CN104774845B

CN104774845B - 突变核苷酸分子及包含其的转化植物细胞以及制备可恢复雄性不育转基因植物的方法

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Publication number: CN104774845B
Application number: CN201510020145.2A
Authority: CN
Inventors: 辜瑞雪; 李敏政
Original assignee: Academia Sinica
Current assignee: Academia Sinica
Priority date: 2014-01-15
Filing date: 2015-01-15
Publication date: 2018-02-27
Anticipated expiration: 2035-01-15
Also published as: US10683518B2; US20180030473A1; CN104774845A; US20150315607A1

Abstract

本发明涉及一种突变核苷酸分子及包含其的转化植物细胞以及制备可恢复雄性不育转基因植物的方法，具体而言，涉及包含转录因子bHLH142的核苷酸序列和插入的T‑DNA区段的突变核苷酸分子，以及包含所述突变核苷酸分子的新型转化植物细胞和雄性不育突变体植物，其中转录因子bHLH142不表达。本发明还涉及新型可恢复雄性不育转基因植物及其制备方法，其中bHLH142转录因子过表达。bHLH基因在花药中组织特异性表达，并且其在花药发育中起关键作用。雄性不育和可恢复雄性不育转基因植物都显示完全的雄性不育表型，但是可恢复雄性不育转基因植物的育性可以在低温下恢复。

Description

突变核苷酸分子及包含其的转化植物细胞以及制备可恢复雄性不育转基因植物的方法

技术领域

本发明涉及一种突变核苷酸分子及包含其的转化植物细胞以及制备可恢复雄性不育转基因植物的方法，具体而言，涉及包含转录因子bHLH142的核苷酸序列和插入的T-DNA区段的突变核苷酸分子，以及包含所述突变核苷酸分子的新型转化植物细胞和雄性不育突变体植物，还涉及新型可恢复雄性不育转基因植物及其制备方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的主要作物之一，喂养着几乎一半的世界人口，并且其充当单子叶植物的模型，单子叶植物包括许多重要的农作物(例如小麦、玉米、高粱、粟)。粮农组织(FAO)预测水稻产量至2050年必须增长50-70％以满足需求。目前采用数种方法来增加水稻产量，例如杂交优势育种、群体改良、远缘杂交、基因工程和分子育种¹。其中，据认为杂交水稻是最有前途的(产量增加15-20％)²。由F1代杂交种子产生的作物在产量提高、农艺性状和最终使用品质的一致性方面给出了显著的益处。这归因于通过组合经仔细选择的亲本系而产生的“杂种优势”。在过去数十年杂交作物是全球作为产量的显著增加的原因，该进展中雄性不育(MS)起着重要作用。雄性不育性状可分为由线粒体等细胞质因子决定的细胞质雄性不育(CMS)，和由细胞核基因决定的基因雄性不育(GMS)。CMS已经长期用于杂交谷物制备，而目前CMS和GMS都用于杂交水稻制备³，这是由于通过操纵任何所选择基因型中的基因-细胞质组合而控制不育性表达的方便性。最重要的是，其规避了异花授粉品种中去雄的需要，从而促进在天然条件下杂交育种生产纯杂交种子。但是，商业化的种子生产必须是简单廉价的，对于该三系杂交体系，为了生产CMS系的种子储备而需要的保持系增加了生产成本。

另一方面，由核基因控制的遗传(GMS)，提供了另一种杂交种子生产体系。对于双系杂交体系，有益的是使用光周期诱导的或温度诱导的MS(PGMS或TGMS)突变体来保持用于杂交种子生长的种子储备库。目前在中国PA64S是双系杂交水稻育种中使用最广泛的母系，并且其与亲本系93-11杂交而产生了超级杂交稻LYP9⁴。PA64S源自自发性PGMS粳稻突变体NK58S(长日照->13.5h)⁴⁰，也是TGMS籼稻，其MS受到大于23.5℃的温度的促进，但是在21～23℃之间的温度恢复其育性。最近的匹配分析证明了这些MS系中的P/TGMS受新型小RNA调节⁵。在最近发现的另一种稻基因MS突变体(Carbon Starved Anther(CSA))的情况下，对R2R3MYB转录调节子进行的突变不能使花粉发育⁶，并且进一步的研究表明csa是新型的光周期敏感性突变体，在短日照条件下显示MS但在长日照条件下显示雄性育性⁷。其对日照长度的MS敏感性的分子基础仍待解决。

使用大量转基因已经生产转基因雄性不育性，但是由于缺少有效经济的手段来控制MS系，或缺乏合适的恢复子(restorer)，转基因雄性不育性在商业生产杂交种子方面的应用受到限制⁸。最近，通过操纵R2R3MYB结构域蛋白(AtMYB103)而在转基因拟南芥植物中证明了可恢复MS体系⁸。在AtMYB103启动子的控制下使用插入突变体或AtMYB103EAR嵌合阻遏子构建体来阻断AtMYB103的功能，导致完全不结籽的MS⁸。将含有被更强的另一特异性启动子驱动的AtMYB103的恢复子导入花粉供体植物中，并杂交到MS转基因植物中用作阻遏子。F1植物的雄性育性得以恢复。嵌合阻遏子和恢复子构成了用于杂交种子生产的可恢复MS体系。该体系在大规模杂交种子生产的成功应用取决于MS雌性亲本系是否能够有效经济地繁殖。作为选择，通过化学或其他因素(例如光周期或温度)控制的诱导型启动子可直接用于调节GMS基因(例如bHLH142)的表达，并且控制转基因植物的花粉发育，消除了保持MS系的昂贵要求。

水稻花药由通过结缔组织和维管组织附着至中央芯部的四个裂片组成。当完成花药形态形成时，在中部形成小孢子母细胞，其由四个花药壁层围绕：外表皮层、内皮层、中间层和绒毡层⁹。绒毡层位于花药壁的最内细胞层，并且在为花粉发育供应诸如脂质、多糖、蛋白和其他营养物等营养物中起重要作用¹⁰。绒毡层在花粉发育末期经历程序化细胞死亡(PCD)¹¹；该PCD引起绒毡层退化并且其特征在于细胞皱缩、线粒体和细胞骨架退化、细胞核皱缩和染色体DNA的核小体内切割。绒毡层PCD必须在花粉发育的特定阶段出现以进行正常的绒毡层功能和花粉发育，并且绒毡层PCD的早熟或延迟以及细胞退化可能引起雄性不育^3,12-14。

对拟南芥中的MS进行遗传和功能基因组研究已经显示，许多转录因子(TF)在花粉发育和绒毡层PCD的调节，如DYSFUNCTIONAL TAPETUM1(DYT)、绒毡层发育和功能1(TapetalDevelopment and Function 1，TDF1，AtMYB35)中的缺陷、ABORTED MICROSPORES(AMS，水稻中TDR1的同源物)和MALE STERILITY1(MS1)方面起关键作用；这些因子中的突变都会产生MS表型。花粉发育的基因调节途径表明，DYT1,TDF1¹⁵和AMS¹⁶在早期绒毡层发育起作用，而MS188¹⁷和MS1^15,18,19在晚期绒毡层发育和花粉壁形成起重要作用。同时，在水稻中，已知数种TF，例如未发育的绒毡层1(Undeveloped Tapetum1，UDT1，DYT1的同源物)是知道的早期绒毡层发育的关键调节子²⁰。此外，TAPETUM DEGERATION RETARDATION(TDR1)¹⁴、GAMYB^21,22、ETERNAL TAPETUM 1(EAT1)²³和DELAYED TAPETUM DEGENERATION(DTD)²⁴中的突变都引起与绒毡层PCD有关的MS。TDR1是拟南芥AMS基因的直系同源物，在水稻中的绒毡层PCD中起关键作用；并且tdr1显示延迟的绒毡层退化和核DNA片段化以及从四分体释放后小孢子的吸收。分子证据指出TDR1直接结合CP1和C6的启动子以用于他们的转录¹⁴。C6编码在脂质球状体发育和花药发育期间的花粉外壁方面起关键作用的转运蛋白¹⁷。CP1涉及生物体系中的细胞内蛋白变性，其突变体显示缺陷性的花粉发育²⁵。EAT1作用在TDR1的下游并且直接调节编码参与绒毡层PCD的天冬氨酸蛋白酶的AP25和AP37的表达²³。

碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白是TF的超家族，并且是植物中最大的TF家族之一。在水稻基因组中存在至少177个bHLH基因^26,27，在拟南芥基因组中存在已经鉴定出多于167个bHLH基因^28,29。通常，真核TF由至少两个离散的结构域组成，DNA结合结构域和激活或阻遏结构域，它们一起用于调节靶基因转录起始的速率³⁰。bHLH TF在植物细胞和组织发育以及植物代谢中起许多不同的作用³。HLH结构域促进蛋白-蛋白相互作用，使得形成同源二聚复合物或异源二聚复合物³¹。它们以二聚体的形式结合至特定的DNA靶位点，并且在多种生物过程中是重要的调节组件²⁹。迄今为止，已经显示bHLH TF中的三种参与水稻花粉发育–UDT1(bHLH164)、TDR1(bHLH5)和EAT1/DTD1(bHLH141)。

