WO2020249138A1 - 糖基转移酶突变体及其应用 - Google Patents

糖基转移酶突变体及其应用 Download PDF

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WO2020249138A1
WO2020249138A1 PCT/CN2020/104957 CN2020104957W WO2020249138A1 WO 2020249138 A1 WO2020249138 A1 WO 2020249138A1 CN 2020104957 W CN2020104957 W CN 2020104957W WO 2020249138 A1 WO2020249138 A1 WO 2020249138A1
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steviol
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rebaudioside
mutant
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王勇
刘志凤
孙雨伟
吕华军
张鹏
李建戌
刘海利
李建华
陈卓
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中国科学院分子植物科学卓越创新中心
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    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention belongs to the field of biotechnology. More specifically, the present invention relates to a glycosyltransferase mutant and its application.
  • Glycosylation is one of the most extensive modifications in the synthesis of natural products.
  • glycosylation modification changes the solubility, stability, toxicity and physiological activity of natural products, has the functions of detoxification of metabolites, preventing biological damage, and changing the distribution interval of substances.
  • the glycosylation of many plant-derived natural products is catalyzed by UDP-dependent glycosyltransferase (UGT).
  • UGT uses UDP-activated sugars as glycosyl donors to specifically transfer sugar molecules to the glycosylation site of the acceptor molecule. on. At present, there are more than 2300 plant-derived UGTs that have been discovered or annotated, but only about 20 UGTs whose protein structure has been resolved.
  • Steviol glycosides are a class of highly glycosylated modified diterpene natural products, mainly from the Asteraceae plant Stevia. Steviol glycoside compounds have the characteristics of high sweetness and low calories, which can replace sucrose and other synthetic sweeteners, and have huge economic benefits in the food industry.
  • stevia sugars mainly include natural sources of Rebaudioside A (Rebaudioside A) and Stevioside (Stevioside). Although the sweetness of these products reaches 300 to 600 times that of sucrose, they still have disadvantages such as bitter aftertaste. , The taste needs to be improved.
  • the industrial upgrading of stevioside has mainly focused on upgrading Lebaudioside A and Stevioside to better taste and sweeter Lebaudioside D and Lebaudioside M.
  • Rebaudioside D and Rebaudioside M are polyglycosides formed by aglycone steviol (steviol) through 5-step or 6-step glycosylation, respectively.
  • the intermediates in their synthesis pathways include rebaudioside A and stevia Glycosides.
  • UGT76G1 is responsible for catalyzing stevioside to produce Lebaudioside A.
  • Lebaudioside A is catalyzed by UGT91D2 (or EUGT11) to produce Leiboldiside D, or UGT76G1 is used to produce Lebaudioside I as a by-product.
  • Lebaudioside D is further catalyzed by UGT76G1 to produce Lebaudioside M. Therefore, UGT76G1 and UGT91D2 are the two key enzyme genes required for the repeated glycosylation process in the synthesis of Lebaudioside D and Lebaudioside M.
  • the purpose of the present invention is to provide a glycosyltransferase mutant and its application.
  • a glycosyltransferase UGT76G1 mutant is provided.
  • the mutant is relative to the wild-type glycosyltransferase UGT76G1, and its spatial structure has amino acids that interact with the glycosyl donor or glycosyl acceptor Mutation occurs and its catalytic activity changes.
  • the increase in the activity of the catalytic substrate Lebaudioside D to Lebaudioside M is a statistically significant increase, such as an increase of 20% or more, 40% or more, 60% or more, 70% Above or higher.
  • the activity of the by-product Lebaudioside I that catalyzes the production of Lebaudioside A is reduced to a statistically significant reduction, such as a reduction of 20% or more, 40% or more, 50% or more. weak.
  • glycosyltransferase UGT76G1 mutant is:
  • amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 1, with mutations at positions 284, 147, 155, 146, 380, 85, 87, 88, 90, 91, 126, 196, 199, 200, 203, 204 or 379 ⁇ protein;
  • (b) Pass the amino acid sequence of (a) protein through one or more (such as 1-20; preferably 1-15; more preferably 1-10, such as 5, 3) amino acid residues
  • the amino acid at position, 90, 91, 126, 196, 199, 200, 203, 204 or 379 is the same as the amino acid after mutation at the corresponding position of the protein (a);
  • the amino acid sequence of (a) protein has more than 80% homology (preferably more than 85%; more preferably more than 90%; more preferably more than 95%, such as 98%, 99%) and has (a ) Protein function derived from (a), but corresponding to the 284,147,155,146,380,85,87,88,90,91,126,196,199,200, of SEQ ID NO:1
  • the amino acid at position 203, 204 or 379 is the same as the amino acid at the corresponding position of (a) protein after mutation;
  • the mutation at position 284 is Ser, and the mutant has improved catalytic activity. Preferably, it catalyzes a substrate containing a 1,2-diglucosyl group.
  • the activity of 1,3-glycosylation is increased or the activity of catalyzing 1,3-glycosylation on the basis of glucose monosaccharide substrate is reduced; preferably, it has an effect on the substrate steviol diglycoside, steviol glycoside or
  • the catalytic activity of Leiboldiside D is improved, while the catalytic activity of the substrates steviol monoglycoside, rubusoside, and Leboldiside A is reduced; more preferably, it catalyzes the formation of Lebaudioside D into Leiboldi
  • the activity of glycoside M is increased and the activity of catalyzing rebaudioside A to by-product rebaudioside I is weakened.
  • the mutation at position 284 is: Ala, and the catalytic activity of the mutant is weakened.
  • the mutation at position 147 is Ala, Asn or Gln, and the catalytic activity of the mutant is weakened.
  • the mutation at position 155 is Ala or Tyr, and the catalytic activity of the mutant is weakened.
  • the mutation at position 146 is Ala, Asn or Ser, and the catalytic activity of the mutant is weakened.
  • the mutation at position 380 is Thr, Ser, Asn or Glu, and the catalytic activity of the mutant is weakened or disappeared.
  • the 85th position is mutated to Val, and this mutant is for the substrate steviol monoglycoside, steviol diglycoside, rubusoside or rebaudioside D Increased catalytic activity.
  • the 87th mutation is Phe, which is compatible with the substrates steviol monoglycoside, steviol diglycoside, rubusoside, stevioside, Leybold
  • the catalytic activity of Diglycoside A or Leiboldoside D is weakened.
  • the mutation at position 88 is Val, and this mutant catalyzes the substrate steviol diglycoside, stevioside, rebaudioside A or rebaudioside D. Increased activity; decreased catalytic activity for the substrate steviol monoglycoside.
  • the 90th mutation is Leu, which has enhanced catalytic activity for the substrate steviol diglycoside; for the substrate steviol monoglycoside and rubusoside The catalytic activity is weakened.
  • the 90th mutation is Val
  • the mutant has enhanced catalytic activity for the substrate steviol diglycoside or stevioside; for the substrate steviol monoglycoside, sweet leaf
  • the catalytic activity of rubusoside is weakened.
  • the 91st mutation is Phe, which has enhanced catalytic activity for the substrate steviol diglycoside; for the substrate steviol monoglycoside and rubusoside , The catalytic activity of stevioside is weakened.
  • the mutation at position 126 is Phe, and the mutant has enhanced catalytic activity for the substrate steviol diglycoside, stevioside or rebaudioside D; for the substrate The catalytic activity of steviol monoglycoside, rubusoside or rebaudioside A was weakened.
  • the mutation at position 126 is Val, which is catalyzed by the substrate steviol monoglycoside, rubusoside, stevioside or rebaudioside A The activity is weakened.
  • the 196th mutation is Gln, which has reduced catalytic activity for the substrate stevioside or rebaudioside D.
  • the 199th mutation is Phe, and this mutant has enhanced catalytic activity for the substrate steviol monoglycoside, steviol diglycoside or rebaudioside D.
  • the mutation at position 199 is Leu, and this mutant is for the substrate steviol monoglycoside, steviol diglycoside, rubusoside or rebaudioside D Increased catalytic activity.
  • the mutation at position 199 is Val. This mutant catalyzes the substrate steviol diglycoside, stevioside, rebaudioside A or rebaudioside D. Increased activity.
  • the mutation at position 200 in the glycosyltransferase UGT76G1 mutant is Ile, and the mutant has enhanced catalytic activity for the substrate steviol diglycoside, rebaudioside A or rebaudioside D; The catalytic activity of the substrate stevioside or rubusoside was weakened.
  • the mutation at position 200 in the glycosyltransferase UGT76G1 mutant is Val, which has enhanced catalytic activity for the substrate Lebaudioside A; for the substrate steviol monoglycoside or sweet leaf suspension The catalytic activity of glucoside is weakened.
  • the mutation at position 203 is Leu, and this mutant has an effect on the substrates steviol monoglycoside, rubusoside, rebaudioside A or rebaudioside.
  • the catalytic activity of glycoside D is weakened.
  • the mutation at position 203 is Val, which has enhanced catalytic activity for the substrate steviol diglycoside or rebaudioside D; for the substrate steviol monoglycoside , Rubusoside or Leiboldiside A, the catalytic activity is weakened.
  • the mutation at position 204 is Phe, which is catalyzed by the substrate steviol monoglycoside, rubusoside, stevioside or rebaudioside D The activity is weakened.
  • the mutation at position 204 is Trp, and the mutant has a positive effect on the substrates steviol monoglycoside, steviol diglycoside, rubusoside, stevioside, Leybold
  • the catalytic activity of Diglycoside A or Leiboldoside D is weakened.
  • the mutation at position 379 is Phe, which has enhanced catalytic activity for the substrate steviol diglycoside; for the substrate steviol monoglycoside and rubusoside
  • the catalytic activity of stevioside or Lebaudioside D is weakened.
  • the mutation at position 379 is Ile, which is compatible with the substrate steviol monoglycoside, steviol diglycoside, stevioside, rebaudioside A or Leybold
  • the catalytic activity of diglycoside D is enhanced.
  • the mutation at position 379 is Val, and the mutant has enhanced catalytic activity for the substrate steviol diglycoside, rebaudioside A or rebaudioside D; The catalytic activity of the substrate steviol monoglycoside, rubusoside or stevioside was weakened.
  • the mutation at position 379 is Trp, which has enhanced catalytic activity for the substrate rebaudioside A; and reduced catalytic activity for the substrate stevioside.
  • positions 199, 200, and 203 are mutated to Ala, which has enhanced catalytic activity for the substrate Lebaudioside A; for the substrate steviol monoglycoside
  • the catalytic activity of stevioside, rubusoside or stevioside is weakened.
  • positions 199, 200, 203, and 204 are mutated to Ala, and this mutant is compatible with the substrates steviol monoglycoside, steviol diglycoside, rubusoside
  • the catalytic activity of stevioside or Lebaudioside D is weakened.
  • an isolated polynucleotide is provided, and the nucleic acid encodes the aforementioned glycosyltransferase UGT76G1 mutant.
  • a vector which contains the polynucleotide.
  • a genetically engineered host cell which contains the vector or the polynucleotide integrated into the genome.
  • the cell includes: a reaction system for 1,3-glycosylation based on 1,2-diglucosyl or glucose monosaccharide substrates, which is used for glycosylation (including catalyzing 1,2 -Diglucosyl or glucose monosaccharide substrate for 1,3-glycosylation) is the glycosyltransferase UGT76G1 mutation; preferably, the reaction system is a Leboldoside M production system.
  • the rebaudioside M production system includes: a system using rebaudioside A as a substrate, including: corresponding to the mutation at position 284 of SEQ ID NO:1 to Ser, and mutation at position 85 Glycosyltransferase UGT76G1 mutant with Val, mutation at position 126 to Phe, mutation at position 199 to Phe, mutation at position 199 to Leu, or mutation at position 203 to Val, and conversion of Leboldoside A to Leybold Enzymes for diglycoside D; preferably, the enzymes that convert rebaudioside A into rebaudioside D include (but are not limited to): EUGT11, UGT91D2.
  • the rebaudioside M production system includes: a system using stevioside as a substrate, including: an enzyme that converts stevioside into rebaudioside A, corresponding to SEQ ID NO:1 A glycosyltransferase UGT76G1 mutant with mutation at position 284 to Ser, mutation at position 88 to Val, mutation at position 90 to Val, mutation at position 126 to Phe, mutation at position 199 to Val, or mutation at position 379 to Ile, and
  • the enzyme that converts Lebaudioside A into Lebaudioside D preferably, the enzyme that converts stevioside into Lebaudioside A is also UGT76G1, mutant UGT76G1, which converts Lebaudioside A into
  • the enzymes of Lebaudioside D include (but are not limited to): EUGT11, UGT91D2.
  • the rebaudioside M production system includes: a system using rebaudioside D as a substrate, including: corresponding to SEQ ID NO: 1, the 284th mutation is Ser, the 85th mutation Is Val, the 88th mutation is Val, the 126th mutation is Phe, the 199th mutation is Phe, the 199th mutation is Leu, the 199th mutation is Val, the 200th mutation is Ile, and the 203th mutation is Val, 379th mutation to Ile, 379th mutation to Val or 379th mutation to Trp glycosyltransferase UGT76G1 mutant.
