚至比野生型的还要高(图2B)。

除了这两项功能外，SHAT1似乎还有独立于SH4的功能。该观点被两项发现支持：首先，shat1突变体的小花出现各种畸形形态而sh4-2没有出现；其次，SAHT1在sh4-2突变体中仍然有表达。虽然通过原位杂交技术本发明人并没有检测到SHAT1在sh4-2中有表达，但通过定量RT-PCR技术，本发明人发现SHAT1的表达在sh4-1中略有升高而在sh4-2中有中等程度的下降(图20B)。SHAT1在sh4-2中仍然保留表达的结果说明SHAT1的表达不仅仅受到SH4的调节。sh4-2的突变破坏了SHAT1在离层的集中表达，但其他的一些表达区域比如花药可能并未受到影响。

qSH1维持SHAT1和SH4在离层的表达，从而推进离层的正确分化(图21)。在粳稻Nipponbare中，SHAT1和SH4的表达从sp81期消失，Nipponbare最终未能形成离层(表1)。相反，通过导入籼稻93-11的qSH1基因，维持SHAT1和SH4在Nipponbare中的表达，使得Nipponbare最终形成离层。这些结果说明qSH1起到维持SAHT1和SH4在离层持续表达的作用(图21)。但是，qSH1可能不是唯一一个维持SHAT1和SH4在离层持续表达的基因。因为有些qSH1功能缺失的水稻品种也表现出落粒性降低的情况。由于本发明人还不太确定这些水稻品种离层是否存在以及qSH1是否表达，还需要进一步的实验验证是否除了qSH1外，还有别的一个或多个因子维持SHAT1和SH4的表达，从而推进离层的分化。

5、驯化过程中对落粒基因的选择

选择落粒性较低的作物品种是农业研究领域的一大挑战。在水稻驯化过程中，人们倾向于选择种子落粒性降低，但又不是完全不落粒的品种。种子保留一定的落粒性，方便了农民收获后的脱粒过程。栽培稻sh4-1的点氨基酸突变使得水稻在减少自然落粒和方便人工脱粒两方面中达到了一个完美平衡。张等发现sh-1等位突变在栽培稻中被迅速固定下来。与野生稻相比，SH4基因的核苷酸序列多态性在籼稻和粳稻中都显著下降。为了探索SHAT1基因在自然群体中是否也存在不同类型的等位突变，本发明人分析了不同水稻地方品种SHAT1基因的核苷酸序列多态。本发明人查看了614份水稻中国地方品种和330份水稻国际品种的高通量测序结果(http://www.ncgr.ac.cn/RiceHapMap)，发现SHAT1基因区共有19个SNP，其中8个在UTR，4个在内含子，7个在外显子(这其中3个SNP引起同义突变，有4个SNP引起错义突变，其中一个落在AP2domain内，由Arg变为Leu)，但并没有发现类似于读码框改变或者提前终止等突变类型。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种调节禾本科植物种子落粒性的方法，其特征在于，所述方法包括：调节禾本科植物中SHAT1蛋白的表达；所述的SHAT1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：调节禾本科植物中SH4和/或qSH1的表达。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法是促进禾本科植物种子落粒的方法，包括：促进禾本科植物中SHAT1蛋白的表达。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法是抑制禾本科植物种子落粒的方法，包括：抑制禾本科植物中SHAT1的表达。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括：将下调SHAT1基因转录、蛋白表达的下调剂转入禾本科植物中；所述的SHAT1蛋白的下调剂是特异性干扰SHAT1基因转录的干扰分子。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的干扰分子是以SHAT1蛋白的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的干扰分子是以SEQIDNO:1或其转录本第1001-1325位作为沉默靶标的dsRNA或构建物。

8.一种SHAT1蛋白的下调剂的用途，用于：

抑制禾本科植物种子落粒；

抑制禾本科植物离层区发育或分化；

使得禾本科植物离层区不完整或缺失；或

使得禾本科植物离层区细胞壁加厚；

所述的SHAT1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；所述的SHAT1蛋白的下调剂是特异性干扰SHAT1基因转录的干扰分子。