TW461919B - Penicillin V amidohydrolase gene from Fusarium oxysporum - Google Patents

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A7 B7 461919 五、發明説明（1 ) 青黴素V醯胺水解酶可將青黴素V (苯氧-甲基青黴 素）經酵素水解成6 —胺基青黴素（6-aminopenicillanic acid, 6 - APA ) 0 ’6 - A Pa 爲一種 活性貝他內醯胺核’可做爲青黴素半合成之材料。在真菌 ，鏈黴菌屬和細菌中已發現各種青徽素V醯胺.水解酶（ penicillin V am i dohydro1ase, PVA) ( Lowe et a 1., 1986，Biotechnol, Lett· 8:151-156) 。Lowe等人已經 從尖鎌孢株分析PVA^i活性；然而此酵素並未被分離 或純化。 本發明是關於一分離的核酸分子，其可編碼源.自尖鎌 孢4 3 5株全部或部份的PVA。此P VA基因已被選殖 ，定序和表現。 另一方面，本發明是發展一源自於尖鎌孢4 3 5株的 新型啓動子，含有部份或.全部PVA基因和/或新型啓動 子的表現載體；以及含有此表現載體的宿主細胞》另一方 面，本發明是建立P V A的生產方法，特別是以苯氧醋酸 鹽做爲誘導者。g) 攀: 1圖1一完整PVA酵素的六個胜肽片段之胺基酸序列 。氮端的胺基酸序列是S E Q . ID. NO. : 1 ; 胜肽A的胺基酸序列是S E Q . 胜肽B 1的胺基酸序列是S E Q .

:胜肽B 2的胺基酸序列是S E Q

4 ;胜肽C的胺基酸序列是S E Q

5 ;胜肽D的胺基酸序列是S E Q 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐.） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂------ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 D . NO. ： 2 ； I D _ NO. :3 ID. N 0 .: I D . N 0 .： ID. NO.: -4 - 4 6 ] 9 1 9 A7 B7 五、發明説明（2 ) 6 ;胜肽E的胺基酸序列是s E Q . 8.。

D

NO 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 圖 2 — 寡 核 甘 酸 探 針 0 — 組 四 個 寡 核. 甘 酸 探 針 係 源 i 於 胜 肽 C ( S Ε Q I D N 0 5 ) 的 7 個 胺 基 酸 的 反 轉 錄 序 列 0 7 個 胺 基 酸 的 序 列 是 S E Q • I D N 0 * 8 ; 從 S Ε Q • I D N 〇 ; 8 反 轉 錄 的 D N A 序列 是 S Ε Q I D * N 0 9 ; 與 S E Q I D - Ν 0 ί ； 9 互 補 的 D N A 序 列 是 S E Q • I D • Ν 0 ； 1 0 : 寡核苷 酸 探 針 是 S E Q I D - Ν 0 * 1 1 9 圖· 3 — 各 種 D Ν A 和 胜 肽片 段 0 P V A Wi 端 胺 基 酸 序 列是 S E Q •. I D Ν 0 • 1 2 ; 2 5 8 5 轉 譯 胺 基 酸 序 列 是 S Ε Q • I D • N 〇 .· ; 1 3 ; 2 5 8 5 D N A 序 列 是 S Ε Q • I D N 0 ; 1 4 t 2 5 8 5 — Μ D Ν A 序 列 是 S E Q I D N 0 :_ 1 5 » 2 5 8 5 — F L 轉 譯 胺 基 酸 序 列 是 與 S Ε Q I D • N 〇 : 1 2 相 同 » 2 5 8 5 — F L D N A 序 列 的 編 碼 股 是 S Ε Q I D N 〇 • ; 1 6 t 2 5 8 5 — F L D Ν A 序 列 的 模 版 股 ( 即 與 編 碼 股 互 捕 ) 是 S E Q - I D N 0 • 1 7 〇 所 有 核 -μ-μ 甘 酸 序 列 ( 除 了 S E Q I D • N 0 * ; 1 7 ) 由 左 至 右 表 示 5 - 至 3 〆 方 向 〇 圖 4 — 2 5 8 5 一 F L 的 圖 示 〇. 面 圖 5 — 基 因 組 Ρ V A 基 因 選 殖 的 ran 圖 示 〇 衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁.) A7 461919 B7 五、發明説明（3 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖 6 — PVA c D N A ( S E Q . ID. NO .:18)和相對應的胺基酸序列（SEQ. ID. NO. : 19)。底線加註的DNA序列（SEQ. ID. Ν Ο . :20的第1348至1368鹼基對） 是與 2 0mer 探針（SEQ· ID. NO. :11 )互補。星號表示終止密碼。 圖 7 — PVA 基因組 DNA (SEQ. ID.

N 0 . : 2 1 )和相對慜的胺基酸序列（S E Q · ID NO. ： 22)。啓動子是位於第1至240鹼基對 (SEQ. ID. NO. :23)。第一個星號表示 轉錄起始點，第二個星號表示終止密碼。 圖8 — PWB19N構築之圖示。 圖9-PSJC62構築之圖示。 圖1 0 — PBMFXPVA6構築之圖示。 .圖1 1 — PBMFXPVA7構築之圖示。 圖12 — PFO20構築之圖示。 圖13 — PFO20 — P構築之圖示。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 圖1 4 — pBMPVA — P構築之圖示。 圖1 5 — PFO20-M構築之圖示。 圖16 — pBMPVA-Μ構築之圖示》 圖17-p BMPVA-P/DAA0 2構築之圖示 〇 圖18-PBMPVA-M/DAA04構築之圖示 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6 19 19 a? ___^_ B7______ 五、發明説明（4 ) 本發明關於一種分離的核酸分子，其具有編碼所有或 部份尖鎌孢PVA的核酸序列。此核酸分子宜爲一種 D N A分子，並且此核酸序列是一D N A序列。此所表示 的所有DNA序列由左至右的方向即爲一般之5 <至3 < 端方向（除了圖1 3的S E Q · I D . N 0 . ： 1 7 )。而且D N A序列具有如圖6和7顯示的所有或部份核 苷酸序列（特別是S E Q1· ID. NO.： 1 8 fO S E Q . ID. N 0 . : 2 1 );或與這些 D N A 序 列互補的D N A序列；或與這些D N A序列之互補序(列互 相雜交的D N A序列。而且DNA序列是在迫切條件（ stringent condition)下進行雜交反應。”迫切條件' .意指反應條件如^較佳具體實例的詳細實施例"所描述。 編碼P V A的核苷酸序列（即D N A序列）其序列長度宜 至少約20個核苷酸。 較佳的探針DNA片段是SEQ. ID. NO. :1 1，啓動者之D N A片段是S E Q . ID. NO : 2 3。 本發明的P V A分子並不需要具催化活性。例如：失 去催化X活性的P V A或片段可應用於X抗體之製造。 本發明也包括修飾的序列》本申請案所使用的*修飾 "字語意謂：核苷酸或多胜肽序列是不同於自然界發現的 野生型序列。 本發明的D N A序列可利用各種不同已知的技藝而獲 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -7 - 經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 4 6 19 19 A7 _ B7_._ 五、發明説明（5 ) 得。至少有三種選擇性原則方法可使用： (i )從含有該序列的基因組DNA或互補DNA ( c D N A )分離雙股D N. A序列； (i i )化學合成D N A序列；和 (i i i )利用聚合酶連鎖反應合成D N A序列。 第一個方法，篩選基因組成c DNA庫以確認一個可 編碼全部或部份PVA的DNA序列。例如：篩選尖鎌孢 基因組DNA庫以確認編褊全部或部份PVA的DNA序 . . 列。可使用各種技藝以篩選基因組DN A或c DNA庫。 例如：使用存在於標的基因組DNA或cDNA可編 碼部份或全部P VA的複寫放射線標識單股D N A探針序 列·，對已變性成爲單股型式的基因組DNA或c DNA菌 落複製本進行DNA/DNA雜交反應。 利用免疫點墨技術也可對基因麗DNA或cDNA庫 進行篩檢。 —個典型的篩選方法對於免疫點墨或雜交技術都適合 ，即首先將位於載體內的基因組DNA庫或c DNA庫且 鋪於瓊脂培養皿，然後將菌落轉移至如硝基纖維素膜的過 濾膜。利用D N A探針雜交或抗體結合至菌落以確認含有 編碼全部或部份PVA的基因組DNA或c DNA的菌落 〇 第二個方法，利用化學合成編碼全部或部份P VA的 本發明D N A序列。例如，編碼P V A的D N A序列可藉 由合成一系列的1 〇 〇個鹼基對對核苷酸，然後按序列順 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 Λ 8 五、發明説明（6) 序相連接（經由適當尾端限制酶位置或互捕尾端序列）， 以形成正確直線序列的核苷酸。 第三個方法，可利用聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction, PCR)合成。編碼全部或部份P V A的 本發明D N A序列。首先將至少1 5個鹼基對長度的合成 DNA寡核苷酸對（P CR引子）雜交至標的DNA序列 的相反股，利用酵素擴大位於標的序列中間區域的D N A 。利用熱將模版變性，引子黏接和D N A聚合酶使黏接引 子延伸的三個重覆循環步驟使DNA片段擴大。參考 White et al.， Trends Genet. 5， 185-189(1989)。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 根據本發明，本發明的D N A序列可應用於許多方面 。利用此D N A序列可製備P V A，使青黴素V轉變成6 _APA。然而，它們也可做爲DNA探針，利用雜交方 法篩選其他c DN A或基因組DN A庫中可編碼類似於 PVA的蛋白質的DNA序列。此外，編碼全部或部份 P V A的本發明D N A序列也可做爲D N A探針，利甩雜 交方法篩選其他微生物而非尖鎌孢的基因組D N A或 c DNA庫中編碼pva分子的DNA序列。 編碼全部或部份P VA的本發萌D NA序列也可被修 飾（即突變）以製造各種突變型。此種突變可能是變質， 即突變改變密碼使胺基酸序列改變；或非變質，即胺基酸 序列不因突變密碼而改變。利用此技藝中已知的各種方法 可製備修飾的D N A序列，例如將P V A . D N A_序列突 變，造成缺失’取代，蕨入，反轉或在編碼的多胜肽增加 本紙張尺度適用t關家辟（CNS ) ( 21GX297公釐) ~ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 46191 9 A7 _____ B7_______ 五、發明説明（7 ) 一或更多個胺基酸。例如：Morinaga, Bio/Te.chnol. 2， 636-639 (1984), Taylor, Nucl. Acids Res. 13, 8749-8 764 (198.5.)和 Kunkel, Proc· Natl. Acad. Sc i. USA 82，48 2-492 ( 1 985 )等人描述的位置特異突變法都可使用 。此外也可從商業上獲得位置特異突變法的套組。例如 Amersham Corp. (Arlington Heights，IL)的位置特異 突變套組。此外，3&7_61'.，1'111(：1.八(^(13尺63.16,791-8 0 2 ( 1 9 8 8 )描述的缺失和f截斷方法都可使用。變質和非變 質方法對於本發明胜肽的製造和使用都有益。例如，這些 突變可能促使高程度的生產、簡易的純化，或提供額外限 制核酸內切酶辨識位置。所有的修飾D NA和多胜肽分子 都包含在本發明的目標內。 本發明也爲P V A發展一新型的啓動子，顯示於圖7 (SEQ. ID. NO· : 23)。本發明的啓動者 可應用編碼其他有用蛋白質或多胜肽的其他已知D N A序 列。 本發明而且也關於一含有編碼全部或部份PV A的 D N A序列和/或P VA的啓動子的表現載體。此表現載 體含有的全部或部份D NA序列宜具有如圖6或7所示的 核苷酸序列。而且本表現載體宜包含一或更多調節DNA 序列，並且操控地連接至編碼全部或部份P VA的D N A 序列。Λ操控地連接，意指調節D N A序列具有指揮編碼 全部或部份P VA的D NA序列的複製和/或表現的能力 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Jli n I» I I —rj— I I I —-.訂— —— . Jt''__ I * ,,,. 厂：；y (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 461919 A7 ___B7_ 五、發明説明（8 ) 本發明所使用的表現載體通常是）質體A型式。其爲 環狀雙股DNA圈，並不與染色體結合。然而其他具有相 同功能的表現載體種類都將包括在本發明。 本發明使用的表現載體一般包含一個複製原點，位於 D N A序列前方（即上游）的啓動子（宜爲S E Q . 經濟部中央標準局貝工消费合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ID. NO. : 23的啓動者）和編碼全部或部份構造 蛋白，如PVA，D型胺基酸氧化酶，單株抗體，胰島素 ，.干擾素，表皮生長因子^，生長荷爾蒙和其他類似物的 D N A序列v編碼全部或部份構造蛋白質的D N A序列之 後是轉錄終止序列和剩餘的載體部份。表現載體也可包括 其他已知的D N A序列，例如：使表現產物穩定的穩定前 導序列，使表現產物分泌的分泌前導序列，調節構造基因 表現的序列（即藉由生長培養基內存在或不存在的營養素 或其他誘導者調控），具有提供對轉形宿主細胞表現型篩 選能力的特徵序列，穩定元素如中間節使質體有絲分裂穩 定，和提供限制酶裂解的作用序列。所使用實際的表現載 體的特性必需與所使用的宿主細胞相容。例如*當利用真 菌細胞系統進行選殖時，表現載體應含有分離自真菌細胞 基因組的啓動子.（如：源自小巢狀麴菌的t r p C啓動子 和源自尖鎌孢的PVA啓動子）ι —些表現載體可能含有 真菌獨立複製序列..（autonomously replicating sequence, ARS;例如，源自尖鎌孢和酵母的A RS)， 促使質體在宿主細胞中的自我複製作用。本發明的真菌表 現載體不宜含有真菌的A R S序列，因此進入宿主細胞的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）~~' -11 - A7 B7 461919 五、發明説明（9 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 質體將可能嵌入宿主染色體。而此種嵌入情形被認爲是較 佳的，因爲其可增加基因穩定性。如預期地，本發明的表 現載體至少需具有指導在大腸桿菌的複製和於真菌細胞的 嵌入作用，且宜使本發明的P V A D N A序列表現的能 力。在大腸桿菌各種宿主中複製的適當原點包括，如： C ο I E I質體複製原點。適宜的啓動子包括，如：源自 小巢狀麴菌的t rpC啓動子，源自尖鎌孢的P V A啓動 子和源自大腸桿菌的n e ’〇 — r基因啓動子。適當的終止 序列包括，如：源自小巢狀麴菌的t r p C終止者，源自 尖鎌孢的P VA終止者和源自大腸桿菌的n e 〇 — r基因 終止者》同時，表現載體宜包含編碼篩選標識物的D N A 序列。像篩選標識物，如腐蟲黴素抗力.（對真菌細胞）， .氨笮青徽溱抗力和新黴素抗力（對細菌細胞）都可使用。 .所有這些物質都是本技藝中已知且商業上皆可獲得。 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 .如圖1 0顯示的含有編碼Ρ V Α的D Ν Α序列的 PBMFXPVA6表現載體是特別適宜地使用，或與 p BMFXPVA6有同一特性的表現載體。同時，如圖 8，9 ，11 ，14和16的表現載體PWB19N， PSJC62 > PBMFXPVA7 > pBMPVA-9 和p BMPVA— Μ也適宜，或與pWB l 9 N， PSJC62，PBMFXPVA7，pBMPVA-P 和p BMPVA— Μ有同一特性的表現載體也可使用。 含有 p B M F X Ρ V A 7，ρ Β Μ Ρ V Α - Ρ 和 p BMP VA_M質體的宿主細胞大腸桿菌DH 5 α菌株 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 12 A7 B7 6 1 9 1 9 五、發明説明（ίο) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ，於1 9 9 4年1 2月1 4日依據布達佩斯條約存放於 American Type Culture Col lection, Rockville, Maryland.，其A T C C登記編碼分別爲6 9 7 2 1 ， 6972 2 和 69720。 含有欲編碼和控制序列的適當表現載體可利用本技藝 中已知的標準重組D N A技術構築。許多的技術於 Sambrook et a 1. Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 2nd edition, Co Id Spring Harbor Laboratory, Cold· Spring. Harbor, NY (1989) —書中有 描述。 經濟部t央標準局貞工消費合作社印製 此外本發明也關於含有由編碼全部或部份P V A，和 /或SEQ. ID. NO. :23啓動者組成的表現 載體的宿主細胞。.此宿主細胞含有的表現載體宜具有如圖 6或7所示的全部或部份核苷酸序列。而且宿主細胞含有 的表現載體宜含有一或更多的調節D W A序列，而具有指 揮複製和/或編碼全部或部份P V A的D N A序列表現的 能力。此外，宿主細胞含有的表現載體所構成的D N A序 列也已被修飾（如：分裂，缺失或截斷），以致編碼失去 催化活性的P VA分子。適當的宿主細胞包括真核和原核 宿主細胞，例如：大腸桿菌。適當的真核宿主細胞包括， 例如：尖鎌孢，頂.頭抱（Cephalospori.um acremon.ium) 和產黃青黴菌-(0611.丨〇111丨11111〇1^73〇261111111)。 特別適宜的宿主細胞是尖鎌孢株。 藉由本技藝中已知的各種方法將表現載體送入宿主細 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -13 - 13 4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6 19 19 a? __ _B7_ :_ 五、發明説明（11) 胞。例如：利用聚乙烯乙二醇媒介原生質體轉形作用方法 將宿主細胞與表現載體進行轉染。然而，將表現載體送入 宿主的其他方法，如：電穿孔作用，原生質體融合法和生 物擺列注射法（biolistic injection)都可使用。 當表現載體已被送入適當宿主細胞，將宿主細胞培養 於適當條件下，使其大量表現所欲的多胜肽，如由全部或 部份P V A構成的多胜肽分子。 含有編碼全部或部份> VA的D NA序列的表現載體 之宿主細胞，可藉由以下六種一般方法中的一或更多種方 法確認：（a ) D N A - D N A雜交；（b )標識物基因 功能的存與否；（c)測量宿主細胞P V A m R N A轉 錄物產生的情形；（d )利用免疫法偵測基因產物；（έ )色度測量法；和（f )酵素測定，酵素測定法爲較佳的 確認方法。 第一個方法：編碼全部或部份P V A的D N A序列存 在與否可利用與D N A序列互補序列做爲探針，然後進行 DNA — DNA或RNA - RNA雜交反應。 第二個方法：重組表現載體宿主系統可利用一些標識 物基因功能進行確認和篩選。例如：乙醯胺之作用，對抗 生素的抗力，對殺真菌劑之抗性，尿嘧啶原質營養生物等 。標識物基因可置放於含有編碼全部或部份PVA之 D N A序列的相同質體中，並且接受調控P V A編碼序列 相同或不同的啓動者調節。標識物基因對於誘發或篩選反 應的表現顯示宿主含有編碼全部或部份P VA的D N A序 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 6 19 19 at B7 五、發明説明（12) 列的完整重組表現載體。 (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) 第三個方法：利用雜交法可測量P V A m R N A轉 錄物製造。例如：利用與D N A序列互補的探針進行北方 點墨法或核酸酶保護測定法。或者萃取宿主所有核酸與此 種探針進行雜交反應。 第四個方法：利用免疫法，如：西方點墨法測量全部 或部份PVA的表現。 第五個方法：利用互捕分析法分析PVA蛋白的表現 。例如：已知細胞中缺乏此種酵素，PVA活性的表現可 利用偵測培養皿上無色受質-苯氧醋酸鹽-對-硝基苯胺 物-是否經酵素水解成黃色對-硝基苯胺物。 第六個方法：PVA的表現可利用已知測量PV A酵 素活性的方法。例如：可利用如後'較佳具體實例的詳細 實施例〃所述的方法。 本發明表現載體，質體或DN A分子的DNA序列可 利用本技藝中_已知的各種方法分析。例如：如Sanger et a 1., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 ( 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 1977)描述的雙去氧鏈終止方法，或如Pr. oc. Natl. Acad. Sci. USA 74，5 6 0 - 5 6 4 ( 1 9 7 7 )描述的 Maxam-Gilbert 方法 都可使用。 當然必需了解的是，並非所有表現載體和DNA調節 序列的功能表現都和本發明的D NA序列表現一樣。並非 所有宿主細胞功能都有相同的表現系統。然而，利用此所 提供的指引而非不適當的實驗*並且不遠離本發明目標的 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS〉A4規格（210X297公釐） 4 6 1 9 t 9 a? ___ϋ_一-— 五、發明説明（13) 任一普通技藝都可篩選表現載體，DN A調節序列和宿主 〇 本發明也關於培養含有可表現P VA的表現載體的宿 主細胞以生產P V A的方法。表現載體宜爲 PBMFXPVA6 或 PBMFXPVA7。我們很驚訝 地發現：利用苯氧醋酸鹽做爲誘導者可增加P V A的生產 a 本發明也關於由全部^部份p v A構成的多胜肽分子 。該多胜肽分子宜具有如圖6或7所示的全部或其中之一 的胺基酸序列。以含有部份P V A的多胜肽分子爲例，該 多胜肽分子的長度宜至少含有10個胺基酸。 此所確認的所有胺基酸殘基都是自然的L構形。依據 標準多胜肽命名〔J. Biol. Chem. 243，3557-3559 ( 1 9 6 9 )〕，胺基酸殘基的縮寫顯示於對應表。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4规格（2〖0X 297公釐） -16 - 4 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明（l4) 對應表 符號 胺基酸 單字母 3字母 Y Try L型酪胺酸 G Gly L型甘胺酸 F Phe L型苯丙胺酸 Μ Met L型甲硫胺酸 A Ala 丙胺酸 S S e r L型絲胺酸 I lie L型異亮胺酸 L Leu L型亮胺酸 T Thr L型蘇胺酸 V Val L型纈胺酸 P Pro L型脯胺酸 K Ly s L型賴胺酸 H His L型組織胺酸 Q Gin L型穀胺醯胺 E Glu L型穀胺酸 W T r p L型白胺酸 R Arg L型精胺酸 D Asp L型天冬胺酸 N A s n L型天冬醯胺 C Cy s L型半胱胺酸 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X 297公釐） 6 4 ，9 τ 9__^_______ 五、發明説明（15) 胺基酸由左至右的表示法，即爲傳統的胺基端至羧基 端的方向。 (請先閲讀背面之注意事項存填寫本貫> 本發明的多胜肽也可藉由合成方法獲得，即利用本技 藝中已知的技術，經由化學合成多胜肽。例如：如 Houghton e t a 1. , Proc. Natl. Acad. Sc i. USA 82， 513卜5 1 35 ( 1 985 )描述的固相程序法。多胜肽的獲得宜藉 由真核或原核宿主細胞表現編碼全部或部份PVA的 DNA序列，或藉由編碼'全部或部份p VA的D NA序列 轉錄出m R N A的試管轉譯作用。例如：利用如上述的 P C R方法合成圖6或7的D N A序列，然後嵌入適當的 表現載體，再轉形進入宿主細胞。培養重組宿主細胞以製 造P V A。利用此所描述的技藝以製造多胜肽。 產生的多胜肽可利用各種蛋白質純化技術進行分離和 純化。例如：使用離子交換層析法，凝膠過濾層析法和免 疫親和層析法》 經濟部中央標準局貞工消費合作社印製 除了製造6 - A P A，本發明的多胜肽也可廣泛應用 於其他方面。例如：該多胜肽可用於製造可與多胜肽結合 的多株或單株抗體。這些抗體可做爲偵測樣本中本發明的 多胜肽，例如：利用放射性免疫法或酵素免疫法偵測細胞 樣本。此抗體也可用於親和性層析法，以純化本發明的多 胜肽，並且分離來自各種來源的多胜肽。 藉由決定D N A序列和推測其胺基酸序列，本發明多 胜肽已確認。由於遺傳密碼本身的退化性，即大部份的胺 基酸殘基和停止訊號擁有一種以上的密碼子，因此其他可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 18 - 4 6 t 9 1 9 A7 B7 經濟部令央樣準局員工消費合作社印製 五、發明説明（16) 編碼如圖6和7相同胺基酸序列的D Ν Α序列都可做爲製 造本發明多胜肽之用。此外，我們必需了解這些DNA的 對偶變異和天然存在的胺基酸序列，或者可使用本技藝中 已知方法誘導。這些變異可能是在全部序列中有一或更多 個胺基酸差異，或在該序列中藉由缺失，取代，插入，反 轉或加入一或更多胺基酸。此種胺基酸取代的製備可基於 殘基本身的極性，電荷，溶解性，忌水性，親水性和/或 兩性而製造。例如：負電^荷胺基酸包括天冬胺酸和穀胺酸 ;正電荷胺基酸包括賴胺酸和精胺酸：具有相似親水性帶 有中性電荷極性基團或非極性基團的胺基酸包括亮胺酸， 異亮胺酸，纈胺酸，甘胺酸，丙胺酸，天冬醯胺，.穀胺醯 胺，絲胺酸，蘇胺酸，苯丙胺酸，酪胺酸。其他可預期的 變異包括前述多胜肽的鹽類和酯類，及前述多胜肽前驅物 ，如前驅物具有甲硫胺酸，Ν —甲醯甲硫胺酸和引導者序 列等氮端取代物。所有的變異都包括在本發明的目標中。 下列的實施例將進一步說明本發明。這些實施例並不 意圖限制本發明的目標，然而將對本發明提供更進一步認 識。 較佳具體實例的詳細眚施例 實施例中使用的微生物菌株，質體，緩衝液，生長培 養基和一般方法如下所描述。 微生物菌株和暂體 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) — Ih--------------------------f 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 19 6 1 9 彳 9 A7 B7 五、發明説明（17) 所使用的質體，細菌和真菌株列於表1 表1 經濟部中央標準局貝Η消費合作社印製 菌株和質體 相關特性 參考資料 大腸桿菌 F- Ψ 80d/acZA Ml 5 生命科學技術 DH5 a Δ (1 acZYA-argF ) U16 9 deoR r ecA1 e n d A1 hsoR17 (r k - m k -) supE44A -thi-1 gyrA96 relAl 公司 尖鎌孢 青黴素V醯胺酶 新型分.離株 435株 製造者 F u s a r i u m oxysporum f . sp. 1 ycopers i c i ATCC 株 ATCC 16322 pBMl1/M5 NeoR,5.6kb ATCC 67436 ----------—-广------訂一-----—成, /! ..( V (請先閱请背面之注意事項再填寫本頁)、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 20 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 6 19 19 A7 __B7 五、發明説明（IS) 菌株和質體 相關特性 參考資料 PES200 AmpR，HygBR, 6. 2 kb ⑴ pUCl 9 AmpR ,2 6 8 6 bp (2) PUT71 5 AmpR ,3337bp (3) pUT715/trpC AmpR,PhlR, ,4.6kb *，圖9 pWBl 9N N e o R ,2.9kb *，圖8 pSJC62 NeoR,PhlR, 5 . 3kb *，圖 9 ' pFO20 AmpR,PVA+, 6. 3kb *，圖 1 2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )人4規格（21.0X297公釐） 4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6 19 19 at B7 五、發明説明（19) PF020-P AmpR,PVA+, 6. 3kb *，圖 13 PFO20-M AmpR,PVA+, 6. 3kb *，圖 15 PF021 NeoR,PVA+, 1 5kb 圖5 PF023 NeoR,PVA+, 9. 2kb *，圖5 PBMFXPVA6 NeoR,PhlR,PVA+, 10.3kb *，圖 1 0 PBMFXPVA7 NeoR,PhlR,PVA+, 14.6kb 圖 1 1 pBMPVA-P ArapR,PVA+, 6. 3kb *，圖 14 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2IO.X297公釐） -22 — 4 6 19 19 A7 B7 五、發明説明（2〇) pBMPVA-M AmpR,PVA+, 6. 3kb 圖 1 6 pBMPVA-P/ DAA01 AmpR,DAA0+, 6. 8kb 米，圖1 7 pBMPVA-P/ DAA02 NeoR,PhlR, DAAO+,8.7kb *，圖 1 7 pBMPVA-M/ DAA03 AmpR,DAA0+, 6. 9kb 宋，圖1 8 pBMPVA-M/ DAA04 NeoR,PhlR, DAA0+,8.8kb 木，圖18 Λί^. ^ 訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁_) 經濟部中央檁準局員工消費合作社印製 (1) Staben et al., 1989, Fungal Genet. Lett. 36: 79-81 ° (2) Yanisch-Perron et a 1., 1 9 8 5, Gene 33: 1 03-11.9 0 (3) Jain etal., 1992, Mol. Gen. Genet. 234:489-49 3。 *描述於後。 緩衝液和培養基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) — -23 - 4 6 19 19 at _____^___B7_^_ 五、發明説明（2〇