  • the rebaudioside M production system includes: a system using the aglycon steviol as a substrate, including: corresponding to SEQ ID NO: 1, the 284th mutation is Ser, the 88th mutation is Val, a mutation at position 90 to Val, a mutation at position 126 to Phe, a mutation at position 199 to Val, or a mutation at position 379 to Ile of the glycosyltransferase UGT76G1 mutant, which converts rebaudioside A or stevioside into lysine
  • the enzyme of Baodiside D and the enzyme that catalyzes the aglycon steviol into steviol glycoside or rebaudioside A; the enzymes that catalyze the aglycon steviol into steviol glycoside or rebaudioside A include (but are not limited to) : EUGT11, UGT91D2, UGT74G1, UGT85C2, UGT75L20, UGT75L21, UGT75
  • the host cell also includes an enzyme for the regeneration and recycling of UDP-glucose; preferably, the enzyme for the regeneration and recycling of UDP-glucose includes (but not limited to): AtSUS3 .
  • the host cells include: prokaryotic cells or eukaryotic cells; preferably, the prokaryotic host cells include E. coli, Bacillus subtilis, etc.; the eukaryotic host cells include: fungal cells, yeast cells , Insect cells, mammalian cells, etc.
  • a method for producing any of the aforementioned glycosyltransferase UGT76G1 mutants comprising the steps of: (1) culturing the host cell to obtain a culture; and (2) Any of the aforementioned glycosyltransferase UGT76G1 mutants are isolated from the culture.
  • a method for modulating the catalytic activity or substrate specificity of the glycosyltransferase UGT76G1 comprising: amino acids that interact with glycosyl donors or glycosyl acceptors in its spatial structure Make mutations; thereby change its catalytic activity or substrate specificity.
  • the 284th position corresponding to SEQ ID NO:1 is mutated to Ser to improve the catalysis of this mutant to substrates containing 1,2-diglucosyl groups (such as steviol diglycoside, stevioside or Leybold Diglycosides D) carry out 1,3-glycosylation activity or reduce the mutant's catalytic glucose monosaccharide substrates (such as steviol monoglycoside, rubusoside, rebaudioside A) based on 1,3 -Glycosylation activity; preferably, the activity of catalyzing Lebaudioside D to Lebaudioside M is increased and the activity of catalyzing Lebaudioside A to produce Lebaudioside I is reduced; or it will correspond to SEQ
  • the 284th position in ID NO:1 is mutated to Ala, which reduces the catalytic activity of the mutant; or the 147th position in SEQ ID NO:1 is mutated to Ala, Asn or Gln, which reduces the
  • it further includes: mutating the 85th position in SEQ ID NO:1 to Val to enhance its resistance to the substrate steviol monoglycoside, steviol diglycoside, rubusoside or rebaudioside D Catalytic activity; the 87th position in SEQ ID NO:1 is mutated to Phe, which weakens its resistance to the substrates steviol monoglycoside, steviol diglycoside, rubusoside, stevioside, rebaudioside A or Leiboldi Catalytic activity of glycoside D; mutation corresponding to position 88 in SEQ ID NO:1 to Val to enhance its catalytic activity on the substrate steviol diglycoside, stevioside, rebaudioside A or rebaudioside D, and weaken the substrate Steviol monoglycoside catalytic activity; the 90th position in SEQ ID NO:1 is mutated to Leu to enhance its catalytic activity for the substrate steviol diglycoside, and weaken the
  • the use of a glycosyltransferase UGT76G1 mutant with an amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO:1 mutated to Ser at position 284 is provided for promoting the performance of substrates containing 1,2-diglucosyl groups.
  • 1,3-glycosylation, 1,3-glycosylation is carried out on the basis of reducing glucose monosaccharide substrate; preferably, it is used to promote the production of Lebaudioside D to Lebaudioside M.
  • a method for regulating glycosylation which includes catalyzing a glycosyltransferase UGT76G1 mutant corresponding to SEQ ID NO:1 mutated to Ser to promote a 1,2- Diglucosyl substrate undergoes 1,3-glycosylation; the glycosyltransferase UGT76G1 mutant corresponding to the 284th mutation in SEQ ID NO:1 is catalyzed to weaken the catalytic glycosylation activity; The glycosyltransferase UGT76G1 mutant with mutation to Ala, Asn or Gln at position 147 in SEQ ID NO:1 is catalyzed to weaken the catalytic glycosylation activity; corresponding to the mutation at position 155 in SEQ ID NO:1 as Ala Or Tyr's glycosyltransferase UGT76G1 mutant for catalysis, weakening the catalytic glycosylation activity; catalyzed by the glycosylation
  • Baodiside D catalyzes glycosylation activity; it is catalyzed by the glycosyltransferase UGT76G1 mutant corresponding to the 379th mutation to Ile in SEQ ID NO:1 to enhance the substrate steviol monoglycoside, steviol diglycoside and stevioside , Rebaudioside A or Rebaudioside D catalyzes glycosylation activity; the glycosyltransferase UGT76G1 mutant corresponding to the mutation at position 379 of SEQ ID NO:1 to Val is catalyzed to enhance the substrate stevia Glycoside, rebaudioside A or rebaudioside D catalytic glycosylation activity; weaken the catalytic glycosylation activity of the substrate steviol monoglycoside, rubusoside or stevioside; to correspond to SEQ ID NO:1
  • the glycosyltransferase UGT76G1 mutant with the mutation at position 379 to Trp cata
  • the glycosylation product (1,3-glycosylation product) is Leiboldiside M, including: using Lebaudioside A as a substrate to correspond to SEQ ID NO:1
  • the enzyme that converts Leiboldiside A into Leboldiside D is catalyzed to obtain Leboldiside M; preferably, the enzyme that converts Leyboldiside A into Lebaudioside D includes: EUGT11, UGT91D2 ; Or use stevioside as the substrate to convert stevioside to rebaudioside A, corresponding to SEQ ID NO:1, mutation at position 284 to Ser, mutation at position 88 to Val, and mutation at position 90 to Val ,
  • the method further includes: applying an enzyme that regenerates and recycles UDP-glucose; preferably, the enzyme that regenerates and recycles UDP-glucose includes (but is not limited to): AtSUS3.
  • composition which contains: the glycosyltransferase UGT76G1 mutant; or contains any one of the aforementioned host cells.
  • kits which contains: any of the aforementioned glycosyltransferase UGT76G1 mutants; or any of the aforementioned host cells; or the aforementioned composition.
  • the composition also includes a pharmaceutically or industrially synthetically acceptable carrier.
  • FIG. 1 The chemical structure of Lebaudioside B. Circle 1: Glycosyl 1; Circle 2: Glycosyl 2; Circle 3: Glycosyl 3.
  • H25A, D124N mutants have no catalytic activity on all tested substrates.
  • a substrate steviol monoside (steviolmonoside);
  • b substrate steviol diglycoside (steviolbioside);
  • c substrate rubusoside (rubusoside);
  • d substrate stevioside (stevioside);
  • e substrate Leiboldiside A;
  • f the substrate Leiboldiside D.
  • Figure 9 The effect of mutation at position T284 on different substrates.
  • a the substrate steviol monoglycoside
  • b the substrate steviol diglycoside
  • c the substrate rubusoside
  • d the substrate stevioside
  • e the substrate Lebaudioside A
  • f the substrate Lai Baodiside D.
  • Figure 10 The catalytic activity of S147 and H155 site mutations on the substrates steviol monoglycoside, rubusoside and Leiboldiside A is weakened.
  • a substrate steviol monoglycoside
  • b substrate rubusoside
  • c substrate rebaudioside A
  • d substrate stevioside
  • e substrate rebaudioside A
  • f substrate Leiboldiside D.
  • T146 and D380 mutations that stabilize glycosyl 3 affect the substrate catalytic activity.
  • a the substrate steviol monoglycoside
  • b the substrate steviol diglycoside
  • c the substrate rubusoside
  • d the substrate stevioside
  • e the substrate Lebaudioside A
  • f the substrate Lai Baodiside D.
  • Figure 14 Results of gel electrophoresis of PCR products when the mutant was constructed.
  • Figure 17 The catalytic activity of the mutant on the substrate steviolbioside.
  • the present inventors revealed a mutant glycosyltransferase UGT76G1.
  • the catalytic activity, substrate specificity and/or substrate specificity of the mutant glycosyltransferase UGT76G1 changes, which can Significantly promote the catalytic activity of 1,3-glycosylation of substrates containing 1,2-diglucosyl groups, and significantly weaken the catalytic activity of 1,3-glycosylation based on glucose monosaccharide substrates.
  • the 1,2-diglucose substrate is Lebaudioside D
  • the mutant glycosyltransferase UGT76G1 of the present invention promotes the production of Lebaudioside M products and reduces the generation of by-products.
  • the present invention also discloses a series of other mutants that strengthen or weaken the catalytic activity of the glycosyltransferase UGT76G1.
  • the “mutant of glycosyltransferase UGT76G1” and “mutant glycosyltransferase UGT76G1” are used interchangeably, referring to the wild-type glycosyltransferase UGT76G1, which corresponds to The polypeptide formed by mutations in the vicinity of the substrate binding pocket or the polypeptide with altered catalytic activity preferably corresponds to the sequence No. 284, 147, 155, 146, 380, 85, 87, 88, 90, 91, 126, A polypeptide formed by mutations at positions 196, 199, 200, 203, 204 or 379.
  • the wild-type glycosyltransferase UGT76G1 can be a protein with an "amino acid sequence such as SEQ ID NO: 1, or a homofunctional variant or active fragment of the protein.
  • the wild type glycosyltransferase UGT76G1 is derived from Stevia rebaudiana; however, it should be understood that the present invention also encompasses UGT76G1 homologues derived from other plants that have homology and have the same function.
  • isolated glycosyltransferase UGT76G1 refers to the glycosyltransferase UGT76G1 mutant substantially free of other proteins, lipids, carbohydrates or other substances naturally associated therewith.
  • Those skilled in the art can use standard protein purification techniques to purify the glycosyltransferase UGT76G1 mutant.
  • the substantially pure protein can produce a single main band on a non-reducing polyacrylamide gel.
  • substrate binding pocket refers to the position in the spatial structure of the glycosyltransferase UGT76G1 that interacts (bound) with the substrate.
  • the protein of the present invention can be a recombinant protein, a natural protein, or a synthetic protein, preferably a recombinant protein.
  • the protein of the present invention can be a natural purified product, or a chemically synthesized product, or produced from a prokaryotic or eukaryotic host (for example, bacteria, yeast, higher plants, insect and mammalian cells) using recombinant technology.
  • the present invention also includes fragments, derivatives and analogs of the glycosyltransferase UGT76G1 mutant.
  • fragment refers to a protein that substantially maintains the same biological function or activity as the natural glycosyltransferase UGT76G1 mutant of the present invention.
  • the protein fragment, derivative or analogue of the present invention may be (i) a protein in which one or more conservative or non-conservative amino acid residues (preferably conservative amino acid residues) are substituted, and such substituted amino acid residues It may or may not be encoded by the genetic code, or (ii) a protein with a substitution group in one or more amino acid residues, or (iii) a protein formed by fusing an additional amino acid sequence to the protein sequence (such as Leader sequence or secretory sequence or sequence used to purify the protein or proprotein sequence, or fusion protein). According to the definition herein, these fragments, derivatives and analogs belong to the scope well known to those skilled in the art.
  • the amino acid sequence of the glycosyltransferase UGT76G1 mutant and its fragments, derivatives and analogs must have the mutation described above in the present invention; preferably, the mutation corresponds to SEQ ID NO:1 Mutations in the 284, 147, 155, 146, 380, 85, 87, 88, 90, 91, 126, 196, 199, 200, 203, 204 or 379 amino acids in the.
  • the term "glycosyltransferase UGT76G1 mutant” also includes (but is not limited to): several (usually 1-20, more preferably 1-10, still more preferably 1-8 , 1-5, 1-3, or 1-2) amino acid deletions, insertions and/or substitutions, and addition or deletion of one or several (usually within 20) at the C-terminal and/or N-terminal, Preferably within 10, more preferably within 5) amino acids.
  • amino acids with similar or similar properties are substituted, the function of the protein is usually not changed.
  • adding or deleting one or several amino acids at the C-terminus and/or N-terminus usually does not change the function of the protein.
  • the term also includes active fragments and active derivatives of glycosyltransferase UGT76G1 mutants.
  • the mutations described above in the present invention preferably, the mutations correspond to the 284, 147, 155, 146, 380, 85, 87, 88, and 88 of SEQ ID NO:1.
  • the term "glycosyltransferase UGT76G1 mutant” also includes (but is not limited to): the amino acid sequence of the glycosyltransferase UGT76G1 mutant has more than 80%, preferably more than 85%, More preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, such as 98% or more, 99% or more sequence identity of the derived protein retaining its protein activity.
