CN105504035A - 一种水稻免疫负调控蛋白、其编码基因及应用 - Google Patents

一种水稻免疫负调控蛋白、其编码基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，公开了一种水稻免疫负调控蛋白OsCUL3(Seq？ID？No：3)、其编码基因(Seq？ID？No：1、2)及上述蛋白或基因在水稻抗病性分子改良中的应用。本发明还公开了上述水稻免疫负调控蛋白OsCUL3的突变蛋白(SEQ？ID？NO：4所示的氨基酸序列)、其编码基因、含有上述基因的表达载体、转化体，还公开了它们在提高水稻抗病性中的应用。本发明通过EMS诱变获得一个OsCUL3功能缺失突变体，该突变体在大田种植环境中表现出细胞程序性死亡失控表型。人工接种结果显示：相较于野生型，突变体oscul3对两种高发主要水稻病害-稻瘟病和白叶枯病的抗性均有显著增强，OsCUL3可应用于水稻抗性分子改良工作，具有巨大开发利用价值和前景。

Description

一种水稻免疫负调控蛋白、其编码基因及应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，涉及一种水稻免疫负调控蛋白OsCUL3、其编码基因及应用。
背景技术
植物在漫长的进化过程中为应对各种生物胁迫形成了一整套复杂而又被精密调控的免疫应激反应机制。相较于哺乳动物，植物体内缺乏适应性免疫系统以及可移动的抗原特异性识别B细胞和T细胞，但植物却能依赖自身每一个细胞所具有的天然免疫系统(Innateimmunity)，当遭受病原菌攻击时，通过在侵染位点发生过敏反应(Hypersensitiveresponse,HR)并将信号传递至邻近组织，从而快速阻止病原菌的进一步侵染和扩张。植物的先天免疫反应从机制和层次上可以分为两类:病原菌相关分子模式诱导的免疫反应(pathogenassociatedmolecularpatterntriggedimmunity,PTI)和效应因子诱导的免疫反应(effectortriggedimmunity,ETI)。PTI依赖于细胞膜表面的模式识别受体(patternrecognitionreceptors,PRRs)，而ETI则由植物专化性的抗病蛋白(R蛋白)识别病原菌分泌的效应蛋白(effector)所激发。在植物体内,它们之间相互影响、相互平衡来共同抵抗病原菌的入侵。
当植物感受到外源生物入侵后会做出一系列应答反应，包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)级联反应的激活，活性氧(reactionoxygens,ROS)爆发，抗性相关基因的表达，甚至启动细胞程序性死亡(programmedcelldeath,PCD),以一种自杀的形式迅速阻断病原菌的进一步侵染和扩张，如ETI过程中的HR反应就是一种典型的PCD。PCD在植物抗病过程中发挥重要作用并且被一系列元件精密调控着，从而确保其在恰当的时候快速启动。当此类负调控因子发生功能性缺失突变后，PCD失去控制，植株便会表现出类病斑表型，即在没有受到任何病原菌侵染的情况下自发形成的类似细胞感染后产生坏死病斑的现象。绝大部分此类突变体其抗病性都有显著增强，因而成为人们研究植物PCD和抗病信号转导分子机制的极佳材料。
水稻既是单子叶模式植物，又是世界上最重要的粮食作物之一。水稻病害是影响其产量的重要限制因子，而水稻类病变突变体能提高植株对多种病害的抗性，因此，近年来水稻类病变突变体研究引起了国内外许多学者的广泛关注。大量研究结果表明类病变很可能自发启动了水稻的HR或SAR抗病反应机制。
分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究的前提。同时，与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能够提供植物更为光谱及长效的抗性，通过抑制作为抗病反应负调控因子的抗病相关基因的功能进行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性、拓宽植物的抗谱。
发明内容
本发明要解决的一个技术问题在于提供一种与水稻抗病性有关的水稻免疫负调控蛋白OsCUL3、其编码基因及应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种水稻免疫负调控蛋白OsCUL3，如(A)或(B)所示的序列：(A)SeqIDNo：3所示的氨基酸序列；(B)在(A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且具有相同功能的由(A)衍生的蛋白质。
一种编码上述蛋白的基因。