Luria培養物：1 % Difco Bacto胰化蛋·白膝， 〇 · 5 96 DifcoBacto酵母萃取物，O'. 5%氯化鈉i。

Luria瓊脂：Luria培養物添加1 . 5 % Difco .

Bact〇3® 脂。 S 0 C培養基：2% D.i.fco Bacto胰化蛋白膝， 0 . 5 % Difco Bacto酵母萃取·.杨，mM N a C ^ >

2 · 5 m M KCj?。滅菌後加入百分之一體積的1 M M g C ^ 2 > 1 M MgS04和20%葡萄糖於培養基。 尖鎌孢植物生長培養基：6 %澱粉，4 % Pharmamedia ( Trader Protein, Memphis, TN) * 0 . 3 % ( N H 4) 2 S 0 4 ' 0 . 7 5% KH2P04，

0 . 7 5% K2HP04，以 ION NaOH 調整 PH =6 _ 8。 P VA生產培養基：尖鎌孢植物生長培養基添加 0.4%苯氧醋酸鹽。

Tr i s — EDTA 緩衝液（TE) ： 1 〇 m Μ

Tris— HC 又（ΡΗ7. 4) > 1 m M EDTA。 --------—4衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 s • 1 Γτ S •1 Γτ 液 篌 . 緩 8 泳 Η 電 ρ 鹽 c 酸鹽 醋酸 I 醋 o

Mm o 4 \ly E A T /fv A T D E Mm 1 酸 檬 檸 Μ 3 .·° ο ο 〇< 7 C II a Η Ν ρ 整 ^ 周 哥 3 Η : 〇 C 3 s Ν S Ν X ο ο IX 2 以 鈉 X ο 2 Η οα Ν ρ 2 Ε m ρ ο S 2 S ， 4ο Μ 3 Μ 2 • Ν ο ο , IX —- 2$ C ， a A Ν τ D ΜΕ 一張 紙 I本

Ns c 準 標 家 國 國 中 用 適 I规 X ο ¥ 公 4 2 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 6 1919 at _ B7_________ 五、發明説明（22)

NaOH調整PH7.4。 5 0 X Denhardt溶液：1% Ficoll’ 1% 多乙烯 社格·琳酮（polyvinylpyrrolidone) ’ 1 %牛血清白蛋白 (B S A )。 3 〇 X N E T ： 4 . 5 M NaCj? ' 〇. 45M T r i s - H C ( P H 7 . 5)，3〇mM E D T A。 方法 所使用的一般選殖技術，DN A定序和從大腸桿菌萃 取質體 DNA 的方 _法如 Sambrook et al. 1989，

Molecular Cloning: A Laboratory Manual’. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, New York.所述。所有限制酶和D N A修飾酶皆來自廠商。其 他常使用的方法如下所述。 ί - 1^1 »^^1 —^ϋ ^^^1 ). 1^1 n (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4 6 19 19 A7 _____ _B7 _ 五、發明説明（23) 浮液每4 0以又分裝至1. 5mj?聚丙烯試管內，並貯存 於-7 0 0C。 將冷凍的細胞在室溫解凍並立即置於冰上。將溶於. TE或黏合混合液的DNA 2-3βί加至細胞中，輕 輕混合並置於冰上1分鐘。把混合物轉移至預冷的0 . 2 〇111電穿孔小池杯（8：[〇-1^(1〇&士&1〇2#16 5 - 2086，81〇-Rad Laboratories, I.nc.)。將Bio-Rad Gene Pulser裝 置（Bio-Rad catalog #165-2075)的容量定爲 2 5 /z F ’電壓設定.2 .. 5 K V。Pulse Controller (Bio-Rad catalog #165-209 8)的電阻設定爲2 0 0歐姆。電穿孔 作用後，將1 m i? S 0 C培養基加到小池杯內。把細胞 懸浮液以塑膠滴管轉移到1 7 X 1 0 Omm聚丙烯試管中 並於3 7 °C培養1小時。再把細胞鋪於一選擇性培養基上 (Lur ia瓊脂內含有4 0 g / m j?的新黴素或 1 0 0以g / m又的氨苄青黴素。） 2 .尖鎌孢原生質體轉形作用 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 尖鎌孢株培養於2 4 °C的2 Omj?馬鈴薯六碳醣培養 物（P D B ; Difco Laboratories) v以 3 0 Am 網目尼 龍過濾物（Spectra/Mesh Nylon N，Spectrum Medical

Induseries, Inc.)過_爐微分生孢子。然後於室溫下， 1 ，5 0 O x g離心8分鐘將微分生孢子離心，再以消毒 過的蒸餾水清洗微分生孢子兩次。取約1 X 1 〇 微分生 抱子置於1 0 0 m 的P D B，於2 4 °c振盪培養1 5小 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）~ -26 - 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 4 6 1 9 1 9 A7 B7 五、發明説明（24) 時，1，500xg離心8分鐘以收集微分生孢子。利用 0緩衝液（1. 4M MgSO4，50mM檸檬酸鈉， PH5. 8)清洗微分生孢子二次，再以含2%奴佛酵素 (Novozyme) 2 3 4 :(BiosPacific, Inc).的 2 Οιηβ 0緩衝液，於2 4 °C處理微分生孢子1 - 2小時，當形成 9 0 %以上的原生質體時，將混合物置於2個1 5 m〆圓 錐形試管內，於4 °C，9 0 0 X g離心3 0分鐘。以T緩 衝液（1.2M山梨糖醇，50mM C a C ^ 2 > l〇m Μ 1'了18—1^(：义，？117.4)於4°(：清洗 原生質體二次，然後再懸浮於含6%聚乙烯乙二醇一 4 0 0 0和1%二甲基亞硕的Τ緩衝液，並調整濃度爲1 父109/1115。將原生質體分裝於1.51115聚丙烯試 管內並貯存在一7 0 °C。 把冷凍的原生質體置於室溫回溫，並加入核酸酶抑制 劑一,羅蘇酸二羧酸鹽（aurintricarboxylate)—使其最· 終濃度爲2mM。取含1 0-2 0 # g質體DNA的1 〇 认义 ΤΈ，加至2 〇 〇 μ 5原生質體懸浮液內，於冰上 反應3 0分鐘。加入含6 0%聚乙烯乙二醇—4 0 0/ 50mM .CaCj22的溶液200#义二次及 8 0 0 M —次，並且輕微地混合，然後置於冰上3 0分 鐘。加入10mj?的1. 2M山梨糖醇/0. 5XPDB 溶液，並輕微地混合。利用4。(：，9 0 X g離心8分鐘將 原生質體離心沈澱，再懸浮於〇 . 51115的1 _ 2M山梨 糖醇/ 0· 5 X PDB溶液。取〇· lmj^原生質體懸 本紙張尺度適用十國國家標準（CNS ) A4規格（210.X297公釐） ·/▲衣 n I I ~~ 訂 I ,.1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 6 19 19 a? B7 五、發明説明（25) 浮液，平鋪於含有二層的1. 2M山梨糖醇/〇. IX PDB/1. 5%瓊脂皿上。其中下層12. 5mj?培養 基含有.7 5 # g/m又的腐蟲黴素（phleomycin)，其可 慢慢擴散進入上層12. 5mj?培養基。把培養皿置於 2 4 °C培養7天。利用在含有2 0 # g /mj?腐蟲黴素的 1 X P D A培養基生長情形和質體D NA探針進行的 D N A點墨雜交法以確認轉形物。

3.從尖鎌孢萃取染色體DNA 尖鎌孢原生質體的製備如尖鎌孢原生質體轉形作用部 份所述。經過離心並以T緩衝液於4 °C清洗二次後，將原 生質體懸浮於4mj?分解緩衝液〔0.7M N a C 5 ·

1 〇 m M Tri_s— ίί〇5°ΡΉ8.. 0，l〇mM EDTA和1%硫酸十二酯鈉（SDS)〕，輕微混合並 於3 7°C反應5分鐘。將0. 4ιηβ含有1 〇%溴化六癸 基三甲基銨（c T A Β )的0 . 7 Μ N a C又加至原生 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項厍填寫本頁) 質體分解物中’輕輕混合並置於65 °C 15分鐘。加入 等體積的氯仿：異戊醇（2 4 : 1 )混合物以萃取染色體 D N A。收集水層並加入0 · 6倍體積的異丙醇沈澱染色 體DNA。在室溫’ 1 ，500xg離心5分鐘，以收集 DNA。以7 0%酒精洗DNA —次，並真空乾燥。將 DNA懸浮於含200//g核糖核酸酶A(EC3. 1. 2 7 · 5 ，購自 S i gma Chem i ca 1 Co..)的 1 m 又 T E 中

