BR122021004512B1 - Métodos para produzir piripiropeno a e método para produzir 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2e, 6e)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2h-pirano-2-ona - Google Patents

Métodos para produzir piripiropeno a e método para produzir 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2e, 6e)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2h-pirano-2-ona Download PDF

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Abstract

é proporcionado um método para a cultura de um microorganismo em que um polinucleotídeo particular ou um vetor recombinante compreendendo ele/eles é introduzido com um composto intermediário necessário para a biossíntese de piripiropeno a. o método da presente invenção permite produzir piripiropeno.

Description

[REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO]
[0001] Este pedido de patente reivindica a prioridade de Pedido de Patente Japonesa No. 14727/2010 que foi depositado em 26 de janeiro de 2010, e cuja divulgação completa é incorporada aqui por referência.
[FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO] CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção refere-se a um método para produzir piripiropeno, mais especificamente, um método para produzir piripiropeno A, E, O ou semelhantes. FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
[0003] Piripiropeno A tem, tal como divulgado no Pedido de Patente Japonesa Em Aberto No. 360895/1992 (Documento de patente 1) e Journal of Antibiotics (1993), 46 (7), 1168-9 (Documento não patentário 1), uma atividade inibidora contra ACAT (acil CoA colesterol aciltransferase) e sua aplicação para o tratamento de doenças causadas pelo acúmulo de colesterol ou semelhante é esperado.
[0004] Como um fungo produtor de piripiropeno A, a cepa de Aspergillus fumigatus FO-1289 foi divulgada no Pedido de Patente Japonesa Em Aberto No. 360895/1992 (Documento de Patente 1); a cepa de Eupenicillium reticulosporum NRRL-3446 foi divulgada em Applied and Environmental Microbiology (1995), 61 (12), 4429-35 (Documento não patentário 2); a cepa de Penicillium griseofulvum F1959 foi divulgada em WO2004/060065 (documento de patente 2); e cepa de Penicillium coprobium PF1169 foi divulgada no Journal of Technical Disclosure 500997/2008 (Documento de patente 3).
[0005] Além disso, como uma rota biossintética de piripiropeno A, uma rota biossintética putativa na cepa de Aspergillus fumigatus FO-1289 foi divulgada no Journal of Organic Chemistry (1996), 61, 882-886 (Documento não patentário 3) e Chemical Review (2005), 105, 4559-4580 (Documento não patentário 4). Estes documentos revelaram que, na cepa de Aspergillus fumigatus FO-1289, estruturas parciais individualmente sintetizadas por policetídeo sintase ou preniltransferase estão ligadas para sintetizar piripiropeno A por uma ciclase.
[REFERÊNCIAS DA TÉCNICA ANTERIOR] [DOCUMENTOS DE PATENTE]
[0006] [Documento de Patente 1] Publicação de Patente Japonesa disponível ao público No. 360895/1992
[0007] [Documento de Patente 2] WO2004/060065
[0008] [Documento de Patente 3] Journal of Technical Disclosure 500997/2008
[DOCUMENTOS NÃO PATENTE]
[0009] [Documento não-Patente 1] Journal of Antibiotics (1993), 46(7), 1168-9.
[0010] [Documento não-Patente 2] Applied and Environmental Microbiology (1995), 61(12), 4429-35.
[0011] [Documento não-Patente 3] Journal of Organic Chemistry (1996), 61, 882886.
[0012] [Documento não-Patente 4] Chemical Review (2005), 105, 4559-4580. [SUMÁRIO DA INVENÇÃO]
[0013] Os presentes inventores descobriram agora que piripiropeno A ou semelhante foi capaz de ser produzido pela cultura de um microorganismo em que um polinucleotídeo particular ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles foi introduzido com um composto intermediário necessário para a biossíntese de piripiropeno A. A presente invenção tem sido feita com base em tal achado.
[0014] Consequentemente, um objetivo da presente invenção é fornecer um método para produzir piripiropeno A.
[0015] Além disso, de acordo com uma modalidade da presente invenção, um método para produzir piripiropeno A, caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo em (I) a (III) abaixo, ou um vetor recombinante compreendendo ele/eles é introduzido com o piripiropeno E e isolando piripiropeno A através do piripiropeno O é fornecido: (I) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo em (a) a (d) abaixo: (a) uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266, (b) uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266 sob condições rigorosas, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada pela sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266, (c) uma sequência de nucleotídeo do polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266 em que um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada pela sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266, e (d) uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade a um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada pela sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266; (II) um polinucleotídeo isolado tendo uma sequência de nucleotídeo codificando pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 267 a 275 ou uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente da mesma; e (III) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo em (1) a (4) abaixo: (1) uma sequência de nucleotídeo em (a) a (i) abaixo: (a) uma sequência de nucleotídeo de 3342 a 5158 de uma sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, (b) uma sequência de nucleotídeo de 5382 a 12777 de uma sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, (c) uma sequência de nucleotídeo de 13.266 a 15.144 de uma sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, (d) uma sequência de nucleotídeo de 16.220 a 18.018 de uma sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, (e) uma sequência de nucleotídeo de 18.506 a 19.296 de uma sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, (f) uma sequência de nucleotídeo de 19.779 a 21.389 de uma sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, (g) uma sequência de nucleotídeo de 21.793 a 22.877 de uma sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, (h) uma sequência de nucleotídeo de 23.205 a 24.773 de uma sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, e (i) uma sequência de nucleotídeo de 25.824 de 27.178 de uma sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266; (j) uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo em (1) sob condições rigorosas, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo; (k) uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1) em que um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionado, e que codificam uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo; e (l) uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1), e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo.
[0016] Além disso, de acordo com outra modalidade da presente invenção, um método para produzir piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo no acima mencionado (I) a (III) ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com deacetil piripiropeno E e isolando piripiropeno A através de piripiropeno E e piripiropeno O é fornecido.
[0017] Além disso, de acordo com outra modalidade da presente invenção, um método para produzir 4-hidroxi-6-(piridin-3-il) -3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2 ,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona, caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo no acima mencionado (I) a (III) ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com 4-oxo-6-(3-piridil)-α-pirona e isolando 4-hidroxi-6-(piridin-3-il) -3-((2E, 6E) -3,7,11-trimetildodeca-2, 6,10-trienil)- 2H-piran-2-ona é fornecido.
[0018] De acordo com outra modalidade da presente invenção, pelo menos, um polinucleotídeo isolado do acima (I) a (III) é fornecido.
[0019] Além disso, de acordo com outra modalidade da presente invenção, um vetor recombinante selecionado do grupo consistindo de pPP6 (No. de Acesso de Aspergillus orizae transformado com o plasmídeo pPP6: FERM BP-11.218), pPP7 (No. de Acesso de Aspergillus orizae transformado com o plasmídeo pPP7: FERM BP-11.219) e pPP9 (No. de Acesso de Aspergillus orizae transformado com o plasmídeo pPP9: FERM BP-11.220) é fornecido.
[0020] Ainda adicionalmente, de acordo com outra modalidade da presente invenção, um transformante que compreende um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pPP6, pPP7 e pPP9 é fornecido.
[0021] De acordo com outra modalidade da presente invenção, a uso do acima mencionado vetor recombinante para produzir piripiropeno A é fornecido.
[0022] De acordo com outra modalidade da presente invenção, uso do transformante acima mencionado para produzir piripiropeno A é fornecido.
[0023] De acordo com o método de produção da presente invenção, piripiropeno A, E, O ou semelhante é capaz de ser produzido por técnicas de recombinação de genes. Portanto, o método de produção da presente invenção faz com que uma contribuição significativa para a tecnologia de produção em massa do piripiropeno A, E, O ou semelhantes. [BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS]
[0024] [Figura 1] A Figura 1 mostra um padrão de eletroforese dos produtos de PCR por gel de agarose. Para a eletroforese, os produtos de PCR amplificados usando os seguintes iniciadores foram usados: M: marcador de peso molecular (100 bp de escala), pista 1: iniciadores de SEQ ID NOs: 1 e 2, pista 2: iniciadores de SEQ ID NOs: 239 e 240, pista 3: iniciadores de SEQ ID NOs: 237 e 238, pista 4: iniciadores de SEQ ID NOs: 241 e 242, pista 5: iniciadores de SEQ ID NOs: 247 e 248, pista 6: iniciadores de SEQ ID NOs: 251 e 252, pista 7: iniciadores de SEQ ID NOs: 245 e 246, pista 8: iniciadores de SEQ ID NOs: 243 e 244, pista 9: iniciadores de SEQ ID NOs: 249 e 250, pista 10: iniciadores de SEQ ID NOS: 235 e 236, pista 11: iniciadores de SEQ ID NOs: 233 e 234, pista 12: iniciadores de SEQ ID NOs: 227 e 228, pista 13: iniciadores de SEQ ID NOs: 229 e 230, pista 14: Os iniciadores de SEQ ID NOs: 231 e 232.
[0025] [Figura 2] Similarmente à Figura 1, Figura 2 mostra um padrão de eletroforese dos produtos de PCR por gel de agarose. Para a eletroforese, os produtos de PCR amplificados usando os seguintes iniciadores foram usados: M: marcador de peso molecular (100 bp de escala), pista 1: iniciadores de SEQ ID NOs: 253 e 254, pista 2: iniciadores de SEQ ID NOs: 257 e 258, pista 3: iniciadores de SEQ ID NOs: 259 e 260, pista 4: Os iniciadores de SEQ ID NOs: 255 e 256, pista 5: iniciadores de SEQ ID NOs: 261 e 262.
[0026] [Figura 3] Similarmente à Figura 1, Figura 3 mostra um padrão de eletroforese dos produtos de PCR por gel de agarose. Para a eletroforese, os produtos de PCR amplificados usando os seguintes iniciadores foram usados: pista 1: marcador de peso molecular (100 bp de escala), pista 2: iniciadores de SEQ ID NOs: 264 e 265 (400 bp de fragmento amplificado).