从对TNG67经T-DNA标记的水稻突变体库³²进行筛选，我们分离了编码bHLH TF的另一成员(bHLH142)的新型MS相关基因。在本发明中，解释了MS在该突变体中的分子机制，其表明bHLH142在花药中特异性表达，并且在花粉发育过程中在PCD所需的蛋白酶基因的转录中bHLH142与TDR1协同调节EAT1启动子活性。也就是说，bHLH142通过控制绒毡层PCD而在水稻花粉发育中起重要作用。空突变体和过表达转基因植物显示完全的雄性不育性表型。最令人感兴趣的是，过表达植物在低温下恢复了育性。在其他主要的谷类作物中发现具有高相似性的SEQ ID No.2的同源物，并且其使用可以通过操纵bHLH基因增加谷类作物的生产率，以用于雄性不育性的开发和杂交作物的生产。

发明内容

本发明的目的在于开发一种突变核苷酸分子以及包含所述突变核苷酸分子的转化植物细胞和雄性不育突变体植物，其中所述雄性不育突变体植物可用作母本生产F1代杂交种子，由此改善作物产量和质量。

本发明提供一种突变核苷酸分子，所述核苷酸分子包含转录因子bHLH142的核苷酸序列和插入的T-DNA区段。优选的是，所述T-DNA区段插入转录因子bHLH142的核苷酸序列的第三内含子中；更优选的是，所述T-DNA区段插入+1257bp处。

在突变核苷酸分子的一个优选实施方式中，所述T-DNA区段包含单拷贝的T-DNA。

在突变核苷酸分子的一个优选实施方式中，转录因子bHLH142的核苷酸序列具有SEQ ID No.1所示DNA序列或与SEQ ID No.1具有至少60％相似性的DNA序列。优选的是，与SEQ ID No.1具有至少80％相似性的DNA序列；更优选的是，与SEQ ID No.1具有至少90％相似性的DNA序列；还更优选的是，与SEQ ID No.1具有至少95％相似性的DNA序列；最优选的是SEQ ID No.1所示DNA序列。此外，转录因子bHLH142具有SEQ ID No.2所示多肽序列或与SEQ ID No.2具有至少60％相似性的多肽序列。优选的是，与SEQ ID No.2具有至少80％相似性的多肽序列；更优选的是，与SEQ ID No.2具有至少90％相似性的多肽序列；还更优选的是，与SEQ ID No.2具有至少95％相似性的多肽序列；最优选的是SEQ ID No.2所示多肽序列。

本发明提供一种转化植物细胞，其包含上述突变核苷酸分子。优选的是，所述T-DNA区段插入转录因子bHLH142的核苷酸序列的第三内含子中；更优选的是，所述T-DNA区段插入+1257bp处。

在包含所述突变核苷酸分子的转化植物细胞的一个优选实施方式中，转录因子bHLH142的核苷酸序列具有SEQ ID No.1所示DNA序列或与SEQ ID No.1具有至少60％相似性的DNA序列。优选的是，与SEQ ID No.1具有至少80％相似性的DNA序列；更优选的是，与SEQ ID No.1具有至少90％相似性的DNA序列；还更优选的是，与SEQ ID No.1具有至少95％相似性的DNA序列；最优选的是DNA序列SEQ ID No.1。此外，转录因子bHLH142具有多肽序列SEQ ID No.2或与SEQ ID No.2具有至少60％相似性的多肽序列。优选的是，与SEQ ID No.2具有至少80％相似性的多肽序列；更优选的是，与SEQ ID No.2具有至少90％相似性的多肽序列；还更优选的是，与SEQ ID No.2具有至少95％相似性的多肽序列；最优选的是SEQ IDNo.2所示多肽序列。

本发明还提供一种包含上述突变核苷酸分子的雄性不育突变体植物，转录因子bHLH142不表达；优选的是，在花药中不表达。优选的是，所述T-DNA区段插入转录因子bHLH142的核苷酸序列的第三内含子中；更优选的是，所述T-DNA区段插入+1257bp处。

在雄性不育突变体植物的一个优选实施方式中，转录因子bHLH142的核苷酸序列具有SEQ ID No.1所示DNA序列或与SEQ ID No.1具有至少60％相似性的DNA序列。优选的是，与SEQ ID No.1具有至少80％相似性的DNA序列；更优选的是，与SEQ ID No.1具有至少90％相似性的DNA序列；还更优选的是，与SEQ ID No.1具有至少95％相似性的DNA序列；最优选的是SEQ ID No.1所示DNA序列。此外，转录因子bHLH142具有SEQ ID No.2所示多肽序列或与SEQ ID No.2具有至少60％相似性的多肽序列。优选的是，与SEQ ID No.2具有至少80％相似性的多肽序列；更优选的是，与SEQ ID No.2具有至少90％相似性的多肽序列；还更优选的是，与SEQ ID No.2具有至少95％相似性的多肽序列；最优选的是SEQ ID No.2所示多肽序列。

在雄性不育突变体植物的一个优选实施方式中，本发明的雄性不育突变体植物是纯合子突变体。

在雄性不育突变体植物的一个优选实施方式中，所述植物是单子叶植物，优选的是，所述单子叶植物是水稻、玉米(maize)、小麦(wheat)、粟(millet)、高粱(sorghum)或二穗短柄草(Brachypodium distachyon)。

在雄性不育突变体植物的一个优选实施方式中，所述植物是双子叶植物；优选的是，所述双子叶植物是拟南芥(Arabidopsis)或芸薹属种植物(Brassica species)。

本发明还提供一种转化植物细胞，所述转化植物细胞包含质粒，所述质粒包含转录因子bHLH142的序列和强启动子。

在包含转录因子bHLH142的序列的转化植物细胞的一个优选实施方式中，转录因子bHLH142的核苷酸序列具有SEQ ID No.1所示DNA序列或与SEQ ID No.1具有至少60％相似性的DNA序列。优选的是，与SEQ ID No.1具有至少80％相似性的DNA序列；更优选的是，与SEQ ID No.1具有至少90％相似性的DNA序列；还更优选的是，与SEQ ID No.1具有至少95％相似性的DNA序列；最优选的是SEQ ID No.1所示DNA序列。

在包含转录因子bHLH142的序列的转化植物细胞的一个优选实施方式中，所述强启动子是泛素启动子(Ubiquitin promoter)、CaMV 35S启动子、肌动蛋白启动子(Actinpromoter)、花药绒毡层特异性启动子(anther tapetum-specific promoter)或花粉特异性启动子(pollen-specific promoter)；优选的是，所述花药绒毡层特异性启动子为Osg6B或TA29，所述花粉特异性启动子为LAT52或LAT59。

本发明还提供一种可恢复雄性不育转基因植物，其中所述转录因子bHLH142过表达；具体而言，在花药中过表达。

在可恢复雄性不育转基因植物的一个优选实施方式中，转录因子bHLH142的核苷酸序列具有SEQ ID No.1所示DNA序列或与SEQ ID No.1具有至少60％相似性的DNA序列。优选的是，与SEQ ID No.1具有至少80％相似性的DNA序列；更优选的是，与SEQ ID No.1具有至少90％相似性的DNA序列；还更优选的是，与SEQ ID No.1具有至少95％相似性的DNA序列；最优选的是SEQ ID No.1所示DNA序列。此外，转录因子bHLH142具有SEQ ID No.2所示多肽序列或与SEQ ID No.2具有至少60％相似性的多肽序列。优选的是，与SEQ ID No.2具有至少80％相似性的多肽序列；更优选的是，与SEQ ID No.2具有至少90％相似性的多肽序列；还更优选的是，与SEQ ID No.2具有至少95％相似性的多肽序列；最优选的是SEQ IDNo.2所示多肽序列。

在可恢复雄性不育转基因植物的一个优选实施方式中，所述转录因子bHLH142的表达受强启动子控制；优选受泛素启动子、CaMV 35S启动子、肌动蛋白启动子、花药绒毡层特异性启动子或花粉特异性启动子控制；优选的是，所述花药绒毡层特异性启动子为Osg6B或TA29，所述花粉特异性启动子为LAT52或LAT59。

在可恢复雄性不育转基因植物的一个优选实施方式中，在低温下恢复所述植物的花粉育性。具体而言，在21-23℃恢复所述植物的花粉育性。

在可恢复雄性不育转基因植物的一个优选实施方式中，所述植物是单子叶植物，优选的是，所述单子叶植物是水稻、玉米、小麦、粟、高粱或二穗短柄草。

在可恢复雄性不育转基因植物的一个优选实施方式中，所述植物是双子叶植物；优选的是，所述双子叶植物是拟南芥或芸薹属种植物。

本发明还提供一种制备上述的可恢复雄性不育转基因植物的方法，所述方法包括：

(a)构建包含bHLH142的DNA序列和强启动子的质粒；和

(b)向靶植物中导入所述质粒。

在所述制备方法的一个优选实施方式中，所述bHLH142的DNA序列是SEQ ID No.1或与SEQ ID No.1具有至少60％相似性的DNA序列。优选的是，与SEQ ID No.1具有至少80％相似性的DNA序列；更优选的是，与SEQ ID No.1具有至少90％相似性的DNA序列；还更优选的是，与SEQ ID No.1具有至少95％相似性的DNA序列；最优选的是SEQ ID No.1所示DNA序列。

