CN116286581A - 菌株及其在发酵产泰乐菌素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程和微生物技术领域。本发明提供一种基因在发酵产泰乐菌素或构建产泰乐菌素的链霉菌中的应用,所述基因包括:强启动子、tylR基因和tylS基因;所述tylR基因的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示;所述tylS基因的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。本发明提供的工程菌株可提高泰乐菌素的产量至出发菌株的2倍以上。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和微生物技术领域。
背景技术
泰乐菌素能够抑制包括细菌、螺旋体、支原体在内的多种病原微生物,已经广泛应用于多种畜禽类疾病的防治。此外,泰乐菌素对幼龄期和生长期畜禽具有良好的促生长作用,因此也作为饲料添加剂被广泛应用(参见文献Baltz RH and Seno ET.Properties ofStreptomyces fradiae mutants blocked inbiosynthesis of the macrolideantibiotic tylosin.Antimicrob Agents Chemother.1981,20:214-225)。
目前工业上主要利用弗氏链霉菌作为泰乐菌素的生产菌株。弗氏链霉菌在经历了多轮紫外诱变、化学诱变后合成泰乐菌素的能力有了较大幅度的提升,但是仍然难以满足日益增长的市场需求。因此,利用现代分子生物学和代谢工程技术建立高效的泰乐菌素增产方法、对降低产品成本、提高生产企业的竞争力来说非常重要。
作为一种链霉菌次级代谢产物,泰乐菌素的合成受到复杂而精确的调控(参见文献Stratigopoulos G,Gandecha AR and Cundliffe E,Regulation oftylosinproduction and morphological differentiation in Streptomyces fradiaeby TylP,a deduced g-butyrolactone receptor.Molecular Microbiology.2002,45:735-744)。前期研究结果表明,泰乐菌素生物合成基因簇中存在多个调控基因。其中,tylR和tylS基因是泰乐菌素生物合成中的两个途径特异性调控基因,它们所编码的蛋白能够正调控泰乐菌素的生物合成,高表达tylR或tylS基因均可提高弗氏链霉菌内中泰乐菌素的产量(参见文献Stratigopoulos G,Bate N and Cundliffe E.Differential roles of twoSARP-encoding regulatory genes during tylosin biosynthesis.MolecularMicrobiology.2002,62:449-458;Stratigopoulos G,Bate N and Cundliffe E.Positivecontrol of tylosinbiosynthesis:pivotal role of tylR.MolecularMicrobiology.2004,54:1326-1334)。tylQ是泰乐菌素生物合成中的一个负调控基因,它所编码的蛋白能够抑制泰乐菌素的合成。在弗氏链霉菌中敲除tylQ后泰乐菌素的产量有所提升(参见文献Stratigopoulos G and Cundliffe E.Expression analysis of thetylosin-biosynthetic gene cluster:pivotal regulatory role of the tylQproduct.Chemistry&Biology.2002,9:71-78)。但是,以上通过操作调控基因进行泰乐菌素增产的研究都是分别进行的。如何组合操作上述调控基因以进一步提高泰乐菌素的产量却至今未有报道。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的是提供一种基因在发酵产泰乐菌素或构建产泰乐菌素的链霉菌中的应用,所述基因包括:强启动子、tylR基因和tylS基因;所述tylR基因的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示;所述tylS基因的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