，並置於·3 7°C 2 0分鐘。.再加入蛋白酶κ·溶液（Ε C 本紙張纽適用中國國家標準（CNS ) A4· (210x297公釐) ' — A7 d61919 ___ B7_ 五、發明説明（26) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 3 4 2 1 . 1 4 ’ 購自 B〇ehringer Mannheim， Gm6H)使其取終濃度爲4 〇 〇 μ g/mj?，將此DNA溶 液置於3 7 °C反應2 〇分鐘。加入〇 . 1倍體積的3 Μ

NaCJ2 ，以等體積的酚：氯仿：異戊醇（25 : 24 : 1 )混合物萃取DN A溶液兩次。收集水層，加入2倍體 積的酒精沈澱染色體DMA。於室溫，1 ，5〇〇\2離 心5分鐘以收集D N A ’然後以7 0 %酒精清洗D N A， 真空乾燥並溶於lm$ .T.E中。 4 . D N A標識 D N A探針的製備係利用質體d N A或聚半乳糖凝膠 純化的D N A片段爲材料，以α - 32P — d c T P ( Amersham Corp.)利用缺口轉譯系統（Life Technologies，Inc.)進行標識》寡梭苷酸探針是利用r —32P - A T P及丁4聚核苷酸激酶酵素進行磷酸化。使 用標識探針前’將DNA探針置於1 〇 〇°C·加熱5分鐘使 其變性，’然後迅速置於冰上2分鐘。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 5 . D N A點墨雜交法 將DNA樣本置於〇. 4m$含0. 4M N a 0 Η ’ 10mM EDTA溶液中，於l〇〇°C加熱1〇分鐘 使其變性.，然後利用點墨裝置器（Min if old, Schleicher 6 Schnell，Inc.)於真空狀況下，將D N A樣品注入Bio -R a d Z e t a - p r o b e G T 膜（B i o - R a d L a b o r a t o r i e s，I n c. 紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' ~ 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 461919 A7 ___________B7__ 五、發明説明（27) )或硝基纖維素膜（Minifold，Schleicher & Schnell， Inc.)。把Zeta-probe GT膜置於一瓶內，加入5 m又雜 交緩衝液 10. 5M NaHP04* pH7. 2 > 7 % S D S )，於6 5 °C作用2小時並維持迴轉狀態進行前 雜交反應。然後再以5mj新鮮製備雜交溶液更新，並加 入DNA探針，於6 5 °C作用1 6 — 2 4小時並維持迴轉 狀態進行雜交反應。將雜交膜以含4 0 mM Na2HP04(pH7. 2)和 5% SDS 的緩衝液於 6 5 °C，沖洗3 0分鐘二次。然後再以含4 0 m Μ Na2HP04(pH7. 2)和 1% SDS 的緩衝液於 6 5 °C沖洗二次。當使用硝基纖維素膜，以相類似的條件 進行雜交反應，除了雜交緩衝液的組成份是6X SSC > 5 X Denhardt 溶液，1 OmM 磷酸鉀（ρΗ7· 2) ，0 ·. 1 % S D S和2 5 〇Λ g / m义的變性鮭魚精子 DNA。將雜交膜以2X SSC — 0. 1 % SDS溶 液於6 5 °C清洗30分鐘，然後以0. IX SSC — 0 . 1 % SDS溶液於6 5°C，沖洗3 0分鐘二次。若 使用寡核苷酸探針|則雜交和清洗的溫度爲5 0 °C。清洗 後，將膜暴露於 Kodak X.AR-5X X-Ray 底片（Eastman kodak Co.)進行自動放射線顯影》 6.南方DNA雜交法 尖鎌孢染色體D N A以許多不同限制酶將其完全水解 ，然後以含0. 25/zg/mi溴化乙錠的0. 8%瓊脂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210_X297公釐) ' (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) I ------ 裝------訂--------^.4、---------------- d 6 1 9 1 9

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 7 . 脂（ 株， 12 利用 後取 2 5 小時 P Η 2 5 液1 凝膠，利用T E A緩衝液進行電泳。把凝膠利用 Sambrook等人所述的方法-酸去嘌呤作用，鹼變性作用和 中和作用—處理，然後利用Bi0_Rad M〇del 785 Vacum

Blotter (Bio-Rad編號 # 1 6 5 — 5 〇 〇 〇 )將凝膠上 D ΝΑ轉移至Bi〇-Rad Zeta-probe GT膜或硝基纖維素膜 ° ϋ N A雜交法和自動放射線顯影法如上所述。 青黴素V醯胺水解酶酵素法 利用5 m又消毒的蒸餾水清洗生長在馬鈴薯六碳醣瓊 PDA，Difco Laboratories)培養皿上一週的尖鎌孢 以分離分生孢子。〇· 5m又的分生孢子溶液接種於 5 m j?錐形瓶中的2 5 m $尖鎌孢植物生長培養基。 2 5 0 r p m迴轉振盪器於2 4 °C培養7 2小時，然 0 _ 2mj?培養物接種於放在1 2 5m$錐形瓶內的 m又 PVA生長培養基，於24 °C振盪培養1 4 4 〇 將生'產培養物先稀釋於5 m Μ磷酸鉀緩衝液（ 7 . 5 )，取稀釋過的培養物1 m 3?加至溶於 mM磷酸鉀緩衝液（pH7. 5)的3%青黴素V溶 m又內，於3 5 °C振盪反應1 5分鐘.。然後加入 lmj? 5%(w/v)三氯醋酸（TCA)溶液終止此 反應。把混合物於1 ，500xg離心8分鐘，取lmj? 澄清上清液加至3mj^對一二甲基胺苯醛（p — DAB ) 反應溶液，於室溫反應5分鐘，然後測定4 1 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0 X 297公釐） 的吸 I ^衣 I I 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -31 經濟部t央標準局員工消費合作社印製 4 6 19 1 9 A7 ------^___B7_____ 五、發明説明（29 ) 光值。其中對—二甲基胺苯醛反應溶液的製備係取1份溶 於1 00%甲醇的1% p— DAB ，加上6份冰醋酸： 水：氫氧化納混合物_(4〇 : 19 : 1)而製成。對 照組試管內有lmj?濃度1 OOeg/mj?的6— ΑΡΑ 和3m$ P — DAB反應溶液，其在41 5 nm的吸光 值爲0 · 2 7。酵素活性（1 u / m $ )的計算係利用

4 1 5 nm的吸光值乘以〇 . 3 4和稀釋倍數。青黴素V 醯胺水解酶活性的表示爲國際單位（1 U ) ，1單位等於 1从mo 1 e青黴素v每分鐘在上述分析條件下的轉換率 〇 實施例1 :青黴素V醯胺酶胺基酸序列 將分泌型式的P VA酵素分離，純化並定其特性。其 爲一種醣蛋白，分子量丨6 5仟道耳頓。利用溴化氰水解純 化酵素，然後以葡.聚糖凝膠G - 1 00進行凝膠過濾，可 純化得到六個主要溴化氰水解P V A片段—A，B 1 ， c/MSr B 2，C，D和E。六個胜肽片段和完整PVA分子的氮 端胺基酸序列利用Edman降解方法決定（Hunkapiller and Hood，1 983，Science 2 1 9:650-6 5 9 )。獲得的胜肽 序列資料顯示於圖1。

實施例2 :青黴素v醢胺酶c D N A選殖 1.從尖鎌孢435株萃取mRNA 將尖鎌孢435株細胞培養在PVA生產培養基’以 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） — " -32 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 4 619 19 g 五、發明説明（30) 懸浮的胍異硫氰酸鹽緩衝液清洗，然後利用音波振盪打破 細胞。藉由離心穿越C s C 墊層（cushion)將RNA 分離（Glisin et al，1 9 74，Biochem. 1 3:2 6 33-2 637 ) 。經過蔗糖梯度分別法後，以寡（d T)層析法製備以 m R N A (Sambrook et a 1. , 1989，Molecular Cloning -A Laboratory Manual, 2nd edition)。再利用試管內 轉譯法和免疫沈澱法決定存在'每一部份的m R N A。 2. cDNA的合成和cDNA庫的製備 根據Gubler-Hof fman的方法從m R N A製備互補 DNA ( cDNA) (Gubler and Hoffman, 1983, Gene 25:263-269)。第一股D N A的合成係將含3; g m R N A * 5 0 m ώ Tris— HCl (pH7. 5 )> 6 5 m Μ K C ^ « 3 m M MgC^2’10mM DTT'〇. 5/ig ο 1 i g o ( d T ) ’ 2. 5/zg放射菌素D’lmM dNTP和2單位的鼠 白血病病毒（MLV)反轉錄酶的5 0 #义反應混合物於 〇°C反應3分鐘，2 0°C反應5分鐘和3 7°C反應1小時 。然後加入 0_5M EDTA 2//J2 和 3M N a C 5 5^32以終止此反應。利用酚/氯仿萃取此混 合物並以2倍體積酒精沈澱第一股DNA。第二股DNA 的合成係利用RNas.e H，DNA聚合酶和DNA連 接酶的修復合成反應。將合成的第一股DN A溶於含有 2 0 m M Tris— HC1 (pH7. 5 ) ’5mM 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4.規格（21QX297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 461919 A7 R7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、 發明説明 ( 31) Μ g C β 2 L ( )m Μ硫酸錢 L ( 〕( 〕Γ η Μ K C . ， 1 | 1 5 0 m Μ β — Ν A D 9 4 0 β Μ d N T P 5 β g 1 1 B S A » 1 單 位 大 腸 桿 菌 R N a S e Η 2 0 單 位 1 I D 請 1 | N A 聚 合 酶 I 和 1 單 位 大 腸 桿 菌 D N A 連 接 酶 的 1 0 0 閱 | 讀 1 I β 修 復 緩 衝 液 於 1 2 °c 反 應 1 小 時 > 然 後 2 0 °C 1 小 背 1 | 時 之 1 〇 再 加 入 3 Μ Ν a C Si 1 0 β 終 止 反 應 0 以 酚 / 注 意 1 氯 仿 事 1 萃 取 此 混 合 物 利 用 加 Λ'2 倍 體 積 酒 精 沈 澱 D N A 0 項 再 1 I 利 用 末 端 去 氧 核 4· + 甘 酸 轉 移 酶 ( T d Τ ) 和 d C T P 使 % 寫 本 1 C D N A 成 爲 C 尾 端 化 〇 取 1 η g 的 C 一 尾 端 化 C D N A 1 和 2 5 η g G — 尾 端 化 質 體 Ρ U C 1 9 接 合 0 利 用 此 接 I I 合 D N A 進 行 轉 形 作 用 和 於 大 腸 桿 菌 中 製 備 C D N A 庫 0 1 | 訂 | 3 寡 核 甘 酸 探 針 的 製 備 1 I — 組 四 個 寡 核 甘 酸 探 針 ( 圖 2 S E Q I D . 1 1 I Ν 0 1 1 ) 係 源 白 胜 肽 C ( 圖 1 S E Q I D 1 1 N 〇 5 ) 的 7 個 胺 基 酸 ( S Ε Q I D N 〇 r I 8 ) 的 反 轉 錄 序 列 其 中胜肽 C 序 列 位 於 近 P V C 酵 1 1 素 的 羧 端 〇 1 I 4 P V A C D N A 同 本 生 物 的 確 認 和 完 整 長 度 1 1 | C D N A 的 製 造 1 1 利 用 退 化 性 寡 核 +-»* 甘 酸 探 針 ( 1〇· 圖 2 S E Q I D 1 1 N 〇 1 1 ) 篩 選 C D Ν A 庫 的 菌 落 0 藉 由 3 2 P 端 標 1 1 識 的 探 針 與 菌 落 斑 點 於 5 0 °C 雜 交 緩 衝 液 ( 6 X N E T 1 1 本紙張尺展通用笮國囤冢標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） 461919 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 五、 發明説明 ( 32) 1 / 1 0 X Denh ardt S / : L % s D S ： 進行雜交反應 0 1 把 雜 交 膜 於 室溫 以 2 X Ν E τ - 0 . 1 % S D S 1 I 清 洗 二 次 ) 每 次 3. 0 分 鐘 然 後於 5 0 °C以 0 5 X 1 1 I N E Τ 一 0 1 % S D S 清 洗二 次， 每次 3 0 分鐘 〇 把 請 先 閱 1 1 具 強 烈 雜 交 訊 號 的菌 落 ( # 3 6 2 )做 進一 步 研 究。 其 含 讀 背 I 1 有 —. 5 0 0 b P 的嵌 入 基 因 可做 爲探 針再 次 篩 選 之 注 意 1 1 C D Ν A 庫 〇 第 二同 本 生 物 ( '# 2 5 8 5 ) 與 上 述探 針 具 事 項 1 I 再 1 | 有 強 烈 雜 交 反 應 ，而 其 含 有 1 .7 kb 嵌入 基 因 。比 較 1 太 裝 P V A 氮 端 胺 基 酸序 列 與 該 嵌 入基 因5 /端 轉 譯 序列 發 現 頁 1 1 除 了 缺 少 5 個 胺基 酸 該 成 熟酵 素的 完整 編 碼 區域 已 被 1 1 選 殖 ( iwt 圖 3 ) 0 利用 位 置 特 異 突變 作用 方法 在 1 .7 k b 1 | .嵌 Λ 基 因 的 5 〆 端製 造 一 P S t I限 制酶 作 用 位置 而 1 訂 I 產 生 # 2 5 8 5 —Μ 同 本 生 物 。加 入一 合成 的 連 接體 將 1 | # 2 5 8 5 — Μ 同本 生 物 轉 變 成完 整長 度c D N A’同 本 生 1 1 物 2 5 8 5 — F L ( 圖 3 和 4 ) 〇 1 1 ： 5 2 5 8 5 一 F L C D N A同 本生 物D N A 序列 分 析 1 2 5 8 5 一 F L 同 本 生 物 內嵌 入基 因的 二 股 D N A 序 1 列 利 用 Maxam- G i 1 ber t方法進行定序（Maxam and Gi lbe rt 1 | 1977 > Pr 0C . Natl > Ac ad • Sc i. USA75 ： 560 -5 64 ) 〇 此 1 嵌 入 基 因 含 有 1 5 2 1 鹼 基 對 開放 讀錄 (0 R F )， 可 編 1 1 I 碼 一 5 5 0 0 0道 爾 頓 蛋 白 質（ 圖6 )。 完 整 P V A 分 1 1 1 .子 氮 端 和溴 化 氰 水解 胜 肽 片 段 的所 有胺 基酸 序 列 資料 都 可 丨 在 此 序 列 上 發 現 。相 當 於 2 0 m e r寡 核苷 酸 探 針（ 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨PX297公釐） -35 - 461919 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（33) s E Q . ID. NO. :11)的區域（1348 至 工368 鹼基對，SEQ. ID. NO. :20)在 圖6中以底線加註方式標明" 實施例3:青黴素V醯胺酶基因組DNA選殖 1. 基因組PVA基因片段的確認 將源自尖鎌孢4 3 5株的^分子量染色體D N A以許 多限制酶水解，然後利用〇 . 6 %聚半乳糖凝膠和T A E 緩衝液進行電泳，再將D N A轉移至硝基纖維素紙。利用 2 5 8 5嵌入基因的DNA製備探針，進行南方點墨法以 決定含有P V A基因片段的分子量。此基因被發現存在於 —約12kb EcoRI片段中》 2. pWB19N質體的構築 將pBMll (ATCC 67366)內位於抗新 黴素基因的N c ο Γ限制酶作用位置以位置特異突變作用 法去除，而產生pBMll/M5(ATCC 67436)質體。以H.ind IE和Sma I水解 pBMl1/M5質體，然後利用大腸桿菌DNA聚合酶 I的klenow片段將H i n d Π水解後產生的突出端轉變 成鈍端。把D N A混合物以〇 . 8%聚半乳糖凝膠進行電 泳分離’將含有抗新徽素基因的1 . 3 k b片段利用電析 出法，於室溫’ 1 0 0 V作用條件下反應1小時而從凝膠 內回收。收集此析出物並以等體積T E —飽和的酚萃取三‘ _；----------.裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、?τ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公慶） -36 -

461919 S 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、 發明説明 ( 34) 次 收 集 水 層 > 並 以 含 0 3 Μ N a C 的 酒 精 進 行 1 I D N A 沈 澱 〇 利 用 聚 半 乳. 糖 凝 膠 電 泳 分 析 回 收 的 D N A 片 1 1 段 0 y*—' 1 I 請 | 以 B S Ρ Η I 裂 解 Ρ U C 1 9 質 體 D Ν A ( 先 閲· 1 I 讀 1 I Yan i sch - Pe r r on e t a 1 • 9 1 9 8 5, G en e, 33 ： 103- 11 9 ) 背 1 | 之 1 I 再 利 用 kl enow 片 段 將 5 突 出 端 轉 變 成 鈍 端 0 將 含 有 多 連 注 意 1 | 事 1 接 體 位 置 和 複 製 起 始 點 的 1 6 k b 片 段 ( 編 號 2 6 3 9 項 存 1 κ ά 至 2 6 8 6 和 編 號 1 至 1 5 2 6 鹼 基 對 ) 分 離 然 後 利 用 % 禽 本 頁 1 .連 接 緩 衝 液 ( 5 0 m Μ Τ r i S —- Η C 1 P Η 7 6 1 I ， 1 0 m Μ Μ g C 1 2 ] Π 1 Μ A Τ P ] .Ώ n Μ D T T 5 % 聚 乙 烯 乙 二 醇 — 8 0 0 0 ) 和 Τ 4 D N A 1 1 連 接 酶 作 用 將其 與 1 3 k b 抗 新 黴 素 基 因 片 段 相 連 接 〇 訂 產 生 的 質 體 命 名 爲 Ρ B Μ 1 9 N 並 藉 電 穿 孔 作 用 進 1 I 入 大 腸 桿 菌 D Η 5 a 細 胞 0 利 用 抗 菊Γ 黴 素 青 黴 素 敏 感 性 I 和 位 於 X — S a 培 V 養 血 上 的 β — 半 乳 糖 -p-f· 甘 酶 a -— 互 補 作 1 Μ Ι 用 活 性 篩 選 P B Μ 1 9 Ν 質 體 0 P B Μ 1 9 Ν 質 體 lis. 的 構 築 顯 示 於 圖 8 〇 此 質 體 利 用 kl enow 填 滿 使 Η i η d m 和 1 1 B S P Η I 接 合 點 有 一 回 復 的 B S Ρ Η I 酵 素 作 用 位 I 置 〇 1 1 I 3 基 因 組 P V A 基 因 片 段 的 選 殖 1 1 1 1 取 1 0 0 β g 源 白 尖 鎌 孢 4 3 5 株 的 高 分 子 量 染 色 體 1 1 D N A 以 Ε W R I 水 解 然 後 利 用 0 * 6 % 聚 半 乳 糖 凝 膠 1 1 和 T A E 緩 衝 液 進 行 電 泳 0 將 D N A 分 子 量 1 1 5 k b 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -37 - 461919 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A 7 B7 ___ 五、發明説明（35) 至12kb的片段利用室溫下1oov反應1小時的電析 出作用從凝膠中回收，然後以等體積的T E飽和酚萃取三 次。回收水層並以含0. 3M NaCJ?的酒精沈澱 DNA，然後將約1 2kb DNA片段載入 pBMl 9N載體以產生pF02 1(圖5)。 P F Ο 2 1 DNA經限制酶作用分析顯示：其含有完整 的PVA基因和位於PVA編/碼序列上游3. 7kb及下 游6.8kb的額外序列。 4 . D N A序列分析 利用Maxam-Gilbert方法分析基因組同本生物編_碼區 域的D N A序列（圖7 ) » c D N A和基因組序列是相同 的，除了 cDNA同本生物5 /端有嵌入一合成的連接體 。在基因組同本生物的5 /端有一額外的3 1 5鹼基對。 此資料顯示PVA mRNA的轉譯起始於圖7的第 2 4 1鹼基，並且先合成一含2 5個胺基酸訊號序列的" 前—PVA"，然後裂解產生分泌型式的PVA酵素。 利用S 1定圖方式決定轉錄起始點（Berk and Sharp, 197 7，Cell, 12:721-732; Sambrook et a 1., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd edition)而證實其位於或近於第1 6 2鹼基，並且在此 位置和第2 4 1鹼基A TG之間沒有其他可能的A T G轉 譯起始訊號。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2.10X297公釐） -38 - A7 B7 461919 五、發明説明（36) 實施例4:在異種宿主內表現PVA基因 1.質體PSJC62的構築 質體 P E S 2 0 0 (Staben et ai_，1 989，Fungal