[0027] [Figura 4] Figura 4 mostra o mapa do plasmídeo pUSA.
[0028] [Figura 5] Figura 5 mostra o mapa do plasmídeo pPP2.
[0029] [Figura 6] Figura 6 mostra um esquema de amplificação de cDNA P450-2.
[0030] [Figura 7] Figura 7 mostra o mapa de plasmídeo de pPP3.
[0031] [Figura 8] Figura 8 mostra espectro de 1H-NMR de piripiropeno E em acetonitrila deuterada.
[0032] [Figura 9] Figura 9 mostra espectro de 1H-NMR em acetonitrila deuterada de um produto da cultura de Aspergillus orizae transformado com plasmídeo pPP2.
[0033] [Figura 10] Figura 10 mostra espectro de 1H-NMR de piripiropeno O em acetonitrila deuterada.
[0034] [Figura 11] A Figura 11 mostra espectro de 1H-NMR em acetonitrila deuterada de um produto da cultura de Aspergillus orizae transformada com o plasmídeo pPP3.
[0035] [Figura 12] A Figura 12 mostra o mapa de plasmídeo de plasmídeos pPP6, pPP7 e pPP9.
[DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO] Deposição de Microorganismos
[0036] Escherichia coli (Escherichia coli EPI300TM-T1R) transformado com plasmídeo pCC1-PP1 foi depositado com o Organismo Depositário Internacional de Patentes, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (Endereço: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki , Japão, 305-8566), sob n° acesso FERM BP-11133 (convertido da deposição doméstica, sob no acesso FERM P-21704) (referência de identificação dos depositantes: Escherichia coli EPI300TM- T1R/pCC1-PP1) em 9 de Outubro de 2008 (data de depósito original).
[0037] Aspergillus orizae transformado com plasmídeo pPP2 foi depositado com o Organismo Depositário Internacional de Patentes, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (Endereço: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão, 305-8566), sob n° acesso FERM BP-11137 (referência de identificação dos depositantes: Aspergillus orizae PP2-1) em 23 de junho de 2009.
[0038] Aspergillus orizae transformado com plasmídeo pPP3foi depositado com o Organismon Depositário Internacional de Patentes, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (Endereço: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão, 305-8566), sob n° acesso FERM BP-11141 (referência de identificação dos depositantes: Aspergillus orizae PP3-2) em 3 de julho de 2009.
[0039] Aspergillus orizae transformado com plasmídeo pPP6 foi depositado com o Organismo Depositário de Patente Internacional, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (Endereço: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão, 305-8566), sob acesso No. FERM BP-11218 (referência de identificação pelos depositantes: Aspergillus orizae PP6) em 21 de Dezembro de 2009.
[0040] Aspergillus orizae transformado com plasmídeo pPP7 foi depositado com o Organismo Depositário de Patente Internacional, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (Endereço: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão, 305-8566), sob no de acesso FERM BP-11219 (referência de identificação dos depositantes: Aspergillus orizae PP7) em 21 de dezembro de 2009.
[0041] Aspergillus orizae transformado com plasmídeo pPP9 foi depositado com o Organismo Depositário de Patente Internacional, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada (Endereço: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japão, 305-8566), sob no de acesso FERM BP-11220 (referência de identificação dos depositantes: Aspergillus orizae PP9) em 21 de dezembro de 2009. Método para produzir Piripiropeno
[0042] A presente invenção refere-se a um método para produzir piripiropeno, em que um produto do metabolismo secundário é obtido pela cultura de um microorganismo em que um gene envolvido na biossíntese de piripiropeno A é introduzido com um composto intermediário necessário para a biossíntese de piripiropeno A.
[0043] Um exemplo de uma através do biossintética de piripiropeno A inclui o seguinte esquema 1. [Tabela 1]
Figure img0001
Esquema 1
[0044] Cada via biossintética do Esquema 1 acima mencionado será descrita em detalhe abaixo.
[0045] 1. Ácido nicotínico é deixado para reagir com ligase CoA e ainda o produto resultante é deixado para reagir com policetídeo sintase tipo LovB (PKS), gerando assim ácido 5 - (3-piridil) -3,5-dioxopentanóico.
[0046] 2. ácido 5 - (3-piridil) -3,5- dioxopentanóico é deixado para reagir com policetídeo sintase tipo LovB (PKS), gerando assim 4-oxo-6-(3-piridil)-α-pirona.
[0047] 3. 4-oxo-6-(3-piridil)-α-pirona e farnesilpirofosfato (FPP) são deixados para reagir com preniltransferase tipo UbiA (UbiAPT), gerando assim 4-hidroxi-6-(piridin-3- il) -3 - ((2E, 6E) -3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona.
[0048] 4. 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trienil)- 2H-piran-2-ona é deixado para reagir com monoxigenase dependente de FAD (FMO) e ainda o produto resultante é deixado para reagir com Ciclase (IMP: proteína de membrana integral) , gerando assim deacetil piripiropeno E.
[0049] 5. Deacetil piripiropeno E é deixado para reagir com acetiltransferase (AT), gerando assim piripiropeno E.
[0050] 6. Piripiropeno E é deixado para reagir com Citocromo P450 monoxigenase (1) (P450-1), gerando assim 11-deacetil piripiropeno O.
[0051] 7. 11-deacetil piripiropeno O é deixado para reagir com Acetiltransferase-2 (AT-2), gerando assim piripiropeno O.
[0052] 8. Piripiropeno O é deixado para reagir com citocromo P450 monoxigenase (2) (P450-2), gerando assim 7-deacetil piripiropeno A.
[0053] 9. 7-deacetil piripiropeno A é deixado para reagir com Acetiltransferase-2 (AT-2), gerando assim piripiropeno A.
[0054] Deacetil piripiropeno E é capaz de ser sintetizado, por exemplo, pelo método no Exemplo de Referência 3 abaixo.
[0055] Piripiropeno E é capaz de ser obtido, por exemplo, pelo método descrito Publicação de Patente Japonesa disponível ao público No. 239385/1996.
[0056] 11-deacetil piripiropeno O é capaz de ser sintetizado, por exemplo, pelo método descrito no Exemplo de Referência 4 abaixo.
[0057] Piripiropeno O é capaz de ser obtido, por exemplo, pelo método descrito em J. Antibiot. 1996, 49, 292.
[0058] 7-deacetil piripiropeno A é capaz de ser sintetizado, por exemplo, pelo método descrito na Publicação de Patente Japonesa disponível ao público No. 259569/1996.
[0059] 4-oxo-6-(3-piridil)-α-pirona é capaz de ser sintetizado, por exemplo, pelo método descrito em J. Org. Chem. Chem. 1983. 48. 3945.
[0060] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo que compreende um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pCC1-PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7 e pPP9 com piripiropeno E e isolando piripiropeno A através piripiropeno O é fornecido.
[0061] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo em (IV) a (V) abaixo, ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com o piripiropeno E e isolando piripiropeno A através do piripiropeno O é fornecido: (IV) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo que codificam pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 269, 270 e 275 ou uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente da mesma; (V) um polinucleotídeo tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo em (1) a (4) abaixo: (1) uma sequência de nucleotídeo em (a) a (c) abaixo: (a) uma sequência de nucleotídeo de 13.266 a 15.144 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (b) uma sequência de nucleotídeo de 16.220 a 18.018 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, e (c) uma sequência de nucleotídeo de 25.824 a 27.178 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266; (2) uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo em (1) sob condições rigorosas, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo; (3) uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1) em que um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo; (4) uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade com um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1), e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo.
[0062] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo que compreende um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pPP2, pPP3 e pPP9 com piripiropeno E e isolando piripiropeno A através piripiropeno O é fornecido.
[0063] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo que compreende plasmídeos pPP2, pPP3 e pPP9 com piripiropeno E e isolando piripiropeno A através do piripiropeno O é fornecido.
[0064] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com deacetil piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo no acima mencionado (I) a (III) ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com o deacetil piripiropeno E e isolando piripiropeno A através do piripiropeno E e piripiropeno O é fornecido.
[0065] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com Deacetil piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo que compreende um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pCC1 -PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7 e pPP9 com deacetil piripiropeno E e isolando piripiropeno A através piripiropeno E e piripiropeno O é fornecido.
[0066] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com deacetil piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um dito polinucleotídeo em (VI) e (VII) abaixo ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com o deacetil piripiropeno E e isolando piripiropeno A através do piripiropeno E e piripiropeno O é fornecido: (VI) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de polinucleotídeo que codificam pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 269, 270, 274 e 275 ou uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente da mesma; (VII) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo em (1) a (4) abaixo: (1) uma sequência de nucleotídeo em (a) a (d) abaixo: (a) uma sequência de nucleotídeo de 13.266 a 15.144 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (b) a sequência de nucleotídeo de 16.220 a 18.018 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (c) uma sequência de nucleotídeo de 23.205 a 24.773 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, e (d) uma sequência de nucleotídeo de 25.824 a 27.178 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266; (2) uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo em (1) sob condições rigorosas, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo; (3) uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1) em que um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionado, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo; (4) uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade a um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1), e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo.
[0067] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com deacetil piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo que compreende um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pPP2, pPP3, pPP7 e pPP9 com deacetil piripiropeno E e isolando piripiropeno A através piripiropeno E e piripiropeno O é fornecido.
[0068] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com deacetil piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo compreendendo plasmídeos pPP2, pPP3, pPP7 e pPP9 com deacetil piripiropeno E e isolando piripiropeno A através piripiropeno E e piripiropeno O é fornecido.