  • the mutation described above in the present invention preferably, the mutation corresponds to the 284, 147, 155, 146, 380, 85, 87, and 87 of SEQ ID NO:1.
  • the invention also provides a polynucleotide sequence encoding a glycosyltransferase UGT76G1 mutant of the invention or a conservative variant protein thereof.
  • the polynucleotide of the present invention may be in the form of DNA or RNA.
  • DNA forms include cDNA, genomic DNA or synthetic DNA.
  • DNA can be single-stranded or double-stranded.
  • DNA can be a coding strand or a non-coding strand.
  • the polynucleotide encoding the mature protein of the mutant includes: only the coding sequence of the mature protein; the coding sequence of the mature protein and various additional coding sequences; the coding sequence (and optional additional coding sequence) of the mature protein and non- Coding sequence.
  • a "polynucleotide encoding a protein” may include a polynucleotide encoding the protein, or a polynucleotide that also includes additional coding and/or non-coding sequences.
  • the present invention also relates to a vector containing the polynucleotide of the present invention, and a host cell produced by genetic engineering using the vector or glycosyltransferase UGT76G1 mutant coding sequence of the present invention, and a method for producing the protein of the present invention through recombinant technology .
  • the polynucleotide sequence of the present invention can be used to express or produce a recombinant glycosyltransferase UGT76G1 mutant.
  • the polynucleotide sequence of the glycosyltransferase UGT76G1 mutant can be inserted into the recombinant expression vector.
  • recombinant expression vector refers to bacterial plasmids, bacteriophages, yeast plasmids, plant cell viruses, mammalian cell viruses or other vectors well known in the art. In short, any plasmid and vector can be used as long as it can replicate and stabilize in the host.
  • An important feature of an expression vector is that it usually contains an origin of replication, a promoter, a marker gene, and translation control elements.
  • an expression vector containing the DNA sequence encoding the glycosyltransferase UGT76G1 mutant and appropriate transcription/translation control signals can be used to construct an expression vector containing the DNA sequence encoding the glycosyltransferase UGT76G1 mutant and appropriate transcription/translation control signals. These methods include in vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis technology, and in vivo recombination technology.
  • the DNA sequence can be effectively linked to an appropriate promoter in the expression vector to guide mRNA synthesis.
  • the expression vector also includes a ribosome binding site for translation initiation and a transcription terminator.
  • the expression vector preferably contains one or more selectable marker genes to provide phenotypic traits for selection of transformed host cells.
  • a vector containing the above-mentioned appropriate DNA sequence and an appropriate promoter or control sequence can be used to transform an appropriate host cell so that it can express the protein.
  • the host cell can be a prokaryotic cell, such as a bacterial cell; or a lower eukaryotic cell, such as a yeast cell; or a higher eukaryotic cell, such as a plant cell.
  • a prokaryotic cell such as a bacterial cell
  • a lower eukaryotic cell such as a yeast cell
  • a higher eukaryotic cell such as a plant cell.
  • Representative examples include: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Agrobacterium; eukaryotic cells such as yeast and plant cells.
  • E. coli is used as the host cell.
  • the substrate containing 1,2-diglucosyl includes but not limited to: steviol diglycoside, stevioside, rebaudioside D or rebaudioside E.
  • the glucose monosaccharide substrate includes, but is not limited to: steviol monoglycoside, rubusoside, lybaudioside A, steviol 19-O-glucose ester, and kaurenoic acid 19-O-glucose ester.
  • the product of 1,3-glycosylation is Leboldoside M
  • the mutant glycosyltransferase UGT76G1 is used to catalyze Leboldoside D to obtain Leboldoside M.
  • Various intracellular or extracellular preparation methods are included in the present invention, or can be used in the present invention.
  • rebaudioside A is used as the substrate
  • rebaudioside A is used as the substrate
  • the 284th position corresponding to SEQ ID NO:1 is mutated to Ser , Mutation at position 85 to Val, mutation at position 126 to Phe, mutation at position 199 to Phe, mutation at position 199 to Leu, or mutation at position 203 to Val.
  • the glycosyltransferase UGT76G1 mutant and The enzyme that converts A into Lebaudioside D" is catalyzed to obtain Lebaudioside M.
  • the "enzyme for converting Leboldiside A into Lebaudioside D” is in the field .
  • the "enzyme that converts rebaudioside A into rebaudioside D” can be EUGT11, UGT91D2 (SEQ ID NO: 5).
  • stevioside is used as the substrate, and the "enzyme that converts stevioside into rebaudioside A" corresponds to the mutation at position 284 of SEQ ID NO:1 to Ser, 88 Mutant of the glycosyltransferase UGT76G1 with mutation at position Val, mutation at position 90 to Val, mutation at position 126 to Phe, mutation at position 199 to Val, or mutation at position 379 to Ile, and "Transform Leboldoside A Catalyze the enzyme of Leiboldiside D to obtain Leboldiside M.
  • the "enzymes that convert stevioside into Lebaudioside A” are.
  • the "enzyme that converts stevioside into Lebaudioside A” is also UGT76G1 and mutant UGT76G1; the "enzyme that converts Lebaudioside A into Lebaudioside D” may be EUGT11 , UGT91D2 (SEQ ID NO: 5).
  • Leiboldiside D is used as the substrate, corresponding to SEQ ID NO: 1, the 284th mutation is Ser, the 85th mutation is Val, the 88th mutation is Val, and the Mutation at position 126 to Phe, mutation at position 199 to Phe, mutation at position 199 to Leu, mutation at position 199 to Val, mutation at position 200 to Ile, mutation at position 203 to Val, mutation at position 379 to Ile, 379
  • the glycosyltransferase UGT76G1 mutant with mutation at position Val or mutation at position 379 to Trp was catalyzed to obtain Leiboldiside M.
  • the aglycon steviol is used as the substrate, and the 284th position corresponding to SEQ ID NO:1 is mutated to Ser, the 88th position is mutated to Val, the 90th position is mutated to Val, and the 126th position corresponds to Glycosyltransferase UGT76G1 mutant with mutation Phe at position 199, Val at position 199 or Ile at position 379, "Enzyme that converts rebaudioside A or stevioside to rebaudioside D" and " The aglycon steviol is catalyzed by the enzyme of stevioside or rebaudioside A" to obtain rebaudioside M.
  • the "enzyme that catalyzes the aglycon steviol to steviol glycosides or rebaudioside A” includes (but not limited to): EUGT11, UGT91D2, UGT74G1, UGT85C2, UGT75L20, UGT75L21, UGT75W2, UGT75T4, UGT85A57, UGT85A58.
  • the above-mentioned method of preparing Lebaudioside M can be carried out intracellularly or extracellularly.
  • a method for intracellular production of Leboldoside M is provided: the mutant glycosyltransferase UGT76G1 corresponding to the 284th position of SEQ ID NO:1 mutated to Ser and the aforementioned "will Enzyme that converts Lebaudioside A into Lebaudioside D", “Enzyme that converts stevioside into Lebaudioside A”, “Enzyme that catalyzes the aglycon steviol to stevioside or Lebaudioside A” And/or the gene encoding "enzyme that converts Lebaudioside A or stevioside into Lebaudioside D" is transformed into host cells, and the cells are cultured to produce Lebaudioside M.
  • the present invention also provides a series of mutants that weaken the catalytic activity of the glycosyltransferase UGT76G1.
  • the mutations occur at positions 147, 155, 146, or 380 of the sequence corresponding to SEQ ID NO:1. For example, they can It is used in production systems that do not use Lebaudioside M as the final product to reduce the amount of substrate converted into Lebaudioside M and accumulate intermediate products.
  • the weakening of the catalytic activity of the glycosyltransferase UGT76G1 can produce a fluctuating effect, which is beneficial to control the types of products and is meaningful for the production of different products.
  • the improved effect of the present invention is that the mutant glycosyltransferase UGT76G1 obtained by the present invention specifically catalyzes the glycosylation of the 3'position of the glucosyl group in the structure of stevioside compounds in an in vitro enzyme reaction.
  • the efficiency of the mutant catalyzing Rebaudioside D (Rebaudioside D) to synthesize Rebaudioside M is greatly increased, and at the same time, the efficiency of catalyzing Rebaudioside A to produce Rebaudioside I is greatly reduced.
  • PCR primers are synthesized by Shenggong Bioengineering Co., Ltd. or GenScript Biotechnology Co., Ltd. Sanger sequencing was commissioned by Shenggong Biological Engineering Co., Ltd.
  • PCR gel recovery kit and plasmid extraction kit are American Axygen products; PCR high-fidelity enzyme PrimeSTAR Max DNA Polymerase is a product of Takara; Restriction endonuclease and T4 ligase are both New England Biolabs (NEB) )product.
  • the seamless cloning kit was purchased from Novozan Biotechnology Co., Ltd. E. coli DH10B was used for cloning construction, and BL21 (DE3) was used for protein expression.
  • pETDuet-1 vector is used for gene cloning and protein expression. Wild-type UGT76G1 and EUGT11 were synthesized by GenScript Biotechnology Co., Ltd., and optimized by E. coli codons. Ni-NTA was purchased from Qiagen. Protein molecular exclusion purification uses Superdex 200 column (GE Healthcare). Molecular diamond (Hampton research, America) was used for protein crystallization condition screening.
  • Standard compounds steviol, Leiboldiside A, stevioside, and stevioside were purchased from Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd., Rubusoside were purchased from Nanjing Guangrun Biological Products Co., Ltd., Leiboldiside D, Laibao Baodiside M was provided by Sichuan Yingjia Hesheng Technology Co., Ltd.
  • UDP glucose was purchased from Beijing Zhongtai Biological Co., Ltd.
  • Other reagents are domestic analytical reagents or chromatographic reagents purchased from Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. IPTG, MgCl 2 , PMSF, and ampicillin were purchased from Shenggong Bioengineering (Shanghai). DnaseI(10mg/mL) was purchased from Shanghai Yanye Biotechnology Service Center. PMSF was purchased from Sigma China.
  • PCR uses Arktik Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific); constant temperature culture uses ZXGP-A2050 constant temperature incubator (Zhicheng) and ZWY-211G constant temperature culture oscillator (Zhicheng); centrifugation uses 5418R high-speed refrigerated centrifuge and 5418 small centrifuge (Eppendorf). Concentrator plus (Eppendorf) was used for vacuum concentration; UV-1200 UV-visible spectrophotometer was used for detection of OD 600 (Shanghai Meipu Da Instrument Co., Ltd.).
  • the rotary evaporator system is composed of IKA RV 10 digital rotary evaporator (IKA), MZ 2C NT chemical diaphragm pump, and CVC3000 vacuum controller (vacuubrand).
  • C3 high-pressure cell disruptor (Sunnybay Biotech Co., Canada) was used for cell disruption.
  • the liquid chromatography uses a Dionex UltiMate 3000 liquid chromatography system (Thermo Fisher Scientific). The crystal diffraction data was collected at the Shanghai Synchrotron Radiation Facility BL19U, and the HKL3000package was used for structural analysis.
  • SrUGT76G1_wild type (SEQ ID NO:1):
  • the concentration of the protein with the highest purity was determined and concentrated to 5mg/mL and 10mg/mL, respectively.
  • the inventors According to the analysis of the structure of UGT76G1 based on the diffraction data, the inventors obtained the complex structure of UGT76G1 protein and UGT76G1 catalyzed product, Lebaudioside B and UDP.
  • the inventors located the substrate binding pocket and identified several key amino acids in the substrate binding pocket ( Figure 5) , They interact with glycosyl donor, glycosyl acceptor or aglycon core respectively.
  • the inventors divided amino acids into 4 categories according to their functions in the glycosylation process (Table 2), and performed single-point or multiple-point mutations on these amino acids. Through in vitro enzymatic tests, it was determined that the mutant protein was involved in the glycosylation process. Changes in the catalytic activity and substrate recognition specificity.
  • mutant gene was amplified by PCR ( Figure 6), transformed into DH10B, and verified by sequencing.
  • the mutant expression vector that was sequenced correctly was transformed into E. coli expression host BL21(DE3).
  • the final concentration of 0.1mM IPTG was used for induction, and the cells were collected after 18 hours of overnight culture at 16°C.
  • the crude enzyme preparation method is the same as that of wild-type UGT76G1.
  • the crude enzyme solution was rotated and incubated with 1 mL Ni-NTA purification resin (4°C), and 25 mM imidazole was eluted in 6-10 column volumes.
  • Reaction conditions 37°C, 30 min. After the reaction, the reaction was quenched with an equal volume of methanol, and after vigorous shaking, the reaction was centrifuged at 12000 rpm for 30 min. Take the supernatant for HPLC detection. Detection method: mobile phase A (acetonitrile)-mobile phase B (water) gradient elution. Calculate the peak area of the catalytic product of the mutant and compare it with that of the wild-type UGT76G1.
  • T284 site stabilizes the first glycosyl in the substrate structure. After mutation of T to A, the catalytic activity of the enzyme on all substrates is reduced, while mutation to S can significantly change the catalytic activity of the enzyme on the substrate ( Figure 9).