Genet. Lett. 36:79-81)具有源自小巣狀麵菌（ Aspergillus n i du 1 ans )的t r p C啓動者序.列，可引導 抗細菌濕黴素B基因的轉錄作用。將pEs200 DNA以EcoRI和C 1 a Ί限制酶水解，利用k丨e n 〇 w 片段把5 /突出端轉變成鈍端。利用聚半乳糖凝膠電泳分 離含1 250 bp tr. pC啓動者的片段，並以電析出 法回收此DNA片段。質體pUT7 1 5 (Jain et al.， 1 9 9 2，Mol. Ge. Genet.2 34:48 9 -49 3 )是一種啓動者探針 載體，帶有源自於印度斯坦鏈異壁菌（ S.treptoallteichus hindustanus)的啓動者不足（ promoter-less)的抗腐蟲黴素基因。將pUT7 1 5 DAN以E c oRV水解然後連接到1 2 5 Ob p的 t r p C啓動者片段。把連接混合物經轉形作用進入大腸 桿菌DH 5 α細胞，並將形成的質體命名爲P UT7 1 5 / t r p C。

將 pUT715/t rpC 以 Bam HI 和 Bg 1 Π限制酶水解’然後經過聚半乳糖凝膠電泳後’把含有 t r pC啓動者和抗腐蟲黴素基因的2. 4 k b DNA 片段分離。把PWB19N DNA以Bam Η I水解 並連接至2. 4 kb DNA片段，然後將形成的質體命 名爲 pSJC62(圖 9)。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21QX297公釐） ^ 訂 贫 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員.工消費合作社印製 -39 - 461919 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（37) 2. PF023的構築 質體P F 0 2 1具有一源自於尖鎌孢4 3 5株基因組 DNA約12kb EcoRI片段的嵌入物。把pF〇 2 1 D N A以S a 1 I酵素水解並以T 4 D Ν Α連 接酶再環化，而形成一具有源自於p F 0 2 1但尖鎌孢 D Ν A非編碼區域D N A 5. ' 8 k b缺失的質體_ p F 0 2 3 (圖 5 )。 3. pBMFXPVA6的構築 將 pSJC62 DNA 以 EcoRI 和 Xba I 水解，形成一含有麴菌t r p C啓動者和抗腐蟲黴素基因 的2 . 4 k b D Ν A片段，並將其分離。將p F 〇 2 3 D Ν Α以E c o R Γ和X b a I水解，利用聚半乳糖 凝膠把DNA混合物分開。把含有pva基因的 7. 9 k b DNA片段分離，並連接到含麴菌trpC 啓動子和抗腐蟲黴素基因的2 . 4 ,k b DNA片段。形 成的質體命名爲PBMFXPVA6 (圖10) ◊ 4. pBMFXPVA7的構築 把 pBMFXPVA6 DNA 以 Ncol 和 X b a I裂解，利用kl enow片段將黏合端轉變成鈍端。藉 由聚半乳糖凝膠將此DNA混合物分開，並把含PVA基 因的4. 3 k b DNA片段分離出《以Xbal酵素水 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .¾ 、言 本紙張尺度適細綱準⑽）Μ規格（胸297如—4卜 A7 B7 91 9 五、發明説明（38) 解PBMFXPVA6 DNA並以kl enow片段處理。將 直線型的PBMFXPVA6 DNA連接至4. 3kb 的PVA基因片段而形成PBMFXPVA7(圖11) 〇 5_ PVA基因在異種宿主內表現 重組質體PBMFXP V A 6是衍生自pF〇23 ( 圖5 ) ’並含有經由小巢狀麴菌t r p C啓動子調控的抗 腐蟲黴素基因。（圖10)。重組質體pBMFXPVA 7是衍生自pBMFXPVA.6，並含有第二套的pvA 基因（圖1 1 )。將這些重組質體經由聚乙烯乙二醇媒介 原生質體轉形作用（Powell and kistler，1 9 90, J. Bacteriol. 172:3163-3171)引入A T C C 16322 株(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici )，它是 P V A基因的異種宿主（即尖鎌孢的一種不同亞種）。經 由抗腐蟲黴素轉形物的D N A分析確認此轉形D N A已嵌 入宿主染色體內。同時，尖鎌孢4 3 5株並無法藉由聚乙 烯乙二醇媒介原生質體轉形作用的程序進行轉形作用。 將轉形物培養在振盪的錐形瓶內並分析其P V A活性 。尖鎌孢4 3 5株的？乂八活性爲2 0 111/1115。未轉 形的ATCC 16322株之PVA活性爲1. 01U /mj?;具有pBMFXPVA6質體（含一個PVA基 因）的轉形物其PVA活性爲1〇 I u/mj?;而具有 PBMFXPVA7質體（含二個PVA基因）的轉形物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 「 · - nn In -111 -1 I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 9 ill 9 i— 6 4

7 B 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（39) 其PVA活性爲130IU/mi (表2)。總括而言， 在異種宿主內PVA活性的表現超過原始尖鎌孢4 3 5株 達5倍之多。 表2 青黴素V醯胺水解酶酵素活性 菌株 振盪錐之效價（IU/ml) 尖鎌孢435株 20 ATCC16322 1 ATCC16322(pBMFXPVA6)+ (―個PVA基因） 10 ATCC16322(pBMFXPVA7)+ (二個PVA基因） 130 而且，重組P VA的表現也可誘導至尖鎌孢4 3 5株 在苯氧醋酸鹽存在時相同的程度（表3)。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -----------裝--------訂------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 461919 五、發明説明（40) 表3 ' 苯氧醋酸鹽誘導青黴素V醯胺水解酶基因表現 菌株 不加.苯氧 醋鹽之效 價（IU/ml ) 加苯氧醋酸 鹽之效價 (IU/ml ) 誘導 程度 尖鎌孢435株 0. 49 21.13 43X ATCC 1 6 3 2 2 CpBMFXPVA7)+ 2.73 135.32 5 0X . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 「裝. 訂 翅濟部中央樣準局員工消費合作，社印製 實施例5:真菌表現載體之構築 藉由添加苯氧醋酸鹽可誘導P VA基因的表現。彳良明 顯地，發展一含有P VA轉錄和轉譯調控區域（宜做爲— 啓動者）的表現載體，可將外來基因在尖鎌孢中表現出來 。以下構築產生的質體P BMPVA-P可做爲表現細胞 內蛋白質之用，質體P BMP V A— Μ可做爲表現分泌型 蛋白質之用。 1.PFO20之構築 將 pF023 DNA 以 BamHl 片段和 xho I 水解，然後利用聚半乳糖凝膠將DNA混合物分離。把含 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 461919 A7 _____B7_ 五、發明説明（41) 有PVA基因5/端上游轉錄及轉譯調控序列的 2 . lkb DNA片段分離出來。把pF〇23以 Xh ο I和H i n dm水解，利用凝膠分離並純化一含 PVA基因後面部份的1. 5 kb DNA片段。將此二 片段連接至pUC 1 9的H i n dffl和B amH I位置。 pF020的構築圖示於圖12。 2. pFO20 — P之構築 利用源自於Mor.inaga等人（ 1984，Bio/Technol. 2: 636-639)的位置特異突變法，在PVA基因的轉譯起始 位置產生一Mlul位置（SEQ. ID. NO.： 2 1第2 4 1鹼基對）AT^PGCGTC (SECUD. ΝΟ·:24) 位置特異突變法 1 'ATACGCGTC (SEQ. ID. NO.:25) Mlul site ’ 產生的Mlul位置可允許藉由Mlul和 B amΉ I裂解將PVA基因的編碼區域去除，然後在 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 來ΑΙ 出Τ 現 A 表 T 列 C 序 A 碼 C 編 G 因 G 基C 來酸 外ί甘 的核 代寡 取變 將突 下 r 控 e 調m 者 5 動 1 啓 一 A 成 V 合 ρ ο

C T GI C GI

2 〇 F P 〇 3 N 1 圖 •於 D 示 I 圖 築 構 Q 的 E P S | 2 的 g 2 取 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 461919 A7 B7 五、發明説明（42) . p F 0 2 0以X m a I水解，然後以細菌鹼性磷酸酶（ BAP)處理防止片段I的自我連接。取p f 〇 2 0以E c 〇 'R I和S p h ][水解去除突變標的區域（即 P VA基因的上游區域），產生的5 k b片段（片段E ) 利用凝膠純化。取相同莫耳數的片段〗和片段π，然後與 2 0 0倍過量莫耳數的1 5 m e r突變寡核替酸混合。首 先將混合物於1 0 0°C加熱3分鐘使.DNA完全變性，然 後以逐漸冷卻方式使變性的D N A片段再次核酸混合。再 此核酸混合過程中，.除了原始的片段I和！！之外會形成二 '種新的DNA，即DNA~a和.DNA— b。如圖1 3所 示’此15 m e r突變寡核苷酸只會與二種環狀dn A中 的一種形成異形雙螺旋鏈’因爲寡核苷酸只與標的區域的 二股DN A中的一股相互補。把D N A與kl enow片段， T4 DNA連接酶和4種dTNP混合反應，使開放式 環狀D N A轉變成封閉式環狀DNA »然後把混合物進行 大腸桿菌DH 5 α的轉形作用，再利用Μ 1 u I水解分析 法篩選轉形物的質體DNA。所得到含有一Ml u I位置 的質體命名爲PFO20 — P。 3. pBMPVA — P 之構築 因爲pF〇2 0 — P有二個B amH I位置，而使其 無法做爲表現載體之用’因此來自於PU C 1 9載體區域 的B amH I位置必需去除。將PF〇2 0 — P以限量的 B a mH I酵素處理，以產生一部份裂解之狀態’然後再 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 I-----^-------------1^1-------1T------^漆------ -45 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 6 1 9 1 9 a7 B7 五、發明説明（43) 以E c 〇 R I水解。形成的5,突出端以klenow片段填滿 。將6· 3 k b DNA片段以凝膠純化，以τ4 D ΝΑ連接酶連接然後轉形至D Η 5 α。形成的質體 pBMPVA — Ρ (圖14)可做爲一表現載體，在 M l u I /B a mH I位置嵌入一欲表現基因的編碼序列 ，利用ΡVA啓動者調控表現出蛋白質。 4. pF〇20— Μ之構築 在P VA分泌訊號序列和成熟P VA蛋白質接合位置 製造—Smal 位置（SEQ· ID. NO. :22 第24 — 25胺基酸）。 AACAAA/GGCAAC (SEQ. ID. NO.27) N K G Ν (SEQ. ID. NO.:28) :位置特異突變法 ” ；! AACCCC/GGGAAC (SEQ. ID. NO.:29)

Smal site 產生的S m a I位置可允許在D N A.分泌訊號序列之 後嵌入一編碼序列，然後使此表現蛋白質分泌至細胞外。 合成一 28me r突變寡核苷酸（GCAGCTCCCA A C C C C G G G A ACGATGATT > SEQ. ID. N 0 . : 3 0 )。 p F 0 2 0 - M之構築圖示於圖1 5。此程序類似於 PFO20-P之構築。質體PFO20以XmaI水解 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ -46 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. -訂 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 461919 五、發明説明（44) ，然後以BAP處理產生一片段I 。pF〇20然後以 S p h I和H i n dm水解去除標的區域，而形成片段Π 。異形雙螺旋鏈形成和D N A伸展之反應條件類以於 'pFO20 — P之構築。利用產生額外的一Sma I位置 以篩檢轉形物之質體D N A。 5. PBMPVA-Μ之構築 質體P F 0 2 0 — Μ有二個B a m Η I和二個 SmaI位置，因此無法使用此載體，必需將來自於 pUC l 9區域的額外B amH I和Sma I位置去除。 將p F 0 2 0 — Μ以B a m Η I部份水解，然後以 E c 〇 R I裂解。所產生的黏合端以kl enow片段填滿。將 6. 3kb DΝΑ片段以凝膠純化，連接並轉形至大腸 桿菌DH5a。形成的質體pBMPVA— Μ (圖1 6) 可做爲一可分泌的表現載體，利用在Sm a I / B a mH I位置嵌入一欲表現基因的編碼序列，藉由 P V A啓動者調控而表現出蛋白質。 實施例6 :利用P V A表現載體表現D型胺基酸氧化酶基 因 選用選殖於三角酵母（Trigonopsis var.iabilis)的 D型胺基酸氧化酶基因做爲一例子，利用尖鎌孢PVA表 現載體將此外來基因表現於尖鎌孢。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -----------ί ------tr~------r^!——---------- (請先聞讀背面之注項再填寫本頁) 47 ~ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 461919_ b7______五、發明説明（45) 1.利用pBMPVA-P表現D型胺基酸氧化酶基因 三角酵母的D型胺基酸氧化酶（D-Amino acid oxidase, DAA0)基因是被 Bristol-Myers Squibb 科學家 所選殖出。該D N A序列分析顯示：接近編碼序列5 e端 存在一3 8鹼基對的插入.序列。利用寡核苷酸直接位置特 異突變法將此插入序列去除，然後在D A A 0基因轉譯起 始位置製造一 N c ο I位置。因此，可純化得到一含 DAAO編碼序列加上700bk 3/端非轉錄區域的 2 . 1 k b NcoI/B_am.HI 片段。 質體pBMPVA—P DNA以Mlul水解，然 後利用kl enow片段將黏合端填滿。再以B a m η I裂解 DNA。利用凝膠純化含有PVA啓動子區域的 4. 7kb片段。將DAA0基因片段連接至含DAA0 .. . 基因的 2. 1 kb NcoI-klenow/BamHI 片段 ，以形成質體PBMPVA — P/DAA01 。利用 N d e I 裂解和 klenow填滿 p BMP V A — P/ D A A 0 _1質體，可製備3 . 4 k b P V A啓動子/ DAAO基因融合片段，然後利用凝膠純化。將此片段嵌 入p S J C 6 2 DNA，然後以klenow填滿Xb a I位 置。形成的質體命名爲PBMPVA — P/DAA02。 此質體之構築圖不於圖1 7。 利用聚乙烯乙二醇媒介原生質體轉形作用將此 PBMPVA-P/DAA02 DNA送入ATCC 1 6 3 2 2株。藉由對腐蟲黴素之活性篩選轉形物。將許 本紙張尺度適用中國國家標準^"CNS ) A4堤格（210χ297公釐） '~~~-48 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 461919 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（46) 多轉形物培養於P v A生產培養基，然後分析其D型胺基 酸氧化酶活性。結果顯示：在ATCC 16322轉形 物表現的D型胺基酸氧化.酶活性爲〇. 2-0. 8 I U/ m又。 2. 利用ρ BMP VA— Μ表現D型胺基酸氧化酶基因 質體pBMPVA-M DNA以SmaI和 B a mH I水解，利用凝膠將含P VA啓動子區域和 Ρ V A可分泌訊息序列的4 · 8 k b .片段純化。利用 Nc 〇1裂解和mu n g豆核酸酶處理DAAO基因以去 除5 /突出端並維持一適當的DAAO基因讀錄，然後以 B a m Η I水解，以產生一 2， 1 kb DA AO基因片 段。將4 · 8 k b Ρ V A啓動子/訊息序列片段連接至 2.lkb DAAO基因片段以產生質體pBMPVA —M/DAA03。將 PBMPVA — M/ DAA03 以 Ndel裂解，然後以klenow片段將5 /黏合端填滿。將 3. 5 k b PVA啓動子一訊息序列/DAAO基因融 合片段純化，然後嵌入PSJC62 DNA的klenow填 滿Xb a I位置。形成的質體命名爲pBMPVA — M/ DAA04(圖 18)。 將 pBMPVA— M/DAA04 DNA 轉形進入 ATCC 16322株。把許多抗腐蟲黴素的轉形物分 析其D型胺基酸氧化酶活性。很不幸地’並沒有任何一個 轉形物具有D型胺基酸氧化酶活性。利用P BMP V A - ί· HI ^^^1 fn 1^1 l· - - - II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） -49 - 461919 A7 _ B7 五、發明説明（47) Μ載體並無法表現D型胺基酸氧化酶基因的原因可能是由 於D型胺基酸氧化酶本身是屬於細胞內蛋白質。而我們已 知：編碼細胞內蛋白質的基因無法利用可分泌表現系統表 現'並且轉移至細胞外（Model, and Russel, 1990, Cell 61:739-741)。即使基因晕在細胞內表現，連接上的 P V A訊息序列可能會使D型胺基酸氧化酶失去活性。因 此，pBMPVA-M載體仍可有效表現其他可分泌蛋白 質基因。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -50 -

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 附件二A :第85100102號專利申請案中文說明書修正頁 民國89年11月修正 c 1)〜般資料： (i)申請人：Chiang, Shu-Jen

Burnett Jr., ffillian V.