在所述制备方法的一个优选实施方式中，所述强启动子是泛素启动子、CaMV 35S启动子、肌动蛋白启动子、花药绒毡层特异性启动子或花粉特异性启动子；优选的是，所述花药绒毡层特异性启动子为Osg6B或TA29，所述花粉特异性启动子为LAT52或LAT59。

在所述制备方法的一个优选实施方式中，通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)将所述质粒导入所述靶植物的愈伤组织中。

附图说明

图1.ms142突变体的表型分析。(A)水稻孕穗期野生型植物(左)和ms142突变体(右)的比较；(B)抽穗期野生型稻穗(左)和ms142突变体(右)的比较；(C)种子成熟期野生型稻穗(左)和ms142突变体(右)的比较；(D)开花期前一天野生型小穗(左)和ms142突变体(右)的表型；(E)开花期后野生型小穗(左)和ms142突变体(右)的表型；(F)收获期野生型稻粒(左)和ms142突变体(右)的比较；(G)除去稻壳后野生型稻粒(左)和ms142突变体(右)的表型；(H)开花期前一天野生型花药(左)和ms142突变体(右)的表型；(I)在野生型(左)和ms142突变体(右)中用苏丹黑对花药进行染色；(J)通过I₂/KI溶液对野生型花粉粒进行染色；和(K)通过I₂/KI溶液对突变体花粉粒进行染色。(A)中条＝20cm，(B)和(C)中条＝3cm，(D)～(G)中条＝0.5cm，(H)和(I)中条＝0.1cm，(J)和(K)中条＝20μm。

图2.T-DNA插入ms142突变体中的证据。(A)hptII探针的DNA印迹(Southernblotting)确认了ms142突变体中的的单个T-DNA插入(用箭头标记)。(B)pTag4载体的T-DNA标记的构建图。(C)在所述突变体中在第三内含子(离ATG+1257bp，以“ATG”中的“A”为+1)处的基因结构和T-DNA插入位点。(D)杂合T4突变体子代基因分型。基因型：WT，野生型样；He；杂合；Ho，纯合。稻粒育性：F，可育；S，不育。

图3.野生型(TNG67)和ms142突变体中花药发育的横向解剖比较。E，表皮；En，蒴内层；ML，中间层；T，绒毡层；Ms，花粉母细胞；Td，四分体；Msp，小孢子；MP，成熟花粉；带线箭头(Arrow)，退化的小孢子；箭头指向端头(arrowhead)，两个绒毡层。条＝20μm。

图4.TUNEL检验显示在ms142突变体中绒毡层程序化细胞死亡缺陷。DNA片段化信号(黄色荧光)在四分体期开始，并且在野生型(TNG67)中于幼小孢子期展示出明显的阳性信号。在ms142花药中没有观察到DNA片段化。红色信号显示碘化丙啶(PI)染色，黄色荧光是TUNEL(绿色)和PI的合成信号。比例尺＝20μm。

图5.bHLH142基因的图示、多重比对和融合有GFP的bHLH142的亚细胞定位。(A)bHLH142基因的图示和T-DNA插入位置。灰色盒表示外显子，间隔线表示内含子。示出ATG起始密码子和TGA终止密码子。bHLH，碱性螺旋-环-螺旋结构域(氨基酸182～228)；NLS，两个核定位信号(分别是氨基酸159～165和235～240)。(B)bHLH结构域的比对。将bHLH142蛋白与来自其他物种的类似蛋白的bHLH结构域比对。星号(*)表示对于结合DNA而言重要的保守性碱性氨基酸Arg。井号(#)表示对于形成α-螺旋而言重要的保守性Leu残基。(C)融合构建体的方案。P35S是花椰菜花叶病毒35S启动子；Tnos是胭脂碱合酶基因终止子。与mRFP融合的VirD2的NLS结构域用作核标记。(D)融合蛋白体内靶向。显示出DIC(亮视野，左栏)和重叠(合并，右栏)。比例尺＝20μm。

图6.bHLH142相关蛋白的系统发生分析。Aral，琴叶拟南芥(Arabidopsislyrata)；Aegt，节节麦(Aegilops tauschii)；At，拟南芥(Arabidopsis thaliana)；Brad，二穗短柄草(Brachypodium distachyon)；Os，水稻(Oryza sativa)；Sei，谷子(Setariaitalica)；Sb，高粱(Sorghum bicolor)；Selm，江南卷柏(Selaginella moellendorffii)；Triu，乌拉尔图小麦(Triticum urartu)；和Zm，玉米(Zea may)。

图7.在不同发育阶段通过(A)RT-PCR和(B)qRT-PCR获得的TNG67(WT)的各种组织中和(C)在TNG67小穗中的bHLH142的基因时空表达；以及(D)在减数分裂时TNG67的小穗中bHLH142反义(左图)和正义(右图)探针的ISH。误差棒表示SD(n＝3)。SC，造孢细胞；MMC，小孢子母细胞；Mei，减数分裂；YM，幼小孢子；VP，液泡化的花粉；PM，花粉有丝分裂；和MP，成熟花粉。在(C)中比例尺＝1mm，在(D)中比例尺＝50μm。

图8.在各种发育阶段中在WT和ms142突变体的花药中的bHLH142表达的原位杂交分析。与bHLH142的正义或反义经dig标记的探针杂交的花药截面。比例尺＝20μm。

图9.通过qRT-PCR进行的在ms142中参与花粉发育的关键调节基因的表达的变换的分析。误差棒表示SD(n＝3)。MMC，小孢子母细胞；Mei，减数分裂；VP，液泡化的花粉。

图10.在ms142和eat1突变体中通过参与花粉发育的关键调节基因的表达图谱确定的bHLH142的基因级联(Gene Hierarchy)。(A)在TNG67(WT)和ms142中的小穗表型。(B)在Hitomebore和H0530(eat1突变体)中的小穗表型。(C)在ms142和eat1突变体及其各自的野生型中的bHLH142的实时RT-PCR。(D)在ms142和eat1突变体及其各自的野生型中的EAT1(bHLH141)的实时RT-PCR。显示的qRT-PCR值为+SE(n＝3)。MMC，小孢子母细胞；Mei，减数分裂；YM，幼小孢子；VP，液泡化的花粉。

图11.bHLH142和TDR1对EAT1启动子的协同调节。(A)在水稻叶子原生质体中的瞬时转录中使用的报告子、效应子和内部对照质粒的示意图。报告质粒含有CaMV35S最小启动子和与萤火虫基因(Luc)融合的EAT1启动子序列(2Kb)。在效应子质粒中，在CaMV35S启动子的控制下驱动bHLH142、TDR1和EAT1基因。Nos和t35s分别表示胭脂碱合酶和CaMV35S的终止子。pBI221载体含有驱动GUS的表达的CaMV35S启动子作为内部对照。(B)在水稻原生质体中通过bHLH142和TDR转录Luc报告基因。将不同的效应子与报告子和内部对照质粒(pBI221)一起共转染。数据表示三个独立的瞬时转化的平均值。误差棒表示SD。使用无效应子质粒(mini35p)的瞬时转化作为阴性对照。

图12.在表达所指定构建体的水稻叶子原生质体中通过(A)Yeast双杂交检验和(B)BiFC对bHLH142、TDR1和EAT1之间的相互作用进行分析。比例尺＝20μm。

图13.bHLH142蛋白和TDR1，以及TDR1和EAT1之间的相互作用。(A)酵母双杂交(Y2H)检验。将表达全长bHLH142的构建体克隆到猎物载体pGADT7(AD)中，在诱饵载体pGBKT7(BD)中制备TDR和EAT1的截短形式。(B)表达所指定构建体的水稻原生质体中的BiFC。条＝10μm。(C)使用抗HA抗体在大肠杆菌中表达的HA融合TDR和bHLH142重组蛋白的Co-IP检验。(D)使用bHLH142抗体在大肠杆菌中表达的HA融合TDR和bHLH142重组蛋白的Co-IP检验。

图14.bHLH142的RNAi敲弱(KD)抑制花粉发育。(A)RNAi载体的构建。(B)RT-PCR显示在四种RNAi敲弱系的花药中bHLH142的下调。(C)WT和KD系#3的表型。在(C)中比例尺＝20cm，在(D)中比例尺＝0.5cm，在(E)中比例尺＝1mm。