  • the relative activity of mutant T284S on the substrates steviol diglycoside, steviol glycoside and rebaudioside D increased by 74.6%, 4.9%, 76.5%, respectively, and the substrate steviol monoglycoside, rubusoside, rebaudioside D
  • the activity of glycoside A decreased by 16.7%, 27.9%, and 52.4%, respectively.
  • the inventors analyzed the substrate structure and found that the three substrates with increased relative catalytic activity have sophorosyl (1,2-diglucosyl), and 1,3-glycosylation is carried out on this basis; The relative catalytic activity of substrates that are directly 1,3-glycosylated on the basis of sugar substrates is weakened.
  • T146A, T146N, and T146S mutants that stabilize the third glycosyl group have reduced catalytic activity on the test substrate, while the D380T, D380S, D380N, and D380E mutants completely lose activity on the substrate ( Figure 11).
  • D380 in addition to interacting with the third glycosyl group of the catalytic product, D380 also interacts with the glycosyl donor substrate through hydrogen bonds. Therefore, the mutation D380 may affect the recognition of glycosyl donors, so that the activity of the enzyme on the substrate is completely lost.
  • Leiboldoside M As a new generation of natural sweetener, Leiboldoside M has a better taste than stevioside and Leboldoside A, which are mainstream in the market. At present, stevioside and Lebaudioside A can be obtained cheaply through natural plant extraction, and Lebaudioside M is expensive to prepare because of its scarce content in plants.
  • the inventors introduced the two glycosyltransferase genes EUGT11 and UGT76G1 required to transform Leiboldiside M into the recombinant E. coli system, and converted stevioside and Leboldiside A into high-value products through enzymatic transformation. Lebaudioside M.
  • the present inventors considered selecting the mutant T284S (SEQ ID NO: 2) of UGT76G1. It not only has a higher catalytic activity for converting Lebaudioside D to the target product Lebaudioside M, but at the same time the conversion activity of the substrate Lebaudioside A is reduced, which can reduce the proportion of by-products.
  • EUGT11 codon optimized cloning vector
  • the EUGT11 gene encoding protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • Arabidopsis cDNA Arabidopsis cDNA
  • the AtSUS3 gene encoding sucrose synthase 3 (SEQ ID NO: 4), used for regeneration and recycling of UDP-glucose
  • the EUGT11 gene and the AtSUS3 gene were loaded step by step between the BamHI/HindIII site and the FseI/KpnI site of pDuet-1 to form the plasmid pLW108.
  • mutant UGT76G1 T284S expression vector As a template, primers were designed to load the homology arms, and the mutant genes were amplified by PCR.
  • the UGT76G1 T284S gene was introduced into the downstream of the AtSUS3 gene of pLW108 by seamless cloning to form the plasmid pHJ830. This plasmid is used to express the three genes EUGT11, AtSUS3 and UGT76G1 T284S simultaneously.
  • Point mutations were performed for wild-type SrUGT76G1, and the sites included positions 85, 87, 88, 90, 91, 126, 196, 199, 200, 203, 204, and 379.
  • the point mutation primers were designed as shown in Table 5 and expressed as wild-type SrUGT76G1
  • the vector pQZ11 was cloned using PCR as a template.
  • Mutant 3A refers to a combination mutant in which positions 199, 200, and 203 are all mutated to A
  • mutant 4A refers to a combination mutant in which positions 199, 200, 203, and 204 are all mutated to A.
  • the results of gel electrophoresis of the PCR products are shown in Figure 14, indicating that all 24 mutations were successfully amplified. After digestion with DpnI, it was transformed into E. coli DH10B and verified by sequencing.
  • Use buffer A [20mM Tris-HCl (pH8.0), 100mM NaCl] to resuspend the cells, add 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 2mM MgCl 2 and 5 ⁇ g/mL DNaseI to mix, and then stand on ice for 30 minutes. After the cells were lysed by a high-pressure cell disruptor, the cells were centrifuged at high speed (10000rpm, 99min). The supernatant was rotated and incubated with 1 mL Ni-NTA (4° C., 1 h), and 25 mM imidazole was eluted in 6-10 column volumes.
  • PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride
  • Reaction conditions 37°C, 30 min. After the reaction, the reaction was quenched with an equal volume of methanol, and after vigorous shaking, the reaction was centrifuged at 12000 rpm for 30 min. Take the supernatant for HPLC detection. Detection method: mobile phase A (acetonitrile)-mobile phase B (water) gradient elution. Calculate the peak area of the catalytic product of the mutant and compare it with the peak area of the catalytic product of the wild-type SrUGT76G1.
  • mutants L85V, I199F, I199L, and L379I increased the activity of the substrate steviolmonoside by 36.96%, 102%, 34% and 20%, respectively.
  • the activity of P91F, L126F, I203V, L379F, 3A, and 4A on the substrate decreased to 20%.
  • G87F is almost completely inactivated, and M88V, I90L, I90V, L126V, N196Q, L200I, L200V, I203L, L204F, L204W, and L379V are also significantly weakened.
  • the enzyme activity test on the substrate rubusoside found that most of the mutants had reduced substrate activity, among which the activities of G87F, L126V, L126F, I203V, L379F, 3A and 4A decreased to 0.66%, 28%, 28, respectively. %, 15%, 19%, 18% and 21%.
  • I90L, I90V, P91F, L200I, L200V, I203L, L204F, L204W, L379V also have a significant decrease.
  • mutants L85V, N196Q, I199F, I199L, and L379I have improved substrate activity. Among them, L85V and I199L are more significant, 49% and 32% respectively.
  • the activity of the mutant on the substrate stevioside changed.
  • M88V, I90V, L126F, I199V, L200I, L379W and L379I were more significant, respectively 25%, 24%, 35%, 32% , 20%, 21%, 51%.
  • the activities of G87F, L204W, 3A, and 4A decreased to 10%, 25%, 25%, and 19%, respectively.
  • P91F, L126V, L204F, L379F, L379V also had a significant decrease.
  • mutants M88V, I199V, L200V, L379I, 3A have increased the activity of the substrate rebaudioside A by 1.4 times, 1.39 times, 1.86 times, 3.57 times and 1.67 times, respectively.
  • L200I, L379V, and L379W also have significant improvements.
  • the mutants G87F, L126V, L126F, I203L, I203V, L204W, L379F and other mutants have weakened substrate activity.
  • mutants L85V, M88V, L126F, I199F, I199L, I199V, L200I, I203V, L379W, L379I, and L379V increased the activity of the substrate Rebaudioside D by 57%, 121%, 35.6, respectively %, 73.7%, 70%, 54.6%, 24%, 55%, 12%, 74.6%, 55.9%.
  • the catalytic activity of mutants G87F, I203L, L204F, L204W, L379F, and 4A on the substrate decreased significantly, respectively: 7.25%, 35%, 39.8%, 20.5%, 43.3%, 14.6%.
  • N196Q also dropped significantly.

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Abstract

提供了一种突变型糖基转移酶UGT76G1及其应用。该突变型糖基转移酶UGT76G1的催化活性、底物专一性和/或底物特异性发生变化，在特定位点的突变可促进含有1,2-二葡萄糖基(槐糖基)的底物进行1,3-糖基化的催化活性，减弱其在葡萄糖单糖基底物基础上进行1,3-糖基化的催化活性。还提供了弱化糖基转移酶UGT76G1的催化活性的突变体，其能够增加特定甜菊糖苷中间体的积累。

Description

糖基转移酶突变体及其应用 技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种糖基转移酶突变体及其应用。
背景技术
糖基化是天然产物合成中最广泛的修饰之一。在植物体内，糖基化修饰改变天然产物的溶解性，稳定性，毒性以及生理活性，具有代谢物脱毒，防止生物侵害，改变物质的分配区间等功能。许多植物来源天然产物的糖基化由UDP依赖型糖基转移酶(UGT)催化，UGT利用UDP活化的糖作为糖基供体，将糖分子特异地转移到受体分子的糖基化位点上。目前，已发现或者被注释的植物来源的UGT多于2300个，然而蛋白结构被解析的UGT仅有约20个。
甜菊糖苷类化合物是一类高度糖基化修饰的二萜天然产物，主要来自于菊科植物甜叶菊。甜菊糖苷类化合物具有高甜度、低热量的特点，能够取代蔗糖以及其他人工合成甜味剂，在食品工业中具有巨大的经济效益。目前广泛应用的甜菊糖类主要包括天然来源的莱宝迪苷A(Rebaudioside A)和甜菊苷(Stevioside)，虽然该类产品甜度达到蔗糖的300～600倍，仍然存在苦涩后味等不利缺点，口感有待改进。近年来针对甜菊糖的产业升级主要集中在将莱宝迪苷A和甜菊苷升级为口感更佳，甜度更高的莱宝迪苷D和莱宝迪苷M。
莱宝迪苷D和莱宝迪苷M在原植物中含量非常低，通过植物提取纯化的方式成本巨大，目前的产量远远不能够满足市场需求。莱宝迪苷D和莱宝迪苷M是苷元甜菊醇(steviol)分别经过5步或6步糖基化修饰形成的多糖苷，它们合成途径中的中间体包括莱宝迪苷A和甜菊苷。根据报道，UGT76G1负责催化甜菊苷生成莱宝迪苷A。莱宝迪苷A经UGT91D2(或EUGT11)催化生成莱宝迪苷D，或者经UGT76G1产生副产物莱宝迪苷I。莱宝迪苷D则进一步经UGT76G1催化产生莱宝迪苷M。因此，UGT76G1和UGT91D2是莱宝迪苷D和莱宝迪苷M合成中反复糖基化过程中所需要的两个关键酶基因。
由于糖基转移酶UGT76G1参与甜菊糖苷类合成中的多步糖基化反应，存在底物特异性不专一以及催化活性较弱等问题。现阶段本领域急需探索提高UGT76G1的底物专一性和催化活性的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种糖基转移酶突变体及其应用。
在本发明的第一方面，提供糖基转移酶UGT76G1突变体，所述突变体相对于野生型的糖基转移酶UGT76G1，其空间结构中与糖基供体或糖基受体相互作用的氨基 酸发生突变，其催化活性改变。
在一个优选例中，所述的催化底物莱宝迪苷D生成莱宝迪苷M的活性提高为具有统计学意义的提高，如提高20％以上、40％以上、60％以上、70％以上或更高。
在另一优选例中，所述的催化莱宝迪苷A生成副产物莱宝迪苷I的活性减弱为具有统计学意义的减弱，如减弱20％以上、40％以上、50％以上或更弱。
在另一优选例中，所述的糖基转移酶UGT76G1突变体中是：
(a)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1，第284、147、155、146、380、85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204或379位发生突变的蛋白；
(b)将(a)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于SEQ ID NO:1的第284、147、155、146、380、85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204或379位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；
(c)与(a)蛋白的氨基酸序列有80％以上同源性(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于SEQ ID NO:1的第284、147、155、146、380、85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204或379位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；
(d)(a)蛋白的活性片段，其包含糖基转移酶UGT76G1空间结构中与糖基供体或糖基受体相互作用的结构，且在对应于SEQ ID NO:1的第284、147、155、146、380、85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204或379位上的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同。
在另一优选例中，所述的糖基转移酶UGT76G1突变体中，所述第284位突变为Ser，该突变体催化活性提高，较佳地其催化含有1,2-二葡萄糖基的底物进行1,3-糖基化的活性提高或催化在葡萄糖单糖基底物基础上进行1,3-糖基化的活性降低；较佳地，其对底物甜菊醇双糖苷，甜菊苷或莱宝迪苷D的催化活性提高，而对底物甜菊醇单糖苷，甜叶悬钩子苷，莱宝迪苷A的催化活性降低；更佳地，其催化莱宝迪苷D生成莱宝迪苷M的活性提高且催化莱宝迪苷A生成副产物莱宝迪苷I的活性减弱。
在另一优选例中，所述的糖基转移酶UGT76G1突变体中，所述第284位突变为：Ala，该突变体催化活性减弱。
在另一优选例中，所述的糖基转移酶UGT76G1突变体中，所述第147位突变为Ala、Asn或Gln，该突变体催化活性减弱。
在另一优选例中，所述的糖基转移酶UGT76G1突变体中，所述第155位突变为Ala或Tyr，该突变体催化活性减弱。
在另一优选例中，所述的糖基转移酶UGT76G1突变体中，所述第146位突变为Ala、Asn或Ser，该突变体催化活性减弱。