在本发明的具体实施例中,所述强启动子为PhrdB启动子、PermE*启动子或PkasO*启动子;所述PkasO*启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
在本发明的具体实施例中,所述链霉菌为弗氏链霉菌ATCC 19609或弗氏链霉菌tylQ基因阻断突变株。
在本发明的具体实施例中,所述弗氏链霉菌tylQ基因阻断突变株为将弗氏链霉菌ATCC 19609的tylQ基因敲除;所述tylQ基因的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种工程菌的构建方法,将质粒pSET152-RSOE导入链霉菌中;所述质粒pSET152-RSOE的构建方法是将质粒pSET152-SOE酶切片段和质粒pSET152-ROE酶切片段连接;所述酶为限制性内切酶EcoR I和EcoR V;所述连接为T4 DNA连接酶进行连接。
在本发明的具体实施例中,所述质粒pSET152-SOE的构建方法是利用限制性内切酶EcoR I对质粒pSET152进行线性化后,与以质粒pSET152::D-C为模板、利用引物EcoRV-PkasO-F和kasOp2进行PCR扩增的DNA片段,和以弗氏链霉菌ATCC 19609的基因组为模板、利用引物PkasO-tylS-F和EcoRI-tylS-R进行PCR扩增得到的DNA片段,进行Gibson组装。
在本发明的具体实施例中,所述质粒pSET152-ROE的构建方法是利用限制性内切酶EcoR I和EcoR V对质粒pSET152进行线性化后,与以质粒pSET152::D-C为模板、利用引物152-PkasO(S)-F和kasOp2进行PCR扩增的DNA片段,和以弗氏链霉菌ATCC 19609的基因组为模板、利用引物PkasO-tylR-F和EcoRI-tylR-R进行PCR扩增得到的DNA片段,进行Gibson组装。
在本发明的具体实施例中,所述弗氏链霉菌包括弗氏链霉菌ATCC 19609和弗氏链霉菌tylQ遗传阻断突变株WT/QKO。
在本发明的具体实施例中,所述突变株WT/QKO的构建方法是将弗氏链霉菌ATCC19609中的tylQ基因敲除。
在本发明的具体实施例中,所述泰乐菌素为泰乐菌素A、泰乐菌素C中一种或多种。
本发明提供的工程菌株可提高泰乐菌素的产量至出发菌株的2倍以上。
附图说明
图1为重组工程菌株WT/RS-OE的构建及验证图。
其中,A为工程菌株WT/RS-OE构建示意图;B为工程菌株WT/RS-OE的PCR验证。M:1kbDNA ladder;1-2:重组工程菌株WT/RS-OE的两个克隆。
图2为含有泰乐菌素生物合成基因簇的质粒pBAC-tylGC构建示意图。
图3为弗氏链霉菌tylQ遗传阻断突变株的构建示意图。
图4为弗氏链霉菌tylQ遗传阻断突变株的PCR验证图。
其中,M:1kb DNA ladder,1:弗氏链霉菌ATCC 19609野生型菌株;2:弗氏链霉菌tylQ遗传阻断突变株。
图5为重组工程菌株WT/QKO/RS-OE的构建及验证图。
其中,A为重组工程菌株WT/QKO/RS-OE的构建示意图,B为重组工程菌株WT/QKO/RS-OE的PCR验证图。M:1kb DNA ladder;1-2:重组工程菌株WT/QKO/R-OE的两个克隆;3-4:重组工程菌株WT/QKO/RS-OE的两个克隆。
图6为泰乐菌素高产工程菌株中泰乐菌素产量对比分析图。
其中,A为重组工程菌株WT/RS-OE中泰乐菌素产量分析,B为为重组工程菌株WT/QKO/R-OE中泰乐菌素产量分析。
图7为泰乐菌素高产工程菌株中泰乐菌素产量对比的高效液相色谱图。
其中,A为重组工程菌株WT/RS-OE与弗氏链霉菌ATCC 19609中泰乐菌素产量对比的高效液相色谱图。WT:弗氏链霉菌ATCC 19609野生型菌株,WT/RS-OE:重组工程菌株WT/RS-OE。B为为重组工程菌株WT/QKO/RS-OE与弗氏链霉菌ATCC 19609中泰乐菌素产量对比的高效液相色谱图。WT:弗氏链霉菌ATCC 19609野生型菌株,WT/QKO/RS-OE:重组工程菌株WT/QKO/RS-OE。
具体实施方案