[0069] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com 4-oxo-6-(3-piridil)-α- pirona, um método para produzir 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11- trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo no acima mencionado (I) a (III) ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com 4-oxo-6- (3-piridil)-α-pirona e isolando 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11- trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona é fornecido. Neste caso, é preferido que, tal como o microorganismo acima mencionado, um capaz de biossíntese de farnesilpirofosfato (FPP) no interior do corpo da célula é usado. Um exemplo de tais microrganismos inclui microrganismos pertencentes ao gênero Aspergillus.
[0070] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com 4-oxo-6-(3-piridil)-α- pirona, um método para produzir 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11- trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona caracterizado pela cultura de um microorganismo que compreende um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pCC1-PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7 e pPP9 com 4-oxo- 6-(3-piridil)-α-pirona e isolando 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11- trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona é fornecido.
[0071] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com 4-oxo-6-(3-piridil)-α- pirona, um método para produzir 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11- trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona, caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo em (VIII) e (IX) abaixo ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com 4-oxo-6-(3-piridil)-α- pirona e isolando 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E, 6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10- trienil)-2H-piran-2-ona é fornecido: (VIII) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo que codificam a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 273 ou uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente da mesma; (IX) um polinucleotídeo possuindo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo em (1) a (4) abaixo: e (1) uma sequência de nucleotídeo de 21.793 a 22.877 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266; (2) uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo em (1) sob condições rigorosas, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo; (3) uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1) em que um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo, e (4) uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1), e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo.
[0072] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com 4-oxo-6-(3-piridil)-α- pirona, um método para produzir 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11- trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona caracterizado pela cultura de um microorganismo compreendendo plasmídeo pPP6 com 4-oxo-6 - (3-piridil)-α-pirona e isolando 4-hidroxi-6-(piridin-3-il) -3 - ((2E, 6E) -3,7,11-trimetildodeca-2, 6,10 - trienil)- 2H-piran-2-ona é fornecido.
[0073] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com deacetil piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno E caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo no acima mencionado (I) a (III) ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com o deacetil piripiropeno E e isolando piripiropeno E é fornecido.
[0074] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com deacetil piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno E caracterizado pela cultura de um microorganismo compreendendo um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pCC1 -PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7 e pPP9 com deacetil piripiropeno E e isolando e piripiropeno E é fornecido.
[0075] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com deacetil piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno E caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo em (X) e (XI) abaixo ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com o deacetil piripiropeno E e isolando piripiropeno E é fornecido: (X) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo que codificam sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 274 ou uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente da mesma; e (XI) um polinucleotídeo tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo em (1) a (4) abaixo: (1) uma sequência de nucleotídeo de 23.205 a 24.773 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (2) uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo em (1) sob condições rigorosas, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo; (3) uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1) em que um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo, e (4) uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1), e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo.
[0076] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com deacetil piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno E caracterizado pela cultura de um microorganismo compreendendo plasmídeo pPP7 com deacetil piripiropeno E e isolando piripiropeno E é fornecido.
[0077] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno O caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo no acima mencionado (I) a (III) ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com o piripiropeno E e isolando piripiropeno O é fornecido.
[0078] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno O caracterizado pela cultura de um microorganismo que compreende um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pCC1 -PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7 e pPP9 com piripiropeno E e isolar piripiropeno O é fornecido.
[0079] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno O caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo em (XII) e (XIII) abaixo, ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com o piripiropeno E e isolando piripiropeno O é fornecido: (XII) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo que codificam pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 269 e 275 ou uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente da mesma, e (XIII) um polinucleotídeo tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo em (1) a (4) abaixo: (1) uma sequência de nucleotídeo em (a) a (b) abaixo: (1) uma sequência de nucleotídeo de 13.266 a 15.144 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, e (2) m sequência de nucleotídeo de 25.824 a 27.178 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266; (3) uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo em (1) sob condições rigorosas, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo; (4) uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1) em que um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo, e (5) uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1), e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo.
[0080] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno O caracterizado pela cultura de um microorganismo compreendendo um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pPP2 e pPP9 com e piripiropeno E e isolando piripiropeno O é fornecido.
[0081] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno E, um método para produzir piripiropeno O caracterizado pela cultura de um microorganismo compreendendo plasmídeos pPP2 e pPP9 com piripiropeno E e isolando piripiropeno O é fornecido.
[0082] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno E, um método para produzir 11-deacetil piripiropeno O caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo no acima mencionado (I) a (III) ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com o piripiropeno E e isolando 11-deacetil piripiropeno O é fornecido.
[0083] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno E, um método para produzir 11-deacetil piripiropeno caracterizado pela cultura de um microorganismo compreendendo um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pCC1-PP1, pPP2, pPP3, pPP6, pPP7 e pPP9 com piripiropeno E e isolando 11-deacetil piripiropeno O é fornecido.
[0084] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno E, um método para produzir 11-deacetil piripiropeno E caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo em (XIV) e (XV) abaixo ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com o piripiropeno E e isolando 11-deacetil piripiropeno O é fornecido: (XIV) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo que codificam sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 269 ou uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente da mesma, e (XV) um polinucleotídeo tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo em (1) a (4) abaixo: (1) uma sequência de nucleotídeo de 13.266 a 15.144 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266; (2) uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo em (1) sob condições rigorosas, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo; (3) uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1) em que um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo, e (4) uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1), e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo.
[0085] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno E, um método para a produção de 11-deacetil piripiropeno O caracterizado pela cultura de um microorganismo compreendendo plasmídeo pPP2 com piripiropeno E e isolando 11- deacetil piripiropeno O é fornecido.
[0086] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com 11-deacetil piripiropeno O, um método para produzir piripiropeno O caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo no acima mencionado (I) a (III) ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com 11-deacetil piripiropeno O e isolando piripiropeno O é fornecido.
[0087] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com 11-deacetil piripiropeno O, um método para produzir piripiropeno O caracterizado pela cultura de um microorganismo que compreende um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pCC1-PP1, pPP2 e pPP3, pPP6, pPP7 e pPP9 com 11- deacetil piripiropeno O e isolando piripiropeno O é fornecido.
[0088] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com 11-deacetil piripiropeno O, um método para produzir piripiropeno O caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo em (XIV) e (XV) abaixo, ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com 11-deacetil piripiropeno O e isolando piripiropeno O é fornecido: (XIV) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo que codificam sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 275 ou uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente da mesma, e (XV) um polinucleotídeo tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo em (1) a (4) abaixo: (1) uma sequência de nucleotídeo de 25.824 a 27.178 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266; (2) uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo em (1) sob condições rigorosas, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo; (3) uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1) em que um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo, e (4) uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1), e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo.
[0089] De acordo com uma modalidade mais preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com 11-deacetil piripiropeno O, um método para produzir piripiropeno O caracterizado pela cultura de um microorganismo compreendendo plasmídeo pPP9 com 11-deacetil piripiropeno O e isolando piripiropeno O é fornecido.
[0090] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno O, um método para produzir 7-deacetil piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo no acima mencionado (I) para (III) ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com piripiropeno O e isolando 7-deacetil piripiropeno A é fornecido.
[0091] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno O, um método para produzir 7-deacetil piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo que compreende um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pCC1-PP1, pPP2 e pPP3 e pPP6, pPP7 e pPP9 com piripiropeno O e isolando 7-deacetil piripiropeno A é fornecido.
[0092] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno O, um método para produzir 7-deacetil piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo em (XIV) e (XV) abaixo, ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com piripiropeno O e isolando 7-deacetil piripiropeno A é fornecido: (XIV) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo que codificam sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 270 ou uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente da mesma, e (XV) um polinucleotídeo tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo em (1) a (4) abaixo: (1) uma sequência de nucleotídeo de 16.220 a 18.018 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266; (2) uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo em (1) sob condições rigorosas, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo; (3) uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1) em que um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo, e (4) uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1), e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo.
[0093] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com piripiropeno O, um método para a produção de 7-deacetil piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo compreendendo plasmídeo pPP3 com piripiropeno O e isolando 7- deacetil piripiropeno A é fornecido.
[0094] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com 7-deacetil piripiropeno A, um método para produzir piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo no acima mencionado (I) a (III) ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com 7-deacetil piripiropeno A e isolando piripiropeno A é fornecido.
[0095] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com 7-deacetil piripiropeno A, um método para produzir piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo compreendendo um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pCC1-PP1, PPP2 e pPP3, pPP6, pPP7 e pPP9 com 7- deacetil piripiropeno A e isolando piripiropeno A é fornecido.
[0096] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com 7-deacetil piripiropeno A, um método para produzir piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo em que pelo menos um polinucleotídeo em (XVI) e (XVII) abaixo ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles é introduzido com 7-deacetil piripiropeno A e isolando piripiropeno A é fornecido: (XVI) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo que codificam sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 275 ou uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente da mesma, e (XVII) um polinucleotídeo tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo em (1) a (4) abaixo: (1) uma sequência de nucleotídeo de 25.824 a 27.178 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266; (2) uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo em (1) sob condições rigorosas, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo; (3) uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1) em que um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo, e (4) uma sequência de nucleotídeo com pelo menos 90% de identidade de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1), e que codifica uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo.
[0097] De acordo com uma modalidade preferida do método de produção da presente invenção, cujo método compreende a cultura com 7-deacetil piripiropeno A, um método para a produção piripiropeno A caracterizado pela cultura de um microorganismo compreendendo plasmídeo pPP9com 7-deacetil piripiropeno A e isolando piripiropeno A é fornecido.
[0098] O microorganismo usado na presente invenção pode ser introduzido com um polinucleotídeo usando o vetor recombinante descrito abaixo. Entretanto, o polinucleotídeo pode ser introduzido no microrganismo, por exemplo, por um método de eletroporação, um método de polietileno glicol, um método de Agrobacterium, um método de lítio, um método de cloreto de cálcio ou semelhantes.