图15.在转基因水稻中由泛素启动子驱动的过表达水稻bHLH142。(A)在pCAMBIA1301载体中由泛素启动子驱动的bHLH142(LOC_Os01g18870)的构建。(B)基因组PCR确认了转基因水稻中靶基因的T-DNA插入(上图)和选择标志物潮霉素(下图)。

图16.TNG67(WT)和Ubi::bHLH142转基因系的表型。(A)WT(左)和转基因系(右)的植物类型；(B)WT(下部)和转基因系(上部图)的穗；(C)WT(左)和不同转基因系(右)的穗；(D)开花前一天WT(左)和不同转基因系的穗；(E)WT(左)和不同转基因系的成熟种子；和(F)WT(左)和不同转基因系的脱壳水稻种子。在(A)中比例尺＝20cm，在(B)中比例尺＝3cm，在(C)中比例尺＝7cm，在(F)中比例尺＝1cm。

图17.过表达bHLH142在减数分裂阶段之前过早地上调Udt1和EAT1但是显著地下调在花粉外壁发育中相关的MS2。SC＝造孢细胞，MMC＝小孢子母细胞，Mei＝减数分裂，YM＝幼小孢子，PM＝花粉有丝分裂，MP＝成熟花粉。

图18.通过使用RT-PCR确定的bHLH142同源物在玉米的各种器官中的基因表达模式。通过测定小花(floret)的长度确定小花尺寸。10G，绿色的小花长度10mm。1DBA，开花前一天。

图19.异源过表达Ubi::bHLH142引起转基因玉米中的雄性不育。(A)转基因系(右图)比WT(左图)具有较小的雄穗分枝角度。(B)开花阶段期间的雄穗，WT在开花阶段期间具有大的张开的花药(左图)，而转基因玉米的花药尺寸显著较小，并且花药不开裂(右图)。(C)WT(左图)和转基因系(右图)的小穗形态。(D)在可育性WT中通过I₂/KI溶液对花粉颗粒染色，但是在转基因系中不能染色，并且花粉不可见，显示透明花粉。比例尺在(A)中＝3cm，在(C)中＝2mm，在(D)中＝50μm。

图20.过表达Ubi::bHLH142转基因系的雄性不育性对环境敏感。bHLH142过表达系在夏季不产生花粉颗粒(左图)，但在冬季具有可育的花粉。通过I₂/KI溶液对花粉颗粒染色。

图21.在水稻花药发育中bHLH142相对于其他关键调节子的分子功能的提出模型。bHLH142位于UDT1的下游但在TDR1的上游，bHLH142与TDR1蛋白相互作用，并且协同调节EAT1的启动子。进而，EAT1调节AP37和CP1以及促进绒毡层PCD。之前工作的证据通过黑色箭头表示，而本研究中证明的数据通过红色箭头表示。

具体实施方式

给出以下实例来证明本发明。这些实例绝不解释为限制本发明。公开内容会能够使本领域技术人员实施本发明而无需进行过度实验。本文通过参考并入所有参考文献的全部内容。

植物材料和生长调节

ms142突变体的种子获自TRIM突变库。ms142突变体及WT(TNG67)的幼苗培养在半强度的Kimura溶液中3周，然后移植到位于中国台湾台南的AS-BCST GMO网棚中的土壤中。

花药解剖结构

在各种发育阶段对WT和ms142突变体的小穗和花药取样，并将其固定在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中过夜，该磷酸盐缓冲液含有4％多聚甲醛和2.5％戊二醛。然后将它们用相同的缓冲液冲洗，并在pH7.0的含有1％四氧化锇的磷酸盐缓冲液中后固定30分钟。脱水后，将试样包埋在Spurr’s Resin(EMS)中。选择处理机KOS Rapid Microwave Labstation来进行后固定、脱水、树脂浸润和包埋。对于TEM，将收集在包铜网格上的超薄切片(90～100nm厚)用6％醋酸双氧铀和0.4％柠檬酸铅染色，并使用透射电子显微镜检查。

总RNA分离和PCR。

使用MaestroZol^TM RNA PLUS(Invitrogen)按照供应商所述从水稻组织分离总RNA。收获不同发育阶段的各种水稻器官以用于RNA分离：根，幼苗，旗叶，节间，长0.5cm、1cm、5cm、9cm和20cm的穗，开花前1天的小穗(1DBA)，外稃，内稃，花药，子房，授粉后5天的种子(S1)、授粉后15天的种子(S3)、授粉后25天的种子(S5)，以及愈伤组织。将花药阶段根据小穗长度分成下述类别：小穗长度为约2mm的小孢子母细胞(MMC)，减数分裂(4mm)、幼小孢子(YM，6mm)、液泡化花粉(VP，8mm)，减数分裂花粉(MP，8mm，具有浅绿色外稃)和开花前一天的成熟花粉(1DBA)。将总RNA用DNA酶(Promega)处理，使用1μg RNA来利用M-MLV逆转录酶cDNA合成试剂盒(Promega)合成寡(dT)引物第一链cDNA。使用1μL逆转录产物作为PCR反应中的模板。使用泛素样5和18srRNA作为标准对照。各样品具有三个生物重复。

qRT-PCR分析。

15μL的RT-PCR反应含有4μL的1/4稀释的cDNA、3μM引物和7.5μL的2X KAPA SYBRFAST master mix(KAPA Biosystems,USA)。使用CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad,USA)进行定量实时PCR(qRT-PCR)。使用CFX Manager Software(Bio-Rad,USA)进行定量分析。用于qPCR的引物列于表1中。

原位杂交

收集后立即将不同发育阶段的TNG67和ms142的小穗固定在PFA[4％多聚甲醛、4％二甲基亚砜0.25％戊二醛、0.1％吐温20、在焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的H₂O中的0.1％Triton X-100]中于4℃过夜，并且使用组织处理机KOS Rapid Microwave Lab station来进行脱水和蜡浸润。包埋后，通过轮转切片机(MICROM,315R)制备10μm厚的切片，并将其固定在APS粘合显微镜载玻片(FINE FROST)上。将组织切片用二甲苯脱蜡，通过乙醇连续稀释液复水，并用蛋白酶K(2mg/mL)在1-磷酸缓冲盐水(PBS)中于37℃预处理30分钟。根据之前的策略进行预杂交(另外包括25％RNAmate,BioChain)和杂交。在下述杂交液中于59℃进行杂交：50％甲酰胺、4×SSPE、1×Denhardt’s(Fluka)、250μg/mL鱼精子DNA(Genemarker)、250μg/mL酵母tRNA(Sigma)、10％右旋糖酐硫酸酯、40U/mL RNasin(Promega)和40ng的经DIG-标记的RNA探针/每载玻片。使用DIG RNA标记试剂盒(SP6/T7,Roche)在pGEM-TEasy载体中通过RT–PCR片段的体外转录而合成RNA探针。通过SP6RNA聚合酶合成反义RNA探针，而通过T7RNA聚合酶合成正义RNA探针并将其用作对照。合成RNA探针的片段序列(SEQ IDNo.119):

5’-catgttcaacaccaagattcattcgggatctccagtgtttgcaagtgcagtggccagcaggctgattgaagtggtggatgagtactaactagctcgagctagctaattagccgaccgaccgatcgatatgatgaaagtttctatgttgctagctagctagggttcttggatgcatgagtactgagtagctctttaattaatttccttttaattttagactgtttaatttggattggtaaagactcgtgttagcttttgggagatctttggtatgtcatggtttgca-3’。

使用敲除突变体的基因级联分析

我们掌握着一些T-DNA/Tos17敲除突变体，例如：从Rice Tos17 InsertionMutant Database(http://tos.nias.affrc.go.jp/)获得的in udt1(TRIM),bHLH142(ms142,TRIM)和eat1(bHLH141)Tos17突变系H0530(Hitomebore的背景)。通过利用特异性引物的基因分型PCR扩增确认了侧接序列(表1)。我们会使用这些突变体验证其基因级联。收集不同发育阶段的小穗样品，分离RNA并进行qRT-PCR分析。

TUNEL检验

PCD的特征在于细胞皱缩、染色质和细胞骨架退化、细胞核皱缩和染色体DNA的核小体间切割³³。为了调查ms142中绒毡层分解的性质，使用DeadEnd Fluorometric TUNEL系统(Promega)进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)。该检验通过向片段化DNA的3’-OH末端酶促引入荧光素-12-dUTP而检测原位DNA切割，即凋亡样PCD的标志性特征。花药发育的阶段主要基于小穗的尺寸和发育阶段。

bHLH142的亚细胞定位

为了对bHLH142进行亚细胞定位，将该基因的编码序列亚克隆至p2FGW7(Invitrogen)中以产生被CaMV 35S驱动的bHLH142-GFP融合基因。使用聚乙二醇法按照之前所述的步骤分离和转化水稻原生质体³⁴。在光下于室温温育16小时后，用Zeiss LSM 780激光扫描共聚焦显微镜观察原生质体。

bHLH142亚科(subfamily)的系统发生分析

使用bHLH142蛋白来利用BLASTP程序从其植物物种中检索最近的同源物。使用CLUSTAL W online(http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html)进行全长蛋白序列的多序列比对，并且使用该比对来利用Mega 5.05进行邻接法分析³⁵。节点处的数量表示基于1000个重复的百分比自举值。分支的长度与每个位点的氨基酸取代的预期数量成比例。用于产生系统发生树和对比的基因鉴定数列于表2中。