本发明提供一种泰乐菌素高产工程菌的构建方法,所述方法包括将强启动子驱动的tylR基因和tylS基因导入到弗氏链霉菌野生型和tylQ遗传阻断突变株中,得到的重组菌株即为泰乐菌素高产工程菌。
本发明采用如下技术方案:
方案I:利用强启动子驱动泰乐菌素合成基因簇中的tylR和tylS基因在弗氏链霉菌中共表达,优选所述强启动子为PkasO*,其启动子序列为SEQ ID NO.4所示,tylR和tylS基因的序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示,tylR和tylS所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;所述方法包括构建含有强启动子和tylR、tylS基因表达盒的重组质粒,并将上述重组质粒转入弗氏链霉菌。
方案II:利用强启动子驱动弗氏链霉菌中tylR和tylS基因在弗氏链霉菌tylQ基因阻断突变株中共表达,优选所述强启动子为PkasO*,其启动子序列为SEQ ID NO.4所示,tylR和tylS基因的序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示,tylR和tylS所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;tylQ基因的序列如SEQ ID NO.7所示,tylQ所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述方法包括构建含有强启动子和tylR、tylS基因表达盒的重组质粒,并将上述重组质粒转入弗氏链霉菌tylQ基因阻断突变株。
前述的方法,所述强启动子选自PhrdB启动子、PermE*启动子或PkasO*启动子,优选PkasO*启动子。
前述的方法,强启动子和tylR、tylS引入的方法,包括无痕敲入法、重组质粒整合法和引入具有自主复制能力的重组质粒。
前述的方法,所述质粒选自pSET152、pKC1139或pIJ10500等,优选质粒pSET152。
前述的方法,所述tylR和tylS基因共表达,包括通过将tylR和tylS基因构建在不同质粒上进行共表达和将tylR和tylS基因构建在同一个质粒上共表达,优选将tylR和tylS基因构建在同一个质粒上共表达。
前述的方法,所述tylQ基因阻断突变株,包括通过在tylQ基因内部插入碱基、缺失碱基、基因敲出、基因替换或RNA干扰等手段阻断tylQ的正确表达。
本发明还提供按照上述方法构建得到的泰乐菌素高产工程菌。
本发明还提供所述泰乐菌素高产工程菌在生产泰乐菌素类化合物中的应用。
本发明中,泰乐菌素产生菌为弗氏链霉菌。本领域技术人员应理解,可以产生泰乐菌素的其他菌株以及利用本发明方法获得的可以高产泰乐菌素的菌株均属于本发明的保护范围。
本领域技术人员应理解,对于SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的蛋白进行一个或者多个氨基酸的突变或修饰,例如替换、增加、缺失部分氨基酸,但是仍具有调控泰乐菌素产生的功能甚至使得活性增强,这样的蛋白仍适用于本发明,且编码该多肽或蛋白的基因同样可以用于本发明,以用来提高泰乐菌素产量的重组工程菌。
本发明所使用的启动子不限于PkasO*启动子,也包括其它链霉菌遗传操作常用的启动子如PermE*启动子、PhrdB启动子等。
本发明中用于高表达tylR和tylS基因的质粒不限于整合型质粒如pSET152,或其他整合型质粒如pIJ10500,还可以是独立复制的游离型高拷贝质粒pKC1139(参见文献Bierman M,Logan R,O'Brien K,Seno E,Rao R,and Schoner B.Plasmidcloning vectorsfor the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomycesspp.Gene,1992,116:43-49;Pullan S,Chandra G,Bibb M,and Merrick M.Genome-wideanalysis of the role of GlnR in Streptomyces venezuelae provides new insightsinto global nitrogen regulation inactinomycetes.BMC Genomics,2011,12:175.)等。