在另一优选例中，所述的糖基转移酶UGT76G1突变体中，所述第380位突变为Thr、Ser、Asn或Glu，该突变体催化活性减弱或消失。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第85位突变为Val，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷D催化活性增强。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第87位突变为Phe，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第88位突变为Val，该突变体对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第90位突变为Leu，该突变体对于底物甜菊双糖苷催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第90位突变为Val，该突变体对于底物甜菊双糖苷或甜菊苷催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第91位突变为Phe，该突变体对于底物甜菊双糖苷催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第126位突变为Phe，该突变体对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷A催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第126位突变为Val，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷A催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第196位突变为Gln，该突变体对于底物甜菊单糖苷或莱宝迪苷D催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第199位突变为Phe，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷或莱宝迪苷D催化活性增强。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第199位突变为Leu，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷D催化活性增强。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第199位突变为Val，该突变体对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性增强。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第200位突变为Ile，该突变体对于底物甜菊双糖苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性增强；对于底物甜 菊单糖苷或甜叶悬钩子苷催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第200位突变为Val，该突变体对于底物莱宝迪苷A催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷或甜叶悬钩子苷催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第203位突变为Leu，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第203位突变为Val，该突变体对于底物甜菊双糖苷或莱宝迪苷D催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷A催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第204位突变为Phe，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第204位突变为Trp，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第379位突变为Phe，该突变体对于底物甜菊双糖苷催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第379位突变为Ile，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性增强。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第379位突变为Val，该突变体对于底物甜菊双糖苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或甜菊苷催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第379位突变为Trp，该突变体对于底物莱宝迪苷A催化活性增强；对于底物甜菊双糖苷催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第199，200，203位突变为Ala，该突变体对于底物莱宝迪苷A催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或甜菊苷催化活性减弱。
在另一优选例中，所述糖基转移酶UGT76G1突变体中，第199，200，203，204位突变为Ala，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性减弱。
在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的核酸是编码前面所述的糖基转移酶UGT76G1突变体。
在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。
在一个优选例中，所述细胞中包括：基于1,2-双葡萄糖基或葡萄糖单糖基底物进行1,3-糖基化的反应系统，其中用于糖基化(包括催化1,2-双葡萄糖基或葡萄糖单糖基底物进行1,3-糖基化)的酶为糖基转移酶UGT76G1突变；较佳地，所述反应系统为莱宝迪苷M生成系统。
在另一优选例中，所述莱宝迪苷M生成系统包括：以莱宝迪苷A为底物的系统，包括：对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第85位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Phe、第199位突变为Leu或第203位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体，以及将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶；较佳地，该将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶包括(但不限于)：EUGT11，UGT91D2。
在另一优选例中，所述莱宝迪苷M生成系统包括：以甜菊苷为底物的系统，包括：将甜菊苷转化为莱宝迪苷A的酶、对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第88位突变为Val、第90位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Val或第379位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体，以及将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶；较佳地，该将甜菊苷转化为莱宝迪苷A的酶同样为UGT76G1，突变型UGT76G1，该将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶包括(但不限于)：EUGT11，UGT91D2。
在另一优选例中，所述莱宝迪苷M生成系统包括：以莱宝迪苷D为底物的系统，包括：对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第85位突变为Val、第88位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Phe、第199位突变为Leu、第199位突变为Val、第200位突变为Ile、第203位突变为Val、第379位突变为Ile、第379位突变为Val或第379位突变为Trp的糖基转移酶UGT76G1突变体。
在另一优选例中，所述莱宝迪苷M生成系统包括：以苷元甜菊醇为底物的系统，包括：对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第88位突变为Val、第90位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Val或第379位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体，将莱宝迪苷A或甜菊苷转化为莱宝迪苷D的酶以及将苷元甜菊醇催化为甜菊苷或莱宝迪苷A的酶；所述将苷元甜菊醇催化为甜菊苷或莱宝迪苷A的酶包括(但不限于)：EUGT11，UGT91D2，UGT74G1，UGT85C2，UGT75L20，UGT75L21，UGT75W2，UGT75T4，UGT85A57，UGT85A58，UGT76G1、突变型UGT76G1。
在另一优选例中，所述的宿主细胞中还包括使UDP-葡萄糖的再生循环利用的酶；较佳地，所述使UDP-葡萄糖的再生循环利用的酶包括(但不限于)：AtSUS3。
在另一优选例中，所述宿主细胞包括：原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；所述真核宿主细胞包括：真菌细胞、酵母细胞、 昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
在本发明的另一方面，提供一种生产前面任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体的方法，包括步骤：(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体。
在本发明的另一方面，提供一种调节糖基转移酶UGT76G1的催化活性或底物专一性的方法，包括：将其空间结构中与糖基供体或糖基受体相互作用的氨基酸进行突变；从而使其催化活性或底物专一性改变。
在一个优选例中，将对应于SEQ ID NO:1中第284位突变为Ser，提高该突变体催化含有1,2-二葡萄糖基的底物(如甜菊醇双糖苷，甜菊苷或莱宝迪苷D)进行1,3-糖基化的活性或降低该突变体催化葡萄糖单糖基底物(如甜菊醇单糖苷，甜叶悬钩子苷，莱宝迪苷A)基础上进行1,3-糖基化的活性；较佳地其催化莱宝迪苷D生成莱宝迪苷M的活性提高且催化莱宝迪苷A生成副产物莱宝迪苷I的活性减弱；或将对应于SEQ ID NO:1中第284位突变为Ala，减弱该突变体催化活性；或将对应于SEQ ID NO:1中第147位突变为Ala、Asn或Gln，减弱该突变体催化活性；或将对应于SEQ ID NO:1中第155位突变为Ala或Tyr，该突变体催化活性减弱；或将对应于SEQ ID NO:1中第146位突变为Ala、Asn或Ser，减弱该突变体催化活性；或将对应于SEQ ID NO:1中第380位突变为Thr、Ser、Asn或Glu，减弱该突变体催化活性或使活性消失。在另一优选例中，还包括：将对应于SEQ ID NO:1中第85位突变为Val，增强其对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷D催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第87位突变为Phe，减弱其对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第88位突变为Val，增强其对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第90位突变为Leu，增强其对于底物甜菊双糖苷催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第90位突变为Val，增强其对于底物甜菊双糖苷或甜菊苷催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第91位突变为Phe，增强其对于底物甜菊双糖苷催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第126位突变为Phe，增强其对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷A催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第126位突变为Val，减弱其对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷A催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第196位突变为Gln，减弱其对于底物甜菊单糖苷或莱宝迪苷D催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第199位突变为Phe，增强其对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷或莱宝迪苷D催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第199位突变为Leu，增强其对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜 叶悬钩子苷或莱宝迪苷D催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第199位突变为Val，增强其对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第200位突变为Ile，增强其对于底物甜菊双糖苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第200位突变为Val，增强其对于底物莱宝迪苷A催化活性；减弱其对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第203位突变为Leu，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第203位突变为Val，增强其对于底物甜菊双糖苷或莱宝迪苷D催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷A催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第204位突变为Phe，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第204位突变为Trp，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Phe，增强其对于底物甜菊双糖苷催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Ile，增强其对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Val，增强其对于底物甜菊双糖苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或甜菊苷催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Trp，增强其对于底物甜菊苷或莱宝迪苷A催化活性；减弱对于底物甜菊双糖苷催化活性；将对应于SEQ ID NO:1中第199、200、203位突变为Ala，增强其对于底物莱宝迪苷A催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或甜菊苷催化活性；或将对应于SEQ ID NO:1中第199、200、203、204位突变为Ala，减弱其对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性。
在本发明的另一方面，提供氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser的糖基转移酶UGT76G1突变体的用途，用于促进含有1,2-双葡萄糖基的底物进行1,3-糖基化，减少葡萄糖单糖基底物基础上进行1,3-糖基化；较佳地，用于促进莱宝迪苷D生成莱宝迪苷M。
在本发明的另一方面，提供一种调控糖基化的方法，包括以对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，促进含有1,2-二葡萄糖基的底物进行1,3-糖基化；以对应于SEQ ID NO:1中第284位突变为Ala的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第147位突变为Ala、Asn或Gln的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第155位突变为Ala或Tyr的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第 146位突变为Ala、Asn或Ser的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第380位突变为Thr、Ser、Asn或Glu的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化催化糖基化活性或使活性消失；以对应于SEQ ID NO:1中第85位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第87位突变为Phe的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第88位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第90位突变为Leu的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第90位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷或甜菊苷催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第91位突变为Phe的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第126位突变为Phe的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷A催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第126位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷A催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第196位突变为Gln的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化对于底物甜菊单糖苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第199位突变为Phe的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第199位突变为Leu的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第199位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第200位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第200位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物莱宝迪苷A催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第203位突变为Leu，弱化对于底 物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第203位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷A催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第204位突变为Phe的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷D催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第204位突变为Trp的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Phe的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷催化糖基化活性，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或甜菊苷催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Trp的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物莱宝迪苷A催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊双糖苷催化糖基化活性；以对应于SEQ ID NO:1中第199、200、203位突变为Ala的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物莱宝迪苷A催化糖基化活性，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或甜菊苷催化糖基化活性；或以对应于SEQ ID NO:1中第199、200、203、204位突变为Ala的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性。