酵母双杂交(Y2H)检验

将MATCHMAKER GAL4双杂交系统(Clontech,USA)用于Y2H检验。由于报道过全长EAT1和TDR1蛋白具有自激活(Ji等,2013)，我们制造了截短的EAT1(EAT1^Δ，氨基酸1–254)和截短的TDR1(TDR^Δ，氨基酸1–344)来减少自激活。将bHLH142的全长cDNA克隆到pGAD-T7(Clontech,USA)中，将全长bHLH142、EAT1、TDR、EAT1^Δ和TDR^Δ分别克隆到pGBK-T7(Clontech,USA)中。将待检测的构建体对共转化到AH109酵母细胞中，并在含有Leu(用于pGADT7质粒)和Trp(用于pGBKT7质粒)撤除成分培养基的平板上于30℃进行选择3～4天。通过在具有30mM 3-氨基-1,2,4三唑(3AT)的SD/–Leu/–Trp/–His平板上生长而就蛋白相互作用测试转化体，并在X-α-Gal诱导后进行测试以确认阳性相互作用。该系统提供了用于检测和确认酵母中蛋白体内相互作用的转录检验。

双分子荧光互补(BiFC)检验

BiFC检验允许活细胞中的蛋白-蛋白相互作用可视化，并且允许直接检测亚细胞区室中的蛋白复合物，为其功能提供深入了解。将bHLH142、UDT1、TDR1和EAT1的全长cDNA独立地引入pJET1.2(Thermo Scientific)中。然后将YFP的N末端氨基酸残基1-174的序列框内融合至测试蛋白的C末端区域的序列，而将YFP的C末端氨基酸残基175-239的序列框内融合至测试蛋白的N末端的序列。接下来，将测试基因引入pSAT5-DEST_CYN1和pSAT4(A)-DEST_NYN1中。按照之前公开的策略³⁶进行在水稻原生质体中的弹道轰击介导的瞬时转化。在具有Plan-Apochromat 40x/1.4油物镜的LSM 780Plus ELYRA S.1共聚焦显微镜(Zeiss,德国)上对荧光图像照相。

共免疫沉淀检验

将融合有血凝素(HA)标记的bHLH142和TDR1融合体的重组蛋白在具有pET-53-DEST(HIS-标记)的细菌中表达，通过在12000rpm离心15分钟使裂解后的细胞提取物澄清化，将其悬浮在结合缓冲液[20mM Tris–HCl(pH 7.9),500mM NaCl]中，并使用超声匀化器(Misonix XL Sonicator Ultrasonic Cell Processor)在冰上超声处理30s。使用Ni²⁺树脂对上清液进行纯化。为了免疫沉淀，通过在旋转下于4℃与20μl的Pure Proteome蛋白G磁珠(Millipore Co.,Billerica,MA)进行30分钟温育而将提取物预澄清。然后将抗体(抗-bHLH142或抗-HA)添加至预澄清的提取物。在4℃温育4小时后，加入40μL的PureProteome蛋白G磁珠，并在旋转下于室温将提取物进一步温育10分钟。充分洗涤后，通过蛋白质印迹分析结合蛋白。使用合成肽(CSPTPRSGGGRKRSR，SEQ ID No.116)作为抗原(GenScript Co)产生针对水稻bHLH142的兔抗血清。

对bHLH142进行的RNAi-介导的基因沉默

为了产生用于抑制bHLH142的表达的RNA干扰(RNAi)构建体，通过利用特异性引物(表1)的PCR对来自bHLH142的5’UTR区的149bp片段进行扩增，并将其克隆到pENTR(Invitrogen)中以产生入门载体pPZP200hph-Ubi-bHLH142 RNAi-NOS(12,483bp)。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化系统³⁷将RNAi构建体转化到WT(TNG67)水稻愈伤组织中。通过在含有潮霉素的培养基上进行选择而从所转化的愈伤组织再生转基因植物。

实施例

新型雄性不育性水稻突变体的鉴定

从中国台湾稻插入突变体(TRIM)(http://trim.sinica.edu.tw)系的T2群体中我们鉴定出具有完全MS表型的T-DNA-标记的水稻突变体(表示为ms142)。在田地里，该突变体不产生可见的种子但保持正常的植物生长(图1A)，其稻穗和小穗与野生型发育相似(图1B～1E)。ms142突变体展示出小穗的正常打开和花药花丝的延伸，并且其花药在稻壳中完全发挥(图1E)。但是，ms142的花药的尺寸显著较小且呈淡黄白色(图1H)，并且没有花粉裂开(图1B和1E)以及花粉粒填充(图1F和1G)。由于缺少脂质累积ms142突变体的花药不能被苏丹黑染色(图1I)并且没有显示花粉粒发育(图1K)。如稍后所揭示的，具有完全MS的ms142是空突变体。

ms142突变体中T-DNA-标记的基因的序列分析

为了确定T-DNA的插入拷贝数，构建了使用hptII作为探针对T2突变系进行的Southern blot分析，在突变系中仅检测到一条带(图2A)。因此，将ms142中的突变归因于单个T-DNA插入事件。在TRIM数据库中对侧接序列标记(FST)进行的分析表明，是ms142是推测的突变体，在bHLH142的第三内含子中离ATG起始密码子1257bp处插入有T-DNA(RAP LocusOs01g0293100,MSU Locus Os01g18870)。将该基因编码的蛋白注释为含有碱性螺旋-环-螺旋二聚化区bHLH结构域的蛋白(RiceXPro Version 3.0)。bHLH142基因由四个外显子和三个内含子组成。此外，使用横跨T-DNA插入位点的特异性引物的PCR进行的基因分型验证了其FST(图2)。为突变体等位基因(R+RB,扩增子＝340bp)和野生型等位基因(F+R,扩增子＝458bp)设计引物。将三个引物组引入一个PCR反应以用于基因分型。

ms142突变体的农艺性状和遗传研究

在户外GMO网棚(outdoor GMO net house)中生长的杂合突变体的自花传粉后代中检查了突变体的农艺性状。杂合植物在营养生长和生殖生长方面与WT行为相似，并且产生量可育性种子。但是，纯合ms142突变体植物显示出与WT相似的植物高度、稻穗数和稻穗长度，但不产生存活的种子。

为了理解ms142中的不育性是否归因于雄性不育性或雌性不育性，将纯合突变体与WT花粉回交，所有的F1代植物在生长和可育性方面都显示出类似WT的表型(数据未示出)。这些结果暗示ms142的雌性器官正常发育。当使ms142BCF1自花传粉时，BCF2子代分群成可育性和不育性植物，比例为3:1(表3)，表明MS性状受隐性基因控制。与突变体表型一致，回交分群仅在纯合植物中显示MS，表明MS表型与基因型共分群。另外，当源自T2、T3、T4和BCF2代的杂合植物的自花传粉种子在不同的年份和不同的种植季节种植时，表型评分表明ms142中的MS是稳定的，并且不受种植季节或年份影响。再次，可育和不可育植物以约3:1的比例分群，这得到卡平方分析的支持(T4和BCF2的数据示于表4)。总之，这些遗传分析验证了ms142中的MS受单个隐性基因座控制。

表3

表4

ms142突变体中的花药壁和花粉发育中的缺陷

为了确定ms142的花药中的缺陷，我们检查了WT和纯合突变体中花药的解剖结构。在小孢子母细胞(MMC)阶段，WT花药壁含有表皮细胞层、内皮细胞层、中间层和绒毡细胞层(图3A)。在减数分裂早期，小孢子母细胞进行减数分裂以形成单倍体小孢子的四分体，绒毡层细胞分化形成大液泡，中间层细胞开始退化(图3B)。在四分体阶段，小孢子母细胞形成四分体(图3C)。在小孢子幼期，游离小孢子释放到花药室，并且小孢子发育，外壁沉积在花粉粒壁上。中间层皱缩，绒毡细胞层变得稠密(图3D)。在成熟花粉阶段，单核花粉发育成三核花粉，其在花粉原生质体中富集有淀粉、蛋白、脂质和其他营养物质。成熟时，绒毡层细胞完全退化，内皮细胞层变稠，为花药开裂做好准备(图3E)。