上述质粒可以通过接合转移技术、原生质体融合技术、电击转化、化学转化等技术整合到链霉菌基因组上。本发明优选接合转移技术,但其他技术仍可适用于本发明。
本发明所使用的重组技术可以是本领域使用的任何适宜的方法,例如将目的基因无痕敲入到菌株基因组的任何位置,将包含目的基因的重组质粒引入菌株,将包含本目的基因的重组质粒整合到菌株的基因组上等。
以下实施案例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中涉及的主要实验材料:
表1本发明所使用的质粒
表2本发明所使用的菌株
实施例
1.泰乐菌素高产工程菌WT/RS-OE的构建
1)tylR和tylS基因高表达重组质粒pSET152-tylR-tylS的构建
以弗氏链霉菌ATCC 19609的基因组为模板,利用引物PkasO-tylR-F和EcoRI-tylR-R进行PCR扩增,获得含有tylR基因的大小约为1.3kb的DNA片段1。
以pSET152::D-C质粒(参见文献Li D,Tian Y,Liu X,Wang W,Li Y,Tan H andZhang J.Reconstitution of a mini-gene cluster combined with ribosomeengineering led to effective enhancement of salinomycin production inStreptomyces albus.Microbial Biotechnology.2021,14:2356-2368)为模板,利用引物EcoRV-PkasO-F和kasOp2进行PCR扩增,获得含有大小约为100bp的含有PKasO*启动子区的DNA片段2。
将上述DNA片段1和DNA片段2与经过EcoRV(购自NEB公司)和EcoRI(购自NEB公司)酶切的质粒pSET152(参见文献Bierman M,Logan R,O'Brien K,Seno E,Rao R,andSchoner B.Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA fromEscherichia coli to Streptomyces spp.Gene,1992,116:43-49)线性质粒片段通过Gibson组装法进行连接,得到重组质粒pSET152-ROE。
重组质粒pSET152-ROE经测序验证正确。
采用类似的构建策略,利用引物PkasO-tylS-F和EcoRI-tylS-R对弗氏链霉菌ATCC19609的基因组进行PCR扩增,获得大小约为800bp的含有tylS基因的DNA片段3。
以pSET152::D-C质粒为模板,通过引物152-PkasO(S)-F和kasOp2进行PCR扩增,获得大小约为100bp的含有PKasO*启动子区的DNA片段4。
将DNA片段3、DNA片段4与经过EcoRI酶切的pSET152质粒片段通过Gibson组装法进行连接,得到重组质粒pSET152-SOE。
重组质粒pSET152-SOE经测序验证正确。
使用限制性内切酶EcoR I和EcoR V对质粒pSET152-ROE进行双酶切,回收大小约为1.4kb的含有启动子PKasO*和tylR基因的DNA片段5,将片段5与用相同限制性内切酶酶切后的质粒pSET152-SOE按等比例混合,利用T4 DNA连接酶(购自赛默飞世尔科技公司)进行连接,得到重组质粒pSET152-RSOE(图1A)。
2)泰乐菌素高产工程菌WT/RS-OE的构建
将验证正确的重组质粒pSET152-RSOE转化大肠杆菌ET12567,然后通过大肠杆菌和链霉菌之间的接合转移将重组质粒pSET52-RSOE导入弗氏链霉菌ATCC 19609中,在含有萘啶酮酸和安普霉素的培养基上筛选具有安普霉素抗性的目标工程菌株WT/RS-OE,该菌株携带有重组质粒pSET152-RSOE的弗氏链霉菌。
将重组菌株WT/RS-OE转接至TSB液体培养基,28℃220rpm震荡培养48h后以提取的基因组DNA作为模板,通过引物152-F和152-R进行PCR扩增得到大小约2.8kb的产物片段,与预期结果一致,表明得到的重组工程菌株正确(图1B)。
TSB液体培养基:称取胰酪蛋白胨17g,大豆蛋白胨3g,葡萄糖2.5g,NaCl 5.0g,磷酸氢二钾2.5g,加蒸馏水溶解并定容至1L,调节pH至7.3,115℃灭菌30分钟。