进一步地，编码所述水稻免疫负调控蛋白OsCUL3的基因组基因如(a)或(b)所示的序列：(a)SeqIDNo：1所示的核苷酸序列；(b)在(a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而生成的可编码具有相同功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物。
进一步地，编码所述水稻免疫负调控蛋白OsCUL3的cDNA基因如(a)或(b)所示的序列：(a)SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；(b)在(a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而生成的可编码具有相同功能的蛋白质的cDNA。
上述蛋白、基因可应用在水稻抗病性分子改良中。
本发明要解决的另外一个技术问题在于提供一种提高水稻抗病性的水稻免疫负调控蛋白OsCUL3的突变蛋白、其编码基因、表达载体、转化体及应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案:
一种水稻免疫负调控蛋白OsCUL3的突变蛋白，如SEQIDNO：4所示的氨基酸序列。
一种编码上述蛋白的基因。
含有上述基因的表达载体或转化体。
上述蛋白、基因或表达载体、转化体在提高水稻抗病性中的应用。
进一步地10、根据权利要求5或9所述的应用，其特征在于，所述抗病性为抗稻瘟病和/或抗白叶枯病。
上述蛋白、基因或表达载体、转化体在提高水稻抗病性中的应用。
进一步地，所述抗病性为抗稻瘟病和/或抗白叶枯病。
本发明通过EMS诱变获得水稻类病斑突变体，并应用真菌几丁质以及细菌鞭毛蛋白处理野生型中花11及突变体叶片后检测ROS含量水平、人工接种稻瘟病和白叶枯病并鉴定抗性水平、应用荧光定量PCR技术比较分析突变体以及野生型中防卫相关基因的表达水平，进而通过图位克隆控制水稻类病变的基因，然后通过遗传转化验证基因功能，最终成功分离一个水稻免疫负调控基因：OsCUL3。实验结果表明：在通过EMS诱变获得的OsCUL3功能缺失突变体中，相较于野生型，其对水稻真菌病害稻瘟病以及细菌病害白叶枯病抗性均有极显著提高，能有效应用于水稻抗病性分子改良工作，具有很大开发应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为野生型中花11与突变体oscul3细胞程序性死亡表型对比图(其中A为整个植株对比图，B为单个叶片对比图)；
图2为稻瘟菌和白叶枯菌人工接种抗性鉴定结果对比图(其中A为接种稻瘟菌的叶片病斑表型对比图，B为接种稻瘟菌的叶片相对病斑面积对比图，C为接种稻瘟菌的叶片相对真菌生物量对比图，D为接种白叶枯菌的叶片病斑表型对比图,E为接种白叶枯菌的叶片病斑长度对比图)；
图3为6个防卫相关基因(PR1a、PR5、PR10、PAL1、AOS2、WRKY45)相对表达量对比图；
图4为ROS积累动态分析图；
图5为野生型中花11及突变体OsCUL3基因序列比对；
图6为转基因互补材料表型对比图(其中A为整个植株对比图，B为单个叶片对比图)；
图7为转基因互补材料稻瘟病抗性鉴定对比图(其中，其中A为接种稻瘟菌的叶片病斑表型对比图，B为接种稻瘟菌的叶片相对病斑面积对比图，C为接种稻瘟菌的叶片相对真菌生物量对比图)。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物由Invitrogen公司合成；测序由上海桑尼生物科技有限公司进行；TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、连接酶、荧光定量PCR试剂盒等购自Takara公司；反转录试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购于Promega公司，使用方法参照说明书。
实施例1、oscul3突变体的获得及细胞程序性死亡表型鉴定
利用EMS诱变水稻粳稻品种中花11种子，经过5代自交获得遗传稳定的oscul3突变体。在大田环境条件下，oscul3经播种移栽60左右，其下部叶片表面开始形成少量黄褐色针点状斑点。随后，斑点数量及单个病斑大小随生长发育迅速向整个植株叶片表面扩展、蔓延(图1)。
实施例2、稻瘟病和白叶枯病抗性鉴定