[0099] O microorganismo usado na presente invenção não é particularmente restrito desde que ele possa ser introduzido com um polinucleotídeo ou um vetor recombinante compreendendo ele / eles. Microrganismos pertencentes ao gênero Aspergillus são preferidos e Aspergillus orizae é particularmente preferido.
[0100] Na presente invenção, cultura dos microorganismos pode ser realizada, por exemplo, por cultura sólida sob condições aeróbicas, agitação da cultura, cultura com borbulhamento sob agitação ou cultura aeróbica de parte profunda, em particular, agitação da cultura é preferido. Como um meio de cultura para os microorganismos, componentes geralmente usados, por exemplo, como fontes de carbono, glicose, sacarose, xarope de amido, dextrina, amido, glicerol, melaço, óleos animal e vegetal ou similares, podem ser usados. Além disso, como fontes de nitrogênio, farinha de soja, gérmen de trigo, licor de infusão de milho, farinha de semente de algodão, extrato de carne, polipeptona, extrato de malte, extrato de levedura, sulfato de amônio, nitrato de sódio, ureia ou semelhantes podem ser usados. Além disso, conforme necessário, a adição de sódio, potássio, cálcio, magnésio, cobalto, cloro, ácido fosfórico (fosfato de dipotássio de hidrogênio ou semelhantes), ácido sulfúrico (sulfato de magnésio ou semelhantes) ou sais inorgânicos que podem gerar outros íons é eficaz. Também, conforme necessário, várias vitaminas tais como tiamina (cloridrato de tiamina ou semelhantes), aminoácidos, tais como o ácido glutâmico (glutamato de sódio ou semelhantes) ou asparagina (asparagina-DL ou semelhantes), nutrientes de traço, tais como nucleotídeos ou agentes de seleção tais como os antibióticos podem ser adicionados. Além disso, as substâncias orgânicas ou substâncias inorgânicas, que ajudam o crescimento de um fungo e promovem a produção de piripiropeno A podem ser adequadamente adicionadas.
[0101] O pH do meio é, por exemplo, cerca de pH 5,5 até pH 8. A temperatura apropriada para a cultura é 15 °C a 40 °C e, em muitos casos, o crescimento acontece em torno de 22 °C a 30 °C. A produção de 4-hidroxi-6-(piridin-3-il) -3 - ((2E, 6E) - 3,7,11-trimetildodeca-2 ,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona , deacetil piripiropeno E, piripiropeno E, piripiropeno O e piripiropeno A varia dependendo do meio e condições de cultura, ou do hospedeiro usado. Em qualquer método para a cultura, a acumulação normalmente atinge um pico em 2 dias a 10 dias. A cultura é terminada no momento em que a quantidade de piripiropeno A na cultura atinge o pico e uma substância desejada é isolada e purificada a partir da cultura.
[0102] Para isolar ácido 5 - (3-piridil) -3,5-dioxopentanóico, 4-oxo-6-(3-piridil)-α- pirona, deacetil piripiropeno E, piripiropeno E, piripiropeno O, 7-deacetil piripiropeno A, piripiropeno A ou semelhante a partir da cultura, pode ser extraído e purificado por um meio de separação comum usando as propriedades do mesmo, tal como um método de extração com solvente, um método de resina de troca de íon, um método cromatografia de coluna de distribuição ou adsorção, um método de filtração, diálise, um método de precipitação, que podem ser usados individualmente ou adequadamente usados em combinação. O método de extração por solvente é particularmente preferido.
[0103] Na presente invenção, o termo "sequência de aminoácido substancialmente equivalente " significa uma sequência de aminoácido que não afeta uma atividade de um polipeptídeo apesar do fato de que um ou mais aminoácidos são alteradas por substituição, supressão, adição ou inserção. De preferência, uma sequência de aminoácido que é alterada por substituição, supressão, adição ou inserção de aminoácido tem uma identidade de sequência de 70% ou mais, de preferência 80% ou mais, mais preferencialmente 90% ou mais, ainda mais preferencialmente 95% ou mais, e ainda mais preferencialmente 98% ou mais à sequência de aminoácido antes da modificação e semelhantes. Além disso, o número de resíduos de aminoácido alterados é, de preferência 1 a 40, mais preferencialmente 1 a 20, ainda mais preferencialmente 1 a 10, ainda mais preferencialmente 1 a 8, e mais preferencialmente 1 a 4.
[0104] Além disso, um exemplo da alteração que não afeta a atividade compreende substituição conservadora. O termo "substituição conservadora" significa a substituição de preferência 1 a 40, mais preferencialmente 1 a 20, mais preferencialmente 1 a 10, ainda mais preferencialmente 1 a 8, e mais preferencialmente de 1 a 4 resíduos de aminoácido com outros resíduos de aminoácido quimicamente semelhantes tais que a atividade do polipeptídeo não seja substancialmente alterado. Exemplos destes incluem os casos em que um certo resíduo de aminoácido hidrofóbico é substituído por outro resíduo de aminoácido hidrofóbico e casos em que um certo resíduo de aminoácido polar é substituído por outro resíduo de aminoácido polar tendo mesmas cargas. Aminoácidos funcionalmente semelhantes capazes de tal substituição são conhecidos na técnica para cada aminoácido. Concretamente, exemplos de aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptofano, fenilalanina, metionina e semelhantes. Exemplos de aminoácidos polares (neutros) incluem glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina, cisteína e semelhantes. Exemplos de aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, histidina, lisina e semelhantes. Exemplos de aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico, ácido glutâmico e semelhantes.
[0105] O termo "condições rigorosas" na presente invenção significa condições onde uma operação de lavagem das membranas após hibridação é realizada a temperaturas elevadas em uma solução com baixas concentrações de sal, uma pessoa versada na técnica seria capaz de determinar apropriadamente a condição, por exemplo, a condição inclui a condição de lavagem em uma solução com 2 x SSC (1 x SSC: 15 mM de citrato trissódico, 150 mM de cloreto de sódio) e 0,5% de SDS a 60 °C durante 20 minutos, e a condição de lavagem em uma solução com 0,2 x SSC (1 x SSC: 15 mM de citrato trissódico, 150 mM de cloreto de sódio) e 0,1% de SDS a 60 °C durante 15 minutos.
[0106] A hibridação pode ser realizada em conformidade com um método conhecido. Além disso, quando uma biblioteca comercialmente disponível é utilizada, ela pode ser realizada de acordo com um método descrito nas instruções anexas.
[0107] Na presente descrição, o termo "identidade" (também referido como homologia) para sequências de nucleotídeo significa um grau de correspondência de bases que constituem cada sequência entre as sequências a serem comparadas. A esta altura, a presença de espaço(s) e as características dos aminoácidos são tidos em conta. Quaisquer valores da "identidade" mostrados na presente descrição podem ser valores calculados usando um programa de pesquisa de homologia conhecidos àqueles versados na técnica. Por exemplo, o valor pode ser prontamente calculado usando padrão (configuração inicial) de parâmetros em FASTA, BLAST ou semelhantes.
[0108] Na presente descrição, a "identidade" para sequências de nucleotídeo é de 90% ou mais, preferencialmente 95% ou mais, mais preferencialmente 98% ou mais, ainda mais preferencialmente 99% ou mais.
[0109] Na presente descrição, o termo ", um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados em um polinucleotídeo" significa que a alteração foi feita por um método conhecido tal como um método de mutagênese específico, ou a substituição ou semelhante de uma pluralidade de nucleotídeos em um grau no qual eles podem ocorrer naturalmente. O número dos nucleotídeos alterados é um ou mais nucleotídeos (por exemplo, um para vários nucleotídeos ou 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos).
[0110] O termo "sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada pela sequência (cada) de nucleotídeos" significa uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína que tem uma atividade equivalente à da " proteína codificada pela sequência (cada) de nucleotídeo. "
[0111] É preferido que uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada pela sequência de nucleotídeo de 3342 a 5158 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266 têm atividade de ligase de CoA.
[0112] É preferido que uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada por uma sequência de nucleotídeo de 5382 a 12777 da sequência de um nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266 têm atividade de policetídeo sintase tipo LovB (PKS).
[0113] É preferido que uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada por uma sequência de nucleotídeo de 13.266 a 15.144 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266 têm atividade de Citocromo P450 monoxigenase (1) (P450-1).
[0114] É preferido que uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada por uma sequência de nucleotídeo de 16.220 a 18.018 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266 têm atividade de Citocromo P450 monoxigenase (2) (P450-2).
[0115] É preferido que uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada por uma sequência de nucleotídeo de 18.506 a 19.296 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266 têm atividade de ciclase (IMP: proteína de membrana integral).
[0116] É preferido que uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada por uma sequência de nucleotídeo de 19.779 a 21.389 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266 têm atividade de monoxigenase dependente de FAD (FMO).
[0117] É preferido que uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada por uma sequência de nucleotídeo de 21.793 a 22.877 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266 têm atividade de preniltransferase tipo UbiA (UbiAPT).
[0118] É preferido que uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada por uma sequência de nucleotídeo de 23.205 a 24.773 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266 têm atividade de (AT) acetiltransferase.
