CN105986019A - 一种水稻广亲和隐性核不育系的鉴定与利用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物分子育种领域，涉及一种水稻广亲和隐性核不育系的鉴定与利用方法。利用籼稻“特青”和广亲和品种“02428”构建重组自交系，筛选育性特征的自交系，培育筛选新的不育系RI127S，该不育系可用于水稻轮回育种的中间材料。优点是：1)雄性不育系的不育性为隐性基因控制，其不育性在正常生长条件下不受光长和温度影响，是水稻理想轮回选择中间材料。2)不育系RI127S不仅带有广亲和基因，而且其基因组是籼稻和粳稻品种的混合体，与籼、粳稻杂交，杂种均为可育，F1结实率籼稻为85％，粳稻为80％；3)自交系RI127本身具有高产性能，可做优良品种的亲本，作不育系可省去人工去雄杂交工序。

Description

一种水稻广亲和隐性核不育系的鉴定与利用方法

技术领域

本发明涉及的水稻育种技术领域，具体涉及一种广亲和隐性雄性核不育系在水稻育种中的利用。

背景技术

育性是水稻的重要性状，在水稻生产上有着重要的意义。水稻雄性不育的研究最早于二十世纪20年代，自60年代以来，许多不同遗传类型的水稻雄性不育材料被发现，大部分为隐性核不育，如光温敏雄性核不育。而对水稻雄性核不育基因的定位，上世纪七八十年代则主要是通过水稻三体和性状标记分析判断基因所在染色体，如隐性核不育基因ms-1、ms-7、ms-8、ms-9、ms-10和ms-14(Khush G S et al.,1991)，现在主要应用分子标记构建遗传连锁图谱的方法进行定位基因，如光敏不育基因PMs1和PMs2(Zhang et al.,1993)。

雄性不育系是指一种雄性生殖器官发育异常或退化(主要是花药或者花粉退化)但是雌性生殖器官发育正常的母本水稻材料，由于花药或花粉早期发育异常造成无花粉型或无生活力花粉，不能自花授粉结实，只有依靠外来花粉才能受精结实，因此借助这种水稻作为遗传工具，通过人工辅助授粉的方法，就能产生大量杂交种子。目前，光、温敏核不育系是杂交水稻最成功的遗传工具，光温敏两系杂交水稻不需要保持系，种子生产简单，生产成本低，两系杂交稻亲本间无恢复系和保持系的限制等优点，但是光温敏核不育系的一系两用，其育性受光温条件所左右，育性不稳定，易产生波动，在光温条件不好的年份两系水稻的制种和繁种都存在一定风险。迄今已育成的光温敏雄性核不育系其核不育基因来源于粳型农垦58S、籼型安农S-1、5460S、衡农S-1、新光S、株1S等，它们的遗传背景较复杂，育性遗传不稳定，因此这些不育系的应用受到很大的限制。

籼稻和粳稻之间亲缘关系较远，亚种间杂交存在着巨大的育种潜力，其杂种F1在产量、品质和抗逆性等方面具有很强的杂种优势。然而，由于籼粳杂交的半不育特性，籼粳杂种优势在实际应用上遇到很大困难，包括株高偏高、花期不遇、结实率低等一系列问题，其中最主要的是籼粳杂种F1代结实率较低，多数杂种的结实率在5％-40％之间。在亚洲栽培稻杂交亲和性的系统研究中，Morinaga和Kuriyama(1958)发现印度的Aus群(秋稻生态型)和印度尼西亚的Bulu群(布鲁生态型)的一些品种与籼、粳亚种杂交都表现有一定的亲和力，所以认为亚洲栽培稻中除籼粳两亚种外还存在中间类型。随后，日本学者Ikehashi和Araki(1984)对74种不同生态型水稻品种间杂交结果进行研究，发现某些水稻品种与籼粳杂交，杂种都表现为可育，他们将这些特殊的水稻品种称为广亲和品种(Wide Compatibility Vatiery,简称WCV)，而控制广亲和性的基因称为广亲和基因(Wide Compatibility Gene)，简称WCG。广亲和品种的发现使得亚种间杂种优势的利用成为可能。Ikehashi和Araki(1986)在筛选广亲和品种和研究广亲和基因的同时，对利用广亲和基因克服籼粳亚种间杂种的不育性进行了探索。他们认为，广亲和基因在杂交水稻育种中的应用是克服杂种不育性的一种有效途径。Yang等(2012)从分子水平阐明了水稻S5位点杂种不育及广亲和的机理，对亚种间杂交水稻育种有重要参考价值。因此利用携带有广亲和基因的广亲和品种进行籼粳优良品 种杂交，利用杂种优势培育新品种将会是水稻育种的一个新方法。本发明利用籼稻“特青”和广亲和品种“02428”构建重组自交系，筛选育性特征的自交系，培育筛选构成新的不育系RI127S，该不育系可用于水稻轮回育种的中间材料。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一个突变基因(OsMADS3)在培育水稻广亲和隐性雄性核不育系中的应用，利用该突变进行培育广亲和隐性雄性核不育系水稻，其中包括在轮回选择中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种利用OsMADS3突变产生的培育广亲和隐性核水稻不育系的方法，包括下列步骤：