Tonzi, Sean M. (U)發明名稱：源自尖鎌孢（FUSARIUM OXYSPORUM)之青 黴素V醯胺水解酶基因 Ciii)序列數目：30 G v )通訊地址： (A) 收件人：Thomas R. Savitsky (B) 街：P. (K Box 40 0 0 (C) 市：Princeton (D )州：紐澤西州 ' (E) 國：美國 (F) ZIP：08543 (v )電腦可讀格式： (A) 媒介形式：Floppy disk (B) 電腦：IBM可相容者

(C) 作業系統：PC-DOS/MS-DOS (D) 軟體：Patentln Release #1.0，Version #1· 30 (vi)目前申請資料： (A) 申請案號：08/363,475 (B) 申請日：23-DEC-l 994 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

n n n n n 1^1 ϋ 一 5, _ 1 I n n n n I -51 - 6 19 19 A7 ___B7_ 五、發明說明（49 ) (C)分類： (v i i i )律師/代理人資料： (A )姓名：S a v i t s k y，T h 〇 m a s R · (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (B )登錄號：3 1，6 6 1 (C)參考/案件編號：ON-O134 (ix)電傳資料： (A )電話：（6 Ο 9 ) 2 5 2 4 9 5 6 (Β)傳真：（ 6 0 9 ) 2 5 2 45 2 6 (2)SEQ ID NO : 1資料： (i )序列特徵： (A) 長度：29個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (C) 股性： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (D )拓撲學：線形 (i i )分子種類：肽 (v)片段種類：N-終端 (v i )最早來源： (A )生物體：尖鎌孢 (ix)特色： (A )名稱/關鍵字··肽 (B )位置：7 (D) 其它資料：/注意事項="第7個胺基酸可以是ala 或.1 y s " 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -52 - A7 461919 B7___ 五、發明說明（5〇 ) (i X )特色： (A)名稱/關鍵字：肽 (B )位置：2 2 (D)其它資料：/注意事項第22個胺基酸可以是 T h r 或 V a 1 " 、 (x i )序列說明：S E Q I D Ν Ο : 1 :

^ I >

Glv Asn Asp Asp Phe Ala Xaa Lys Xaa Ala Ser Leu Ly? Lys Ser Leu 3. 5 l〇 15

Lvs Leu Pro Gly Thr Xaa Val Tyr Phe Thr Gin His Val 20 25 (2)SEQ ID NO: 2資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：12個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (C) 股性：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii) 分子種類：肽 (ix)特色： (A) 名稱/關鍵字：肽 (B) 位置 (D)其它資料：/注意事項="第7個胺基酸可以是ser 或 pro" (i X )特色： (A)名稱/關鍵字：肽 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱績背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂---------" 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -53 - A7 4 6 19 19. B7 _ 五、發明說明（51 ) (B )位置：7 (D)其它資料：/注意事項=”第22個胺基酸可以是 a 1 a 或 1 e u 丨' (i X )特色： (A )名稱/關鍵字：肽 (B )位置：8 (D)其它資料：/注意事項第8個胺基酸可以是asp 或 g 1 u " (ix)特色： (A )名稱/關鍵字：肽 (B )位置：1 2 (D)其它資料：/注意事項第12個胺基酸可以是 t y r 或 a r g ” (xi )序列說明：SEQ I D NO : 2 :

Gly Leu Asn Xaa Ser Gin Xaa Xaa Gin Phe Tyr Xaa 1 5 . 10 (2)SEQ ID NO: 3資料： (i )序列特徵： (A) 長度：12個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (C) 股性： (D )拓撲學：線形 (i i )分子種類：肽 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ---

tr---------A 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -54 - A7 461919 ___B7____ 五、發明說明（52 ) (ix)特色： (A) 名稱/關鍵字：肽 (B) 位置：8 (D)其它資料：/注意事項="第8個胺基酸可以是ser 或 1 y s " (xi)序列說明：SEQ ID N0:3:

Leu Val Lys Thr Gly Pro Ala Xaa Xaa Val Ser He 1 5 10 (2)SEQ ID NO: 4資料： (i )序列特徵： (A) 長度：10個胺基酸 (B) 種類：胺基酸 (C) 股性： (D) 拓撲學：線形 (ii)分子種類：肽 (ix)特色： (A) 名稱/關鍵字：肽 (B) 位置：8 (D)其它資料：/注意事項="第8個胺基酸可以是ser 或 1 y s" (xi)序列說明：SEQ ID N0:4:

Gly Asn Asp Asp Phe Ala Ala Xaa Xaa Ala 1 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

;· n n n 1· n ϋ -I 一aj· 1 ϋ i>i ϋ ϋ 1 I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -55 - A7 461919 B7____ 五、發明說明（53 ) (2)SEQ ID NO: 5資料： (i )序列特徵： (A )長度：2 0個胺基酸 (B)種類：胺基酸 (C )股性： (D )拓撲學：線形 (i i )分子種類：肽 (i X )特色： (A) 名稱/關鍵字：肽 (B) 位置：3 (D)其它資料：/注意事項="第7個胺基酸可以是asn 或 lys" (ix)特色： (A) 名稱/關鍵字：肽

(B) 位置：U (D)其它資料：/注意事項="第13個胺基酸可以是 i 1 e 或 a r g '· (xi)序列說明：SEQ ID N0:5:

Gly Xaa Xaa Thr Ala Asp Thr Asn Val Leu Leu Ala Xaa Val Lys Trp 1 5 10 . 15

Val Glu Glu Gly 20 (2)SEQ ID NO : 6資料： (i )序列特徵： (A)長度：25個胺基酸 (B )種類：胺基酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂---------峻 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -56 - A7 461919 _____B7___ 五、發明說明（54 ) (C) 股性： (D) 拓撲學：線形 (i i )分子種類：肽 (i X )特色： (A) 名稱/關鍵字：肽 (B )位置：1 6 (D)其它資料··/注意事項="第16個胺基酸可以是asn 或s e r '丨 (i X )特色： (A )名稱/關鍵字：肽 (B) 位置：21 (D)其它資料：/注意事項="第21個胺基酸可以是 a s η 或 h i s 丨’ ’ (i x )特色： (A )名稱/關鍵字：肽 (B )位置：2 3 (D)其它資料：/注意事項="第2 3個胺基酸可以是 v a 1 或 s e r " (i x )特色： (A)名稱/關鍵字：肽 (B )位置：2 5 (D)其它資料：/注意事項=”第25個胺基酸可以是 thr或 arg" (xi)序列說明：SEQ ID N0:6: 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） ~ " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------蟓 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 461919 __B7____ 五、發明說明（55 ) lie His Trp Ser Gly Leu Glu Asp Gly Leu lie Ser Ala Glu Asn Xaa 1.5 10

Asp Tyr Tyr Asn Xaa Val Xaa Ser Xaa ' 20 25 (2)SEQ ID NO : 7資料： (i )序列特徵： (A)長度：4個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (C) 股性： (D )拓撲學：線形 (i i )分子種類：肽 (xi )序列說明：SEQ ID NO : 7 :

Pro Tyr Asn Asp 1 (2)SEQ ID NO : 8資料： (i )序列特徵： (A)長度：7個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (C )股性： (D) 拓撲學：線形 (i i )分子種類：肽 (xi)序列說明：SEQ ID N0:8:

Val Lys Trp Val Glu Glu Gly 1 5 (2)SEQ ID NO : 9資料： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------， 裝--------訂---------唉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -58 - 4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6 19 19 A7 _:_ B7五、發明說明（56 ) (i )序列特徵： (A) 長度：20個鹼基對 (B) 種類：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線形 (ii)分子種類：cDNA (xi )序列說明：SEQ I D NO : 9 : GTNAARTGGG TNGARGARGG (2)SEQ ID NO: 10資料： (i )序列特徵： (A)長度：20個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股性：單股 (D)拓撲學：線形 (ii)分子種類：cDNA (xi )序列說明：SEQ ID NO: 10 : CCYTCYTCNA CCCAYTTNAC (2)SEQ ID NO: 11資料： (i )序列特徵： (A) 長度：20個鹼基對 (B) 種類：核酸 (C )股性：單股 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------Αέ, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -59 - 461919 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7__五、發明說明（57 ) (D )拓撲學：線形 (i i )分子種類：cDNA (X i )序列說明：S E Q I D N 0 : 1 1 : i CCYTCYTCNT CGGAYTTNAC I (2)SEQ ID NO : 12資料： (i) 序列囀徵·· (A)長度：10個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (C) 股性： (D) 拓撲學：線形 (i i )分子種類：肽 (v)片段種類：N-終端 (xi )序列說明：SEQ ID NO : 1 2 : Gly Asn Asp Asp Phe Ala Ala Lys Cys Ala 15 l〇 (2)SEQ ID NO : 13資料： (i )序列特徵： (A )長度：5個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (C) 股性： (D) 拓撲學：線形 (ii) 分子種類：肽 (X i )序列說明：S E Q I D N 0 : 1 3 : (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ----訂---------唉 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -60 - 461919 A7 _ B7 ___ 五、發明說明（58 )

Val Ala Lys Cys Ala 1 5 (2)SEQ ID NO: 14資料： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (i )序列特徵： (A) 長度·· 23個鹼基對 (B) 種類：核酸 (C )股性：單股 (D)拓撲學：線形

(ii)分子種類：cDNA (xi )序列說明：SEQ ID NO: 14: I TTTTTTTTGT AGCGAAATGC GCC 丨 23 (2)SEQ ID NO: 15資料： (i )序列特徵： (A) 長度：23個鹼基對 (B) 種類：核酸 (C )股性：單股 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (D )拓撲學：線形 (ii)分子種類：cDNA (X i )序列說明：S E Q I D N 0 : 1 5 : TTTTTTCTGC AGCGAAATGC GCC 23 (2)SEQ ID NO : 1 6資料： (i )序列特徵： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -61 A7 461919 ___ . B7_ 五、發明說明（59 ) (A )長度：3 3個鹼基對 (B)種類：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線形 (i i )分子種類：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID NO: 16:

CCCGGGAACG ACGACTTTGC AGCGAAATGC GCC (2)SEQ ID NO: 17資料： .(i )序列特徵： (A) 長度：33個鹼基對 (B) 種類：核酸 (C) 股性：單股 (D )拓撲學：線形 (ii)分子種類：cDNA (X i )序列說明：S E Q I D N 0 : 1 7 : GGCGCATTTC GCTGCAAAGT CGTCGTTCCC GGG 33 (2)SEQ ID NO: 18資料： (i )序列特徵： (A) 長度：1767個鹼基對 (B) 種類：核酸 (C )股性：單股 (D) 拓撲學：線形 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 ----訂---------竣 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -62 - 461919 A7 B7 五、發明說明（6〇 ) (ii)分子種類：cDNA (i X )特色： (A)名稱/關鍵字：CDS (B )位置：1 . 1 5 2 1 (xi )序列說明：SEQ ID ΝΌ: 18 ·· GGC AAC GAT GAT TTT GCC GCG AAA TGC GCC AGC CTC AAG AAG TCG CTC 48 Gly Asn Asp Asp Phe Ala Ala Lys Cys Ala Ser Leu Lys Lys Ser Leu 1 5 10 15 • AAA CTC CCC GGC ACC ACC GTA TAC TTC ACC CAG CAT GTC TCG GCT GGT 96 Lys Leu Pro Gly Thr Thr val Tyr Phe Thr Gin His Val Ser Ala Gly 20 25 30 ACC AAC ATC ACT TTC CCC GAT AAT CAC CCG ACC TGC GGT CCT AAC TAT 144 Thr Asn lie Thr Phe Pro Asp Asn His Pro Thr Cys Gly Pro Asn Tyr 35 40 45 CAG GTT ACG GAC GTT GAG GTC TGC CGC GTG GCC ATG TTA GTC AAG ACG 192 丨 Gin Val Thr Asp Val Glu Val Cys Arg Val Ala Met Leu Val Lys Thr j 50 55 60 J GGA CCC GCC TCA AAC GTT AGC ATC GAA GCT TGG CTT CCC TTG AAC TGG 240 j Gly Pro Ala Ser Asn Val Ser He Glu Ala Trp Leu Pro Leu Asn Trp 65 70 75 80 ACA GGT CGG TTC TTA GGA ACT GGC AAT GGT GGA TTA GCT GGC TGT ATG . 288 Thr Gly Arg Phe Leu Gly Thr Gly Asn Gly Gly Leu Ala Gly Cys Met 85 90 95 CCC TAC AAC GAT ATG GCG TAC GGC AAC AGT TTC GGC TTC GCC AGC GTT 336 Pro Tyr Asn Asp Met Ala Tyr Gly Asn Ser Phe Gly Phe Ala Ser Val 100 105 110 GGC ACG AAC AAC GGA CAT AAC GGA ACC TCA GGC CTA CCC ATG TAC CGC 384 ； Gly Thr Asn Asn Gly His Asn Gly Thr Ser Gly Leu Pro Met Tyr Arg 115 120 125 AAC CCA GGC GTG GTT GAG GAC TTT GCC TAT CGT GCG GTG CAC GCT GGT 432 Asn Pro Gly Val Val Glu Asp Phe Ala Tyr Arg Ala Val His Ala Gly 130 135 140 GCT GTT ATC GGA AAG AAG ATC ACC CAG GGC TTT TAC GGC AAG AAG TTC 480 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂---------4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -63 - 4 6 1 9 1 9 A7 _ B7 五、發明說明（61 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製

Ala 145 Val He Gly Lys Lys 150 lie Thr Gin Gly Phe 155 Tyr Gly Lys Lys Phe X60 AAG TCC TAC TTT CTC GGC TGC TCG ACA GGA GGA CGT CAA GCA ATG AAG 528 Lys Ser Tyr Phe Leu 165 Gly cys Ser Thr Gly 170 Gly Arg Gin Ala Met 175 Lys TTG GCA CAG AGC TTC CCC GAG GAT TAC GAT GGC TAT GTG GCA GGT GCT 576 Leu Ala Gin Ser 180 Phe Pro Glu Asp Tyr 185 Asp Gly Tyr Val Ala 190 Gly Ala CCG GCT ATG CGC TGG AAC GGT CTT CAG GCA CGC TCT GGA AGT TTC TGG 624 Pro Ala Met 195 Arg Trp Asn Gly Leu 200 Gin Ala Arg Ser Gly 205 Ser Phe Trp GGC ATC ACC GGC CCC CCT GGA GCT CCT GGC CAT GTG ACT CCA* GAC GAG 672 Gly lie 210 Thr Gly Pro Pro Gly 215 Ala Pro Gly His Val 220 Thr Pro Asp Glu TGG GAA ATG GTG CAC AAG AGC GTC CTG ACT CAG TGC GAC GAG CCC ATT 720 Trp 225 Glu Met Val His Lys 230 Ser Val Leu Thr Gin 235 Cys Asp Glu Pro lie 240 GAT GGC GTC GAT GAC GGC GTG CTT GAG GAC CCC ACC CTC TGT CAG TAC 768 ksp Gly Val Asp Asp 245 Gly Val Leu Glu Asp 250 Pro Thr Leu Cys Gin 255 Tyr CGC CCT GAG GCT CTC ATC TGC GGT AAG GGC CAG ACC GAG AAT TGC CTG 816 Arg Pro Glu Ala 260 Leu lie Cys Gly Lys 265 Gly Gin Thr Glu Asn 270 Cys Leu. ACC AAG GCC AAG ATT GAG ACG GTC CGC AAA GTC TTT TCT CCC CTA TAC 864 Thr Lys Ala 275 Lys lie Glu Thr Val 280 Arg Lys Val Phe Ser 285 Pro Leu Tyr ACC ACG AAT GAG ACA TAC GTC TAC CCT CGA GCG GTT CCT GGT GCT AAC 912 Thr Thr 290 Asn Glu Thr Tyr Val 295 Tyr Pro Arg Ala Val 300 Pro Gly Ala Asn GCT CTC TTT AAC TTT GTT GTC GCC GAG ACA CCA TTC GTT TAC TCC ACA 960 Ala 305 Leu Phe Asn Phe Val 310 Val Ala GlU Thr Pro 315 Phe Val Tyr Ser Thr 320 GAA TGG TAC CAG TAT GTC ATC TGG GAA GAC CCT GAG TGG AAT CCT GAC 1008 Glu Trp Tyr Gin Tyr 325 Val lie Trp GlU Asp 3 30 Pro GlU Trp Asn Pro 335 Asp ACT ATT GGG CCC AAG GAC TAT GAT AGA GGT GCC GAG ATG AAC CCC TAT 1056 Thr lie Gly Pro 340 Lys Asp Tyr Asp Arg 345 Gly Ala GlU Met Asn 350 Pro Tyr GAC ATT GAG ACT TGG GAG GGA GAC CTG TCT AAG TTC CGC AAG CGT GGC 1104 Asp He Glu 355 Thr Trp Glu Gly Asp 360 Leu Ser Lys Phe Arg 365 Lys Arg Gly AAC AAG ATG ATT CAC TGG CAC GGC CTT CAG GAC GGA CTC ATC AGC GCC 1X52 Asn Lys 370 Met lie His Trp His 375 Gly Leu Gin Asp Gly 380 Leu lie Ser Ala GAG AAC TCA GAC GAT TAT TAT AAT CAC GTG TCT CGA ACA ATG GGC CTC 1200 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

· Β—i ·ϋ ϋ I ϋ 1 a— n ·1 I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -64 - 461919 A7 B7 五、發明說明（62 )

Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Tyr Asn His Val Ser Arg Thr Met Gly Leu 385 390 395 400 AAT AGT AGO CAG CTG GAC CAG TTT TAT AGG TTC TTC CGC GTC AGT GGG 1248 Asn Ser Ser Gin Leu Asp Gin Phe Tyr Arg Phe Phe Arg Val Ser Gly 405 410 415 TGT GGC CAT TGC AGO GCC GGA GAC GGG GOT TCT CGC ATT GGA AAC AAC 1296 Cys Gly His Cys Ser Ala Gly Asp Gly Ala Ser Arg lie Gly Asn Asn 420 425 - 430 GCC GGA AAC ATG GGC GGC AAG ACG GCA GAT ACT AAT GTG CTT CTG GCT 1344 Ala Gly Asn Met Gly Gly Lys Thr Ala Asp Thr Asn Val Leu Leu Ala 435 440 445 ATT GTG AAA TGG GTC GAG GAA GGC GTT GCG CCA GAA ACG ATT GGG GGC 1392 lie Val Lys Trp Val Glu Glu Gly Val Ala Pro Glu Thr lie Gly Gly 450 * 455 460 TAC AAG AAC GTC GGC GGA ACT GCA GAX GGC GCT TTT GAC TAT GAG CGT 1440 Tyr Lys Asn Val Gly Gly Thr Ala Asp Gly Ala Phe Asp Tyr Glu Arg 465 470 475 480 AGG CAT TGC CGA TAC CCA CAC CGC AAT GTC TGG GAC GGG AAG GGG AAT 1488 : Arg His Cys Arg Tyr Pro His Arg Asn Val Trp Asp Gly Lys Gly Asn | 485 490 495 GTG AAG GAT CCC GAT AGC TGG AAC TGT AAG ATC TGAGGTGTGG CCCTAGGCTT 1541 Val Lys Asp Pro Asp Ser Trp Asn Cys Lys He 500 505 TTGTGGCTGT CGTTAGGTGG CATACGTATA TAAGAGGATC ACTGTGAACA TGCTTTATGT 1601 丨 TGTGCAAGAA TTGATTGAGA ATCAGATTGA GCTTGCAGAG CCAAGGCAAA TAGACCCAAC 1661 TGTTGACGAG ATCTTGGCCG AAGGTAGAGG CAACGGGGAG AGAGACCATG GAAGACAAGG 1721 CGTAGAAAAT GGCCGGGGAA GACGGAAAAA AAAAACCCCC CCCCCC 1767 (2)SEQ ID NO: 1 9資料： (i )序列特徵： (A)長度：5 07個胺基酸 --------- 裝-------I訂·！----竣 -i\ //. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (B)種類：胺基酸 (D)拓撲學：線形 (ii)分子種類：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 19: Gly Asn Asp Asp Phe Ala Ala Lys Cys Ala Ser Leu Lys Lys Ser Leu 1 5 l〇 15 Lys Leu Pro Gly Thr Thr Val Tyr Phe Thr Gin His Val Ser Ala Gly 20 25 30 Thr Asn lie Thr Phe Pro Asp Asn His Pro Thr Cys Gly Pro Asn Tyr 35 40 45 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -65 - 4 6 1 9 1 9 A7 B7^、發明說明（63 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Gin Val Thr Asp Val Glu Val Cys Arg Val Ala 'Met Leu Val Lys Thr 50 55 60 Gly Pro Ala Ser Asn Val Ser lie Glu Ala Trp Leu Pro Leu Asn Trp 65 70 75 80 Thr Gly Arg Phe Leu Gly Thr Gly Asn Gly Gly Leu Ala Gly Cys Met 85 90 95 Pro Tyr Asn Asp Met Ala Tyr Gly Asn Ser Phe Gly Phe Ala Ser Val 100 105 . 110 Gly Thr Asn Asn Gly His Asn Gly Thr Ser Gly Leu Pro Met Tyr Arg 115 120 125 > ♦ Asn Pro Gly Val Val Glu Asp Phe Ala Tyr Arg Ala Val His Ala Gly 130 135 140 Ala Val lie Gly Lys Lys lie Thr Gin Gly Phe Tyr Gly Lys Lys Phe 145 150 155 160 Lys Ser Tyr Phe Leu Gly Cys Ser Thr Gly Gly Arg Gin Ala Met Lys 165 170 175 Leu Ala Gin Ser Phe Pro Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Val Ala Gly Ala 180 185 X90 Pro Ala Met Arg Trp Asn Gly Leu Gin Ala Arg Ser Gly Ser Phe Trp 195 200 205 Gly lie Thr Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly His Val Thr Pro Asp Glu 210 215 220 Trp Glu Met Val His Lys Ser Val Leu Thr Gin Cys Asp Glu Pro lie 225 230 235 240 Asp Gly Val Asp Asp Gly Val Leu Glu Asp Pro Thr Leu Cys Gin Tyr 245 250 255 Arg Pro Glu Ala Leu lie Cys Gly Lys Gly Gin Thr Glu Asn Cys Leu 260 265 270 Thr Lys Ala Lys lie Glu Thr Val Arg Lys Val Phe Ser Pro Leu Tyr 275 280 285 Thr Thr Asn Glu Thr Tyr Val Tyr Pro Arg Ala Val Pro Gly Ala Asn 290 295 300 Ala Leu Phe Asn phe Val Val Ala Glu Thr Pro Phe Val Tyr Ser Thr 305 310 315 320 Glu Trp Tyr Gin Tyr Val lie Trp Glu Asp Pro Glu Trp Asn Pro Asp 325 330 335 Thr lie Gly Pro Lys Asp Tyr Asp Arg Gly Ala Glu Met Asn Pro Tyr 340 345 350 Asp lie Glu Thr Trp Glu Gly Asp Leu Ser Lys Phe Arg Lys Arg Gly 355 360 365 -----------. I I 1 I I I I 訂 _ I-------^ / (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -66 _ 461919 A7 B7 五、發明說明（64

Asn Lys Met lie His Trp His Gly Leu Gin Asp Gly Leu lie Ser Ala 370 375 380 Glu Asn ser Asp Asp Tyr Tyr Asn His Val Ser Arg Thr Met Gly Leu 385 390 395 400 Asn Ser Ser Gin Leu Asp Gin Phe Tyr Arg Phe Phe Arg Val Ser Gly 405 4X0 415 Cys Gly His Cys Ser Ala Gly Asp Gly .Ala Ser Arg lie Gly Asn Asn 420 425. 430 e Ala Gly Asn Met Gly Gly Lys Thr Ala Asp Thr Asn Val Leu Leu Ala 435 440 445 lie Val Lys Trp Val Glu Glu Gly Val Ala Pro Glu Thr lie* Gly Gly 450 > 455 460 Tyr Lys Asn Val Gly Gly Thr Ala Asp Gly Ala Phe Asp Tyr Glu Arg 465 470 475 480 Arg His cys Arg Tyr Pro His Arg Asn Val Trp Asp Gly Lys Gly Asn 485 490 495 Val Lys Asp Pro Asp Ser Trp Asn Cys Lys He 500 505 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本買) 裝 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2)SEQ ID N0:20資料： (i )序列特徵： (A) 長度：20個鹼基對 (B) 種類：核酸 (C) 股性··單股 (D )拓撲學：線形 (ii)分子種類：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID N0:20: GTGAAATGGG TCGAGGAAGG (2)SEQ ID NO: 21資料： (i )序列特徵： (A)長度：2284個鹼基對 ϋ張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公楚1 ~ -67 ο 2 訂---------Λ 4 6 1 9 1 9 A7 B7 五、發明說明（65 ) (B)種類：核酸 (C )股性：雙股 (D )拓撲學：線形 (ii)分子種類：DNA(基因組） (ix)特色：

(A) 名稱/關鍵字：CDS (B) 位置：241..1836 (xi )序列說明：SEQ ID NO : 21 : AGGTGTCATA CGCQTGTACC GAGGTATCAC CTCCTTTCTT GGACTATTGG TTGGTTGTTC 60 TATGAAGGAC CATCCGTTCA CCCCGCAGGA ACCAGGGACA TCTATGGCAA GAGTTTATCC 120 CGAGGCATGT ATATAATAAA GCTCTTGCCT CTCCTTCTCC TGACACTTCT CAGCCAGGCT 180 CAGGAGGCTG GCAQTGAGTT GAATATCTAT CTGTCTGATA GTTGTTCGTC ATCAGGCACT 240 ATG CGC GTC AAC TTC TCG ACC CTG CTG- CTT CCC AGC CTC CTC .CAA GGG 288

Met Arg Val Asn Phe Ser Thr Leu Leu Leu Pro Ser Leu Leu Gin Gly 510 515 520 CTA GGT GCA TGC GCA GCT CCC AAC AAA GGC AAC GAT GAT TTT GCC GCG 336

Leu Gly Ala Cya Ala Ala Pro Asn Lys Gly Asn Asp Asp Phe Ala Ala 525 530 535 AAA TGC GCC AGC CTC AAG AAG TCG CTC AAA CTC CCC GGC ACC ACC GTA 384

Lys Cys Ala Ser Leu Lys Lys Ser Leu Lys Leu Pro Gly Thr Thr Val 540 545 - 550 555 TAC TTC ACC CAQ CAT GTC TCG GCT GGT ACC AAC ATC ACT TTC CCC GAT 432

Tyr Phe Thr Glp His Val Ser Ala Gly Thr Asn lie Thr Phe Pro Asp 560 565 570 AAT CAG CCG ACC TGC GGT CCT AAC TAT CAG GTT ACG GAC GTT GAG GTC 480

Asn His Pro Thr cys Gly Pro Asn Tyr Gin Val Thr Asp Val Glu Val 575 580 585 TGC CGC GTG GCC ATG TTA GTC AAG ACG GGA CCC GCC TCA AAC GTT AGC 528

Cys Arg Val Ala Met Leu Val Lys Thr Gly Pro Ala Ser Asn Val Ser 590 595 600 ATC GAA GCT TGG CTT CCC TTG AAC TGG ACA GGT CGG TTC TTA GGA ACT 576 lie Glu Ala Trp Leu Pro Leu Asn Trp Thr Gly Arg Phe Leu Gly Thr 605 610 615 GGC AAT GGT GGA TTA GCT GGC TGT ATG CCC TAC AAC GAT ATG GCG TAC 624

Gly Asn Gly Gly Leu Ala Gly Cys Met Pro Tyr Asn Asp Met Ala Tyr 620 625 630 635 GGC AAC AGT TTC GGC TTC GCC AGC GTT GGC ACG AAC AAC GGA CAT AAC 672

Gly Asn Ser Phe Gly Phe Ala Ser Val Gly Thr Asn Asn Gly His Asn 640 645 €50 <；GA ACC TCA GGQ CTA CCC ATG TAC CGC AAC CCA GGC GTG GTT GAG GAC 720

Gly Thr Ser Gly Leu Pro Met Tyr Arg Asn Pro Gly Val Val Glu Asp 655 660 665 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) '' - I ί I B1 1· ϋ-i-r-9J· ϋ n I ^ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 68 4 6 19 19 A7 B7 五、發明說明（66 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 TTT GCC TAT CGT GCG GTG CAC GCT GGT GCT GTT ATC GGA AAG AAG ATC 768 Phe Ala Tyr 670 Arg Ala Val His Ala 675 Gly Ala Val lie Gly 680 Lys Lys lie ACC CAG GGC TTT TAC GGC AAG AAG TTC AAG TCC TAC TTT CTC GGC TGC 816 Thr Gin 685 Gly Phe Tyr Gly Lys 690 Lys Phe Lys Ser Tyr 695 Phe Leu Gly Cys TCG ACA GGA GGA CGT CAA GCA ATG AAG TTG GCA CAG AGC TTC CCC GAG 864 Ser 7 00 Thr Gly Gly Arg Gin 705 Ala Met Lys Leu Ala 710 Gin Ser Phe Pro Glu 715 GAT TAC GAT GGC TAT GTG GCA GGT GCT CCG GCT ATG CGC TGG AAC GGT 912 Asp Tyr Asp Gly Tyr 720 Val Ala Gly Ala Pro 725 Ala Met Arg Trp Asn 730 Gly CTT CAG GCA CGC TCT GGA AGT TTC TGG GGC ATC ACC GGC ccc CCT GGA 960 Leu Gin Ala Arg 735 ； Ser Gly Ser Phe Trp 740 Gly IXe Thr Gly Pro 745 Pro Gly GCT CCT GGC CAT GTG ACT CCA GAC GAG. .TGG GAA ATG GTG CAC AAG AGC 1008 Ala Pro Gly 750 His Val Thr Pro Asp 755 Glu. Trp Glu Met Val 760 His 'Lys Ser GTC CTG ACT CAG TGC GAC GAG CCC ATT GAT GGC GTC GAT GAC GGC GTG 1056 Val Leu 765 Thr Gin Cys Asp Glu 770 Pro He Asp Gly Val 775 Asp Asp Gly Val CTT GAG GAC ccc ACC CTC TGT CAG TAC CGC CCT GAG GCT CTC ATC TGC 1104 . Leu 780 Glu Asp Pro Thr Leu 785 Cys Gin Tyr Arg Pro 790 Glu Ala Leu lie Cys 795 GGT AAG G(SC CAG ACC GAG AAT TGC CTG ACC AAG GCC AAG ATT GAG ACG 1152 Gly Lys Gly Gin Thr 800 GlU Asn Cys Leu Thr 805 Lys Ala Lys lie GlU 810 Thr GTC CGC AAA GTC TTT TCT ccc CTA TAC ACC ACG AAT' GAG ACA TAC GTC ' 1200 Val Arg Lys Val 815 Phe Ser Pro Leu Tyr 820 Thr Thr Asn Glu Thr 825 Tyr Val TAC CCT CGA GCG GTT CCT GGT GCT AAC GCT CTC TTT ΛλΟ TTT GTT GTC 1248 Tyr Pro Arg 830 Ala Val Pro Gly Ala 835 Asn Ala Leu Phe Asn 840 Phe Val Val GCC GAG ACA CCA TTC GTT TAC TCC ACA GAA TGG TAC CAG TAT GTC ATC 1296 i Ala Glu 845 Thr Pro Phe Val Tyr 850 Ser Thr Glu Trp Tyr 855 Gin Tyr Val lie TGG GAA GAC CCT GAG TGG AAT CCT GAC ACT ATT GGG CCC AAG GAC TAT 1344 Trp 860 Glu Asp Pro Glu Trp 865 Asn Pro Asp Thr lie 870 Gly Pro Lys Asp Tyr 875 GAT AGA GGT GCC GAG ATG AAC CCC TAT GAC ATT GAG ACT TGG GAG GGA 1392 Asp Arg Gly Ala GlU 880 Met Asn Pro Tyr Asp 885 lie Glu Thr Trp Glu 890 Gly GAC CTG TCT AAG TTC CGC AAG CGT GGC AAC AAG ATG ATT CAC TGG CAC 1440 Asp Leu Ser Lys 895 Phe Arg Lys Arg Gly 900 Asn Lys Met lie His 905 Trp His GGC CTT CAG GAC GGA CTC ATC AGC GCC GAG AAC TCA GAC GAT TAT TAT 1488 Gly Leu Gin 910 Asp Gly Leu lie Ser 915 Ala Glu Asn Ser Asp 920 Asp Tyr Tyr AAT CAC GTG TCT CGA ACA ATG GGC CTC AAT AGT AGC CAG CTG GAC CAG 1536 Asn His 925 Val Ser Arg Thr Met 930 Gly Leu Asn Ser Ser 935 Gin Leu Asp Gin TTT TAT AGG TTC TTC CGC GTC AGT GGG TGT GGC CAT TGC AGC GCC GGA 1584 Phe 940 Tyr Arg Phe Phe Arg 945 Val Ser Gly Cys Gly 950 His Cys Ser Ala Gly 955 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝---- 訂---------典 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 69 - A7 B7 五、發明說明（67) GAC GGG GOT TCT CGC ATT GGA AAC AAC GCC GGA AAC ATG GGC GGC AAG 1632

Asp Gly Ala Se^: Arg He Gly Asn Asn Ala Gly Asn Met Gly Gly Lys 960 965 970 ACG GCA GAT ACT AAT GTG CTT CTG GCT ATT GTG AAA TGG GTC GAG GAA 1680

Thr Ala Asp Thr Asn Val Leu Leu Ala lie Val Lys Trp Val Glu Glu 975 980 985 GGC GTT GCG CCA GAA ACG ATT GGG GGC- TAC AAG AAC GTC GGC GGA ACT 1728

Gly Val Ala Pro Glu Thr lie Gly Gly Tyr Lys Asn Val Gly Gly Thr 990 995 1000 GCA GAT GGC GCT TTT GAC TAT GAG CGT AGG CAT TGC CGA TAC CCA CAC 1776

Ala Asp Gly Ala Phe Asp Tyr Glu Arg Arg His Cys Arg Tyr Pro His 1005 1010 1015 CGC AAT GTC TGG GAC GGG AAG GGG AAT GTG AAG GAT CCC GAT AGC TGG 1824

Arg Asn Val Trp Asp Gly Lys Gly Asn Val Lys Asp Pro Asp Ser Trp 1020 1025 1030 1035 AAC TGT AAG ATC TGAGGTGTGG CCCTAGGCTT TTGTGGCTGT CGTTAGGTGG 1876

Asn Cys Lys lie CATACGTATA TAAGAGGATC ACTGTGAACA TGCTTTATGT TGTGCAAGAA TTGATTGAGA 1936 ATCAGATTGA GCTyGCAGAG CCAAGGCAAA TAGACCCAAC TGTTGACGAG ATCTTGGCCG 1996 AAGGTAGAGG CAACGGGGAG AGAGACCATG GAAGACAAGG CGTAGAAAAT GGCCGGGGAA 2056 GACGGGCTGT CGGCGATGGA GTAGCAACAG CTGTCACTGG TGGTCAATGA CTACACTTCX 2116 GAGCGGCGAG AGATTATAGG GACCGCACAC AGGCCATCAT TTCCCGATAA CTAATGGAGA 2176 CGCAATGGAG CGATGTTTAA ATGCGACAAG ACTGCCATCA TCTAGGTACT TCATGCGTCG 2236 CTAAACGCAC CAATGCTGCG CTGCTCATGA TTGTAAACTT AGTTTATA 2284 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝

n I— · IB· n ϋ ϋ ϋ I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -70 - 4 6 1 9 1 9 A7 一 B7 五、發明說明（68 ) (2)SEQ ID N0:22 資料： (i )序列特徵： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (A )長度：5 3 2個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學：線形 (ii)分子種類：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID N0:22:

Met Arg Val Αβη Phe Ser Thr Leu Leu Leu Pro Ser Leu Leu Gin Gly 1 5 10 15

Leu Gly Ala Cya Ala Ala Pro Asn Lys Gly Asn Asp Asp Phe Ala Ala 2Q 25 30

Lys Cys Ala Ser Leu Lys Lys Ser Leu Lys Leu Pro Gly Thr Thr Val 35 40 45

Tyr Phe Thr Gin His Val Ser Ala Gly Thr Asn'lie Thr Phe Pro Asp 50 55 60

Asn His Pro Thr Cys Gly Pro Asn Tyr Gin Val Thr Asp Val Glu Val 65 70 75 80

Cys Arg Val Met Leu Val Lys Thr Gly Pro Ala Ser Asn Val Ser 85 90 95

He Glu Ala Trp Leu Pro Leu Asn Trp.Thr Gly Arg Phe Leu Gly Thr 10Q 105. 110 *

Gly Asn Gly Gly Leu Ala Gly Cys Met Pro Tyr Asn Asp Met Ala Tyr 115 120 125

Gly Asn Ser Phe Gly Phe Ala Ser Val Gly Thr Asn Asn Gly His Asn 130 135 140 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Gly Thr Ser Gly Leu Pro Met Tyr Arg Asn Pro Gly Val Val Glu Asp 145 150 155 160