[0119] É preferido que uma proteína substancialmente equivalente a uma proteína codificada por uma sequência de nucleotídeo de 25.824 a 27.178 de uma sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266 têm atividade de Acetiltransferase-2 (AT- 2). Obtenção de Polinucleotídeo Isolado
[0120] O método para a obtenção do polinucleotídeo isolado da presente invenção não é particularmente restrito. O polinucleotídeo pode ser isolado a partir da cepa de Penicillium coprobium PF1169 ou fungo filamentoso pelo método seguinte. Concretamente, com base em uma sequência de uma homologia obtida pelo método do Exemplo 9 abaixo ou semelhante, iniciadores capazes de amplificar especificamente qualquer um ou mais genes de um gene da policetídeo sintase, gene preniltransferase, gene hidroxilase, gene acetiltransferase ou gene adenilato sintetase, que estão envolvidos na síntese de piripiropena A, são sintetizados. O PCR é realizado para uma biblioteca genômica de fosmídeo da cepa de Penicillium coprobium PF1169 que é preparada separadamente e ainda hibridação de colônia é realizada, obtendo-se assim o polinucleotídeo isolado utilizado na presente invenção
[0121] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, é fornecido pelo menos um polinucleotídeo isolado do acima (I) a (III). Em particular, é proporcionado pelo menos um polinucleotídeo do seguinte (I) a (III): (I) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo dos seguintes (a) a (d): (a) uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266, (b) uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266 sob condições rigorosas, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada pela sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266, (c) uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 266 em que um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada pela sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266, e (d) uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade do polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 266, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada pela sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266; (II) um polinucleotídeo isolado possuindo uma sequência de nucleotídeo que codifica pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 267-275 ou a sequência de aminoácido da mesma substancialmente equivalente; e (III) um polinucleotídeo isolado tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo dos seguintes (1) a (4): (1) uma sequência de nucleotídeo em (a) a (i) abaixo: (a) uma sequência de nucleotídeo de 3342 a 5158 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (b) uma sequência de nucleotídeo de 5382 a 12777 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (c) uma sequência de nucleotídeo de 13.266 a 15.144 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (d) uma sequência de nucleotídeo de 16.220 a 18.018 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (e) uma sequência de nucleotídeo de 18.506 a 19.296 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (f) uma sequência de nucleotídeo de 19.779 a 21.389 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (g) uma sequência de nucleotídeo de 21.793 a 22.877 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (h) uma sequência de nucleotídeo de 23.205 a 24.773 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, e (i) uma sequência de nucleotídeo de 25.824 a 27.178 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266; (j) uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeo de (1) sob condições rigorosas, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo; (k) uma sequência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo em (1) em que um ou mais nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados, e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada por cada sequência de nucleotídeo, e (l) uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade do polinucleotídeo da sequência de nucleotídeo de (1), e que codifica uma proteína substancialmente equivalente à proteína codificada pela sequência de cada nucleotídeo.
[0122] De acordo com uma modalidade mais preferida da presente invenção, é proporcionado um polinucleotídeo isolado selecionado a partir do seguinte (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g ) e (h): (a) um polinucleotídeo possuindo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266, (b) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que consiste de uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs: 269, 270, 273, 274 e 275, (c) um polinucleotídeo que tem uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente ao mostrado na SEQ ID NO: 269, e, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de hidroxilase, (d) um polinucleotídeo que tem uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente ao mostrado na SEQ ID NO: 270, e que codifica um polipeptídeo tendo atividade de hidroxilase, (e) um polinucleotídeo que tem uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente ao mostrado na SEQ ID NO: 273, e que codifica um polipeptídeo tendo atividade preniltransferase, (f) um polinucleotídeo que tem uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente ao mostrado na SEQ ID NO: 274, e que codifica um polipeptídeo tendo atividade de acetilase, (g) um polinucleotídeo que tem uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente ao mostrado na SEQ ID NO: 275, e que codifica um polipeptídeo tendo atividade de acetilase, e (h) um polinucleotídeo isolado tendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do seguinte (i), (ii), (iii), (iv) e (v): (i) uma sequência de nucleotídeo de 13.266 a 15.144 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (j) ) uma sequência de nucleotídeo de 16.220 a 18.018 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (k) i) uma sequência de nucleotídeo de 21.793 a 22.877 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, (l) ) uma sequência de nucleotídeo de 23.205 a 24.773 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266, e (v) uma sequência de nucleotídeo de 25.824 a 27.178 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266
[0123] De acordo com uma modalidade mais preferida da presente invenção, é proporcionado um polinucleotídeo isolado selecionado a partir do seguinte (A), (B) e (C): (A) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que consiste de uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO: 275, (B) um polinucleotídeo que tem uma sequência de aminoácido substancialmente equivalente à mostrada na SEQ ID NO: 275, e que codifica um polipeptídeo tendo atividade de acetilase, e (c) um polinucleotídeo isolado tendo a sequência de nucleotídeo de 25.824 a 27.178 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 266.
[0124] De acordo com uma modalidade ainda mais preferida da presente invenção, é fornecido o polinucleotídeo de ditos (c), (d), (e), (f) e (g), em que as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos codificados pelo polinucleotídeo de ditos (c), (d), (e), (f) e (g) têm uma identidade de sequência de 90% ou mais das sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOs: 269, 270, 273, 274 e 275, respectivamente.
[0125] De acordo com uma modalidade ainda mais preferida da invenção, é fornecido o polinucleotídeo de dito (B), em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de dito (B) tem uma identidade de sequência de 90% ou mais com a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 275.
Vetor Recombinante
[0126] O vetor recombinante, de acordo com a presente invenção, pode ser preparado por modificação de qualquer um ou mais dos polinucleotídeos no acima mencionado (I) a (III) em uma forma apropriada, dependendo de um objeto e ligando- os a um vetor de acordo com um método convencional, por exemplo, técnicas de recombinação de genes descritas em [Sambrook, J. et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"., (EUA), 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989].
[0127] O vetor recombinante usado na presente invenção pode ser adequadamente selecionado a partir de vírus, plasmídeo, fosmídeo, vetores cosmídicos ou semelhante. Por exemplo, quando uma célula hospedeira é Escherichia coli, os seus exemplos incluem bacteriófago a base de À fago e plasmídeos a base de pBR e pUC. No caso de um Bacillus subtilis, exemplos incluem plasmídeos a base de pUB. No caso de levedura, os exemplos incluem plasmídeos a base de Yep, YRp, YCp e YIp.
[0128] É preferido que, pelo menos um plasmídeo, dentre os plasmídeos usados, contenha um marcador de seleção para selecionar um transformante. Como o marcador de seleção, um gene de resistência à droga de codificação e gene de auxotrofia complementar pode ser usado. Exemplos concretos preferidos destes incluem, quando um hospedeiro a ser usado é bactéria, genes resistentes à ampicilina, genes resistentes à canamicina, gene resistente à tetraciclina e semelhantes, no caso da levedura, gene biossintético de triptofano (TRP1), gene biossintético de uracila (URA3), gene biossintético de leucina (LEU2) e semelhantes, no caso de um fungo, os genes resistentes a higromicina, genes resistentes a bialafos, genes resistentes a bleomicina, genes resistentes a aureobasidina e semelhantes; e, no caso de uma planta, genes resistentes à canimicina, genes resistentes à bialafos e semelhantes.
[0129] Além disso, moléculas de DNA servindo como um vetor de expressão usado na presente invenção tem de preferência sequências de DNA necessárias para expressar cada gene, por exemplo, sinais regulatórios de transcrição e sinais regulatórios de tradução tais como promotores, sinais de iniciação da transcrição, locais de ligação a ribossomos sinais de parada de tradução, terminadores. Exemplos preferidos dos promotores incluem promotores de lactose operon, triptofano operon e semelhantes em Escherichia coli; promotores de gene de álcool-desidrogenase, gene da fosfatase ácida, gene de metabolização da galactose, gene de gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase ou semelhante em levedura; promotores de gene de α-amilase, gene de glucoamilase, gene de celobiohidrolase, gene de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, gene abp1 ou semelhante em fungos; um promotor CaMV 35S RNA, um promotor CaMV 19S RNA ou um promotor do gene da nopalina sintetase em plantas.
[0130] O vetor de recombinação de acordo com a presente invenção é de preferência um vetor de recombinação selecionado do grupo consistindo de plasmídeos pPP6, pPP7 e pPP9.
[0131] Além disso, de acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o uso de um vetor de recombinação selecionado do grupo consistindo de plasmídeos pPP6, pPP7 e pPP9 para a produção de piripiropeno A é exemplificado. Transformante
[0132] Um hospedeiro em que o polinucleotídeo isolado de acordo com a presente invenção é introduzido pode ser adequadamente selecionado dependendo do tipo do vetor usado, a partir de actinomicetes, Escherichia coli, Bacillus subtilis, leveduras, fungos filamentosos, células vegetais ou semelhantes.
[0133] Um método de introduzir um vetor recombinante num hospedeiro pode ser selecionado, dependendo de uma célula hospedeira em teste, a partir de transferência conjugal, transdução por fago, bem como os métodos de transformação tais como um método de íon de cálcio, um método de íon de lítio, um método de eletroporação, um método de PEG, um método de Agrobacterium ou um método de arma de partículas.
[0134] Nos casos em que uma pluralidade de genes é introduzida nas células hospedeiras na presente invenção, os genes podem estar contidos em uma única molécula de DNA ou individualmente em moléculas de DNA diferentes. Além disso, quando uma célula hospedeira é uma bactéria, cada gene pode ser projetado de modo a ser expresso como mRNA policistrônico e feito em uma molécula de DNA.
[0135] O transformante de acordo com a presente invenção é de preferência um transformante que compreende um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pPP6, pPP7 e pPP9.
[0136] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, uso de um transformante compreendendo um ou mais vetores selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos pPP6, pPP7 e pPP9 para produzir piripiropeno A é exemplificado.
[EXEMPLOS]
[0137] A presente invenção será ainda ilustrada em detalhe pelos exemplos seguintes, que não são destinados a limitar a presente invenção.