1)以广亲和水稻(与籼稻和粳稻杂交，杂交种都可育的一类材料)品种02428与籼稻品种特青杂交，通过自交一代获得F2代，再通过单粒传法构建重组自交系，在F6代的家系中得到育性性分离的家系RI127，其分离比可育单株与不育单株的比例为3:1，对家系RI127用基因组上150对标记其基因型进行鉴定，得到RI127家系中的不育单株RI127S；

2)利用RI127家系中不育单株RI127S作母本，以水稻明恢63作父本杂交得到F1代，自交一代得到育性分离的F2群体,提取F2群体单株的总DNA，取10株可育单株的总DNA等量混合作为可育池模板，取10株不育单株的总DNA等量混合作为不育池模板，利用Gramene网站上常用SSR标记为引物进行PCR扩增，将扩增所得的产物通过聚丙烯酰胺凝胶检测，筛选得到多态性标记引物RM580；以该多态性标记RM580为引物，以F2群体所有单株为模板进行PCR，将所得的扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶检测，结合单株表型，将控制该育性性状的基因定位在水稻1号染色体的5.5Mb-5.9Mb区段内；对区间内育性相关基因候选基因OsMADS3进行测序，以可育池总DNA为可育模板，以不育池总DNA为不育模板，利用日本晴基因组中OsMADS3序列为参考序列设计引物，进行PCR，对PCR产物进行测序，发现OsMADS3基因在可育单株和不育单株总DNA内存在差异，以日本晴中OsMADS3的CDS序列为参考序列设计引物，提取可育单株和不育单株的总RNA，反转录成cDNA为模板，进行RT-PCR，发现OsMADS3在不育单株中不表达，在可育单株中能够正常表达。因此我们得到OsMADS3功能缺失型的不育单株作为材料继续研究；

3)针对步骤2)所得的不育单株，设计相邻的三条引物SP1、SP2、SP3(引物序列见表5)，利用步骤2)中的不育池混合总DNA的模板，首先选取引物SP1(序列见表5)为一侧引物，与一条随机引物AD2a(序列见表5)组合，以不育池混合的总DNA为第一轮PCR为模板，进行PCR，以所得的PCR产物为第二轮PCR的模板，以引物SP2(序列见表5)为第二轮PCR的一侧引物，采用相同的随机引物AD2a(序列见表5)组合进行PCR，以所得的PCR产物为第三轮PCR的模板，以引物SP3(序列见表5)为一侧引物，利用相同的随机引物AD2a组合(序列见表5)进行PCR，在所得的PCR产物中选取大于200bp的产物进行测序，最终确定OsMADS3基因的第二个外显子的282bp处被插入了一段1633bp长的序列(如图3所示)，插入序列如SEQ ID NO：1所示；

4)苗期提取不育系单株RI127S叶片的总DNA，根据上述步骤3)所述的插入位点(如图3所示)和插入序列(如SEQ ID NO：1所示)设计引物M-361F和M-820R(序列见表6)、InsertF1(序列见表6)和 1639R1(序列见表6)，利用PCR扩增不育系RI127S的总DNA，根据出现条带鉴定RI127S不育系的基因型：野生可育型的基因型引物M-361F和M-820R能扩增出208bp的条带，不育基因型只有InsertF1和1639R1能扩增出1.7kb的条带，而杂合可育型两对引物都能扩增出正确条带(参见图5)；本实验中的引物的核苷酸序列见表6所示；

5)以不育单株RI127S作母本，以水稻籼稻和粳稻分别作父本授粉杂交，观察F1代的结实率；

6)将带有隐性雄性核不育基因的RI127S不育系作为轮回选择育种的中间材料培育新品种，申请人提供了一种水稻广亲和雄性核不育系在水稻轮回育种中的应用，其步骤包括：

1)选生产可得到的籼稻和粳稻中优良骨干亲本各为两个品种，分别编号为骨干品种1、2、3、4，其中籼稻中的骨干品种编号为骨干品种1、骨干品种2，粳稻中的骨干品种编号为骨干品种3、骨干品种4，将籼稻骨干品种1、2与粳稻骨干品种3、4两两同时杂交，分别得到籼稻F₁(或命名为F_1A)和粳稻F₁(或命名为F_1B)；

2)以F_1A为父本，以RI127S不育系为母本杂交得到F_1C；以F_1B为父本，以RI127S不育系为母本杂交得到F_1D，再将F_1C、F_1D分别自交一代得到F_2C和F_2D；

3)选择F_2C和F_2D中表型优良利于育种的单株，利用标记引物M-361F和M-820R、InsertF1和1639R1(引物序列见表6)鉴定出不育单株和可育单株，再分别以F_2C中的不育单株即母本花粉与F_2D中的可育单株的花粉混合后进行授粉，同时以F_2D中的不育单株即母本花粉与F_2C中的可育单株的花粉混合进行授粉，获得新的F_1N；