在一个优选例中，所述的糖基化产物(1,3-糖基化产物)为莱宝迪苷M，包括：以莱宝迪苷A为底物，以对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第85位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Phe、第199位突变为Leu或第203位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体和将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶进行催化，获得莱宝迪苷M；较佳地，该将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶包括：EUGT11，UGT91D2；或以甜菊苷为底物，以将甜菊苷转化为莱宝迪苷A的酶、对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第88位突变为Val、第90位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Val或第379位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体，以及将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶进行催化，获得莱宝迪苷M；较佳地，该将甜菊苷转化为莱宝迪苷A的酶同样为UGT76G1，突变型UGT76G1，该将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶包括：EGUT11，UGT91D2；或以莱宝迪苷D为底物，以对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第85位突变为Val、第88位突变为Val、 第126位突变为Phe、第199位突变为Phe、第199位突变为Leu、第199位突变为Val、第200位突变为Ile、第203位突变为Val、第379位突变为Ile、第379位突变为Val或第379位突变为Trp的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，获得莱宝迪苷M；或以苷元甜菊醇为底物，以对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第88位突变为Val、第90位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Val或第379位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体、将莱宝迪苷A或甜菊苷转化为莱宝迪苷D的酶以及将苷元甜菊醇催化为甜菊苷或莱宝迪苷A的酶进行催化，获得莱宝迪苷M；所述将苷元甜菊醇催化为甜菊苷或莱宝迪苷A的酶包括：EUGT11，UGT91D2，UGT74G1，UGT85C2，UGT75L20，UGT75L21，UGT75W2，UGT75T4，UGT85A57，UGT85A58，UGT76G1、突变型UGT76G1。
在另一优选例中，所述方法还包括：应用使UDP-葡萄糖的再生循环利用的酶；较佳地，所述使UDP-葡萄糖的再生循环利用的酶包括(但不限于)：AtSUS3。
在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述组合物中含有：所述的糖基转移酶UGT76G1突变体；或含有前面任一所述的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，其中含有：前面任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体；或前面任一所述的宿主细胞；或前面所述的组合物。
在另一优选例中，所述的组合物中，还包括药学上或工业合成上可接受的载体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、Ni-NTA纯化后UGT76G1(53.4kDa)的SDS-PAGE。其中，P：沉淀；S：上清；F：流穿液；W：洗涤液；R：树脂；M：Marker。
图2、UGT76G1的分子排阻纯化峰图以及SDS-PAGE。
图3、UGT76G1与甜菊醇双糖苷、UDP-葡萄糖共结晶晶体。
图4、莱宝迪苷B的化学结构。1号圈：糖基1；2号圈：糖基2；3号圈：糖基3。
图5、莱宝迪苷B的结合口袋。
图6、突变体PCR产物凝胶电泳。
图7、突变体蛋白表达。
图8、H25A、D124N突变体对所有测试底物均无催化活性。a，底物甜菊醇单糖苷(steviolmonoside)；b，底物甜菊醇双糖苷(steviolbioside)；c，底物甜叶悬钩子苷(rubusoside)；d，底物甜菊苷(stevioside)；e，底物莱宝迪苷A；f，底物莱宝迪苷D。
图9、T284位点突变对不同底物的影响。a，底物甜菊醇单糖苷；b，底物甜菊醇双糖苷；c，底物甜叶悬钩子苷；d，底物甜菊苷；e，底物莱宝迪苷A；f，底物莱 宝迪苷D。
图10、S147、H155位点突变对底物甜菊醇单糖苷，甜叶悬钩子苷，莱宝迪苷A的催化活性减弱。a，底物甜菊醇单糖苷；b，底物甜叶悬钩子苷；c，底物莱宝迪苷A；d，底物甜菊苷；e，底物莱宝迪苷A；f，底物莱宝迪苷D。
图11、稳定糖基3的T146与D380突变影响底物催化活性。a，底物甜菊醇单糖苷；b，底物甜菊醇双糖苷；c，底物甜叶悬钩子苷；d，底物甜菊苷；e，底物莱宝迪苷A；f，底物莱宝迪苷D。
图12、双突变体对底物莱宝迪苷A、莱宝迪苷D的催化活性。a，底物莱宝迪苷A；b，底物莱宝迪苷D。
图13、重组大肠杆菌系统发酵生产莱宝迪苷M。
图14、突变体构建时，PCR产物凝胶电泳结果。
图15、部分突变体(L126V，L126F，L379F，L379W，L379V)蛋白表达纯化后，SDS-PAGE检测结果。
图16、突变体对底物甜菊单糖苷(steviolmonoside)的催化活性。
图17、突变体对底物甜菊双糖苷(steviolbioside)的催化活性。
图18、突变体对底物甜叶悬钩子苷(rubusoside)的催化活性。
图19、突变体对底物甜菊苷(stevioside)的催化活性。
图20、突变体对底物莱宝迪苷A(rebaudioside A)的催化活性。
图21、突变体对底物莱宝迪苷D(rebaudioside D)的催化活性。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种突变型糖基转移酶UGT76G1，所述的突变型糖基转移酶UGT76G1的催化活性、底物专一性和/或底物特异性发生变化，可显著地促进含有1,2-二葡萄糖基的底物进行1,3-糖基化的催化活性，以及显著地减弱在葡萄糖单糖基底物基础上进行1,3-糖基化的催化活性。当所述的1,2-二葡萄糖基底物为莱宝迪苷D时，本发明的突变型糖基转移酶UGT76G1促进莱宝迪苷M产物的生成以及减少副产物的生成。本发明也揭示了其它一系列强化或弱化糖基转移酶UGT76G1的催化活性的突变体。
如本文所用，除非另外说明，所述的“糖基转移酶UGT76G1突变体”、“突变型糖基转移酶UGT76G1”可互换使用，是指对应于野生型糖基转移酶UGT76G1，在相应于其底物结合口袋附近发生突变后构成的多肽或催化活性发生改变的多肽，较佳地相应于其序列第284、147、155、146、380、85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204或379位发生突变后构成的多肽。
若需要表示野生型的糖基转移酶UGT76G1，其可以为“氨基酸序列如SEQ ID NO: 1的蛋白，或者也可以是该蛋白的同功能变体或活性片段。较佳地，所述的野生型糖基转移酶UGT76G1来源于甜叶菊(Stevia rebaudiana)；但是应理解，本发明中也涵盖来源于其它植物的与之具有同源性且功能相同的UGT76G1同源物。
如本文所用，“分离的糖基转移酶UGT76G1”是指糖基转移酶UGT76G1突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化糖基转移酶UGT76G1突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
如本文所用，“底物结合口袋”是指糖基转移酶UGT76G1的空间结构中与底物发生相互作用(结合)的位置。
本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
本发明还包括所述糖基转移酶UGT76G1突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然糖基转移酶UGT76G1突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，所述的糖基转移酶UGT76G1突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，肯定存在本发明上面所述的突变；较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1中的第284、147、155、146、380、85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204或379位氨基酸的突变。
在本发明中，术语“糖基转移酶UGT76G1突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括糖基转移酶UGT76G1突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在本发明上面所述的突变；较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1中的第284、147、155、146、380、85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204或379位氨基酸的突变。
在本发明中，术语“糖基转移酶UGT76G1突变体”还包括(但并不限于)：与所 述的糖基转移酶UGT76G1突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在本发明上面所述的突变；较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1中的第284、147、155、146、380、85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204或379位氨基酸的突变。
本发明还提供了编码本发明糖基转移酶UGT76G1突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或糖基转移酶UGT76G1突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的糖基转移酶UGT76G1突变体。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码糖基转移酶UGT76G1突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，糖基转移酶UGT76G1突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含糖基转移酶UGT76G1突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明中，所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌；真核细胞如酵母、植物细胞等。在本发明的具体实施例中，以大肠杆菌作为宿主细胞。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
本发明中，所述的含有1,2-二葡萄糖基的底物包括但不限于：甜菊醇双糖苷，甜菊苷，莱宝迪苷D或莱宝迪苷E。所述的葡萄糖单糖基底物包括但不限于：甜菊醇单糖苷，甜叶悬钩子苷，莱宝迪苷A，甜菊醇19-O-葡萄糖酯，贝壳杉烯酸19-O-葡萄糖酯。
在获得了本发明所述的突变型糖基转移酶UGT76G1的信息后，本领域人员清楚如何运用该突变体莱对含有1,2-二葡萄糖基的底物进行1,3-糖基化。
例如，1,3-糖基化的产物为莱宝迪苷M，利用所述的突变型糖基转移酶UGT76G1催化莱宝迪苷D，从而获得莱宝迪苷M。各种胞内或胞外的制备方法均包含在本发明中，或可被运用于本发明中。
考虑到底物的成本，在本发明的一种优选方式中，以莱宝迪苷A为底物，以莱宝迪苷A为底物，以对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第85位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Phe、第199位突变为Leu或第203位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体和“将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶”进行催化，获得莱宝迪苷M。由于本领域中已知莱宝迪苷M的制备及其上游反应机理，因此本领域技术人员了解所述“将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶”在本领域中有哪些。较佳地，所述“将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶”可以为EUGT11，UGT91D2(SEQ ID NO:5)。
在本发明的另一种优选方式中，以甜菊苷为底物，以“将甜菊苷转化为莱宝迪苷A的酶”、对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第88位突变为Val、第90位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Val或第379位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体，以及“将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶”进行催化，获得莱宝迪苷M。同样地，基于本领域已知技术，本领域人员了解所述“将甜菊苷转化为莱宝迪苷A的酶”有哪些。较佳地，所述“将甜菊苷转化为莱宝迪苷A的酶”同样为UGT76G1、突变型UGT76G1；所述“将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶”可以为EUGT11，UGT91D2(SEQ ID NO:5)。
在本发明的另一种方式中，以莱宝迪苷D为底物，以对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第85位突变为Val、第88位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Phe、第199位突变为Leu、第199位突变为Val、第200位突变为Ile、第 203位突变为Val、第379位突变为Ile、第379位突变为Val或第379位突变为Trp的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，获得莱宝迪苷M。
在本发明的另一种方式中，以苷元甜菊醇为底物，以对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第88位突变为Val、第90位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Val或第379位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体、“将莱宝迪苷A或甜菊苷转化为莱宝迪苷D的酶”以及“将苷元甜菊醇催化为甜菊苷或莱宝迪苷A的酶”进行催化，获得莱宝迪苷M。同样地，基于本领域已知技术，本领域人员了解所述“将苷元甜菊醇催化为甜菊苷或莱宝迪苷A的酶”有哪些。较佳地，所述“将苷元甜菊醇催化为甜菊苷或莱宝迪苷A的酶”包括(但不限于)：EUGT11，UGT91D2，UGT74G1，UGT85C2，UGT75L20，UGT75L21，UGT75W2，UGT75T4，UGT85A57，UGT85A58。
上述的制备莱宝迪苷M的方法可在胞内或胞外进行。作为本发明的一种优选方式，提供了一种胞内生产莱宝迪苷M的方法：将对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser的突变型糖基转移酶UGT76G1以及前述“将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶”、“将甜菊苷转化为莱宝迪苷A的酶”、“将苷元甜菊醇催化为甜菊苷或莱宝迪苷A的酶”和/或“将莱宝迪苷A或甜菊苷转化为莱宝迪苷D的酶”的编码基因转化入宿主细胞，培养该细胞，从而生产莱宝迪苷M。
本发明中，还提供了一系列弱化糖基转移酶UGT76G1的催化活性的突变体，其突变发生在对应于SEQ ID NO:1序列的第147、155、146或380位等，例如，它们可被用于并非以莱宝迪苷M为终产物的生产系统中，减少底物转化为莱宝迪苷M的量，积累中间产物。糖基转移酶UGT76G1的催化活性的弱化可以产生此消彼长的效果，有利于控制产物的种类，对于不同产物的生产是有意义的。
与现有技术相比，本发明的进步效果在于：本发明所获得的突变型糖基转移酶UGT76G1在体外酶反应中高效特异催化甜菊苷类化合物结构中葡萄糖基3’位的糖基化，相比于野生型蛋白，突变体催化莱宝迪苷D(Rebaudioside D)合成莱宝迪苷M的效率大幅上升，同时大幅降低催化莱宝迪苷A产生副产物莱宝迪苷I。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与仪器设备
PCR引物由生工生物工程有限公司或金斯瑞生物科技有限公司合成。桑格测序委托生工生物工程有限公司。PCR胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒为美国Axygen产品； PCR高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase为日本宝生物公司(Takara)产品；限制性内切酶、T4连接酶均为New England Biolabs(NEB)产品。无缝克隆试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司。大肠杆菌DH10B用于克隆构建，BL21(DE3)用于蛋白表达。pETDuet-1载体用于基因克隆及蛋白表达。野生型UGT76G1、EUGT11由金斯瑞生物科技有限公司合成，经大肠杆菌密码子优化。Ni-NTA购自Qiagen。蛋白分子排阻纯化使用Superdex 200 column(GE Healthcare)。蛋白结晶条件筛选使用Molecular diamond(Hampton research，America)。
标准品化合物甜菊醇、莱宝迪苷A、甜菊苷、甜菊双糖苷购自上海源叶生物科技有限公司、甜叶悬钩子苷购自南京广润生物制品有限公司，莱宝迪苷D、莱宝迪苷M由四川盈嘉合生科技有限公司提供。UDP葡萄糖购自北京中泰生物有限公司。其他试剂为国产分析纯或色谱纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。IPTG，MgCl 2，PMSF，氨苄霉素购于生工生物工程(上海)。DnaseⅠ(10mg/mL)购于上海彦烨生物科技服务中心。PMSF购自西格玛奥德里奇(Sigma)中国。
PCR使用Arktik Thermal Cycler(Thermo Fisher Scientific)；恒温培养使用ZXGP-A2050恒温培养箱(智城)和ZWY-211G恒温培养振荡器(智城)；离心使用5418R高速冷冻式离心机和5418小型离心机(Eppendorf)。真空浓缩使用Concentrator plus浓缩仪(Eppendorf)；OD 600使用UV-1200紫外可见分光光度计检测(上海美谱达仪器有限公司)。旋转蒸发系统由IKA RV 10 digital旋转蒸发仪(IKA)和MZ 2C NT化学隔膜泵、CVC3000真空控制器(vacuubrand)组成。细胞破碎使用C3高压细胞破碎仪(Sunnybay Biotech Co.，Canada)。液相色谱使用Dionex UltiMate 3000液相色谱系统(Thermo Fisher Scientific)。晶体衍射数据在上海同步辐射光源(Shanghai Synchrotron Radiation Facility BL19U)收集，HKL3000package进行结构解析。
实施例1、UGT76G1蛋白表达纯化结晶与结构解析
1、野生型UGT76G1表达载体pQZ11构建过程
以密码子优化的UGT76G1基因克隆载体为模板，使用特异引物对(表1)扩增目的基因。将PCR产物克隆至载体pETDuet1的BamHI/HindIII位点中，所获得的表达载体pQZ11经测序验证。
表1、野生型UGT76G1表达载体构建使用的引物
Figure PCTCN2020104957-appb-000001
2、蛋白表达纯化
按1％v/v转接过夜培养的携带野生型UGT76G1表达载体pQZ11的大肠杆菌 BL21(DE3)至1L的LB中，37℃、200rpm培养至OD 600≈1.0。使用终浓度0.1mM的IPTG诱导，16℃过夜培养18h后收集菌体。使用重悬buffer重悬细胞，加入1mM PMSF，2mM MgCl 2以及5μg/mL DNase I混匀后，冰上静置30min。使用高压细胞破碎仪裂解细胞后，高速离心，将离心后上清与Ni-NTA纯化树脂旋转孵育(4℃)，25mM咪唑洗脱6-10个柱体积。最后，使用250mM咪唑10个柱体积洗脱纯化树脂(图1)，浓缩至20mg/mL后，进行分子排阻纯化。收集FPLC出峰位置的蛋白，经SDS-PAGE验证后(图2)用于筛选晶体。