Phe Ala Tyr Arg Ala Val His Ala Gly Ala Val lie Gly Lys Lys lie 165 170 175

Thr Gin Gly Pha Tyr Gly Lys Lys Phe Lys Ser Tyr Phe Leu Gly Cys X80 185 190

Ser Thr Gly Gly Arg Gin Ala Met Lys Leu Ala Gin Ser Phe Pro Glu 195 200 205

Asp Tyr Asp Gly Tyr Val Ala Gly Ala Pro Ala Met Arg Trp Asn Gly 210 215 220

Leu Gin Ala Arg Ser Gly Ser Phe Trp Gly lie Thr Gly Pro Pro Gly 225 230 235 240 ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） -71 461919 A7 _____ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（69 )

Ala Pro Gly His Val Thr Pro Asp Glu Trp Glu Met Val His Lys Ser 245 250 255 Val Leu Thr Gin Cys Asp Glu Pro lie Asp Gly Val Asp Asp Gly Val 260 265 270 Leu Glu Asp Pro Thr Leu Cys Gin Tyr Arg Pro Glu A-la Leu He Cys 275 280 285 Gly Lys Gly Gin Tiir Glu Asn Cys Leu Thr Lys Ala Lys lie Glu Thr 290 295 300 Val Arg Lys Val Phe Ser Pro Leu Tyr Thr Thr Asn Glu Thr Tyr Val 305 310 315 320 Tyr Pro Arg Ala Val Pro Gly Ala Asn Ala Leu Phe Asn Phe Val Val 325 330 335 Ala Glu Thr Pro Phe Val Tyr Ser Thr Glu Trp Tyr Gin Tyr Val lie 340 345 350 Trp Glu Asp Pro Glu Trp Asn Pro Asp Thr lie Gly Pro Lys Asp Tyr 355 360 365 Asp Arg Gly Ala Glu Met Asn Pro Tyr Asp 工le'Glu Thr Trp Glu Gly .370 375 380 Asp Leu Ser Lys Phe Arg Lys Arg Gly Asn Lys Met lie His Trp His 385 390 395 400 Gly Leu Gin Asp Gly Leu lie Ser Ala Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Tyr 405 410 415 Asn His Val Ser Arg Thr Met Gly Leu.Asn Ser Ser Gin Leu Asp Gin 420 425. 430 * Phe Tyr Arg Phe Phe Arg Val Ser Gly Cys Gly His Cys Ser Ala Gly 435 440 445 Asp Gly Ala Ser Arg lie Gly Asn Asn Ala Gly Asn Met Gly Gly Lys 450 455 460 Thr Ala Asp Thr Asn Val Leu Leu Ala lie Val Lys Trp Val Glu Glu 465 470 475 480 Gly Val Ala Pro Glu Thr lie Gly Gly Tyr Lys Asn Val Gly Gly Thr 485 490 495 Ala Asp Gly Ala Phe Asp Tyr Glu Arg Arg His Cys Arg Tyr Pro His 500 505 510 Axg Asn Val Trp Asp Gly Lys Gly Asn Val Lys Asp Pro Asp Ser Trp 515 520 525 Asn Cys Lys lie 530 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝----- 訂----- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -72 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4 6 19 19 A7 ____________ B7 五、發明說明（7〇 ) (2)SEQ ID NO : 23資料： (i )序列特徵： (A)長度：240個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股性：雙股 (D )拓撲學：線形 (ii)分子種類：DNA(基因組） (X i )序列說明：SEQ I D NO : 23 : AGGTGTCATA CGCGTGTACC GAGGTATCAC CTCCTTTCTT GGACTATTGG TTGGTTGTTC 60 TATGAAGGAC CAXCCGTTCA CCCCGCAGGA ACCAGGGACA TCTATGGCAA GAGTTTATCC 120 CGAGGCATGT ATATAATAAA GCTCTTGCCT CTCCTTCTCC TGACACTTCT CAGCCAGGCT 180 CAGGAGGCTG GCAGTGAGTT GAATATCTAT CTGTCTGATA GTTGTTCGTC ATCAGGCACT 240 (2)SEQ ID N0:24資料： (i)序列特徵： (A )長度：9個鹼基對 (B)種類：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線形 (i i )分子種類：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID N0:24: 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） ' 裝--------訂·--------峻' ·,---... -. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -73 - 4 4 6 1 9 1 9 A7 _ B7 _ 五、發明說明（Ή ) ATGCGCGTC 9 (2)SEQ ID NO: 25資料： (i )序列特徵： (A)長度：9個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線形 (ii)分子種類：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID N0:25: (2)SEQ ID NO: 26資料： (i )序列特徵： (A) 長度：15個鹼基對 (B) 種類：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線形 (ii)分子種類：cDNA (X i )序列說明：S E Q I D N 0 : 2 6 :

GGCACTATAC GCGTC (2)SEQ ID NO : 27資料： (i )序列特徵： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -74 - 4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6 19 19 A7 _B7五、發明說明（72 ) (A) 長度：12個鹼基對 (B) 種類：核酸 (C )股性：單股 (D )拓撲學：線形 (ii)分子種類：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID N0:27: aacaaaggca AC (2)SEQ ID NO: 28資料： (i)序列特徵： (A)長度：4個胺基酸 (B )種類：胺基酸 (C) 股性： (D) 拓撲學：線形 (i i )分子種類：肽 (xi)序列說明：SEQ ID NO : 28 : Asn Lys Gly Asn 1 (2)SEQ ID NO: 29資料： (i )序列特徵： (A) 長度：12個鹼基對 (B) 種類：核酸 (C) 股性：單股 (D )拓撲學：線形 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) n m n n 一 -OJI n n 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -75 - A7

461 it I B7_ 五、發明說明（73 )

(i i )分子種類：cDNA (x i )序列說明：S E Q I D N Ο : 2 9 : AACCCCGGGA AC 12 (2)SEQ ID NO: 30資料： (i )序列特徵·· (A) 長度：28個鹼基對 (B) 種類：核酸 (C) 股性··單股 (D )拓撲學：線形 (ii)分子種類：cDNA (xi )序列說明：SEQ ID NO : 30 : GCAGCTCCCA ACCCCGGGAA CGATGATT 28 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂---------" 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -76 -

Claims (1)

1. 461919 申請專利範圍

   附件一 A :