4)将F_1N自交，从F₂开始，采用本领域常规选择育种方法，选择农艺性状优良的可育单株，连续自交和选择3到4代，选育花期、株型、产量稳定的终端品系。

利用籼稻品种“特青”(TQ)(由广东省农科院黄耀祥院士选育和惠赠)和广亲和品种“02428”(来自江苏省农业科学院)构建重组自交系(总体技术路线见图1所示)，在F₆的一个家系RI127出现部分突变表型，即雄蕊向雌蕊不同程度的转变，最终表现出完全不育，突变型单株和野生型单株分离比为1:3，表明这个突变性状是受单个隐性基因控制，申请人将这个突变株命名为ms1。用全基因组标记鉴定RI127基因组组成，发现它拥有籼稻“特青”基因组的55％(见图2)，广亲和品种02428基因组的45％，同时还发现RI127S广亲和基因的S5(Yang等2012)染色体区段来自亲本02428，表明RI127S携带广亲和基因S5。将RI127不育单株RI127S与籼稻品种“特青”、“明恢63”(来自福建省农业科学院)和“金23(常德市农业科学研究所)”杂交，F₁结实率分别为84.6％、89.9％、94.8％，将RI127S不育单株与粳稻品种“中花11”(中国农业科学院作物科学研究所)、“日本晴”(一个公开的粳稻品种)和“牡丹江8号(黑龙江省牡丹江地区农业科学研究所)”杂交，F₁结实率分别为81.5％、80.6％和78.7％。本发明的实施例表明，本发明获得的RI127S不育单株无论与籼稻还是粳稻进行杂交均可得到可育的F₁，表明RI127S不育单株是一个广亲和雄性核不育系。同时近等基因系RI127可育单株也是一个具有高产潜力的材料，因此RI127S不育单株携带了高产基因组成，它可以用于籼稻、粳稻轮回育种的亲本材料加以利用。申请人将所得的RI127家系中的不育单株RI127S与籼稻“明恢63”单株杂交得到的F₁构建分离群体，利用图位克隆方法将该基因定位在一个374kb的区间内(见图3)，该区间包含一个影响水稻花发育的基因MADS3(LOC_Os01g10504)。通过对可育单株和不育单株比较测序后确定MADS3基因在第二外显子内有一段插 入序列，根据预测该插入序列为一个反转座子。已有文献报道4种OsMADS3突变体，mads3-1和mads3-2均是由于Tos17插入MADS3基因的C末端导致的突变，mads3-1是弱功能型的，花器官没有缺陷；mads3-2是中间功能型，插入在C末端的K功能结构域上，导致基因表达下降，而使雄蕊向浆片转化(Yamaguchi et al.,2006)。mads3-3是由于T-DNA插入MADS3基因的第二个内含子上导致的突变，它是一个强功能型的，在突变体中检测不到OsMADS3的转录，几乎所有的雄蕊在第三轮中都转化为了类似浆片的器官(Yamaguchi et al.,2006)。mads3-4是MADS3的K功能域上发生了突变，导致表达量降低，是另外一个中间功能型，突变后出现了雄性不育现象(Hu et al.,2011)。本发明中的等位突变发生在MADS3的MADS-box 功能域上，同样导致了雄性不育(见图4)。同时申请人开发了标记鉴定隐性不育单株的标记引物M-361F，M-820R(其序列见SEQ ID NO：2，3)，标记引物InsertF1(其序列见SEQ ID NO：4)和标记引物1639R1(见SEQ ID NO：5)，我们从苗期就可以鉴定出育种所需要的不育单株，从而可以大大提高选择的效率。

本发明与现有技术相比，其优点在于：

1、本发明的雄性不育系的不育性是隐性基因控制的，该雄性不育性在正常生长条件下不受环境的光长和温度影响，为水稻育种提供了非常好的轮回选择中间材料。

2、本发明的雄性不育系RI127S不仅带有广亲和基因，而且其基因组是籼稻和粳稻品种的混合体，它与籼稻或粳稻杂交，杂种均为可育，F₁结实率均可达到85％(籼稻)，80％(粳稻)。

3、本发明分离的突变体RI127本身具有高产性能，表明它不仅可以作为不育系省去人工去雄杂交的繁琐，而且在育种过程中还具备优良亲本功能。

附图说明

序列表SEQ ID NO 1：是OsMADS3基因第二外显子中的插入序列(总长度为1633bp)。

SEQ ID NO 2：是鉴定本发明雄性不育系基因型的功能标记引物M-361F的DNA序列。

SEQ ID NO 3：是鉴定本发明雄性不育系基因型的功能标记引物M-820R的DNA序列。

SEQ ID NO 4：是鉴定本发明雄性不育系基因型的功能标记引物InsertF1的DNA序列。

SEQ ID NO 5：是鉴定本发明雄性不育系基因型的功能标记引物1639R1的DNA序列。

图1：本发明的突变体RI127的构建流程图。

图2：是突变体RI127的基因组成。黑色区段为为水稻品种“特青”的基因型，白色区段为水稻品种“02428”的基因型。图中的数字1到12分别代表水稻染色体的数目。

图2中：SSR标记序列参见http://www.gramene.org/；分子标记的物理位置参考数据库Rice Genome Annotation Project Rice Genome Browser-Release 7http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/。