Exemplo 1: Preparação de DNA Genômico de Cepa de Penicillium coprobium PF1169
[0138] Meio NB esterilizado (500 ml) foi colocado em um frasco Erlenmeyer (1 L). Cepa de Penicillium coprobium PF1169 (Journal of Technical Disclosure No. 500997/2008 (Documento de Patente 3)) preculturado em meio de ágar de 1/2 CMMY a 28 °C durante 4 dias foi adicionado ao meio acima mencionado e submetido a cultura líquida a 28 °C durante 4 dia. A filtração foi realizada com Miracloth para se obter 5 g de células fúngicas. A partir destas células fúngicas, 30 μg de DNA genômico foi obtido de acordo com o manual ligado ao kit de purificação de DNA genômico Genomic-tip 100 / G (fabricado por Qiagen KK).
Exemplo 2: Iniciadores de Degeneração para Amplificação de Policétideo Sintase (PKS) e Fragmento Amplificado do mesmo
[0139] Com base em uma sequência de aminoácido conservada dentre várias policétideo sintases de fungo filamentoso, os seguintes iniciadores foram projetados e sintetizados como iniciadores degenerados para a amplificação:
[0140] LC1: GAYCCIMGITTYTTYAAYATG (SEQ ID NO: 1)
[0141] LC2c: GTICCIGTICCRTGCATYTC (SEQ ID NO: 2)
[0142] (Em que R = A / G, Y = C / T, M = A / C, I = inosina).
[0143] Usando estes iniciadores degenerados, o DNA genômico preparado no Exemplo 1 e polimerase ExTaq (fabricado por Takara Bio Inc.) foram deixados reagir de acordo com o manual em anexo. Um fragmento amplificado de cerca de 700 pb foi detectado (Figura 1). Além disso, em seguida, o fragmento amplificado acima mencionado foi analisado para especificar a sequência dos seus internos 500 pb (SEQ ID NO: 3).
Exemplo 3: Sequenciamento em Larga Escala de DNA Genômico e Pesquisa de Homologia de Sequência de Aminoácido
[0144] O DNA genômico da cepa de Penicillium coprobium PF1169 obtido no Exemplo 1 foi sujeito a sequenciamento em larga escala e pesquisa de homologia de sequências de aminoácido. Especificamente, uma parte da 50μg de DNA genômico foi pré-tratado e, subsequentemente, sujeito ao sequenciador de DNA Roche 454FLX para obter cerca de 250 pb, 103 milhares de sequências de fragmento (no total, 49 Mb da sequência).
[0145] Para estas sequencias, como sequências conhecidas entre policetídeo sintases e preniltransferases, as seguintes cinco sequencias (sequencias derivadas de policetídeo sintases: Aspergillus (A.) fumigatus PKS 2146 a.a. e sintase de ácido 6-metilsalicílico de Penicillium (P.) griseofluvum 1744 a.a.; bem como preniltransferases: Preniltransferase Aspergillus (A.) fumigatus, Preniltransferase (4- hidroxibezoato octapreniltransferase) Aspergillus (A.) fumigatus e Preniltransferase Penicillium (P.) marneffei) foram selecionados e pesquisa por homologia de sequência de pesquisa de software BLASTX foi realizada, obtendo-se assim 89, 86, 2, 1 e 3 de sequências de homologia, respectivamente (ver Tabela 2). Além disso, a partir das sequências de homologia de A. fumigatus PKS 2146 a.a. e sintase de ácido 6- metilsalicílico P. griseofluvum 1744 a.a., 19 e 23 de sequências contig foram respectivamente obtidas (as sequências contig do A. fumigatus PKS 2146 AA: SEQ ID NOS: 179 a 197; as sequências contig de sintase de ácido 6-metilsalicílico P. griseofluvum 1744 a.a.: SEQ ID NOS: 198 a 220) (ver Tabela 2). [Tabela 2]
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Exemplo 4: Amplificação por PCR a partir de DNA genômico
[0146] A partir dos resultados da pesquisa de blastx obtidos no Exemplo 3, para policetídeo sintases, 13 tipos de pares de iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 227 a 252 foram sintetizados. Similarmente, para preniltransferases, 5 tipos de pares de iniciadores mostrados na SEQ ID NOs: 253 a 262 foram sintetizados. Quando PCR foi realizada para o DNA genômico usando estes iniciadores, fragmentos amplificados com o tamanho esperado foram observados para todos os pares de iniciadores (ver Figura 1 e Figura 2).
Exemplo 5: Construção de Biblioteca Genômica de Fago
[0147] Uma biblioteca genômica de fago À da cepa de Penicillium coprobium PF1169 foi construída usando ÀBlueSTAR Xho I Half-site Arms Kit (fabricado por Takara Bio Inc., Cat. No. 69.242-3), de acordo com o manual anexo. Isto é, o DNA genômico foi parcialmente digerido com uma enzima de restrição, Sau3A1. O fragmento de DNA com cerca de 20 kb (0,5 μg) foi ligado a 0,5 μg de ÀBlueSTAR DNA ligado ao kit. Esta solução de ligação foi submetida a embalagens in vitro usando Lambda INN Packaging Kit (fabricado por Nippon Gene Co., Ltd.), com base no manual de ligado ao kit para se obter 1 ml de uma solução. Esta solução com fagos acondicionados (10 μL) foi infectado em 100 μL de cepa de E. coli ER1647 e cultivada em um meio de formação de placa a 37 ° C durante a noite, obtendo-se assim cerca de 500 clones de placas. Assim, a biblioteca genômica composta por cerca de 50.000 clones de fagos em que 10 a 20 kb de DNA genômico da cepa de Penicillium coprobium PF1169 foram introduzidas pela infecção clone foi construída.
Exemplo 6: Triagem de Biblioteca de Fago
[0148] Para 10000 clones da biblioteca de fagos preparados no Exemplo 5, a triagem primária foi realizada por hibridização de placas usando, como uma sonda, o produto de PCR amplificado pelo par de iniciadores LC1-LC2c preparado acima. Para a rotulagem e detecção da sonda, AlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star (fabricado por GE Healthcare, Cat. No. RPN3690) foi usado. A hibridização acima mencionada foi realizada de acordo com o manual anexo.
[0149] Pela triagem primária, 6 clones permaneceram como candidatos. Além disso, como o resultado da triagem secundária por hibridização de placas, 4 clones foram obtidos. Estes clones positivos foram infectados com cepa de E. coli BM25.8 e os fagos foram convertidos a plasmídeos de acordo com o manual anexo, obtendo assim 4 tipos de plasmídeos que contêm uma região desejada.
Exemplo 7: Preparação de Biblioteca de Genoma de Fosmídeo
[0150] Uma biblioteca genômica da cepa de Penicillium coprobium PF1169 foi construída de acordo com o manual anexo ao Kit de Produção de Biblioteca de Fosmid CopyControl (fabricado por Epicentre, Cat. No. CCFOS110). Isto é, 0,25 μg de fragmento de DNA de cerca de 40 kb de DNA genômico foi terminado bruscamente, e então incorporado no vetor fosmídeo pCCFOS (fabricado por Epicentre). Esta solução de ligação foi submetida a acondicionamento in vitro usando Extrato de Acondicionamento Lambda MaxPlax anexo ao kit com base no manual anexo ao kit. Esta solução com o vírus acondicionado (10 μL) foi infectada em 100 μL de cepa de E. coli EPI300TM T1R-e cultivada num meio contendo cloranfenicol a 37 °C durante a noite e selecionada, obtendo-se assim cerca de 300 clones de colônias. Assim, a cerca de 30.000 clones dos fosmídeos em que 40 kb do DNA genômico de Penicillium coprobium cepa PF1169 foram introduzidas pela infecção foram obtidos. Eles foram aliquotados em uma placa de 96 poços de modo a ser de cerca de 50 clones por poço. Assim, a biblioteca genômica composta por 96 líquidos, cerca de 4800 clones foram construídos.
Exemplo 8: Triagem de Biblioteca de Fosmídeo
[0151] De acordo com o manual anexo aos fosmídeos, DNAs de plasmídeo foram individualmente preparados a partir de 96 líquidos da biblioteca preparada no Exemplo 7. Usando os iniciadores de degeneração para a amplificação da policétideo sintase sintetizado no Exemplo 2, PCR foi realizada durante 96 líquidos destas amostras de DNA de plasmídeo. Como resultado, os fragmentos de DNA de cerca de 700 pb foram amplificados a partir de 9 líquidos. Adicionalmente, uma placa de Petri contendo as colônias de cerca de 300 clones ou mais foi preparada a partir dos líquidos positivos e re-triagem foi realizada por hibridização de colônias. Como um resultado, usando par de iniciadores LC1-LC2c, 9 tipos de fosmídeos foram obtidos a partir de cerca de 4800 clones.
Exemplo 9: Sequenciamento de Larga Escala de DNA genômico e de Procura de Homologia de Sequência de Aminoácido
[0152] O DNA genômico da cepa de Penicillium coprobium PF1169 obtido no Exemplo 1 foi sujeito ao sequenciamento em larga escala e pesquisa de homologia de sequências de aminoácido. Especificamente, a parte de 50 μg de DNA genômico foi pré-tratada e, em seguida, submetido ao sequenciador de DNA Roche 454FLX para obter 1405 sequências de fragmentos com um comprimento contig médio de 19.621 kb (sequência de um comprimento de base total de 27.568160 Mb).
[0153] Por estas sequências, como sequências conhecidas dentre policetídeo sintases e preniltransferases, a sequência cinco seguinte (sequências derivadas de policetídeo sintases: sintase de ácido 6-metilsalicílico de Penicillium (P.) griseofluvum 1744 a.a. (P22367) e Aspergillus (A.) fumigatus PKS 2146 a.a. (Q4WZA8); bem como preniltransferases: Penicillium (P.) marneffei Preniltransferase (Q0MRO8), Aspergillus (A.) fumigatus Preniltransferase (Q4WBI5) e Aspergillus (A.) fumigatus Preniltransferase (4-hidroxibezoato octapreniltransferase) (Q4WLD0)) foram selecionados e pesquisados por sequência de homologia de pesquisa de software bastx foi realizado, obtendo-se assim 22 (P22367), 21 (Q4WZA8), 2 (Q0MRO8), 3 (Q4WBI5) e 3 (Q4WLD0) das sequências homólogas, respectivamente.