2.泰乐菌素高产工程菌WT/QKO/RS-OE的构建
1)弗氏链霉菌tylQ基因阻断突变株WT/QKO的构建
通过PCR targeting(参见文献Gust B,Kieser T and Chater K.PCR targetingsystem in Streptomyces coelicolor A3(2).Norwich:John Innes Centre,2002)方法将质粒pBeloBAC11(购自武汉安格思生物科技有限公司)上的氯霉素抗性基因(cat)替换成来源于pSET152质粒的安普霉素抗性基因aac3(IV)和链霉菌复制起始位点oriT,生成重组质粒pBAC-apr。
将质粒pBeloBAC11转入大肠杆菌BW25113/pKD20(参见文献Datsenko KA andWanner BL.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coliK-12using PCR products.2000,97(12):6640-6645)得到大肠杆菌BW25113/pKD20/pBeloBAC11。
以BacApr和BacOriTD为引物、以质粒pSET152为模板进行PCR扩增,得到含有安普霉素抗性基因aac3(IV)和链霉菌复制起始位点oriT的DNA片段aac(3)IV-oriT。
将DNA片段aac(3)IV-oriT通过电击转化法导入到大肠杆菌BW25113/pIJ790/pBeloBAC11中,筛选具有安普霉素抗性的转化子,提取质粒得到质粒pBAC-apr。
利用限制性内切酶NotI(购自NEB公司)对质粒pBAC-apr进行线性化后,与以弗氏链霉菌ATCC 19609基因组为模板、利用引物Bac-tylDR和Bac-tylDF进行PCR扩增所获得的大小约4kb的DNA片段进行组装,得到重组质粒pDS-tyl。
同时,将以质粒pIJ778(参见文献Gust B,Kieser T and Chater K.PCRtargeting system in Streptomyces coelicolor A3(2).Norwich:John Innes Centre,2002)为模板、利用引物778-F和778-R-H进行扩增的PCR产物与以弗氏链霉菌ATCC 19609基因组为模板、利用引物778-tylUF和778-tylUR进行扩增的大小约4kb的DNA片段Gibson组装,得到重组质粒pUS-tyl。
将经测序验证正确的重组质粒pDS-tyl和pUS-tyl分别通过大肠杆菌和链霉菌之间的接合转移导入弗氏链霉菌ATCC 19609中,在含有萘啶酮酸、链霉素安和壮观霉素的高氏一号培养基上筛选具有安普霉素、链霉素和壮观霉素抗性的重组菌株WT/DS-US。
提取重组菌株WT/DS-US的基因组后使用限制性内切酶HindIII消化,然后通过Gibson组装法进行DNA片段自连,得到重组质粒pBAC-tylGC(图2A)。
将质粒pBAC-tylGC转入大肠杆菌BW25113/pIJ790(参见文献Gust B,Kieser Tand Chater K.PCR targeting system in Streptomyces coelicolor A3(2).Norwich:John Innes Centre,2002)得到大肠杆菌BW25113/pIJ790/pBAC-tylGC。
以DtylG-F和DtylG-R为引物、以质粒pIJ778为模板进行PCR扩增,得到大小为约1kb的DNA片段Amp-DG。
将Amp-DG通过电击转化法导入到大肠杆菌BW25113/pIJ790/pBAC-tylGC中,筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子,提取质粒得到质粒pBAC-tylGC-DG-Amp。
使用限制性内切酶HindIII酶切消化质粒pBAC-tylGC-DG-Amp后利用Klenow酶补平3’粘末端,由T4 DNA连接酶将线性质粒进行自连,得到重组质粒pBAC-tylGC-DG。
与出发质粒pBAC-tylGC相比,重组质粒pBAC-tylGC-DG中缺失了从编码框6087到tylGV之间约58kb的DNA片段。采用上述类似的基因敲除策略,将质粒pBAC-tylGC-DG转化大肠杆菌BW25113/pIJ790中得到大肠杆菌BW25113/pIJ790/pBAC-tylGC-DG。