图3：为OsMADS3基因定位示意图和突变体插入示意图以及MADS3基因在水稻可育单株和水稻不育单株中的表达差异图。图中标记说明：Fragment 1片段是由引物M-126F和M-316R扩增得到，均在插入位点前；Fragment 2片段是由引物M-361F和M-3C-1R扩增得到，包含插入位点；Fragment 3片段是由引物M-126F和M-3C-1R扩增得到，是OsMADS3基因的全长CDS。

图4：是本发明分的离突变体RI127的表型。在图4中，图4中的A图为抽穗后可育单株与不育单株的整体照片。图4中的B图为RI127与“MH63”杂交后的F₂的分离群体中可育单株与不育单株的花器官发育 图片。图4中的C图为可育单株和不育单株花粉碘染后的图片。

图5：是利用OsMADS3基因内部标记和插入序列标记鉴定RI127基因型图。图中标记说明：M-361F和M-820R为OsMADS3基因内部标记，InsertF1为插入位点左侧引物，1639R1为插入序列上引物，两种PCR产物大小结合可以确定可育纯合型(F)，杂合型(F_H)和不育型(S)。

图6：本发明分离的的突变体RI127在水稻轮回育种中的应用流程图。

具体实施方式

实施例1：构建重组自交系，获得不育系。

根据图1所示的技术路线，将籼稻品种“特青”(广东省农科院黄耀祥院士选育和惠赠)与广亲和偏粳品种“02428”(江苏省农业科学院)杂交得到F₁，利用F₁自交一代得到F₂，从F₂中随机选取200粒种子，自交得到200个家系，每个家系选1粒种子继续自交，得到F₃，同样在F₃中每个家系选一粒种子自交，一直自交到F₆，通过单粒传法(Wang et al.,1994)衍生了177个重组自交系(见图1)，其中第127个重组自交系出现了完全不育突变单株和正常可育单株，它们的分离比为1:3；不育单株表现出雄蕊发育不正常，部分雄蕊变成了类似雌蕊的结构，或者雄蕊完全退化。将RI127用基因组上150对标记鉴定其基因型组成，发现其基因组成来自籼稻的占55％，来自粳稻的占45％。同时还发现RI127S广亲和基因的S5染色体区段来自亲本02428，表明RI127S携带广亲和基因S5(如图2所示)，表明突变体RI127的可育单株具有高产潜力，其株高、抽穗期、每穗实粒数和产量如表1所示。

表1 突变体RI127的可育单株的农艺性状考察

2008年5月，在中国，湖北武汉华中农业大学试验田网室内，以突变体RI127不育单株RI127S作母本，以三个籼稻品种“明恢63”，“特青”(来自福建省农业科学院)和“金23”(来自常德市农业科学研究所)，作父本分别进行杂交；以三个粳稻品种“中花11”(来自中国农业科学院作物科学研究所)；“日本晴”和“牡丹江8号”(来自黑龙江省牡丹江地区农业科学研究所)，作父本分别杂交，得到F₁种子，将所得的F₁种子播种在生根培养基上使其发芽，在光照时间为14小时，光暗周期上午8:00到晚上10:00为光照，晚上10:00-次日早上8:00为黑暗，光照强度为90000-100000lux，温度控制在25℃到30℃之间)生长室培养两周，将小苗从培养基中取出，送到中国海南省陵水南繁基地试验，收获种子，考察结实率，得到如表2所示的结果，证明突变体RI127的不育系RI127S与不同籼稻、粳稻杂交得到的F₁均为可育。

表2 本发明的突变体RI127的不育系RI127S与不同籼稻粳稻杂交得到的F₁结实率

本发明将所得到的水稻重组自交系127(或称为RI127)材料，命名为水稻RI127，Oryza sativa L.RI127， 于2014年12月10日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO：P201415。

本发明组织培养中使用的生根操作方法和培养基配方：

组培操作：

1)将水稻RI127的不育单株RI127S与籼稻粳稻做杂交得到的F1种子去除颖壳。

2)用75％乙醇溶液漂洗1min，漂洗过程中需要不断振荡。

3)用1.5‰浓度的HgCl₂漂洗18min，大约每隔3min振荡一次。

4)用灭过菌并放凉的ddH₂O漂洗3～5次，去除表面残留的HgCl₂。

5)将处理好的种子放入生根培养基上，于光培养室培养，约半个月后可长成完

整植株，再移入田间。

生根培养基：

加H₂O 1000ml并用1N KOH调节pH到5.8，煮开后分装到生根管中，封口膜封口灭菌。

培养基配方：

1)MSmax(10×)