   第85100102號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國90年1月修正 1·—種經分離的DNA分子，其具有編碼SEQ. D . N 〇 S . ·· 19或22胺基酸序列的序列’ S E Q . D NO. ggcaacgatgattttgccgcgaaatgcgccagcctcaagaagtcgctcaaactccccsgC' " 60 GHDDFAAKCASLKKSLK LPG ACCACCGTATACTTCACCCAGCATGTCTCGGCTGGTACCAACATCACTTTCCCCGATAAT. 120 T T V Y F T Q Η V S A G T Η I T F P D W CACCCGACCTGCGGTCCTAACTATCAGGTTACGGACGTTGAGGTCTGCCGCGTGGCCATG 180 Η P T C G p N Y QVTDV E V C RV.AM TTAGTCAAGACGGGACCC^CCTCAAACGTTAGCATCG^AGCTTGGCTTCCCTTGA/.CTGC 240 lvktgpasnvsieawlplhw ACAGGTCGGTTCTTAGGAACTGGCAATGGTGGATTAGCTGGCTGTATGCCCTACAACGAT 300 TGRFLGTGNGGL AGCMPYND. ATGGCGTACGGCAACAGTTTCGGCTTCGCCAGCGTTGGCACGAACAACGGACATAACGGA 360 AACA； N N H A Y G H S F G F A S V G T N N G Η N G ACCTCAGGCCTACCCATGTACGGCAACCCAGGCGTGGTTGAGGACTTTGCCTATCGTGCG 420 T Ξ G . L P Μ Y R N FGVVED F Λ Y R Λ GTGCACGCTGGTGCTGTTATCGG/VAAGAAGATCACCCAGGGCTTTTACGGCAAGAAGTTC 480 VH AGAVIGK KITQGF YGKKF --,ν卜J---------裝------訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫^/1'·) 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 AAGTCCTACTTTCTCGQCTGCTCGACAGGAGGACGTCAAGCAATGAAGTTGGCACAGAGC 540 KSYFLGCSTGGRQAMKLAQS. TTCCCCGAGGATTACGATGGCTATGTGGCAGGTGCTCCGGCTATGCGCTGGAACGGTCTT 600 F P EDY DGYVAGAPAMRWHGL CAGGCACGCTCTGGAAGTTTCTGGGGdATtACGGGCCCCCCTGGAGCTCCTGGCCATGTG 660 Q ARSGSFWGI TGPPGAPGH V ACTCCAGACGAGTGGGAAATGGTGCACAAGAGCGTCCTGACTCAGTGCGACGAGCCCATT 720 TPDEW EHVHKSVLTQ CDEPI GATGGCGTCGATGACGGCGTGCTTGAGGACCCCACCCTGTGTCAGTACCGCCCTGAGGCT 7Θ0 dgvddgvledptlcqyrpea 本紙張尺度適用中國困家標準（CNS)Α4说格（210x297公釐） 4 6 19 19 fiib B8 C8 D8 申請專利範圍 CTCATCTGCGGTAAGGGCCAGACCGAGAATTGCCTGACCAAGGCCAAGATTGAGACGGTC 840 LI C G K GQT EHCLTKAK I ETV CGCAAAGTCTTTTCTCCCCTATACACCACGAATGAGACATACGTCTACCCTCGAGCGGTT 900 RKVFS PLYTTNETYVYPRAV 960 f 先 閲 讀 GAATGGTACCAGTATGTCATCTGGGAAGACCCTGAGTGGAATCCTGACACTATTGGGCCC 1020 背 EWYQYVIWEDPEWNPDTIGP ; * AAGGACTATGATAGAGGTGCCGAGATGMCCCCTATGACATTGAGACTTGGGAGGGAGAC 1080 * KDYDRGAEMHPYDIETWEGD· CCTGGTGCT PGA AACGCTCTCTTTAACTTTGTTGTCGCCGAGACACCATTCGTTTACTCCACA halfnfvvaetpfvyst AAGTTCCGCAAGCGTGGCAACAAGATGATTCACTGGCACGGCCTTCAGGACGGA 1140 KPRKRGHKMIHWHGLQDG CTCATCAGCGCCGAGAACTCAGACGATTATTATAATCACGTGTCTCGAACAATGGGCCTC 1200 LISAEHSDDYYNHV SR TMGL AATAGTAGCCAGCTGGACCAGTTTTATAGGTTCTTCCGCGTCAGTGGGTGTGGCCATTGC 1260 NSSQ LDQFYFFFRVSGCGH .C AGOGCCGGAGACGGGGCTTCTCGCATTPGAAACAACGCCGGAAACATGGGCGGCAAGACG 1320 s agd gasrichnagnmggkt CTGTCTAAG L 5 I ρΤσΑΛΑΤ V K w GCAGATACTAATGTGCTTCTGGCTATTGTG ADTHVLL AI TqGGTCGAGGAAGQCGTTGCGCCAGAA 1380 VEEGVAPE 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ACGATtGGCGGCTACAAGAACGTCGGCGGAACTGCAGATGGCGCTTTTGACTATG^GCGT 1440 TIGG YKRVGGTADGAFDVER AGGCATTGCCGATACCCACACCGCAATGTCTGGGACGGGAAGGGGAATGTGAAGGATCCC 1500 RH CRYPHR NVMDG-K GHVKDP * . · GATAGCTGGAACTGTAAGATCTGAGGTGTGGCCCTAGGCTTTTGTGGCTGTCGTTAGGTG 1560 DSWHCKI* GCATACGTATATAAGAGGATCACTGTGAACATGCTTTATGTTGTGCT^AGAATTGATTGAG 1620 AATCAGATTGAGCTTGCAGAGCCAAGGCAAATAGACCCAACTGTTGACGAGATCTTGGCC 1680 GAAGGTAGAGGCAACGGGGAGAGAGACCATGGAAGACAAGGCGTAGAAAATGGCCGGGGA 1740 AGACGGAAAAAAAAAACCCCCCCCCCC 1767 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（2丨0X297公嫠） 9 1— 9 6 4 S 8 8 8 ABCD 六、申請專利範圍 SEQ. I D . NO. :22 AGGTGTCATACGCGTGTACCGAGGTATCACCTCCTTTCTTGGACTATTGGTTGGTTGTTC 60 TATGAAGGACCATCCGTTCACCCCGCAGGAACCAGGGACATCTATGGCAAGAGTTTATCC 120 CGAGGCATGTATATAATAAAGCTCTTGCCTCTCCTTCTCCTGACACTTCTCAGCCAGGCT ISO ♦Transcription start CAGGAGGCTGGCAGTGAGTTGAATATCTATCTGTCTGATAGTTGTTCGTCATCAGGCACT 240 ATGCGCGTCAACTTCTCGACCCTGCTGCTTCCCAGCCTCCTCCAAGGGCTAGGTCCAtcc 300 丨 MRVN FST LLLPSLLOGLGAC GCAGCTCCCTVACAAAGGCAACGATGATTTTGCCGCGAAATGCGCCAGCCTCAAGAAGTCG 360 AAPNKGNDDFAAKCASLKKS CTCAAACTCCCCGGCACCACCGTATACTTCACCCAGCATGTCTCGGCTGGTACCAACATC 420 LKL PGTTVyFTQHVSAGTNI ----------裝-- .. / ... ' {讀先閲讀背面之注意事項再填寫) ACTTTCCCCGAT； T Γ Ρ GATAATCACCCGACCTGCPGTCCTAACTATCAGGTTACGGACGTTGAGGTC DNHPTC(3PHYQVT DVEV 4Θ0 TGCCGCGTGGCCATGTTAGTCAAGACGCGACCCGCCTCAAACGTTAGCATCGAAGCTTGG CRVAHLVK'TaPASHVS I E Λ W CTTCCCTTGAACTGGACAGGTCGGTTCTTAGGAACTGGCAATGGTGGATTAGCTGGCTGT L P L H WT G R F ^ G T G H G G LAG C 540 600 訂 ATGCCCTACAACGATAT Μ P Y AACGATATGGCGTACGGC’fACAGTTT NDMAY G^SF fCGGCTTCGCCAGCGTTGGCACGAAC GFASVGTH 660 AA CGGACATAACGGAACCTCAGGCCTACCCATGTACCGCAACCCAGGCGTGGTTGAGGAC GHN G TSGLPMYRNPGVVED 720 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 TTTGCCTATCGTGCGGTGCACGCTGGTGCTGTTATCGGAAAGAAGATCACCCAGGGCTTT FAYRAVHAGAV IGKKITQGF TACGGCAAGAAGTTCAAGTCCTACTTTCTCGGCTGCTCGACAGGAGGACGTCAAGCAATG YGKK FKS Y FLGCSTGG RQAM AAGTTGGCACAGAGCTTCCCCGAGGATTACGATGGCTATGTGGCAGGTGCTCCGGCTATG KLAQSFPED^DGYVAGAPAM CGCTGGAACGGTCTTCAGGCACGCTCTQGAAGTTTCTGGGGCATCACCGGCCCCCCTGGA R W H G L Q A R S Q S FWG I T G P P G 780 840 900 960 GCTCCTGGCCATGTGACTCCAGACGAGTGGGAAATGGTGCACAAGAGCGTCCTGACTCAG 1020 A P G Η V T P D EWEMVHKS VLTQ TGCGACGAGCCCATTGATGGCGTCGATGACGGCGTGCTTGAGGACCCCACCCTCTGTCAG CDEPIDGVDDGVLEDP TLCQ 1080 線 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS > A4規格（210X297公釐） A8 DO 461919 g 六、申請專利範圍 TACCGCCCTGAGGCTCTCATCTGCGGTAAGGGCCAGACCGAGAATTGCCTGACCAAGGCC 1140 Y R P EALICGKGQTEHCLTKA AAGATTGAGACGGTCCGCAAAGTCTTTTCTCCCCTATACACCACGAATGAGACATACGTC 1200 KIETVRKVFSPLYTTNETYV ,TACCCTCGAGCGGTTCCTGGTGCTAACCCTCTCTTTAACTTTGTTGTCGCCGAGACACCA 1260 IyPRAVPGANALFHFV. VAE TP ! · TTCGTTTACTCCACAGAATGGTACCAGTATGTCATCTGGGAAGACCCTGAGTGGAATCCT 1320 FVYSTEWYQY VIWEDPEWN.P C；.C«uTATTGGGCCCAAGGACTATGATAGAGGTGCCGAGATGAACCCCTATGACATTGAG 13SC dtigpkdydfgaemnpydi E !ACTTGGGAGGGAGACCTGTCTAAGTTCCGCAAGCGTGGCAACAAGATGATTCACTGGCAC 1440 !twegdlskfj?krg nkmihwh GGCCTTCAGGACGGACTCATCAGCGCiCCAGAACTCAGACGATTATTATAATCACGTGTCT 1500 GLQDGLISAEKSDDYYN'HVS CGAACAATGGGCCTCAATAGTAGCCAGCTGGACCAGTTTTATAGGTTCTTCCGCGTCAGT 1560 RTMG LNSSQtDQFYRFFRVS GGGTGTGGCCATTGCAGCGCCG(?AGACGGGGCTTCTCGCATTGGAAACAACGCCGGAAAC 1620 G C G H C S λ G D G A S R I G Η H A G H ATGGGCGGCAAGACGGCAGATACTAATGTGCTTCTGGCTATTqTQAAATGGQTCQAQGAA 1680 MGGKTADTH VLL AIVKWVEE t _ GGCGTTGCGCCAGAAACGATTGGGGGOTACAAGAACGTCGGCGGAACTGCAGATGGCGdT 1740 GVAPETIGGYKNVGGTAD GA TTTGACTATGAGCGTAGGCATTGCCG^TACCCACACCGCAATGTCTGGGACGGGAAGGGG 1800 FD YER RH CRYP HRNVWDGKG AATGTGAAGGATCCCGATAGCTGGAAQTGTAAGATCTGAGGTGTGGCCCTAGGCTTTTGT 1860 N V K D P D S W H C K I * GGCTGTCGTTAGGTGGCATACGTATATAAGAGGATCACTGTGAACATGCTTTATGTTGTG 1920 CAAGAATTGATTGAGAATCAGATTGAqCTTGCAGAGCCAAGGCAAATAGACCCAACTGTT 1980 GACGAGATCTTGGCCGAAGGTAGAGGCAACGGGGAGAGAGACCATGGAAGACAAGGCGTA 2040 GAAAATGGCCGGGGAAGACGGGCTGTCGGCGATGGAGTAGCAACAGCTGTCACTGGTGGT 2100 CAATGACTACACTTCTGAtSCGGCGAG^GATTATAGGGACCGCACACAGGCCATCATTTCC 2160 CGATAACTAATGGAGACGCAATGGAGCGATGTTTAAATGCGACAAGACTGCCATCATCTA 2220 GGTACTTCATGCGTCGCTAAACGCACCAATGCTGCGCTGCTCATGATTGTAAACTTAGTT 2280 TATA 2284 本紙張尺度逋用中國國家棣準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） |_^-------#! I (請先閲讀背面之注意事項再填寫才λ W 訂 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4 B8 C8 6 1919_^__ 六、申請專利範圍 2.—種經分離的DNA分子，其具有編碼SEQ_ ID. NO. :19胺基酸序列的序列β {請先閱讀背面之注意事項再填寫丰λ ) δ~ 6 -装. 3.—種經分離的DNA分子，其具有編碼SEQ· ID. NO. :22胺基酸序列的序列β 4·—種經分離的DNA分子，其具有SEQ. ID NO. :18的核苷酸序列， S E Q . ID. NO. :18 GGCAACGATGATTTTGCCGCGAAATGCGCCAGCCTCAAGAAGTCGCTCAAACTCCCCGGC G N D D F A A K C A SLKK SLKLPG ACCACCGTATACTTCACCCAGCATGTCTCGGCTGGTACCAACATCACTTTCCCCGATAAT . 12 0 TT VYFTQHVSAGTHITFPDN CACCCGACCTGCGGTCCTAACTATCAGGTTACGGACGTTGAGGTCTGCCGCGTGGCCATG 180 HP T C G P N Y.QVT D V E V C R V A M TTAGTCAAGACGGGACCCr-CCTCAAACGTTAGCATCG>AGCTTGGCTTCCCTTGA7.CTGC 240 L\rKTGPASNVSIEAV；LPLNW ACAGGTCGGTTCTTAGGAACTGGCAATGGTGGATTAGCTGGCTGTATGCCCTACAACGAT 300 T G R F LGTGHGGL AG C Μ P Y H D ATGGCGTACGGCAACAGTTTCGGCTTCGCCAGCGTTGGCACGAACAACGGACATAACGGA 360 M A Y G N S F G F A S V G T N N G Η N G ACCTCAGGCCTACCCATGTACCGCAACCCAGGCCTGGTTGAGGACTTTGCCTATCGTGCG 420 T3GLPMYRHFGVVEDFAYRA GTGCACGCTGGTGCTGTTATCGGAAAGAAGATCACCCAGGGCTTTTACGGCAAGAAGTTC 480 V H A G A V I G K K I T Q G F Y G K K F 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 AAGTCCTACTTTCTCGGCTGCTCGACAGGAGGACGTCAAGCAATGAAGTTGGCACAGAGC 540 KSYFLGCSTGGRQAMKLAQS. TTCCCCGAGGATTACGATGGCTATGTQGCAGGTGCTCCGGCTATGCGCTGGAACGGTCTT 600 PPEDYDGYVAGAPAHRWHGL CAGGCACGCTCTGGAAGTTTCTGGGGCATCACCGGCCCCCCTGGAGCTCCTGGCCATGTG 660 QAR SGSFWGITGPPGAPGH V ACTCCAGACGAGTGGGAAATGGTGCACAAGAGCGTCCTGACTCAGTGCGACGAGCCCATT 720 TPDEWEMVHKSVL TQCDEPI • . GATGGCGTCGATGACGGCGTGCTTGAGGACCCCACCCTCTGTCAGTACCGCCCTGAGGCT 780 DGVDDGVLEDPTLCQYR PEA 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)八4規洛（210Χ297公釐） 5 Λ8 B8 461919 g| 六、申請專利範圍 CTCATCTGCGGTAAGGGCCAGACCGAGAATTGCCTGACCAAGGCCAAGATTGAGACGGTC 840 LI CG KGQTENCLTKAKI ETV CGCAAAGTCTTTTCTCCCCTATACACCACGAATGAGACATACGTCTACCCTCGAGCGGTT 900 RKVFS P LY TTH ET Y V Y P RAV CCTGGTGCTAACGCTCTCTTTAACTTTGTTGTCGCCGAGACACCATTCGTTTACTCCACA 960 PGANALFHFVVAETPFVYST GAATGGTACCAGTATGTCATCTGGGA^GACCCTGAGTGGAATCCTGACACTATTGGGCCC 1020 E W YQYV I W EDPEWN PDT I G P AAGGACTATGATAGAGGTGCCGAGATQAACCCCTATGACATTGAGACTTGGGAGGGAGAC 1080 KDY DRG AEMHPYDIETWEGD· CTGTCTAAGTTCCGCAAGCGTGGCAACAAGATGATTCACTGGCACGGCCTTCAGGACGGA 1140 LSKFR KRGNKMIHWHGLQDG CTCATCAGCGCCGAGAACTCAGACGATTATTATAATCACGTGTCTCGAACAATGGGCCTC 1200 L I S A E M S D D Y Y N Η V S R TMGL AATAGTAGCCAGCTGGACCAGTTTTATAGGTTCTTCCGCGTCAGTGGGTGTGGCCATTGC 1260 H S S Q LD Q F YRFF RVSG C (； H C --------^--裝一i (請先閲讀背面之注意事項再填寫^λ ) AGCGCCGGAGACGGGGCTTCTCGf：An*CGAAACAACGCCGG S.AGDGASR IGNHAG AAACA' N M CATGGGCGG CAAGACG 1320 G G K T 訂 GCAGATACTAATGTGCTTCTGGCTATTGTGAAATQGQTCGAGGAAGQCGTTGrfirrAflAA 1380 A D T N V L L A I VKWV E EG VA P E_ _ ACGATi-GG«XGGCTACAAGAACGTCGGCpGAACTGCAGATGGCGCTTTTGACTATGAGCGT 144 0 T I G G Y KWVGCTAD GAFDY ER GGATCCC 1500 D P AGGCATTGCCGATACCCACACCGCAATpTCTGGGACGGGAAGGGGAATGTGAAi R H C R Y P H R N V W D & K G N V K GATAGCTGGAACTGT： D S W N C AAGATCTGAGGTPTGGCCCTAGGCTTTTGTGGCTGTCGTTAGGTG K I * 1560 線 經 濟 部 智 慧 財 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 GCATACGTATATAAG AGGATCACTGTGfACATGCTTTATGTTGTGCAAGAATTGATTGAG 1620 AATCAGATTGAGCTTGCAGAGCCAAGGPAAATAGACCCAACTGTTGACGAGATCTTGGCC 1680 GAAGGTAGAGGCAACGGGGAGAGAGACpATGGAAGACAAGGCGTAGAAAATGGCCGGGGA 1740 AGACGGAAAAAAAAAACCCCCCCCCCC 1767 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐） 6 A8 B8 C8 D8 461919 申請專利範圍 D 5.—種經分離的DNA分子，其具有SEQ· NO. :21的核苷酸序列， t SEQ. I D . NO. : 2 1 AGGTGTCATACGCGTGTACCGAGGTATCACCTCCTTTCTTGGACTATTGGTTGGTTGTTC 60 1 r TATGAAGGACCATCCGTTCACCCCGCAGGAACCAGGGACATCTATGGCAAGAGTTTATCC 120 ] CGAGGCATGTATATAATAAAGCTCTTQCCTCTCCTTCTCCTGACACTTCTCAGCCAGGCT 180 : ★Transcription start CAGGAGGCTGGCAGTGAGTTGAATATQTATCTGTCTGATAGTTGTTCGTCATCAGGCACT 240 . 裝 ATGCGCGTCAACTTCTCGACCCTGCTqCTTCCCAGCCTCCTCCAAGGGCTAGGTCCATOC 300 M R V N F S T L· L L P S L· L O G L· G A C* : · { GCAGCTCCCAACAAAGGCAACGATGATTTTGCCGCGAAATGCGCCAGCCTCAAGAAGTCG 360 A A P H KGH D D F A A K C A S L K K S CTCAAACTCCCCGGCACCACCGTATAGTTCACCCAGCATGTCTCGGCTGGTACCAACATC 420 LKLPGTTVYFTQHVSAGTNI 訂 ACTTTCCCCGATAATCACCCGACCTGCGGTCCTAACTATCAGGTTACGGACGTTGAGGTC 480 vrPDNHPT'CGPHYQVTDVEV TGCCGCGTGGCCATGTTAGTCAAGACGGGACCCGCCTCAAACGTTAGCATCGAAGCTTGG 540 CRVAMLV KTGPASHVS I EA W CTTCCCTTGAACTGGACAGGTCGGTTCTTAGGAACTGGCAATGGTGGATTAGCTGGCTGT 600 L P L N W T G R F ^ G T G N G G L A G C 線 ATGCCCTACAACGATATGGCGTACGGC^ACAGTTTCGGCTTCGCCAGCGTTGGCACGAAC 660 MPYHDMAY GHSFGFASVGTH . .. r AACGGACATAACGGAACCTCAGGCCTACCCATGTACCGCAACCCAGGCGTGGTTGAGGAC 720 H G Η H G T S GLPMYRHPGVVED 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 TTTGCCTATCGTGCGGTGCACGCTGGTGCTGTTATCGGAAAGAAGATCACCCAGGGCTTT 780 FAYRAVHAGAVIGKKITQGF 840 TACGGCAAGAAGTTCAAGTCCTACTTTCTCGGCTGCTCGACAGGAGGACGTCAAGCAAI YGKKFKS YFIiGCSTGGRQ AM AAGTTGGCACAGAGCTTCCCCGAGGATTACGATGGCTATGTGGCAGGTGCTCCGGCTATG 900 K LAQSFP EDYDG YVA GAPAM CGCTGGAACGGTCTTCAGGCACGCTCTpGAAGTTTCTGGGGCATCACCGGCCCCCCTGGA 960 RWHGLQARSCSF WGI.TGPPG GCTCCTGGCCATGTGACTCCAGACGAGTGGGAAATGGTGCACAAGAGCGTCCTGACTCAG- 1020 apghvtpdewemvhksvltq TGCGACGAGCCCATTGATGGCGTCGATGACGGCGTGCTTGAGGACCCCACCCTCTGTCAG 1080 CDEP. IDGVDpGVLEDPTLCQ 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4規格（210X297公釐） -7 - A8 B8 C8 D8 461919 六、申請專利範圍 TACCGCCCTGAGGCTCTCATCTGCGGTAAGGGCCAGACCGAGAATTGCCTGACCAAGGCC 1140 Y R P E A LICGKGQT ENCLTKA AAG ATTGAG ACGGTCCGCAAAGTCTTTTCTCCCCTATACACCACGAATGAGACATACGTC 1200 K I ETVRKVFSPLYTTNETYV TACCCTCGAGCGGTTCCTGGTGCTAAGGCTCTCTTTAACTTTGTTGTCGCCGAGACACCA 1260 ypravpganalfnfv vae tp TTCGTTTACTCCACAGAATGGTACCAQTATGTCATCTGGGAAGACCCTGAGTGGAATCCT 1320 F V Y S T E W Y Q Y V I W E D P E W N .P C：.CACTATTGGGCCCAAGGACTATGATAGAGGTGCCGAGATGAACCCCTATGACATTGAG 12ZZ dtigpkdydrgaemnpydie ACTTGGGAGGGAGACCTGTCTAAGTTCCGCAAGCGTGGCAACAAGATGATTCACTGGCAC 1440 TW EG D LSKFRKRG NKMI HWH- GGCCTTCAGGACGGACTCATCAGCGCCCAGAACTCAGACGATTATTATAATCACGTGTCT 1500 G L Q D G L I S A E H S D D Y ϊ Ν·Η V S * CGAACAATGGGCCTCAATAGTAGCCAGCTGGACCAGTTTTATAGGTTCTTCCGCGTCaGT 1560 RTMGLNSSQLDQFYRFFRVS GGGTGTGGCCATTGCAGCGCCGC?AGACpGGGCTTCTCGCATTGGAAACAACGCCGGAAAC 1620 GC GHCSAG.DPASRIGHHAGH ATGGGCGGCAAGACGGCAGATACTAATCTGCTTCTGGCTATTqTqAAATGGGTCQAQGXA 1680 MG G KTA DTN VLL A IVK WVE E ^CGTTGCGCCAGAAACGATT^GGGCTACAAGAACGTCGGCGGAACTGCAGATGGCGCT 1740 g~vapeti ggvkhvggta dga TTTGACTATGAGCGtAGGCATTGCCGATACCCACACCGCAATGTCTGGGACGGGAAGGGG 1800 F D Y E R R H C R V P H R H V W D G K G AATGTGAAGGATCCCGATAGCTGGAACTGTAAGATCTGAGGTGTGGCCCTAGGCTTTTGT 1860 HVKDPDSW. NCKI * GGCTGTCGTTAGGTGGCATACGTATATIlAGAGGATCACTGTGAACATGCTTTATGTTGTG 1920 • · CAAGAATTG ATTGAG AATCAG ATTGAGCTTGCAGAGCCAAGGCAAATAG ACCGAACTGTT 1980 GACGAGATCTTGGCCGAAGGTAGAGGCILACGGGGAGAGAGACCATGGAAGACAAGGCGTA 2040 GAAAATGGCCGGGGAAGACGGGCTGTCGGCGATGGAGTAGCAACAGCTGTCACTGGTGGT 2100 CAATGACTACACTTCTGA6CGGCGAGAGATTATAGGGACCGCACACAGGCCATCATTTCC 2160 CGATAACTAATGGAGACGCAATGGAGCGATGTTTAAATGCGACAAGACTGCCATCATCTA 2220 GGTACTTCATGCGTCGCTAAACGCACCAATGCTGCGCTGCTCATGATTGTAAACTTAGTT 2280 TATA 2284 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） 一 8 - I I —II _1 . n n n u in - (請先閱讀背面之注意事項再填寫才，λ ) 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 461919 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Θ. —種經分離的DNA分子，其具有SEQ· ID N 0 . : 1 1的核Μ酸序列， S E Q . I D . NO. :11 A CC-YTC-YTC-CTC-GGA-YTT-NAC G T其中Ν是A，G，Τ或C ;且Υ是C或Τ。 7_ —種經分離的DNA分子’其具有SEQ. ID.NO.:23的核替酸序列’ SEQ. ID. NO. :23 AGGTGTCATACGCGTGTACCGAGGTATCACCTCCTTTCTTGGACTATTGGTTGGTTGTTC 60 TATGAAGGACCATCCGTTCACCCCGCAGGAACCAGGGACATCTATGGCAAGAGTTTATCC 120 CGAGGCATGTATATAATAAAGCTCTTGCCTCTCCTTCTCCTGACACTTCTCAGCCAGGCT 180 ★Transcription start CAGGAGGCTGGCAGTGAGTTGAATATCTATCTGTCTGATAGTTGTTCGTCATCAGGCACT 240 請 先 閲 讀 背 ιέ 之 注 S 裝 訂 8. —種經分離的DNA分子 ，具有 SEQ. ID. N 0 . 1 7所示的核苷酸序列， S E Q . ID. NO. :14 其係作爲引子或探針 1 4 ，1 5 ，1 6 或 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 YXXnTITGTAGCGAAATGCGCC SEQ. D . NO. 5 TTTTTTCTGCAGCGAAATGCGCC SEQ. I D . NO. :16 CCCGGGAACGACGACTTTGCA-GCGAAATGCGCC SEQ. ID. N 0 . :17 GGCGCATTTCGC TGCA__AAGTCGTCGTTCCCGGG 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210 X 297公嫠） 9 - Λ» B8 C8 D8 461919 六、申請專利範圍 9·-種經分離的DNA分子’其具有SEQ. I 〇 · N 〇 . : 9或10的核奋酸序列， S E Q . ID. N 0 . :9 SEQ. ID. NO· :10 SEQ ID no: 9 GTN-AAR-TGG-GXN-GAR-GAR-GG SEQ ID NO： 10 CC-YTC-YTC-NAC-CCA-YTT-NAC 其中N是A，G，T或C : R是A或G ; Y是C或T。 1 0 ·—種經分離的DNA分子’其具有S EQ. ID. N 0 :26或30的核苷酸序列’ SEQ. ID. NO. :26 GGCACTATACC^CGTC SEQ. ID. NO. :30 nr.AnnTCnCA^CCCCGGGAACGATGATT 1 1 一種用於分離或製備如申請專利範圍第1至10 項中任一項之經分離的DNA分子的經分離多肽，其具有選自 SEQ. ID. NOS. :1，2，3，4，5，6 ，8或1 2的胺基酸序列’ S E Q . ID. NO. : 1 Gly-Asn-Asp-Asp-Phc-AIa-[AIa/Lys]-Lys-[]- Ala-Scr-Lcu-Lys-Lys-Scr-Lcu-Lys-Lcu-Pn)-Gly- Thr-(Tlii/Va|]-Vai-Tyr-Phe-Thr-Gln-Iiis-VaI SEQ. ID. NO· :2 Gfy-Uu-Asn-[Sei/Pn)|-Ser-GIii-fAla/Lcuj-[Asp/G 丨丨 i 卜 GInHPhe-Tyr-【Tyr/Ai^J 本紙張尺度適用中围國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --^-------^------ίτ----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本t) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 461919 六、申請專利範圍 SEQ. ID. N 0 . :3 Lcu-Val-Lys-Thr-GIy-Pn)-Ala-[SeiyLys|-[ J-Val-Ser-Ue SEQ. I D . NO. :4 Gly-Asn-Asp-A5i>-P|ic-Ala-Ala-ISeryLys]-[]-Ala SEQ. ID. NO. :5 Gly-[ ]-(Asn/Lys]-Thr-Ala-Asp-Thr-Asn-Val- Lcu-Leu-AIa-[De/AiTgj-VaJ-Lys-Trp-Val-Glu- GIu-GIy SEQ. ID· NO. :6 De-His-Tr^Ser-Cly-Lcu-GIu-Asp-Gly-Leu-nc- Ser-Al»-GIu-AsD-[Asn/Serl-Asp-Tyr-Tyr-Asn- [Asiimis]-Vai-[yal/Ser|-Ser-[ThiyAr^] SEQ. I D . NO. :8 Val-Lys-Trp-VaX-Glu-Glu-Gly, SEQ. ID. NO. :12 Gly-Asn-Asp-Asp-Phe-Ala-Ala-Lys-Cys-Ala 1 2 .如申請專利範圍第1 1項之多肽，其具有 S E Q . ID. NOS. :1或12的胺基酸序列。 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) Λ4規格（210X W7公釐） I I 訂 I I線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫) 經育部智慧財產局員工消費合作社印製 -11 -