以DtylQ-F和DtylQ-R为引物、质粒pIJ778为模板,通过PCR扩增得到大小为1kb的DNA片段Amp-DQ。将DNA片段Amp-DQ通过电击转化方法导入大肠杆菌BW25113/pIJ790/pBAC-tylGC-DG中,筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子,提取质粒。对上述得到的质粒进行酶切、3’粘末端补平及质粒自连,得到tylQ基因缺失的重组质粒pBAC-tylGC-DQ。质粒pBAC-tylGC-DQ通过测序验证正确(图3)。
将重组质粒pBAC-tylGC-DQ转化进入大肠杆菌ET123567(参见文献Kieser T,BibbM,Buttner M,Chater K and Hopwood D.Practical Streptomyces Genetics,2000,JohnInnes Foundation,Norwich,United Kingdom),挑选具有氯霉素和安普霉素抗性的菌株。通过大肠杆菌和链霉菌之间的结合转移将质粒pBAC-tylGC-DQ导入到弗氏链霉菌ATCC19609中,通过安普霉素和萘啶酮酸的固体培养基筛选得到单交换菌株。将单交换菌株在不含抗生素的高氏一号固体培养基上传代,挑取单菌落分别涂布在含有安普霉素和不含抗生素的高氏一号固体培养基上。挑选在含有安普霉素的培养基上不能生长、在无抗生素的培养基上可以生长的菌株。通过引物对tylS-R/P450-R对待筛选的菌株基因组进行PCR扩增,扩增产物大小为1.4kb的菌株即为tylQ基因遗传阻断突变株WT/QKO;相应地,对弗氏链霉菌野生型进行PCR扩增则得到大小约为2.0kb的DNA产物(图4)。
2)泰乐菌素高产工程菌WT/QKO/RS-OE的构建
利用大肠杆菌与链霉菌之间接合转移技术,将重组质粒pSET52-RSOE导入弗氏链霉菌tylQ遗传阻断突变株WT/QKO中,在含有萘啶酮酸和安普霉素的培养基上筛选具有安普霉素抗性的目标工程菌株WT/QKO/RS-OE(图5A)。
将重组工程菌株WT/QKO/RS-OE转接至TSB液体培养基,28℃220rpm震荡培养48h后以提取的基因组DNA作为模板,通过引物152-F和152-R进行PCR扩增得到大小约2.8kb的产物片段,与预期结果一致,表明所得到的重组工程菌WT/QKO/RS-OE正确(图5B)
TSB培养基:称取胰酪蛋白胨17g,大豆蛋白胨3g,葡萄糖2.5g,NaCl 5.0g,磷酸氢二钾2.5g,加蒸馏水溶解并定容至1L,调节pH至7.3,115℃灭菌30分钟。
3.泰乐菌素高产工程菌的发酵及泰乐菌素产量分析
1)弗氏链霉菌及重组工程菌的培养条件和发酵条件:
将弗氏链霉菌ATCC 19609野生型及其重组菌株WT/RS-OE和WT/QKO/RS-OE涂布于高氏一号培养基,28℃培养7天后刮取孢子,保存于10%甘油奶粉溶液中。
将100μL保存在10%甘油奶粉溶液中的孢子分别接种到50mL种子培养基中,28℃220rpm培养3天,取3mL培养液转接到60mL发酵培养基中,28℃220rpm培养180小时后收集发酵液,发酵液经过13000rpm离心10分钟后,取上清液并稀释5倍后,用0.22μm滤膜过滤,取20μL用于泰乐菌素的HPLC分析。
10%甘油奶粉溶液:称取脱脂奶粉10g,量取甘油10mL,加蒸馏水定容至100mL,115℃灭菌15分钟。
高氏一号培养基:称取可溶性淀粉20g,NaCl 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,K2HPO40.5g,KNO3 1g,FeSO4·7H2O 0.01g,琼脂20g,加蒸馏水定容至1L,121℃灭菌30分钟。
种子培养基:称取豆饼粉5g,酵母粉5g,CaCO3 3g,玉米浆6g,加蒸馏水定容至1L,调节pH到6.8,每瓶50mL分装,并添加豆油200μL,121℃灭菌30分钟。
发酵培养基:称取CaCO3 2g,鱼粉10.5g,玉米粉17g,玉米蛋白10.5g,甜菜碱盐酸盐0.4g,NaCl 1g,KCl 0.9g,(NH4)2HPO4 0.37g,硫酸镍0.004g,氯化钴0.003g,MgSO4·7H2O0.1g,加蒸馏水定容至1L,调节pH到6.8,每瓶分装60mL,并添加豆油2.5mL,121℃灭菌30分钟。