NH₄NO₃16.5g

KNO₃19.0g

KH₂PO₄1.7g

MgSO₄·7H₂O 3.7g

CaCl₂·2H₂O 4.4g 或 CaCl₂3.32g

逐一溶解药品后，加dH₂O定容到1000ml。

2.MSmin母液(100×)

KI 0.083g

H3BO30.62g

MnSO·4H₂O 2.23g 或 MnSO4·H₂O 1.69g

ZnSO₄·7H₂O 0.86g

Na2MoO₄·2H₂O 0.025g

CuSO₄·5H₂O 0.0025g

CoCl₂·6H₂O 0.0025g

注意：Na₂MoO₄必须单独溶解后再与其它组分混合。

加dH₂O定容到1000ml室温保存。

3.Fe²⁺-EDTA(100×)

取一个烧杯加300ml dH₂O以及FeSO₄·7H₂O 2.78g；在另一个烧杯中也加300ml dH₂O加热到70℃后加入Na₂EDTA·2H₂O 3.73g；待到两种药品都溶解了，混合，70℃保温2hr，然后加dH2O定容到1L，4℃保存。

4.维生素(100×)

加dH2O定容到1000ml 4℃保存。

实施例2：雄性不育基因的图位克隆。

具体步骤如下：

(1)定位群体：将突变体RI127的不育系RI127S与籼稻品种“MH63”杂交，从自交一代中获得F₂的分离群体，用来进行雄性不育基因的定位。通过田间性状调查表明：不育单株：可育单株分离比为1:3，不育单株表现出雄蕊发育不正常，部分雄蕊变成了类似雌蕊的结构，或者雄蕊完全退化，如图4所示。

(2)水稻总DNA提取：DNA抽提方法参考CTAB法(见Zhang等，genetic diversity and differentiation ofindica and japonica rice detected by RFLP analysis,1992，TheorAppl Genet,83,495-499)。

(3)混合集团分析(bulked segregant analysis)定位目标基因：随机选取水稻12条染色体上120个(每条染色体上选取10条)SSR标记进行扩增反应，发现1号染色体上的SSR标记RM580与OsMADS3座位连锁，选取附近的标记SSR标记引物RM576，在F₂代分离群体中作进一步验证，证明都与OsMADS3连锁，最终将OsMADS3定位在SSR标记RM1118和RM10353之间，发现RM1118就在OsMADS3内部。本发明中所用到的SSR标记信息全部来自于Gramene网站数据库(http://www.gramene.org/)。

(4)OsMADS3基因的克隆：对OsMADS3基因进行比较测序，对RI127正常可育单株和不育单株的OsMADS3基因的全基因组包含启动子共12kb进行测序，以确认RI127中OsMADS3基因是否含有等位基因型之间的差异。为了保证测序的准确性，每个扩增片段测3个重复。其中有一个CAD7引物(见序列表SEQ ID NO：2和3)在RI127S中没有扩增到产物，因此将其他所得的扩增产物进行测序，将得到的测序片段使用Sequencher 3.1.2软件(Gene Codes Corporation,美国)分别进行序列拼接。测序结果表明，能扩增到的区段都没有差异，推测在CAD7这段序列中可育单株RI127和不育单株RI127S之间存在差异，推测插入了一段序列。而该序列的插入导致了该基因功能在控制花器官发育中的功能被破坏，于是我们将这个突变的基因命名为osmads5。

(5)测序方法：首先，抽提上述RI127正常可育单株和不育单株RI127S叶片的总DNA，利用CTAB法稍作改进。具体步骤如下：取水稻植株叶片0.2克放到研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉末状，装入2ml离心管，加入700ul 100℃预热的1.5×CTAB溶液于离心管中，小心混匀后放入56℃水浴，30min 后取出离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(体积比为24：1)，猛烈混匀，离心(13000rpm)10min，取上清于新的离心管中，加入900ul无水乙醇混匀后-20℃放半小时以上。将析出的DNA离心，14000rpm(10min)。去上清，沉淀用1ml 70％乙醇清洗一次，离心干燥，溶于200ul水中，4℃冰箱保存。利用14对PCR产物相互部分重叠的引物(见下所述)，采用高保真度的LA-Taq从这两个植株的基因组汇总进行PCR扩增(PCR反应总体系为20μl，具体配法为：DNA第一链模板1μl，10×PCRbuffer 2μl，2mM dNTP 1.6μl，25mMMg²⁺1.5μl，双向引物各0.4μl，LATaq酶0.2μl，加双蒸水至20μl。所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、LATaq酶均购自宝生物工程大连有限公司产品。PCR反应条件如下：94℃4min，(94℃30sec，58℃30sec，72℃50sec)×35cycles，72℃7min，4℃保存。然后，取5μl的PCR产物做测序前的消化反应。利用20U的EXOI(Biolabs公司产品)0.25μl，2U的SAP(宝生物工程大连有限公司)0.13μl以及10×PCR buffer(宝生物工程大连有限公司)0.3μl，在37℃反应，使PCR产物消化1小时，80℃水浴10min终止反应。最后，利用美国PE公司的测序试剂盒BigDye Terminator Cycle Sequencing v2.0和ABI 3730测序仪(美国ABI公司产品，按照说明书操作)分别从每个PCR产物两端测序。