在MMC阶段，在WT和ms142之间的花药中没有可见的差异。ms142花药由正常表皮、内皮、中间层和绒毡层组成(图3F)。但是在减数分裂早期，ms142小孢子母细胞不进入减数分裂并形成异常的细胞器(图3G，由箭头表示)。通过透射电子显微镜也观察到内质网凋亡的结构。ms142绒毡层细胞连续地变得液泡化和拉伸化，一些细胞分成两个绒毡层(图3G)。突变体绒毡层的中间层保持其起始形状，但是在四分体阶段不能分成4个细胞(图3H)。在液泡化花粉期间ms142突变体的小孢子最后退化。绒毡层和中间层细胞含有大液泡，中间层细胞不退化(图3I)。因此，在成熟阶段在子囊腔中没有成熟的花粉粒。成熟花药壁仍保持4～5个细胞层，即表皮、内皮、中间层和一个或两个绒毡细胞层。与之相反，在突变体中即使在花药发育的晚期内皮细胞层也不变厚(图3J)。

突变的bHLH142引起绒毡层PCD缺陷

组织学分析表明，ms142具有异常的花药形态学和绒毡层细胞的败育退化(图3)。因此，我们怀疑bHLH142的突变可能改变了绒毡层PCD，其造成了绒毡层退化^3,12-14。绒毡层PCD的特征在于细胞皱缩、线粒体和细胞骨架退化、核皱缩以及染色体DNA的核小体内断裂¹³。因此，我们进行了TUNEL检验来检测WT和ms142的花药中的DNA片段化。在减数分裂期间在WT的绒毡层细胞中开始出现TUNEL阳性信号，在小孢子幼期期间检测到强TUNEL信号(图4)。与之相反，在整个花药发育过程中在ms142的绒毡层中未观察到DNA片段化(图4)。

bHLH142是核蛋白

图5A中显示的bHLH142的基因结构表明，bHLH结构域含有二分(bipartite)核定位信号(NLS)，并且预测该基因编码理论分子量为40.7kDa、pI为6.2的379个氨基酸的蛋白。

bHLH142的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID No.1

AAGAAACCAACTGCTTTCTCCTACCCAATATCACCCTTGCCCCTTTTATATACTCTTCCTCTCATCACCTTCTCGATCGGCCTCTCTCCTCTCCTCTCATCAGCTCACACCCCCAACCAACAAACCTAGTTAATTTAGCTCTAGTTGGTTCATCCCTGCTGCACTGCGAGCTCAAGTAATCGATCTGAGCTCTGAAGAAAAAGGTGGTAGAGTGCGAGGAAGATGTATCACCCGCAGTGCGAGCTCCTGATGCCGCTTGAGAGCCTGGAGATGGACGTCGGCCAGTCGCACCTCGCCGCCGCCGTCGCAGCAGCCATGCCGGGGGAGCTCAACTTCCACCTCCTCCACTCGCTCGACGCCGCCGCGGCGGCTGCCTCCTCCACCGCCGCCTCGGCCTCCTCCCAGCCCACCGTCGACTACTTCTTCGGCGGCGCCGACCAGCAGCCGCCGCCGCCGGCGGCGATGCAGTACGACCAGCTGGCGGCGCCGCACCACCACCAGACGGTGGCCATGCTGCGCGACTACTACGGCGGCCACTACCCGCCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCCACCGAGGCGTACTTCCGCGGCGGGCCAAGGACGGCCGGGTCGTCGTCGCTCGTGTTCGGCCCGGCCGACGACGAGTCGGCCTTCATGGTCGGACCCTTCGAGAGCTCCCCGACGCCGCGGTCCGGCGGCGGCAGGAAGCGTAGCCGCGCCACCGCCGGCTTCCACGGCGGCGGGCCGGCCAACGGCGTCGAGAAGAAGGAGAAGCAGCGCCGCCTGCGGCTCACCGAGAAGTACAACGCCCTCATGCTCCTCATCCCCAACCGCACCAAGGAGGATAGAGCGACGGTGATCTCAGACGCGATCGAGTACATCCAGGAGCTAGGGAGGACGGTGGAGGAGCTGACGCTGCTGGTGGAGAAGAAGCGGCGGCGGAGGGAGATGCAGGGGGACGTGGTGGACGCGGCGACGTCGTCGGTGGTGGCGGGGATGGATCAGGCGGCGGAGAGCTCGGAGGGCGAGGTGATGGCGGCGGCGGCGATGGGCGCGGTGGCACCGCCGCCGCGGCAGGCGCCGATCCGGAGCACGTACATCCAGCGGCGGAGCAAGGAGACGTTCGTGGACGTGCGGATCGTGGAGGACGACGTGAACATCAAGCTCACCAAGCGCCGCCGCGACGGCTGTCTCGCCGCCGCGTCGCGCGCGCTGGACGACCTCCGCCTCGACCTCGTCCACCTCTCCGGCGGCAAGATCGGCGACTGCCACATCTACATGTTCAACACCAAGATTCATTCGGGATCTCCAGTGTTTGCAAGTGCAGTGGCCAGCAGGCTGATTGAAGTGGTGGATGAGTACTAACTAGCTCGAGCTAGCTAATTAGCCGACCGACCGATCGATATGATGAAAGTTTCTATGTTGCTAGCTAGCTAGGGTTCTTGGATGCATGAGTACTGAGTAGCTCTTTAATTAATTTCCTTTTAATTTTAGACTGTTTAATTTGGATTGGTAAAGACTCGTGTTAGCTTTTGGGAGATCTTTGGTATGTCATGGTTTGCATGTATTATTTTGGTCTACTTGGATAAATAATTGATGCTCTTTGAGACGTTAATTAAT.

bHLH142的氨基酸序列如下所示：

SEQ ID No.2

MYHPQCELLMPLESLEMDVGQSHLAAAVAAAMPGELNFHLLHSLDAAAAAASSTAASASSQPTVDYFFGGADQQPPPPAAMQYDQLAAPHHHQTVAMLRDYYGGHYPPAAAAAAATEAYFRGGPRTAGSSSLVFGPADDESAFMVGPFESSPTPRSGGGRKRSRATAGFHGGGPANGVEKKEKQRRLRLTEKYNALMLLIPNRTKEDRATVISDAIEYIQELGRTVEELTLLVEKKRRRREMQGDVVDAATSSVVAGMDQAAESSEGEVMAAAAMGAVAPPPRQAPIRSTYIQRRSKETFVDVRIVEDDVNIKLTKRRRDGCLAAASRALDDLRLDLVHLSGGKIGDCHIYMFNTKIHSGSPVFASAVASRLIEVVDEY

由于bHLH蛋白表征为TF，我们假设bHLH142定位在细胞核中。为了验证其亚细胞定位，我们构建了在35S启动子和nos终止子的控制下的绿色荧光蛋白基因(GFP)和bHLH142的融合基因以用于在水稻叶叶肉原生质体中瞬时表达(图5C)。作为阳性对照，还使用相同的调控元件将NLS序列与红色荧光蛋白(RFP)基因融合。将这些构建体通过粒子轰击导入水稻原生质体中。如所预期的，只有GFP构建体在核质中以及原生质体中发现游离GFP。但是，bHLH142:GFP融合蛋白和阳性对照NLS:RFP专一性地定位在细胞核中(图5D)。这些结果确认，作为TF，bHLH142蛋白定位在细胞核中。

系统发育分析

为了理解在各种有机体中bHLH142的进化关系，我们使用全长bHLH142蛋白序列来NCBI BLAST数据库，从10个不同的陆生植物检索到21个含有bHLH结构域的同源物。系统发生树显示UDT1(bHLH164)和TDR1(bHLH5)在同一簇中，而bHLH142和EAT1(bHLH141)进化并多样化成两个单独的进化枝。系统发生分析还表明，bHLH142遗传自共同的单子叶植物祖先。水稻bHLH142与来自二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、粟(Setaria italica)、乌拉尔图小麦(Triticum urartu)、玉米(Zea may)、高粱(Sorghum bicolor)和节节麦(Aegilops tauschii)的相关蛋白享有高相似性(图6)。来自重要谷类作物(例如玉米、粟、高粱和小麦)的bHLH142的保守性同源物与水稻对应物在氨基酸序列上享有84.1％、79.2％、72.2％和78％的相似性(表5)。玉米同源物，GRMZM2G021276，在不成熟的穗和减数分裂穗以及花药中高度表达。一致的是，我们的RT-PCR资料也验证了玉米同源物在减数分裂花药中组织特异地表达(图14)。该结果暗示，玉米bHLH142同源物还可以在花药和花粉发育中起类似作用。