将弗氏链霉菌ATCC 19609野生型、工程菌WT/RS-OE和WT/QKO/RS-OE发酵180h后的产物进行HPLC分析(图7),结果表明,工程菌株WT/RS-OE和WT/QKO/RS-OE的发酵液中泰乐菌素的产量分别提高到野生型菌株的2.4倍和2.8倍(图6)。
综上所述,本发明通过弗氏链霉菌中共同高表达tylR和tylS基因,或者在tylQ基因阻断突变株中高表达tylR和tylS基因获得了重组工程菌株WT/RS-OE和WT/QKO/RS-OE。重组工程菌株WT/RS-OE和WT/QKO/RS-OE中泰乐菌素的产量较野生型菌株分别提高至2.4倍和2.8倍。该方法在泰乐菌素类化合物的增产中具有重要应用价值。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对此做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明主要内容的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.基因在发酵产泰乐菌素或构建产泰乐菌素的链霉菌中的应用,其特征在于,
所述基因包括:强启动子、tylR基因和tylS基因;
所述tylR基因的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示;
所述tylS基因的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
2.依据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述强启动子为PhrdB启动子、PermE*启动子或PkasO*启动子;
所述PkasO*启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
3.依据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述链霉菌为弗氏链霉菌ATCC 19609或弗氏链霉菌tylQ基因阻断突变株。
4.依据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述弗氏链霉菌tylQ基因阻断突变株为将弗氏链霉菌ATCC 19609的tylQ基因敲除;
所述tylQ基因的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
5.工程菌的构建方法,其特征在于,将质粒pSET152-RSOE导入链霉菌中;
所述质粒pSET152-RSOE的构建方法是将质粒pSET152-SOE酶切片段和质粒pSET152-ROE酶切片段连接;
所述酶为限制性内切酶EcoR I和EcoR V;
所述连接为T4 DNA连接酶进行连接。
6.依据权利要求5所述工程菌的构建方法,其特征在于,
所述质粒pSET152-SOE的构建方法是利用限制性内切酶EcoR I对质粒pSET152进行线性化后,与以质粒pSET152::D-C为模板、利用引物EcoRV-PkasO-F和kasOp2进行PCR扩增的DNA片段,和以弗氏链霉菌ATCC 19609的基因组为模板、利用引物PkasO-tylS-F和EcoRI-tylS-R进行PCR扩增得到的DNA片段,进行Gibson组装。
7.依据权利要求5所述工程菌的构建方法,其特征在于,所述质粒pSET152-ROE的构建方法是利用限制性内切酶EcoR I和EcoR V对质粒pSET152进行线性化后,与以质粒pSET152::D-C为模板、利用引物152-PkasO(S)-F和kasOp2进行PCR扩增的DNA片段,和以弗氏链霉菌ATCC 19609的基因组为模板、利用引物PkasO-tylR-F和EcoRI-tylR-R进行PCR扩增得到的DNA片段,进行Gibson组装。
8.依据权利要求5所述工程菌的构建方法,其特征在于,所述弗氏链霉菌包括弗氏链霉菌ATCC 19609和弗氏链霉菌tylQ遗传阻断突变株WT/QKO。
9.依据权利要求8所述工程菌的构建方法,其特征在于,所述突变株WT/QKO的构建方法是将弗氏链霉菌ATCC 19609中的tylQ基因敲除。
10.权利要求1所述的应用,其特征在于,所述泰乐菌素为泰乐菌素A、泰乐菌素C中一种或多种。
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