Exemplo 10: Triagem de Biblioteca de Fosmídeo e Análise de Sequência dos Genes Agrupados
[0154] De acordo com o manual anexo a um kit de fosmídeo (fabricado por EPICENTRE, Kit de Produção de Biblioteca de Fosmídeo CopyControle), DNAs plasmídicos foram individualmente preparados a partir de 96 líquidos da biblioteca preparada no Exemplo 7. Com base em sequências de base determinadas pelo sequenciador de DNA Roche 454FLX, pesquisa de homologia de sequências de aminoácidos foi realizada para pesquisar as regiões adjacentes a policétideo sintase e preniltransferase. Com base na sequência de bases de preniltransferase da região obtida, um par de iniciadores (No. 27) capaz de amplificar 400 pb fragmento de DNA foi sintetizado. Usando os iniciadores, PCR foi realizada para estes 48 líquidos de amostras de DNA de plasmídeo. Como resultado, os fragmentos de DNA esperados de cerca de 400 pb (SEQ ID NO: 263) foram amplificados a partir de 11 líquidos (ver Figura 3). Além disso, uma placa de Petri contendo as colônias de cerca de 300 ou mais clones foi preparada a partir de 6 líquidos dos líquidos positivos e re-triagem foi realizada por hibridização de colônias. Como resultado, usando par de iniciadores 27F + 27R (iniciador 27F: SEQ ID NO: 264, iniciador 27R: SEQ ID NO: 265), 4 tipos de fosmídeos foram obtidos a partir de cerca de 4800 clones. Um deles foi nomeado pCC1-PP1 e toda a sequência do fragmento inserido foi determinada (SEQ ID NO: 266).
[0155] O pCC1-PP1 obtido foi transformado em cepa de Escherichia coli EPI300TM-T1R (ligado ao kit de fosmídeo), obtendo-se assim cepa de Escherichia coli EPI300TM-T1R /pCC1-PP1.
[0156] Quando uma pesquisa de homologia foi realizada entre a sequência acima mencionada de SEQ ID NO: 266 e cada um de ligase de CoA; policetídeo sintase tipo LovB (PKS); Citocromo P450 monoxigenase, Ciclase (IMP: proteína integral de membrana), monoxigenase dependente de FAD (FMO), que são hidroxilases; preniltranferase tipo UbiA (UbiAPT); Acetiltransferase (AT), Acetiltransferase-2 (AT-2), que são acetiltransferases, e Cátion transportando ATPase (as enzimas acima mencionadas são todas derivadas da cepa de Aspergillus fumigatus Af293), uma alta homologia de 70% ou mais foi observada em qualquer pesquisa.
[0157] Os nucleotídeos 3342 a 5158 de SEQ ID NO: 266 codificar a ligase CoA e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 267; os nucleotídeos 5382 a 12777 de SEQ ID NO: 266 codificam policétideo sintase tipo LovB (PKS) e do polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 268; os nucleotídeos 13.266 a 15.144 de SEQ ID NO: 266 (daqui em diante, uma proteína codificada por esta sequência de polinucleotídeo é referida como Citocromo P450 monooxigenase (1) (P450-1)) e os nucleotídeos 16.220 a 18.018 (a seguir, uma proteína codificada por esta sequência de polinucleotídeo é referida como Citocromo P450 monooxigenase (2) (P450-2)) codificam Citocromo P450 monooxigenases e os polipeptídeos correspondentes são mostrados com as sequências de aminoácido representadas na SEQ ID NOs: 269 e 270, respectivamente; os nucleotídeos 18.506 a 19.296 de SEQ ID NO: 266 codificam Ciclase e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 271; os nucleotídeos 19.779 a 21.389 de SEQ ID NO: 266 codificam monoxigenase dependente de FAD (FMO) e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 272; os nucleotídeos 21.793 a 22.877 de SEQ ID NO: 266 codificam preniltransferase tipo UbiA (UbiAPT) e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 273; os nucleotídeos 23.205 a 24.773 de SEQ ID NO: 266 codificam acetiltransferase (AT) e o polipeptídeo correspondente é mostrado com o sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 274; os nucleotídeos 25.824 a 27.178 de SEQ ID NO: 266 codificam Acetiltransferase-2 (AT-2) e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 275; e os nucleotídeos 27798 a 31855 de SEQ ID NO: 266 codificam Cátion transportando ATPase e o polipeptídeo correspondente é mostrado com a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 276.
Exemplo 11: Análise de Função do Gene por Transformação de Aspergillus Oryzae
[0158] Piripiropeno E usado abaixo foi capaz de ser produzido por um método para a cultura de um microorganismo com base no método descrito na Publicação de Patente Japonesa Em Aberto No. 239385/1996, WO94/09147 ou Patente dos EUA No. 5.597.835, ou o método de síntese total descrito em Tetrahedron Letters, vol. 37, No. 36, 6461-6464, 1996. Além disso, piripiropeno O usado abaixo foi capaz de ser produzido por um método para a cultura de um microorganismo com base no método descrito em J. Antibiotics 49, 292-298, 1996 ou WO94/09147. (1) Preparação de Vetor de Expressão para Introduzir no Fungo Filamentoso
[0159] pUSA (Figura 4) e pHSG399 (Takara Bio Inc.) foram individualmente digerido com KpnI e ligados, obtendo-se assim pUSA-HSG. Este plasmídeo foi digerido com SmaI e KpnI na ordem mencionada, e sujeitos a purificação de gel, obtendo-se assim um vetor de DNA linear tendo uma extremidade coesiva KpnI e extremidade romba SmaI. (2) Preparação de Plasmideo pPP2
[0160] Com fosmídeo pCC1-PP1 como um modelo, o polinucleotídeo do acima mencionado P450-1 foi amplificado usando um par de iniciadores P450-1 com Kpn F (SEQ ID NO: 277) / P450-1 com Swa R (SEQ ID NO: 278). Um fragmento de DNA purificado foi clonado em pCR-Blunt (Invitorogen, Cat. No. K2700-20). O plasmídeo obtido foi digerido com KpnI e SwaI. O acima mencionado fragmento P450-1 foi ligado ao vetor acima descrito pUSA-HSG, obtendo-se assim um plasmídeo pPP2 mostrado na Figura 5. (3) Preparação de plasmídeo pPP3
[0161] Com fosmídeo pCC1-PP1 como um modelo, de acordo com o fluxo mostrado na Figura 6, exons sozinhos foram primeiro amplificados com os pares de iniciadores F1 (SEQ ID NO: 279) / R1 (SEQ ID NO: 280), F2 (SEQ ID NO: 281) / R2 (SEQ ID NO: 282), F3 (SEQ ID NO: 283) / R3 (SEQ ID NO: 284), F4 (SEQ ID NO: 285) / R4 (SEQ ID NO: 286), F5 (SEQ ID NO: 287) / R5 (SEQ ID NO: 288) e F6 (SEQ ID NO: 289) / R6 (SEQ ID NO: 290), obtendo-se assim seis fragmentos. Em seguida, amplificação foi realizada com estes fragmentos como modelos usando pares de iniciadores de F1/R2, F3/R4 e F5/R6, obtendo-se assim fragmentos mais longos. Adicionalmente, através da repetição de amplificação usando pares de iniciadores de F1/R4 e F1/R6, cDNA, que não contêm íntrons do polinucleotídeo do acima mencionado P450-2 foi preparado. Este fragmento de cDNA foi inserido em pCR-Blunt (Invitorogen, Cat No. K2700-20.) e o plasmídeo obtido foi usado como um modelo para a amplificação por um par de iniciadores, infusão F de P450-2-cDNA (SEQ ID NO: 291 )/ infusão R de P450-2-cDNA (SEQ ID NO: 292). Com base no manual de instruções do kit, um plasmídeo pPP3 mostrado na Figura 7 foi obtido usando In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit (Clontech). (4) Preparação de cada Plasmídeo pPP6, pPP7 e pPP9
[0162] Usando vetor pUSA-HSG para a transformação do fungo filamentoso obtido no Exemplo acima mencionado 11 (1), cada um dos seguintes plasmídeos nomeadamente pPP6 e pPP7, e pPP9 foi obtido. 1) Preparação do plasmídeo pPP6 (UbiA PT)
[0163] Com fosmídeo pCC1-PP1 como um modelo, o polinucleotídeo acima mencionado UbiA PT foi cada amplificado usando UbiA PT F com Kpn (SEQ ID NO: 293) e UbiA PT R com Swa (SEQ ID NO: 294). Um fragmento de DNA purificado foi clonado num vetor de fragmentos de PCR, PCR-Blunt (Invitorogen, Cat. No. K2700- 20). O plasmídeo obtido foi digerido com KpnI e SwaI. Depois de cada fragmento ser purificado, foi ligado entre o KpnI e os sítios SmaI do vetor de fungo filamentoso acima descrito pUSA-HSG, obtendo-se assim um plasmídeo pPP6 mostrado na Figura 12. 2) Preparação de plasmídeo pPP7 (AT)
[0164] Com fosmídeo pCC1-PP1 como um modelo, o polinucleotídeo de AT foi cada amplificado usando um par de iniciadores AT F com Swa (SEQ ID NO: 295) e em AT R com Kpn (SEQ ID NO: 296). Um fragmento purificado foi clonado em um vetor de fragmentos de PCR, PCR-Blunt (Invitorogen, Cat. No. K2700-20). O plasmídeo obtido foi digerido com KpnI e SwaI. Cada fragmento foi ligado entre o KpnI e os sítios SmaI do vetor de fungo filamentoso acima mencionado pUSA-HSG, obtendo-se assim um plasmídeo pPP7 mostrado na Figura 12. 3) Preparação de plasmídeo pPP9 (AT-2)
[0165] Com fosmídeo pCC1-PP1 como um modelo, o fragmento de Toxina foi amplificado usando um par de iniciador de infusão F de Toxina (SEQ ID NO: 297) e infusão R de toxina (SEQ ID NO: 298), e inserido entre o KpnI e os sítios SmaI do vetor de fungo filamentoso acima descrito pUSA-HSG usando In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit (fabricado por Clontech, cat. No. 639.619), com base no manual de instruções do kit, obtendo-se assim um plasmídeo pPP9 mostrado na Figura 12. (5) Obtenção de Transformante de Aspergillus Oryzae (A. Oryzae)
[0166] Em um meio de agar de CD-Met (contendo L-Metionina 40 μg/ml), A. Oryzae (cepa HL-1105) foi cultivado em 30 °C durante uma semana. A partir desta placa de Petri, conídios (> 108) foram coletados e semeados em 100 ml de meio YPD líquido em um balão de 500 ml. Após 20 horas de cultura-(30°C, 180 rpm), células fúngicas com uma forma de bola de musgo foram obtidas. As células fúngicas foram recolhidas com um filtro de 3G-1 de vidro, lavadas com 0,8 M de NaCl, e a água foi bem removida. O resultante foi suspenso com solução I TF (solução de formação de protoplasto) e, em seguida, agitado a 30°C, a 60 rpm durante 2 horas. Em um intervalo de 30 minutos, a observação ao microscópio foi realizada e a presença de protoplastos foi verificada. Depois disso, o meio de cultura foi filtrado e submetido a centrifugação (2000 rpm, 5 minutos) para coletar protoplastos, que foram então lavados com solução II TF. Após a lavagem, volume de 0,8 de solução II TF e volume 0,2 de solução III TF foram adicionados e misturados, obtendo-se assim uma suspensão de protoplastos.