稻瘟病接种采用打孔法。分别将野生型中花11和突变体种子经浸种催芽后播种于装满灭菌营养土的直径15cm、高度15cm的圆柱形培养盆内，每盆5株，于人工温室12小时光照、12小时黑暗26℃恒温培养至分蘖盛期。当突变体类病斑表型产生后，用打孔器在倒三叶叶片表面人为制造直径1.5mm的圆形伤口，吸取10微升预先准备好的孢子浓度约105个/ml的稻瘟菌生理小种RB22菌液滴于伤口处并用透明胶带固定，于人工气候室内保持光照、温度不变，调整湿度至80％培养促进发病，15天后调查病斑大小并取样。提取接种部位水稻叶片和稻瘟菌的DNA，应用荧光定量PCR技术，以水稻Actin为内参，对稻瘟菌基因Pot2的DNA进行相对定量，以此代表二者生物量的比值。扩增引物分别为:OsActin-F:CAGGCCGTCCTCTCTCTGTA，OsActin-R:AAGGATAGCATGGGGGAGAG；MoPot2-F:ACGACCCGTCTTTACTTATTTGG，MoPot2-R:AAGTAGCGTTGGTTTTGTTGGAT。结果显示：相较于野生型中花11，突变体oscul3对稻瘟菌生理小种RB22的抗性有显著提高，其病斑面积显著小于野生型，稻瘟菌在突变体叶片中的繁殖扩增速度亦明显被有效抑制(图2)。
以剪叶法进行白叶枯病接种。中花11和突变体oscul3种子浸种催芽后播种移栽于中国水稻研究所试验田。待孕穗期挑选全展剑叶，用沾有白叶枯菌菌液的剪刀剪去叶尖约5cm，每小种接种3个单株，每单株至少接种3个分蘖。15天后调查发病情况，以病斑长度代表感病级别。结果表明：突变体oscul3对3个白叶枯菌小种的抗性极显著高于野生型中花11，病斑基本不扩展(图2)。
实例3、防卫相关基因表达量分析
野生型中花11和突变体种植于中国水稻研究所试验田，正常大田管理。于分蘖盛期挑选长势一致的3个单株分别取倒三叶的叶尖部分(约1/3叶片总长部分)，用InvitrogenTrizol试剂盒提取总RNA，Promega反转录试剂盒合成cDNA第一链，荧光定量PCR选用Takara公司试剂盒，操作步骤均参照说明书。所用引物序列信息如下：qPR1a-F：CGTGTCGGCGTGGGTGT，qPR1a-R：GGCGAGTAGTTGCAGGTGATG；qPR5-F：GGCGGAGTTCACCATCGG，qPR5-R：GCGTGTGTCTTCCTGTCGTTG；qPR10-F：CGGGCACCATCTACACCA，qPR10-R：CGGGCACCATCTACACCA；qPAL1-F：TTCAACGCCGACACCT，qPAL1-R：GTAGAGCGGATACGACCTG；qAOS2-F：AAGCTGCTGCAATACGTGTACTGG，qAOS2-R：CGACGAGCAACAGCCTTCCG；qWRKY45-F：GCCGACGACCAGCACGATCACC，qWRKY45-R：ACGAGCCGACGCCGCCCTC。结果表明：6个防卫相关基因在突变体中均上调表达，上调倍数在3-12倍不等。由此进一步说明该突变基因在免疫应激反应过程中起负调控作用(图3)。
实例4、PAMP处理后ROS积累动态分析
材料种植方法参照实施例2中稻瘟病接种部分，播种8-9周后，以3mm直径打孔器对倒三叶进行打孔取样，期间注意尽量避开主叶脉。样品先于ddH2O中浸泡黑暗处理6小时去除因物理伤害造成的背景。然后随机挑选3片叶片置于1.5ml离心管底部，依次加入100ulImmunstar-HRPsubstrate，1ulperoxidase-Streptavidin(HRP)，最后分别加入Chitin或Flg22至终浓度8nM或100nM。迅速用Glomax20/20Luminometer仪器每10秒钟测定一次荧光值，持续测定120个循环。结果如图4所示：突变体对Chitin和Flg22都反应更为敏感，ROS积累速率和峰值明显高于野生型中花11。
实例5、OsCUL3基因的图位克隆
以突变体oscul3为母本，水稻籼稻品种南京11为父本杂交获得F1，F1套袋自交获得F2分离定位群体。F2种植于中国水稻研究所试验田，于分蘖盛期分别挑选10株野生型表型单株和10株突变体表型单株，取其幼嫩叶片通过CTAB法抽提基因组DNA。按表型等量混合10份DNA构建野生型和突变体基因池，用136对均匀分布于水稻12条染色体且在中花11和南京11间呈多肽的SSR标记引物分别扩增双亲以及两个基因池，通过连锁分析将OsCUL3初步定位在2号染色体长臂。而后进一步扩大分析1288株突变体表型单株基因型并开发新的In-Del标记，最终将OsCUL3精细定位于标记ZN36和ZN9之间的125KB物理区间内。该区间共包含18个开放阅读框。应用引物：ZS69-F：TAATTGTCTGCCAATGTGACG，ZS69-R：CACCTCGGCCTAAAACCCT分别扩增野生型以及突变体中OsCUL3DNA序列，通过测序后发现：突变体中OsCUL3基因第二外显子和内含子的衔接处发生了11个碱基的替换以及8个碱基的缺失。为验证该突变是否对内含子的剪切造成影响，通过PCR扩增分别获得野生型以及突变体中OsCUL3基因cDNA，测序比对结果显示：突变造成内含子剪切识别位点后移，导致oscul3第二外显子中的28个碱基被错误切除，由此产生移码突变并最终造成突变体蛋白翻译的提前终止(图5)。