表5

作物	登录号	氨基酸相似性
			高粱	XP 002457706	72.2％
玉米	ZmLOC100283549	84.1％
			小麦	EMS50437	78.0％
粟	XP_004967599	79.2％
			短柄草	XP_003567568	80.7％

bHLH142的表达模式

使用WT的RT-PCR和qRT-PCR分析显示，bHLH142mRNA仅在水稻幼穗中累积，而不在其他组织(例如根、芽、叶、外稃、内稃、子房和种子)中累积。特别是，在发展中的穗中发现高水平的转录物(图7A和7B)。具体而言，在减数分裂阶段bHLH142转录物在小孢子母细胞(MMC)中高度表达，在花药中极其高度表达(图7C)。另外，原位杂交(ISH)清楚地证明，在减数分裂早期bHLH142在花药中特异性表达，而在WT小穗的外稃和内稃中不特异性表达(图7D)。ISH和在不同发育阶段WT花药的横截面显示了在减数分裂早期的绒毡层中和在减数分裂阶段过程中在绒毡层和小孢子母细胞中的阳性信号，在小孢子幼期信号减弱，在液泡化的花粉阶段之后信号可忽略。令人感兴趣的是，还在脉管细胞中检测到ISH信号(图8)，表明bHLH142的靶基因还与花药中的营养获取有关。相反，在ms142的无效突变体的花药中没有检测到ISH信号(图8)。

另外，通过qRT-PCR检查到的在WT和ms142的花药中各种已知花药调节基因的表达模式，确认了bHLH142转录物在ms142无效突变体中的敲除(图9A)。另外，相对于WT花药，在ms142花药中TDR1、bHLH141(EAT1)、AP37、AP25,CP1,CYP703A3,CYP704B2、MS2和C6的表达显著下调(图9E，9G-9M)。但是，在MMC和减数分裂阶段MSP1和UDT1转录物在突变体中上调(图9B-9C)。在ms142的GAMYB转录物方面没有显著的变化(图9D)。令人感兴趣的是，与其他下游基因相比，在ms142中TDR1的表达受抑制较少(图9E-9M)。在WT花药中，bHLH142转录物在减数分裂过程中更丰富，但是在ms142无效突变体中可忽略。令人感兴趣的是，EAT1突变体还在减数分裂阶段过程中显示较低量的bHLH142 mRNA(图10)。我们还比较了这些突变体中EAT1mRNA的表达，以更了解这些TF在花粉发育中的调节性相互作用。在WT中，EAT1的表达(在小孢子幼期)比bHLH142(在减数分裂阶段)稍迟(图10)。令人感兴趣的是，在MMC时ms142花药显示了与WT花药相似量的EAT1mRNA，但是在小孢子幼期趋于降低(图10)。总之，这些数据表明，在花药和花粉发育的调节回路中bHLH142在UDT1的下游但EAT1的上游起作用。

bHLH142和TDR1协调地调节EAT1启动子活性

基于不同突变体中的已知花粉调节基因的表达的变换(图9和图10)，我们推测bHLH142可能调节EAT1启动子活性并且用EAT1_pro-Luc构建体执行瞬时启动子检验。我们的结果证明bHLH142或TDR1蛋白单独不能独立地驱动EAT1_pro-Luc的表达。但是，当组合时这两种TF蛋白在一起将来自EAT1启动子的Luc表达显著地增加了最多30倍。但是，EAT1在同一细胞中的另外表达(additional expression)将Luc表达从30倍增加减少至18倍增加，据推测归因于EAT1和bHLH142在与TDR1结合时的竞争(图11)。显然，TDR1和bHLH142共调节EAT1启动子的活性。

bHLH142、TDR1(bHLH5)和EAT1(bHLH141)中的蛋白相互作用

我们进行了酵母双杂交分析来确定作为诱饵的bHLH142是否与猎物TDR1或EAT1相互作用。如之前报道过全长EAT1和TDR1蛋白天然地拥有自激活活性^23，24，我们的Y2H研究也确认了该现象(图12A)。因此，我们构建了截短的EAT1^Δaa(1-254)(在氨基酸1–254处截短的EAT1)和TDR^Δaa(1-344)(在1–344处截短的TDR氨基酸)以消除自激活(图12A)。我们的结果显示，bHLH142不自激活(图12A)；仅共表达bHLH142和TDR^Δaa(1-344)的酵母菌株在严谨选择培养基中正常生长(图13A)，并且在bHLH142和EAT1^Δaa(1-254)之间没有直接的相互作用。因此，如在酵母细胞中所证明的，bHLH142不与EAT1直接相互作用(图13A)，并且TDR1的C末端序列的保留足以赋予两种蛋白的相互作用。显然，TDR^Δaa(1-344)和EAT1^Δaa(1-254)中的氨基酸序列含有相互作用位点，与之前的研究²⁴一致。这些结果进一步得到EAT1启动子检验的我们的结果的支持，即对于EAT1的转录同时需要bHLH142和TDR1(图11)。此外，双分子荧光互补(BiFC)检验显示，黄色荧光蛋白(YFP)信号仅在共表达NYN1-bHLH142和CYN1-TDR1的水稻细胞的细胞核中和在共表达NYN1-TDR1和CYN1-EAT1的细胞中检测到，但在共表达NYN1-bHLH142和CYN1-EAT1的细胞中未检测到(图13B)。bHLH142和TDR1蛋白的体外相互作用通过共免疫沉淀(Co-IP)实验得到进一步验证，所述实验中融合有HA的TDR1与bHLH142的相互作用得到确认(图13C和13D)。总之，所有这些分子数据提供了TDR1和bHLH142之间的物理相互作用的确凿证据。

RNAi转基因水稻系验证bHLH142在花粉发育中的作用

为了进一步验证bHLH142的生物学功能，我们产生了RNA干扰(RNAi)构建体来抑制水稻中bHLH142的表达。将来自bHLH142的5’UTR的基因特异性区域扩增，使其与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)内含子融合并将其通过根癌农杆菌导入至WT愈伤组织中。获得的所有16个T0RNAi转基因系都具有与T-DNA突变体ms142相似的MS表型。如通过RT-PCR检查过的，这些RNAi系显示减少的bHLH142表达，并且产生了发育不良的花药且没有花粉粒(图14)。该结果进一步支持bHLH142在水稻花药和花粉发育中起关键作用的观点。RNAi片段(SEQ IDNo.120)：

caacaaacctagttaatttagctctagttggttcatccctgctgcactgcgagctcaagtaatcgatctgagctctgaagaaaaaggtggtagagtgcgaggaagatgtatcacccgcagtgcgagctcctgatgccgcttgagagcct

过表达bHLH142引起雄性不育

对于功能性基因组研究，我们构建了通过组成型表达泛素启动子驱动的过表达bHLH142(图15A)并经由根癌农杆菌引入野生型(TNG67背景)愈伤组织³⁸。基因组PCR确认了靶基因的T-DNA插入和选择标志物潮霉素(下图)。PCR在23个所测试的T0转基因系中具有带(图15B)。

令人感兴趣地观察到过表达bHLH142 T0转基因植物都显示稻粒不育性(图16)。Ubi::bHLH142转基因系具有相似的植物类型和穗长度(图16B和16C)，除了WT在开花阶段后没有稻粒填充(图16A)。观察到过表达转基因系花药比WT短，并显示浅黄色(图16D)。种子成熟阶段后，WT的稻粒填充有淀粉，但是在那些过表达系中没有可见的种子(图16E和16F)。

通过使用RT-PCR，我们在水稻中检测到与花粉发育有关的一些调节基因。如所预期的，在花药发育的各种阶段期间过表达系组成型地表达大量的bHLH142转录物。令人感兴趣的是，Udt1在过表达系中同时上调。EAT1 mRNA也在减数分裂阶段之前过早地上调，但在花药发育后期减少其表达。但是，MS2在过表达系中显著下调(图17)。据推测过表达系中的稻粒不育性缺陷归因于诸如UDT1²⁰和EAT1²³等绒毡层程序化细胞死亡基因的上调。此外，据报道有助于花粉外壁发育的MS2的下调可能与过表达系中的花粉发育缺陷相关。

在玉米中异源过表达bHLH142赋予雄性不育

由于bHLH142与玉米具有高同一性³⁸，从玉米ZmLOC100283549(表示为Zm-142)的同源物设计基因特异性引物组。RT-PCR表明Zm-142在诸如叶、根、茎和雄蕊等玉米的植物器官中不表达。令人感兴趣的是，Zm-142在1mm～7mm长度的小花中特异性表达，但在后期和在成熟花粉中不能检测到(图18)。Zm-142的表达模式与bHLH142相似³⁸。

因此，我们使用农杆菌介导转化法(agrobacterium-mediated pollentransformation method)利用与图15A中的过表达bHLH142的相似的构建体，转化到玉米中(在栽培种Crystal White的背景下)。一个转基因玉米显示明显的雄性不育性表型，具有比WT(图19A，左图)较小的雄穗分枝角度(图19A，右图)。开花阶段期间雄穗，WT具有比转基因系大的花药，并且在开花阶段期间具有正常开放的小穗和花丝延伸(图19B，左图)。但是，转基因玉米的花药尺寸显著较小，并且花药完全不延伸花丝(图19B，右图)。开花前一天的WT的小穗形态示于图19C中(左图)，具有长且胖的花药，但是转基因系的花药较短并且皱缩(图19C，右图)。将玉米成熟花药颗粒用I₂/KI溶液染色，可育性WT花药颗粒被染上暗红色。但是，转基因系的花粉不能被染色，并且由于无淀粉累积而是透明的。这暗示转基因系是雄性不育的(图19D)。