SrUGT76G1_野生型(SEQ ID NO:1)：
Figure PCTCN2020104957-appb-000002
3、蛋白结晶与结构解析
根据分子排阻纯化UGT76G1色谱结果以及SDS-PAGE结果，测定纯度最高的蛋白组分的浓度，分别浓缩至5mg/mL和10mg/mL。按照浓缩蛋白与底物浓度的摩尔比为1：20添加小分子底物，使用坐滴法20℃静置后获得优质的UGT76G1与底物(甜菊醇双糖苷、UDP-葡萄糖)复合物的晶体(图3)，分辨率达
Figure PCTCN2020104957-appb-000003
根据衍射数据解析UGT76G1的结构，本发明人获得UGT76G1蛋白与UGT76G1催化后的产物莱宝迪苷B与UDP的复合物结构。
实施例2、突变体蛋白构建与表达
根据UGT76G1-底物莱宝迪苷B(图4)和UDP的复合物结构以及反复验证，本发明人定位到底物结合口袋，并且确定了若干位于底物结合口袋中的关键氨基酸(图5)，它们分别与糖基供体、糖基受体或苷元母核相互作用。本发明人根据氨基酸参与糖基化过程的功能将它们分为4类(表2)，对这些氨基酸进行单点或多点突变，通过体外酶学测试，测定突变体蛋白在参与糖基化过程中的催化活性以及底物识别特异性的改变。
表2、氨基酸突变位点
Figure PCTCN2020104957-appb-000004
Figure PCTCN2020104957-appb-000005
1、突变体构建
使用含点突变位点的引物(表3)，以野生型UGT76G1表达载体pQZ11为模板，PCR扩增突变体基因(图6)，转化至DH10B，测序验证。
表3、扩增突变体所使用引物
Figure PCTCN2020104957-appb-000006
2、突变体蛋白表达纯化
测序正确的突变体表达载体转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)。以1％v/v转接过夜培养的携带突变体表达载体的BL21(DE3)至1L LB培养基中，37℃，200rpm培养至OD 600＝1.0左右。使用终浓度0.1mM的IPTG诱导，16℃过夜培养18h后收集菌体。粗酶制备方法同野生型UGT76G1。粗酶液与1mL Ni-NTA纯化树脂旋转孵育(4℃)，25mM咪唑洗脱6-10个柱体积。最后，使用250mM咪唑1mL在4℃孵育10-30分钟后，洗脱目的蛋白。使用BSA法测定目的蛋白的浓度，使用50％甘油保存蛋白(-20℃)。如图7所示，全部突变体蛋白均有表达。后续利用突变体蛋白进行体外酶活性测试。
实施例3 突变体蛋白的体外功能验证
1、突变体体外酶反应
酶反应体系包括：10μg蛋白，1.5mM UDP-葡萄糖，250μM糖基受体底物缓冲buffer(20mM Tris-HCl，pH＝8.0，100mM NaCl)。每个突变体蛋白对同一底物的反应均重复三次。
反应条件：37℃，30min。反应结束后，使用等体积的甲醇淬灭反应，剧烈震荡后，12000rpm，离心30min。取上清液进行HPLC检测。检测方法：流动相A(乙腈)-流动相B(水)梯度洗脱。计算突变体催化产物峰面积，与野生型UGT76G1的催化产物峰面积比较。
2、突变体催化活性及底物专一性
1)体外功能验证结果如图8所示，H25/D124直接参与糖基化位点去质子化过程，H25A、D124N突变体对所有底物丧失催化活性。
2)T284位点稳定底物结构中的第一个糖基。将T突变为A后，酶对所有底物的催化活性均降低，而突变为S能显著改变酶对底物的催化活性(图9)。突变体T284S对底物甜菊醇双糖苷，甜菊苷，莱宝迪苷D的相对活性分别增加74.6％、4.9％、76.5％，对底物甜菊醇单糖苷，甜叶悬钩子苷，莱宝迪苷A的活性分别降低16.7％、27.9％、52.4％。本发明人分析底物结构发现，相对催化活性增加的三种底物中具有槐糖基(1,2-二葡萄糖基)，在此基础上进行1,3-糖基化；而在葡萄糖单糖基底物基础上直接进行1,3-糖基化的底物，其相对催化活性减弱。
3)S147、H155稳定底物结构中第二个糖基。突变体S147A、S147N、S147Q、H155A、H155Y对所有测试底物的相对催化活性均减弱(图10)。说明S147、H155位点突变不仅破坏第二个糖基的稳定情况，同时还影响底物分子与酶的结合。
4)稳定第三个糖基的T146A、T146N、T146S突变体对测试底物的催化活性减弱，而D380T、D380S、D380N、D380E突变体对底物完全失去活性(图11)。根据蛋白-底物结晶结构，D380除与催化产物的第三个糖基相互作用外，还通过氢键与糖基供 体底物发生相互作用。因此，突变D380可能影响糖基供体识别，使得酶对底物的活性完全丧失。
实施例4、利用含突变体的重组大肠杆菌系统发酵生产莱宝迪苷M
莱宝迪苷M作为新一代天然甜味剂，其口感更优于目前市场主流的甜菊苷、莱宝迪苷A等。目前通过天然植物提取的方式可以廉价获得甜菊苷和莱宝迪苷A，而莱宝迪苷M由于在植物中含量稀少而制备价格昂贵。本发明人在重组大肠杆菌系统中引入转化莱宝迪苷M所需要的两种糖基转移酶基因EUGT11和UGT76G1，通过酶法转化的方式将甜菊苷、莱宝迪苷A转化为高价值的莱宝迪苷M。由于UGT76G1存在底物杂泛性，可能将底物莱宝迪苷A转化为副产物莱宝迪苷I，因此本发明人考虑选择UGT76G1的突变体T284S(SEQ ID NO:2)，该突变体不仅具有更高的转化莱宝迪苷D至目标产物莱宝迪苷M的催化活性，同时对底物莱宝迪苷A的转化活性下降，能够降低副产物的比例。
>SrUGT76G1_T284S(SEQ ID NO:2)
Figure PCTCN2020104957-appb-000007
1、质粒构建
以EUGT11(密码子优化)克隆载体为模板，通过PCR扩增EUGT11基因(编码含有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白)。以拟南芥cDNA为模板，通过PCR扩增AtSUS3基因(编码蔗糖合酶3(SEQ ID NO:4)，用于UDP-葡萄糖的再生循环利用)。将EUGT11基因和AtSUS3基因分步装载至pDuet-1的BamHI/HindIII位点和FseI/KpnI位点之间，构成质粒pLW108。以突变体UGT76G1 T284S表达载体为模板，设计引物加载同源臂，通过PCR扩增突变体基因。通过无缝克隆的方式将UGT76G1 T284S基因引入pLW108的AtSUS3基因下游，构成质粒pHJ830。该质粒用于同时表达EUGT11、AtSUS3和UGT76G1 T284S三个基因。
表3、构建质粒所使用的引物
Figure PCTCN2020104957-appb-000008
Figure PCTCN2020104957-appb-000009
2、重组大肠杆菌系统发酵生产莱宝迪苷M
将上述质粒转化大肠杆菌BL21，挑取单克隆，接种于10mL LB培养基中(Amp＝100μg/mL)，37℃培养4h，以1％接种比接种于1L LB培养基中，37℃培养2h至OD600＝0.5，降温至22℃，添加IPTG(终浓度100μM)诱导20h后，浓缩收集菌体，进行静息细胞转化反应，反应体系如表4所示。反应至48h收取样品进行HPLC检测。
发酵结果显示(图13)，在48小时内，莱宝迪苷A(Rebaudioside A；RA)约有50％转化为莱宝迪苷D(Rebaudioside D；RD)(25％)和莱宝迪苷M(Rebaudioside M；RM)(25％)，副产物莱宝迪苷I(Rebaudioside I；RI)的比例小于1％。
表4、静息细胞转化反应体系
Figure PCTCN2020104957-appb-000010
实施例5、二萜母核相关突变体蛋白的体外功能验证
1、突变体构建
针对野生型SrUGT76G1进行点突变，位点包括第85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204、379位，设计点突变引物如表5，以野生型SrUGT76G1表达载体pQZ11作为模板使用PCR克隆。突变体3A是指第199、200、203位均突变为A的组合突变体，突变体4A是指第199、200、203、204位均突变为A的组合突变体。PCR产物凝胶电泳结果如图14，表明24个突变均成功扩增。经DpnⅠ酶切后，转化至大肠杆菌DH10B，测序验证。
表5、PCR克隆引物
Figure PCTCN2020104957-appb-000011
Figure PCTCN2020104957-appb-000012
Figure PCTCN2020104957-appb-000013
2、突变体蛋白表达纯化
测序正确的突变体表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)。按1％v/v转接过夜培养的大肠杆菌BL21(DE3)至1L的LB(Amp＝100μg/mL)中，37℃，200rpm培养1～2h。降温降转速至16℃，160rpm继续培养至OD 600＝1.0左右。使用终浓度0.1mM的IPTG进行诱导，过夜培养18-20h后收集菌体。使用buffer A[20mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM NaCl]重悬细胞，加1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)，2mM MgCl 2以及5μg/mL DNaseI混匀后，冰上静置30分钟。高压细胞破碎仪裂解细胞后，高速离心(10000rpm，99min)。上清与1mL Ni-NTA旋转孵育(4℃，1h)，25mM咪唑洗脱6～10个柱体积。最后使用250mM咪唑1mL 4℃孵育10～30分钟后，洗脱目的蛋白。BSA法测定目的蛋白浓度，在50％甘油-20℃条件保存蛋白。
部分突变体(L126V，L126F，L379F，L379W，L379V)蛋白表达纯化后，SDS-PAGE检测如图15所示。
3、突变体体外功能验证
酶反应体系包括：10μg蛋白，1.5mM UDP-葡萄糖，250μM糖基受体底物和缓冲液[20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，100mM NaCl]。每个突变体蛋白对同一底物的反应均重复三次。
反应条件：37℃，30min。反应结束后，使用等体积的甲醇淬灭反应，剧烈震荡后，12000rpm，离心30min。取上清液进行HPLC检测。检测方法：流动相A(乙腈)-流动相B(水)梯度洗脱。计算突变体催化产物峰面积，与野生型SrUGT76G1的催化产物峰面积比较。
4、突变体体外功能分析结果
(1)突变体对底物甜菊单糖苷(steviolmonoside)的催化活性
如图16，突变体L85V、I199F、I199L、L379I对底物steviolmonoside的活性分别提高了36.96％、102％、34％以及20％。而P91F、L126F、I203V、L379F、3A、4A对底物的活性降至20％。G87F几乎完全失活，M88V，I90L，I90V，L126V，N196Q，L200I，L200V，I203L，L204F，L204W，L379V也有显著性减弱。
(2)突变体对底物甜菊双糖苷(steviolbioside)的催化活性
如图17，在对底物steviolbioside的测试中发现，突变体L85V、M88V、I90L、I90V、P91F、L126F、I199F、I199L、I199V、L200I、I203L、I203V、L204F、L379F、L379I、L379V对底物活性提高，其中M88V、I199F与L200I最为显著，分别提高了1.38倍、1.29倍与1.65倍。而突变体G87F与4A对底物活性降低至3％与14％。L204W，L379W，3A也有显著性降低。
(3)突变体对底物甜叶悬钩子苷(又称甜茶素，rubusoside)的催化活性
如图18，对底物rubusoside的酶活测试发现，大部分突变体对底物的活性降低，其中G87F、L126V、L126F、I203V、L379F、3A以及4A活性分别降至0.66％、28％、28％、15％、19％、18％以及21％。I90L，I90V，P91F，L200I，L200V，I203L，L204F，L204W，L379V也有显著性减弱。但是突变体L85V、N196Q、I199F、I199L、L379I对底物活性有提升。其中L85V与I199L比较显著，分别为49％与32％。
(4)突变体对底物甜菊苷(stevioside)的催化活性
如图19，突变体对底物stevioside的活性改变，活性增强的突变体中，M88V、I90V、L126F、I199V、L200I，L379W以及L379I较为显著，分别为25％、24％、35％、32％、20％、21％、51％。而G87F、L204W、3A、4A的活性分别降至10％、25％、25％、19％。P91F，L126V，L204F，L379F，L379V也有显著性减弱。
(5)突变体对底物莱宝迪苷A(rebaudioside A)的催化活性
如图20，突变体M88V，I199V，L200V，L379I，3A对底物rebaudioside A的活性分别提高1.4倍，1.39倍，1.86倍，3.57倍以及1.67倍。L200I，L379V，L379W也有显著性提高。而突变体G87F，L126V，L126F，I203L，I203V，L204W，L379F等突变体对底物的活性减弱。
(6)突变体对底物莱宝迪苷D(rebaudioside D)的催化活性
如图21，体外酶活性验证发现，突变体L85V、M88V、L126F、I199F、I199L、I199V、L200I、I203V、L379W、L379I、L379V对底物Rebaudioside D的活性分别提高了57％、121％、35.6％、73.7％、70％、54.6％、24％、55％、12％、74.6％、55.9％。而突变体G87F、I203L、L204F、L204W、L379F、4A对底物的催化活性显著下降，分别为：7.25％、35％、39.8％、20.5％、43.3％、14.6％。N196Q也有显著性下降。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (19)

  1. 糖基转移酶UGT76G1突变体，其特征在于，所述突变体相对于野生型的糖基转移酶UGT76G1，其空间结构中与糖基供体、糖基受体相互作用的氨基酸发生突变，其催化活性改变。
  2. 如权利要求1所述的糖基转移酶UGT76G1突变体，其特征在于，所述突变体是：
    (a)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1，第284、147、155、146、380、85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204或379位发生突变的蛋白；
    (b)将(a)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于SEQ ID NO:1的第284、147、155、146、380、85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204或379位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；
    (c)与(a)蛋白的氨基酸序列有80％以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白，但对应于SEQ ID NO:1的第284、147、155、146、380、85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204或379位的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同；
    (d)(a)蛋白的活性片段，其包含糖基转移酶UGT76G1空间结构中与糖基供体或糖基受体相互作用的结构，且在对应于SEQ ID NO:1的第284、147、155、146、380、85、87、88、90、91、126、196、199、200、203、204或379位上的氨基酸与(a)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同。
  3. 如权利要求2所述的糖基转移酶UGT76G1突变体，其特征在于，所述第284位突变为Ser，该突变体催化活性提高，较佳地其催化含有1,2-双葡萄糖基的底物进行1,3-糖基化的活性提高或催化在葡萄糖单糖基底物基础上进行1,3-糖基化的活性降低；较佳地，其对底物甜菊醇双糖苷，甜菊苷或莱宝迪苷D的催化活性提高，而对底物甜菊醇单糖苷，甜叶悬钩子苷，莱宝迪苷A的催化活性降低；更佳地，其催化莱宝迪苷D生成莱宝迪苷M的活性提高且催化莱宝迪苷A生成副产物莱宝迪苷I的活性减弱；
    所述第284位突变为Ala，该突变体催化活性减弱；
    所述第147位突变为Ala、Asn或Gln，该突变体催化活性减弱；
    所述第155位突变为Ala或Tyr，该突变体催化活性减弱；
    所述第146位突变为Ala、Asn或Ser，该突变体催化活性减弱；
    所述第380位突变为Thr、Ser、Asn或Glu，该突变体催化活性减弱或消失；
    所述第85位突变为Val，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩 子苷或莱宝迪苷D催化活性增强；
    所述第87位突变为Phe，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性减弱；
    所述第88位突变为Val，该突变体对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷催化活性减弱；
    所述第90位突变为Leu，该突变体对于底物甜菊双糖苷催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化活性减弱；
    所述第90位突变为Val，该突变体对于底物甜菊双糖苷或甜菊苷催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化活性减弱；
    所述第91位突变为Phe，该突变体对于底物甜菊双糖苷催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷催化活性减弱；
    所述第126位突变为Phe，该突变体对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷A催化活性减弱；
    所述第126位突变为Val，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷A催化活性减弱；
    所述第196位突变为Gln，该突变体对于底物甜菊单糖苷或莱宝迪苷D催化活性减弱；
    所述第199位突变为Phe，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷或莱宝迪苷D催化活性增强；
    所述第199位突变为Leu，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷D催化活性增强；
    所述第199位突变为Val，该突变体对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性增强；
    所述第200位突变为Ile，该突变体对于底物甜菊双糖苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化活性减弱；
    所述第200位突变为Val，该突变体对于底物莱宝迪苷A催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化活性减弱；
    所述第203位突变为Leu，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性减弱；
    所述第203位突变为Val，该突变体对于底物甜菊双糖苷或莱宝迪苷D催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷A催化活性减弱；
    所述第204位突变为Phe，对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷D催化活性减弱；
    所述第204位突变为Trp，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性减弱；
    所述第379位突变为Phe，该突变体对于底物甜菊双糖苷催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性减弱；
    所述第379位突变为Ile，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性增强；
    所述第379位突变为Val，该突变体对于底物甜菊双糖苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷催化活性减弱；
    所述第379位突变为Trp，该突变体对于底物莱宝迪苷A催化活性增强；对于底物甜菊双糖苷催化活性减弱；
    所述第199、200、203位突变为Ala，该突变体对于底物莱宝迪苷A催化活性增强；对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或甜菊苷催化活性减弱；或
    所述第199、200、203、204位突变为Ala，该突变体对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性减弱。
  4. 分离的多核苷酸，其特征在于，所述的核酸是编码权利要求1～3任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体。
  5. 一种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的多核苷酸。
  6. 一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，或基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。