表3 测序引物的DNA序列(上海生工生物技术有限公司合成)

(6)OsMADS3基因在突变体中的表达

本发明中所对应的OsMADS3基因(LOC_Os01g10504)，从Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/ORF_infopage.cgi)上得到CDS的序列设计引物。通过常规的RT-PCR方法(参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，北京，2002版)。从突变体RI127中的可育单株和不育单株的开花前三天的穗组织中雄蕊扩增，cDNA的具体扩增方法如下：

1)先将突变体RI127中的可育单株和不育单株RI127S的开花前三天的穗组织中取雄蕊的RNA，RNA抽提使用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)。

2)RT-PCR中反转录合成cDNA第一链：配混合液1：总RNA 2μg，DNaseI 2U,10x DNAseI buffer1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在25℃放置15min以除去DNA，15min后将混合液1置于65℃水浴中温浴10min以去除DNAse I活性，然后置于冰上5min；向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligdT，10mM dNTP mixture1μl，25mMEDTA1μl，将在冰上冷却的混合液1立即置于65℃水浴中温浴10min，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5min，配混合液2；将混合液110μl，5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，RRI1μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时；反应结束后将混合液2置于70℃水浴15min，-20℃保存反应最终产物。反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司。

3)根据NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的该基因全长cDNA序列，设计特异引物PCR扩增特异片段。根据插入序列的位置设计引物，目的是检测在突变体中OsMADS3基因的表达情况。引物的DNA序列如表4所述：

表4 检测突变体中OsMADS3基因的表达情况(引物的DNA序列)

PCR反应总体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCR buffer 2μl，2mM dNTP 1.6μl，25mM Mg²⁺1.5μl，双向引物各0.4μl LATaq酶0.2μl，加双蒸水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、LATaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：94℃4min，(94℃30sec，56℃30sec，72℃50sec)×35cycles，72℃7min，4℃保存。将PCR产物10μL于1％(w/v)0.5×TBE琼脂糖凝胶中电 泳检测，发现可育单株插入位点前后均可扩增到正确大小条带，而不育单株RI127S则只在突变位点前有带，跨插入位点的就没有条带，说明插入序列改变了OsMADS3基因正常转录，插入序列没有和OsMADS3基因一起转录，如图4中的B图所示。

实施例3 插入序列的获得和基因内部标记鉴定基因型的验证

(1)插入序列的获得

利用以水稻不育单株RI127S的总DNA为模板，进行TAIL-PCR扩增，测序，分离得到插入序列。TAIL-PCR具体方法为：首先是利用Primary PCR，体系总体积为20μl：总DNA 40ng，10×PCRbuffer 2μl，2mM dNTP 1.5μl，25mMMg²⁺1.5μl，10μM特异引物(specific primer)10.3μl，100μM AD引物AD2a(primer)0.2μl，rTaq酶0.1μl，加双蒸水至20μl。

反应程序：94℃5min；(94℃30sec；62℃1min；72℃2.5min)×5cycles；94℃30sec；25℃2min；72℃(32％ramp)，2.5min；(94℃20sec；65℃1min；72℃2.5min；94℃20sec；65℃1min；72℃2.5min；94℃20sec；45℃1min；72℃2.5min)×15cycles；72℃7min；25℃10min。然后是Secondary PCR，体系总体积20μl：上一轮PCR为模板，取1μl，10×PCRbuffer 2μl，50％glycerol 2μl，2mM dNTP 1.5μl，25mMMg²⁺1.5μl，10μM特异引物(specific primer)20.3μl，100μM AD primerAD2a 0.2μl，rTaq酶0.1μl，加双蒸水至20μl。

反应程序：94℃5min；(94℃20sec；65℃1min；72℃2.5min；94℃30sec；65℃1min；72℃2.5min；94℃30sec；45℃1min；72℃2.5min)×15cycles；72℃7min；25℃10min。最后是Tertiary PCR，体系总体积为20μl：以上一轮PCR为模板，取1μl，10×PCRbuffer 2μl，50％glycerol 2μl，2mM dNTP1.5μl，25mMMg²⁺1.5μl，10μM specific primer30.3μl，100μM AD primer AD2a 0.2μl，rTaq酶0.1μl，加双蒸水至20μl。