异源过表达bHLH142诱导在低温下诱导可恢复的雄性不育

bHLH142过表达的植物在夏季也显示完全的雄性不育表型(图20，左图)。与之相反，在冬季低温条件下，过表达转基因系的花药在子房室内产生许多花粉粒，它们的花粉粒能够被I₂/KI溶液染色，表明该植物恢复了育性(图20，右图)。因此，我们的靶bHLH142的该新型功能性质相对于用于杂交作物生产的其他遗传MS(GMS)基因是大优点。该可恢复的花粉育性性状使得其在生产杂交作物种子时更期望，原因在于仅需一次杂交而像利用细胞质MS(CMS)那样保持MS系的种子储备库。另外，在产生转基因系时相对于抑制途径已知生物技术公司优先采用过表达途径，因为过表达系比RNAi或反义敲弱系更稳定。

水稻bHLH142在玉米、高粱和小麦中具有同源物，并且他们与水稻对应物在氨基酸序列方面共享大于70％的相似性(表3)。这对于基因工程化F1代杂交种生产的雄性不育和产生在谷类作物的生长和籽粒产量方面的杂交优势(杂种优势)是有益的。

bHLH142是水稻花药发育的新型主要调节子

迄今为止，已经显示bHLH TF中的三种在水稻中参与花粉发育，并且这些TF基因的突变都导致完全的MS，包括UDT1(bHLH164)²⁰、TDR1(bHLH5¹⁴和EAT1/DTD1(bHLH141)^23，24。它们都通过调节绒毡层PCD而在花粉发育中起重要作用。在该研究中，我们鉴定了新型水稻MS突变体，ms142(图1)，其在bHLH142的内含子中插入有T-DNA，该内含子编码含有TF蛋白的另一碱性螺旋-环-螺旋二聚化区域bHLH结构域。该表型的特征在于具有小的花药而没有花粉粒发育(图1)。基因分析表明，突变归因于单个T-DNA插入事件。我们还指出该TF位于细胞核中(图5)，并且在调节水稻花粉发育中起关键作用。在无效突变体中对花药发育进行关闭解剖学检查，平行地进行DNA降解的TUNEL检验和对关键基因转录物进行ISH，证明了小孢子发育中的缺陷与绒毡层PCD缺陷相关。绒毡层细胞的及时降解对于活花粉发育而言是至关重要的。此外，在WT水稻中通过RNAi抑制bHLH142的表达赋予了MS表型(图21)。因此，本发明鉴定了另一bHLH TF参与水稻中以及类似地参与其他植物中的花粉发育的动态调节。

我们对参与花粉发育的已知调节基因的表达谱进行的分析证明了在ms142中在花粉发育期间诸如TDR1、EAT1、AP37、CP1、C6、MS2等数种基因的下调(图9)。因此，我们提出bHLH142以更高的基因级联(gene hierarchy)参与花药发育的相同调节途径(图10)。早期研究报道了TDR1正向调节CP1和C6¹⁴，而最近的研究提出EAT1在调节两种天冬氨酸蛋白酶基因AP25和AP37的表达时与TDR1相互作用²³。另一研究还报道了水稻中DTD(与EAT1、bHLH141相同)的突变产生严重的MS²⁴。与该报道一致，我们还发现NIAS Tos17突变体H0530(敲除EAT1(bHLH141)基因)，不能产生花粉(图10B)。但是，eat1/dtd突变体显示了正常的减数分裂过程，但ms142不能超过减数细胞分裂，这可能归因于bHLH142所起的额外作用。与该观点一致，我们的ISH分析揭示，除了绒毡层植物，bHLH142还在小孢子母细胞中以及在维管束中表达(图8)。该结果表明，bHLH142还可能在用于小孢子发育过程中的细胞板形成的营养物质获得中起另外的作用。

本发明揭示除了UDT1(bLHL164)、TDR1(bLHL5)和EAT1(bHLH141)之外，对于花粉发育bHLH142在bHLH TF家族中作为另一关键因子。我们的诱变分析表明bHLH142的基因级联是在Udt1(bHLH164)的下游但在TDR1(bHLH5)和EAT1(bHLH141)的上游(图10和图9)。令人感兴趣的是，所有这4种bHLH TF都在花药中组织特异性地表达，并且参与随后的花粉发育事件中的重要过程，特别是在绒毡层PCD中。因此，其相当独特之处在于数种bHLH TF在调节花药发育中协调作用，并且可能更多的TF参与控制调节性网络以确保正常的花粉发育。

另外，我们注意到与调节网络中的其他下游基因相比，在ms142中TDR1的表达受抑制较低，这可能够归因于还已知TDR1被另一TF GAMYB调节的事实²²。一致的是，我们还发现GAMYB的表达在ms142中不改变(图9)。总之，这些结果表明在花粉发育过程中在产生TDR1的调节回路中可能存在两种平行的途径。

bHLH142与TDR1协调地起作用来调节EAT1启动子

由于TDR1和EAT1mRNA在ms142中都下调，我们假设TDR1与bHLH142相互作用，并且对于编码用于绒毡层PCD的天冬氨酸蛋白酶的AP25和AP37的转录活性而言正向调节EAT1启动子。我们的启动子瞬时检验提供了bHLH142和TDR1在调节EAT1启动子上协同工作的确凿证据(图11)。我们还证明EAT1蛋白的另外表达将EAT1-Luc启动子的强度从30倍增加显著地减少至18倍增加(图11)，这可能归因于bHLH142和EAT竞争与TDR1的相互作用。据推测，更多的EAT1有利于TDR1-EAT1相互作用，并从而可能减少bHLH142和TDR1之间的相互作用，因此减少EAT1转录活性(图11)。可能bHLH142与TDR1相互作用，而TDR1进而与EAT1相互作用，并且bHLH142不与EAT1直接相互作用(图13)。是否需要某些其他TF来调节bHLH142的转录，这对于阐明整个调节级联是值得进一步调查的。

我们的分子研究提供了bHLH142和TDR1可以形成蛋白相互作用的体内(Y2H,BiFC)和体外(co-IP)的确凿证据(图13)。co-IP提供两种蛋白在体外物理地相互作用的最可信的证据。亚细胞定位也证明了bHLH142蛋白定位在细胞核中(图5D和13B)，并且其蛋白不自激活(图13和图12)。由于我们还在我们的Y2H实验中发现全长TDR1的自激活(图12)、TDR^Δaa(1-344)和EAT1^Δaa(1-254)的N末端截短形式也在我们的实验中使用以减少自激活。这两种N末端截短蛋白形式在酵母细胞中不显示自激活(图12A)。因此，我们通过使用这些截短蛋白来消除偏差而确信bHLH142与TDR1相互作用(图13)。我们的数据指出bHLH142与TDR1在C末端相互作用(图13)，并且支持了之前研究的结论，因为DTD/EAT1(bHLH141)与TDR1在C末端区域相互作用²⁴。换言之，bHLH142和EAT1(bHLH141)可以与TDR1在TDR1的C’末端相互作用。该发现还支持了我们的EAT1启动子检验的结果，其中另外的EAT1蛋白减少EAT1启动子活性，据推测这归因于在TDR1的C’末端中bHLH142和EAT1蛋白之间的竞争。基于该工作和之前的工作，水稻花粉发育的当前调节网络示于图21中。使用各种水稻MS突变体的之前工作提出，UDT1和GAMYB可以正向调节TDR1的转录²²，并且TDR1进而控制C6和CP1的转录¹⁴。最近的研究提出来下述证据：TDR1为了其直接调节两种天冬氨酸蛋白酶基因的表达以引发绒毡层PCD而与EAT1相互作用²³。在本发明中，我们证明bHLH142作用在UDT1的下游，但在TDR1和EAT1的上游，然后bHLH142在激活EAT1转录时与TDR1相互作用(图21中由红色箭头指示)。此外，我们指出EAT1直接地正向调节AP37和CP1的转录，两种蛋白在花粉发育后期参与绒毡层PCD。

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Claims

1.一种制备可恢复雄性不育转基因植物的方法，所述可恢复雄性不育转基因植物中转录因子bHLH142过表达，所述方法包括：

(a)构建包含bHLH142的DNA序列和强启动子的质粒；和

(b)向靶植物中导入所述质粒。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述植物的育性在低温下恢复。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述植物是单子叶植物。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述单子叶植物是水稻、玉米、小麦、粟、高粱或二穗短柄草。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述植物是双子叶植物。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述双子叶植物是拟南芥或芸薹属种植物。

7.如权利要求1所述的方法，其中，所述bHLH142的DNA序列是SEQ ID No.1。

8.如权利要求1所述的方法，其中，所述强启动子是泛素启动子、CaMV 35S启动子、肌动蛋白启动子、花药绒毡层特异性启动子或花粉特异性启动子。

9.如权利要求1所述的方法，其中，通过根癌农杆菌将所述质粒导入所述靶植物的愈伤组织中。