实例6、转基因互补验证OsCUL3基因功能
为验证OsCUL3能否恢复突变体类病斑表型，以野生型中花11基因组DNA为模板，1300-OsCUL3-F：GGCCAGTGCCAAGCTTTTTGTCAAGGCTGAATAACGA，1300-OsCUL3-R：CCATGATTACGAATTCTAGCCTCAAATTCAACCCGTA为引物，通过PCR扩增成功获得包含启动子、表达框以及终止子在内的OsCUL3DNA全长序列。随后应用Clontech公司In-fusionHDCloning试剂盒(货号：PT5162-1)通过重组将OsCUL3PCR产物片段连接上经EcoRⅠ，HindⅢ双酶切线性化后的载体pCAMBIA1300(具体使用参照说明书)。将此重组产物热激转化大肠杆菌DH5a后涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板上生长16小时，挑选阳性克隆小提质粒送上海桑尼生物科技有限公司测序，将测序正确的质粒命名为pCAMBIA1300-OsCUL3。
水稻转化采用农杆菌侵染法，首先电击转化将重组质粒pCAMBIA1300-OsCUL3导入农杆菌菌株EHA105。以此重组农杆菌菌株侵染突变体愈伤组织，经潮霉素筛选后，阳性愈伤再依次通过分化、生根获得转基因T0代植株：pOsCUL3。将此转基因植株种植于海南陵水中国水稻研究所南繁实验基地，正常水肥管理。表型鉴定结果显示：所有的阳性转基因植株在整个生育期间无类病斑产生，表型均得以恢复正常。由此表明OsCUL3为水稻PCD的一个负调控因子，突变体类病斑表型确系由OsCUL3功能性缺失引起(图6)。
为进一步阐明PCD与水稻抗病性之间的相关性，选用纯合的单拷贝互补T2代家系进行人工稻瘟菌接种，接种方法参照实例2。结果如图7所示：互补植株对稻瘟菌生理小种RB22表现更为敏感，接种15天后，突变体被侵染叶片中的真菌生物量显著低于转基因植株。由此可见：PCD引发了突变体植株中免疫机制的激活。
以上结果充分说明OsCUL3为一个抗性相关蛋白，在水稻免疫应激反应过程中主要起负调控作用。随着CRISP基因组定点编辑技术的发展以及其它分子生物学技术手段的日趋成熟，未来该基因将可有效应用于水稻抗性分子改良工作中，具有极大开发利用价值和意义。
以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。有必要指出，本发明不局限于以上实施例，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种水稻免疫负调控蛋白OsCUL3，其特征在于，如(A)或(B)所示的序列：
(A)SeqIDNo：3所示的氨基酸序列；
(B)在(A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且具有相同功能的由(A)衍生的蛋白质。
2.一种编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，编码所述水稻免疫负调控蛋白OsCUL3的基因组基因如(a)或(b)所示的序列：
(a)SeqIDNo：1所示的核苷酸序列；
(b)在(a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而生成的可编码具有相同功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物。
4.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，编码所述水稻免疫负调控蛋白OsCUL3的cDNA基因如(a)或(b)所示的序列：
(a)SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；
(b)在(a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而生成的可编码具有相同功能的蛋白质的cDNA。
5.权利要求1所述蛋白、权利要求2、3或4所述基因在水稻抗病性分子改良中的应用。
6.权利要求1所述水稻免疫负调控蛋白OsCUL3的突变蛋白，其特征在于，如SEQIDNO：4所示的氨基酸序列。
7.一种编码权利要求6所述蛋白的基因。
8.含有权利要求6所述基因的表达载体或转化体。
9.权利要求6所述蛋白、权利要求7所述基因或权利要求8所述表达载体、转化体在提高水稻抗病性中的应用。
10.根据权利要求5或9所述的应用，其特征在于，所述抗病性为抗稻瘟病和/或抗白叶枯病。
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