反应程序：94℃5min；(94℃30sec；45℃1min；72℃2.5min)×35cycles；72℃7min；25℃10min。取5μL最后一轮PCR的产物于1％(w/v)0.5×TBE琼脂糖凝胶中电泳检测，挑选有大于250bp以上DNA片段的PCR产物进行如下外切酶消化处理：5μl的PCR产物，0.25μl 20U的EXOI(Biolabs公司产品)，2U的SAP(宝生物工程大连有限公司)0.13μl以及10×PCR buffer(宝生物工程大连有限公司)0.3μl在37℃反应，使PCR产物消化1小时，80℃10min终止反应。用美国PE公司的测序试剂盒BigDye Terminator Cycle Sequencing v2.0(按说明书操作)和ABI 3730测序仪(美国ABI公司产品，按说明书操作)分别从每个PCR产物两端测序。为了保证测序的准确性，每个扩增片段测3个重复。得到的测序片段再使用Sequencher 3.1.2软件(Gene Codes Corporation,美国)分别进行序列拼接。测序结果在NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)用BLASTN工具与水稻基因组序列进行同源比对。

表5 测序引物的DNA序列(上海生工生物技术有限公司合成)

说明：AD2a引物中的括号内的碱基表示编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物，N代表碱基为A/G/C/T混合物，S代表碱基G/C混合物，W代表碱基A/T混合物。

TAIL-PCR测序结果发现399bp序列不属于OsMADS3，并且是从OsMADS3第二个外显子277bp的地方开始插入的，说明插入位点在此处。为得到全部插入序列，在399bp上设计引物RetransF2(见表4)和RetransF3(见表4)，与基因特异引物CAD7R(见序列表SEQ ID NO：2和3)分别配对扩增，分别得到600bp和677bp的片段，与之前的399bp拼在一起，用BLASTN工具作blast发现是来自第5染色体上的两个反转座子中间的一段序列，为确保得到完整的插入序列，继续用RetransF3与基因特异引物M-50R(见表4)配对扩增，得到一段723bp的序列，其中355bp是和插入序列677bp有重叠，剩下的368bp则属于OsMADS3的后面第二个内含子的序列，到此我们得到全长为1633bp的插入序列(见序列表SEQ ID NO：1)。该插入序列被预测为一个反转座子。

(2)利用基因内部标记鉴定基因型的验证

在测序OsMADS3基因过程中，我们设计的CAD7引物，在RI127两种基因型中有差异，可育的可以扩增到目的条带，而不育的则不能扩增到目的条带。在插入序列获得过程中，我们利用插入序列设计引物1639F1和1639R1，以及MADS3上插入位点两侧引物M-361F和M-820R，可进一步鉴定到可育的纯合型和杂合型的基因型，鉴定结果如图5所示。所述的引物序列如表6所示。

表6 鉴定到可育的纯合型和杂合型的基因型的引物

实施例4 不育系RI127S的应用

本发明选育的不育系RI127S具有广亲和性，该不育系与籼稻、粳稻杂交均可得到结实率较高的F₁，不受光温等环境条件影响，具有高产性能，杂交时可免去“人工去雄”的步骤，苗期鉴定可以利用本发明开发的鉴定基因型的功能标记引物进行辅助选择，因此该不育系是对提高籼稻粳稻杂交(简称籼粳杂交)获得优良性状提供了很重要的中间材料。本实施例的技术路线可参见图6，图6是申请人设计的包括本发 明的不育系RI127S应用于水稻育种的总体技术流程：首先选择籼稻和粳稻优良育种亲本各两个骨干品种(这些“骨干品种”都是可以得到的，在生产上具有优良性状的品种，对于本领域的技术人员而言按照通用的标准选择作为本实施例的“骨干品种”并不困难，为描述方便，申请人将这些“骨干品种”分别命名为“骨干品种1、2、3、4”，是指代不同的品种，但是都是来源于优质和高产品种的材料)，编号骨干品种1、2、3、4，其中骨干品种1与2配对使用，骨干品种3与4配对使用，按照常规杂交方法分别得到籼稻杂交F₁(或称为F_1A)，粳稻杂交的F₁(或称为F_1B)；以F_1A和F_1B分别作父本，以本发明的不育系RI127S作母本，以F_1A和RI127不育系杂交的，得到F_1C，以F_1B和RI127不育系杂交的，得到F_1D；之后再分别自交一代得到F_2C和F_2D；选择F_2C和F_2D中表型优良利于育种的单株，利用本发明开发出的功能标记引物(见表6)鉴定其中的不育单株和可育单株，分别以F_2C中的不育单株为母本，用F_2D中的可育单株(作父本)的花粉进行混合授粉，同时以F_2D中的不育单株为母本，以F_2C中的可育单株(做父本)的花粉进行混合授粉，获得新的F_1N；将新的F_1N自交，从F_{2 代}开始，实施常规选择育种(常规选择育种方法为报道的方法)，选择农艺性状优良的可育单株(选择农艺性状优良可育单株的方法为报道的方法)，通过连续自交和选择(连续自交和选择的方法为报道的方法)，最终得到花期稳定、株型适中、产量高产的稳定的水稻新品系。

主要参考文献：

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Claims (1)