  7. 如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞中包括：基于1,2-双葡萄糖基或葡萄糖单糖基底物进行1,3-糖基化的反应系统，其中用于糖基化的酶为糖基转移酶UGT76G1突变体；较佳地，所述反应系统为莱宝迪苷M生成系统。
  8. 如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述莱宝迪苷M生成系统包括：
    以莱宝迪苷A为底物的系统，包括：对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第85位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Phe、第199位突变为Leu或第203位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体，以及将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶；较佳地，该将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶包括：EUGT11，UGT91D2；或
    以甜菊苷为底物的系统，包括：将甜菊苷转化为莱宝迪苷A的酶、对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第88位突变为Val、第90位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Val或第379位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体，以及将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶；较佳地，该将甜菊苷转化为莱宝迪苷A 的酶同样为UGT76G1，突变型UGT76G1，该将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶包括：EUGT11，UGT91D2；或
    以莱宝迪苷D为底物的系统，包括：对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第85位突变为Val、第88位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Phe、第199位突变为Leu、第199位突变为Val、第200位突变为Ile、第203位突变为Val、第379位突变为Ile、第379位突变为Val或第379位突变为Trp的糖基转移酶UGT76G1突变体；或
    以苷元甜菊醇为底物的系统，包括：对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第88位突变为Val、第90位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Val或第379位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体，将莱宝迪苷A或甜菊苷转化为莱宝迪苷D的酶以及将苷元甜菊醇催化为甜菊苷或莱宝迪苷A的酶；所述将苷元甜菊醇催化为甜菊苷或莱宝迪苷A的酶包括：EUGT11，UGT91D2，UGT74G1，UGT85C2，UGT75L20，UGT75L21，UGT75W2，UGT75T4，UGT85A57，UGT85A58，UGT76G1、突变型UGT76G1。
  9. 如权利要求6～8任一所述的宿主细胞，其特征在于，细胞中还包括使UDP-葡萄糖的再生循环利用的酶；较佳地，所述使UDP-葡萄糖的再生循环利用的酶包括：AtSUS3。
  10. 如权利要求6～8任一所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括：原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；所述真核宿主细胞包括：真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
  11. 一种生产权利要求1～3任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体的方法，其特征在于，包括步骤：
    (1)培养权利要求6所述的宿主细胞，获得培养物；和
    (2)从培养物中分离权利要求1～3任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体。
  12. 一种调节糖基转移酶UGT76G1的催化活性或底物专一性的方法，包括：将其空间结构中与糖基供体或糖基受体相互作用的氨基酸进行突变；从而使其催化活性或底物专一性改变。
  13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，将对应于SEQ ID NO:1中第284位突变为Ser，提高该突变体催化含有1,2-双葡萄糖基的底物进行1,3-糖基化的活性或降低该突变体催化葡萄糖单糖基底物基础上进行1,3-糖基化的活性；较佳地其催化 莱宝迪苷D生成莱宝迪苷M的活性提高且催化莱宝迪苷A生成副产物莱宝迪苷I的活性减弱；
    将对应于SEQ ID NO:1中第284位突变为Ala，减弱其催化活性；或
    将对应于SEQ ID NO:1中第147位突变为Ala、Asn或Gln，减弱其催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第155位突变为Ala或Tyr，减弱其催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第146位突变为Ala、Asn或Ser，减弱其催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第380位突变为Thr、Ser、Asn或Glu，减弱其催化活性或使活性消失；
    将对应于SEQ ID NO:1中第85位突变为Val，增强其对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷D催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第87位突变为Phe，减弱其对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第88位突变为Val，增强其对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；减弱其对于底物甜菊单糖苷催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第90位突变为Leu，增强其对于底物甜菊双糖苷催化活性；减弱其对于底物甜菊单糖苷或甜叶悬钩子苷催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第90位突变为Val，增强其对于底物甜菊双糖苷或甜菊苷催化活性；减弱其对于底物甜菊单糖苷或甜叶悬钩子苷催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第91位突变为Phe，增强其对于底物甜菊双糖苷催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或甜菊苷催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第126位突变为Phe，增强其对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷A催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第126位突变为Val，减弱其对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷A催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第196位突变为Gln，减弱其对于底物甜菊单糖苷或莱宝迪苷D催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第199位突变为Phe，增强其对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷或莱宝迪苷D催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第199位突变为Leu，增强其对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷D催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第199位突变为Val，增强其对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第200位突变为Ile，增强其对于底物甜菊双糖苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；减弱其对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化 活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第200位突变为Val，增强其对于底物莱宝迪苷A催化活性；减弱其对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第203位突变为Leu，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第203位突变为Val，增强其对于底物甜菊双糖苷或莱宝迪苷D催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷A催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第204位突变为Phe，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第204位突变为Trp，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Phe，增强其对于底物甜菊双糖苷催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Ile，增强其对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Val，增强其对于底物甜菊双糖苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化活性；减弱对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或甜菊苷催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Trp，增强其对于底物甜菊苷或莱宝迪苷A催化活性；减弱对于底物甜菊双糖苷催化活性；
    将对应于SEQ ID NO:1中第199、200、203位突变为Ala，增强其对于底物莱宝迪苷A催化活性，减弱对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或甜菊苷催化活性；或
    将对应于SEQ ID NO:1中第199、200、203、204位突变为Ala，减弱其对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化活性。
  14. 氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser的糖基转移酶UGT76G1突变体的用途，用于促进含有1,2-双葡萄糖基的底物进行1,3-糖基化，减少葡萄糖单糖基底物基础上进行1,3-糖基化；较佳地，用于促进莱宝迪苷D生成莱宝迪苷M。
  15. 一种调控糖基化的方法，其特征在于，包括：
    以对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，促进含有1,2-双葡萄糖基的底物进行1,3-糖基化；
    以对应于SEQ ID NO:1中第284位突变为Ala的糖基转移酶UGT76G1突变体进 行催化，弱化催化糖基化活性；或
    以对应于SEQ ID NO:1中第147位突变为Ala、Asn或Gln的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第155位突变为Ala或Tyr的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第146位突变为Ala、Asn或Ser的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第380位突变为Thr、Ser、Asn或Glu的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化催化糖基化活性或使活性消失；
    以对应于SEQ ID NO:1中第85位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第87位突变为Phe的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第88位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第90位突变为Leu的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第90位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷或甜菊苷催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第91位突变为Phe的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第126位突变为Phe的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷A催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第126位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷A催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第196位突变为Gln的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化对于底物甜菊单糖苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第199位突变为Phe的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第199位突变为Leu的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第199位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第200位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第200位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物莱宝迪苷A催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第203位突变为Leu，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第203位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或莱宝迪苷A催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第204位突变为Phe的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷D催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第204位突变为Trp的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Phe的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷催化糖基化活性，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物甜菊双糖苷、莱宝迪苷A或莱宝迪苷D催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊单糖苷、甜叶悬钩子苷或甜菊苷催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第379位突变为Trp的糖基转移酶UGT76G1突变体进 行催化，增强对于底物莱宝迪苷A催化糖基化活性；弱化对于底物甜菊双糖苷催化糖基化活性；
    以对应于SEQ ID NO:1中第199、200、203位突变为Ala的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，增强对于底物莱宝迪苷A催化糖基化活性，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷或甜菊苷催化糖基化活性；或
    以对应于SEQ ID NO:1中第199、200、203、204位突变为Ala的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，弱化对于底物甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱宝迪苷D催化糖基化活性。
  16. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，糖基化产物(1,3-糖基化产物)为莱宝迪苷M，包括：
    以莱宝迪苷A为底物，以对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第85位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Phe、第199位突变为Leu或第203位突变为Val的糖基转移酶UGT76G1突变体和将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶进行催化，获得莱宝迪苷M；较佳地，该将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶包括：EUGT11，UGT91D2；或
    以甜菊苷为底物，以将甜菊苷转化为莱宝迪苷A的酶、对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第88位突变为Val、第90位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Val或第379位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体，以及将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶进行催化，获得莱宝迪苷M；较佳地，该将甜菊苷转化为莱宝迪苷A的酶同样为UGT76G1，突变型UGT76G1，该将莱宝迪苷A转化为莱宝迪苷D的酶包括：EGUT11，UGT91D2；或
    以莱宝迪苷D为底物，以对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第85位突变为Val、第88位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Phe、第199位突变为Leu、第199位突变为Val、第200位突变为Ile、第203位突变为Val、第379位突变为Ile、第379位突变为Val或第379位突变为Trp的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化，获得莱宝迪苷M；或
    以苷元甜菊醇为底物，以对应于SEQ ID NO:1第284位突变为Ser、第88位突变为Val、第90位突变为Val、第126位突变为Phe、第199位突变为Val或第379位突变为Ile的糖基转移酶UGT76G1突变体、将莱宝迪苷A或甜菊苷转化为莱宝迪苷D的酶以及将苷元甜菊醇催化为甜菊苷或莱宝迪苷A的酶进行催化，获得莱宝迪苷M；所述将苷元甜菊醇催化为甜菊苷或莱宝迪苷A的酶包括：EUGT11，UGT91D2，UGT74G1，UGT85C2，UGT75L20，UGT75L21，UGT75W2，UGT75T4，UGT85A57，UGT85A58，UGT76G1、突变型UGT76G1。
  17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：应用使UDP-葡萄糖的再生循环利用的酶；较佳地，所述使UDP-葡萄糖的再生循环利用的酶包括：AtSUS3。
  18. 一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有：
    权利要求1～3任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体；或
    含有权利要求6～10任一所述的宿主细胞。
  19. 一种试剂盒，其特征在于，其中含有：
    权利要求1～3任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体；或
    权利要求6～10任一所述的宿主细胞；或
    权利要求18所述的组合物。
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