1.一种水稻广亲和隐性核不育系的鉴定与利用方法，其特征在于下列步骤：

(1)将籼稻与粳稻杂交，杂交种都可育的广亲和品种02428与籼稻品种特青杂交，通过自交一代获得F2代，通过单粒传法构建重组自交系，在F6代的第127家系出现育性分离，筛选得到不育系RI127S；

(2)以所得的不育单株RI127S作母本，以水稻籼稻品种明恢63作父本，杂交得到F1代，利用F1自交一代得到育性分离的F2群体，提取F2群体单株总DNA，取10株可育单株的总DNA等量混合作为可育池模板，取10株不育单株的总DNA等量混合作为不育池模板，利用Gramene网站上报道的SSR标记中第一染色体上10对SSR标记作为引物，引物编号为RM1，RM151，RM158，RM580，RM23，RM129，RM237，RM319，RM315，RM165，进行PCR，将所得的扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶检测，筛选得到多态性标记；以获得的多态性标记引物RM580为引物，以F2群体全部单株为模板进行PCR，将所得产物利用聚丙烯酰胺凝胶检测，结合单株表型，将控制RI127不育系育性性状的基因定位于水稻1号染色体5.5Mb-5.9Mb区段内；对5.5Mb-5.9Mb区段内育性候选基因OsMADS3进行测序，以所述的可育池总DNA和所述的不育池总DNA为模板，利用粳稻品种日本晴中基因组OsMADS3的序列作为参考序列设计引物，编号为CAD6到CAD16F和R，MPF1，MP F2和R2，MPF3和R3(序列见说明书表3)，进行PCR，对PCR产物进行测序；以粳稻品种日本晴OsMADS3基因的CDS序列为参考序列设计引物，引物编号为M-126F，M-316R，3C-1R(序列见说明书表4)，提取可育单株和不育单株的总RNA，反转录成cDNA作为模板，进行RT-PCR，分析OsMADS3基因功能，确定控制RI127不育系的育性性状的基因为OsMADS3基因；

(3)根据步骤(2)测序结果在不育单株和可育单株中OsMADS3基因上有差异的位置上设计相邻的三条引物SP1、SP2、SP3，利用步骤(2)所述的不育池模板，第一轮以SP1为侧引物，与随机引物AD2a进行组合，以不育池模板作为第一轮PCR的模板，进行PCR；将所得的PCR产物作为第二轮PCR的模板，以SP2为侧引物，用第一轮随机引物AD2a组合进行PCR；以第二轮的PCR产物为第三轮PCR的模板，以SP3侧引物，用第一轮随机引物AD2a组合进行PCR，利用最后一轮的所得PCR产物选取大于200bp的产物进行测序，找出在不育单株OsMADS3基因的第二外显子282bp处的插入序列，该插入序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

(4)提取RI127S不育系苗期单株叶片的总DNA，根据步SEQ ID NO：1所示序列设计引物InsertF1和1639R1，根据插入序列插在不育单株OsMADS3基因的位置，在插入位点两侧以粳稻品种日本晴中OsMADS3基因序列设计引物M-361F和M-820R，分别进行PCR扩增，根据出现条带鉴定RI127S不育系的基因型，当出现由引物M-361F和M-820R PCR扩增所得的产物为208bp的条带判定为野生可育基因型，当出现由引物InsertF1和1639R1PCR扩增所得产物为1.7kb条带判定为不育基因型，当出现上述两对引物都能扩增出的条带判定为杂合可育型；

(5)以不育系RI127S中的不育单株作母本，分别以籼稻和粳稻作父本授粉杂交，得到F1，观察F1的结实率；

(6)将带有鉴定为隐性雄性核不育基因的不育系作为轮回选择的中间材料，进行新品种，培育，具体步骤如下：

1)将鉴定为性状优良的育种亲本材料分别编号1、2、3、4，将亲本材料1与2杂交得到F_1A，将亲本材料3与4杂交得到F_1B；

2)以步骤1)中得到的F_1A和F_1B分别作父本，以RI127S不育系作母本进行杂交，其中F_1A和RI127不育系杂交得到F_1C，通过自交一代得到F_2C；F_1B与RI127不育系杂交得到F_1D，通过自交一代得到得到F_2D；

3)以F_2C中的不育单株作母本，以F_1B为父本杂交得到F₁，将F₁自交一代得到F₂，测验F₂的育性，得到杂合株系，对杂合株系自交后代进行筛选，得到株高、花期适中的杂合株系，对杂合株系自交3-4代得到性能稳定的品种；

4)以F_2D中的不育单株作母本，以F_1A为父本杂交得到到F₁，将F₁自交一代得到F₂，测验F₂的育性，得到杂合株系，对杂合株系自交后代进行筛选，得到株高、花期适中的杂合株系，对杂合株系自交3-4代得到性能稳定的品种；

其中,

步骤(2)中所述的引物的DNA序列如下所示：

步骤(3)中所述的引物的DNA序列如下所示：

该AD2a引物中的N代表该碱基为A/G/C/T混合物，S代表碱基G/C混合物，W代表碱基A/T混合物，

步骤(4)中所述的引物的DNA序列如下所示：