[0167] Para 200 μl desta suspensão, 10 μg de DNA de plasmídeo (pPP2 ou pPP3) foram adicionados. A mistura foi deixada em repouso em gelo por 30 minutos e adicionou-se solução III TF (1 mL). A mistura resultante foi misturada suavemente e, em seguida, deixada repousar à temperatura ambiente durante 15 minutos. Depois disso, o DNA de plasmídeo foi introduzido nos protoplastos acima mencionados. Para isso, solução II TF (8 mL) foi adicionada e submetida a centrifugação (a 2000 rpm durante 5 minutos). Além disso, os protoplastos foram então recuperado com 1 a 2 ml sendo deixado. A solução de protoplastos recuperada foi colocada em um meio de regeneração (camada inferior) e um meio de regeneração (camada superior) foi vertido. O resultante foi misturado virando uma placa de Petri e, em seguida, cultivados a 30 ° C durante 4 a 5 dias. Clones gerados foram isoladas no meio de regeneração (camada inferior), subcultivados e purificados, obtendo-se assim um transformante (Aspergillus oryzae PP2-1 e Aspergillus oryzae PP3-2).
[0168] Com base no método descrito no exemplo acima mencionado 11 (5), os transformantes em que cada um dos DNAs de plasmídeo (pPP6, pPP7 e pPP9) foram introduzidos foram obtidos (Aspergillus oryzae PP6, Aspergillus oryzae PP7 e Aspergillus oryzae PP9).
[0169] A solução I TF acima mencionada(solução de formação de protoplasto) foi preparada com as seguintes composições.
Figure img0004
[0170] Após as composições acima mencionadas (pH 5,5) serem preparadas, esterilização por filtro foi realizada.
[0171] A solução II TF acima composições.
Figure img0005
[0172] Água foi ainda adicionada para manter a um volume total de 200 ml.
[0173] Após as composições acima mencionadas serem preparadas, esterilização na autoclave foi realizada.
[0174] A solução III TF acima mencionada foi preparada com as seguintes composições:
Figure img0006
Figure img0007
[0175] Água foi ainda adicionada para manter um volume total de 10 ml.
[0176] Após as composições acima mencionadas serem preparadas, esterilização por filtro foi realizada.
[0177] O meio de regeneração acima mencionado foi preparado com as composições seguintes.
Figure img0008
[0178] Água foi ainda adicionada para manter um volume total de 1L.
[0179] Após as composições acima mencionadas (pH 5,5) serem preparadas, esterilização por autoclave foi realizada.
[0180] Além disso, a solução de elementos traço usada acima foi preparada com a seguinte composição.
[0181] Nome do Composto Quantidade
[0182] FeSO4.7H2O 1,0g
[0183] ZnSO4.7H2O 8,8g
[0184] CuSO4.5 H2O 0,4g
[0185] Na2B4O7.10H2O 0,1g
[0186] (NH4)6Mo7O24.4H2O 0,05g
[0187] Água foi ainda adicionada para manter um volume total de 1L.
[0188] Após as composições acima mencionada serem preparadas, esterilização por autoclave foi realizada. (6) Análise de Função e Teste de Cultura Adicional de P450-1
[0189] A um meio YPD (1% (p / v) extrato de levedura, 2% (p / v) de peptona, 2% (p / v) Dextrose) contendo 1% (p / v) de maltose, um volume 1/100 de 2 mg / mL de solução de dimetil sulfóxido de piripiropeno E foi adicionado para proporcionar meio A. Da flora de Aspergillus oryzae PP2-1 cultivada em meio de agar Czapek Dox, conídios do mesmo foram coletados e suspensos em água esterilizada. Esta suspensão de conídios foi ajustada para 104 esporos / mL. Além disso, 100 μL desta suspensão de conídios ajustada foi adicionada a 10 mL de meio A e cultivada com agitação a 25 ° C durante 96 horas. A esta solução de cultura, 10 mL de acetona foi adicionada e a mistura foi bem misturada. Posteriormente, a acetona foi removida usando um concentrador centrífugo. Para isso, 10 mL de acetato de etila foram adicionados e a mistura resultante foi bem misturada e, em seguida, apenas a camada de acetato de etila foi recuperada. Um produto seco obtido por remoção de acetato de etila usando o concentrador centrífugo foi dissolvido em 1000 μL de metanol. Este foi utilizado como uma amostra e analisado por LC-MS (Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, 2695 módulo de separação, Coluna: Waters XTerra C18 (Φ4,5 * 50 mm, 5 um)) e LC-RMN (fabricado por Burker Daltonik, Avance500).
[0190] Como os resultados da medição acima mencionada de LC-MS, foi confirmado que o composto obtido foi único composto A, que aumentou por um peso molecular de 16 em comparação com piripiropeno E. Além disso, como os resultados da medição de LC-RMN, confirmou-se que este composto A foi um hidróxido de posição 11 de piripiropeno E. Foi confirmado que o citocromo P450 monoxigenase (1) acima mencionado tinha uma atividade de hidroxilase da posição 11 de piripiropeno E. com piripiropeno E. como um substrato.
[0191] Propriedades físico-químicas do Composto A acima mencionado, são apresentadas abaixo: 1. Espectro de massa: ES-MS 468m / z (M + H) + 2. Fórmula molecular: C27H33NO6 3. HPLC: Coluna: coluna Waters C18 XTerra (5 μm, 4,6 mm x 50 mm), 40°C, Fase móvel: A partir de solução de acetonitrila aquosa a 20% a 100% de acetonitrila em 10 minutos (gradiente linear), taxa de fluxo: 0,8 ml / min, Detecção: tempo de retenção 6,696 minutos a UV 323 nm 4. Espectro 1H-NMR (CD3CN, 2H: 3,134, 3,157 H-11)
[0192] Os gráficos do espectro 1H-NMR de piripiropeno E e espectro 1H-NMR de acordo com a 4 acima mencionada são mostrados na Figura 8 e Figura 9, respectivamente. (7) Análise de Função e Teste de Cultura Adicional de P450-2
[0193] A um meio YPD (1% (p / v) extrato de levedura, 2% (p / v) de peptona, 2% (p / v) Dextrose) contendo 1% (p / v) maltose, um volume 1/100 de 2 mg / mL de solução de sulfóxido de dimetila de piripiropeno E foi adicionado para fornecer meio A e, similarmente, um volume 1/100 de solução de sulfóxido de dimetila 2 mg/mL de piripiropeno O foi adicionado para fornecer meio B. Da flora de Aspergillus oryzae PP3-2 cultivados em meio de ágar Czapek Dox, conídios do mesmo foram coletados e suspensos em água esterilizada. Esta suspensão de conídios foi ajustada para 104 esporos / mL. Além disso, 500 μL da suspensão de conídios ajustada foi adicionada a 50 mL de meio A ou meio B e cultivadas com agitação a 25 ° C durante 96 horas. A esta solução de cultura, 50 mL de acetona foi adicionado e a mistura foi bem misturada. Posteriormente, a acetona foi removida usando um concentrador centrífugo. Para isso, 50 mL de acetato de etila foram adicionados e a mistura resultante foi bem misturada e então, apenas a camada de acetato de etila foi recuperada. Um produto seco obtido por remoção de acetato de etila usando o concentrador centrífugo foi dissolvido em 1500 μL de metanol. Este foi utilizado como uma amostra e analisado por LC-MS (fabricado por Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, 2695 módulo de separação, coluna: Waters XTerra C18 (Φ4,5 * 50 mm, 5 um)) e LC- NMR (fabricado por Burker Daltonik, Avance500). Como os resultados da medição LC-MS, a partir de uma amostra obtida a partir do meio A, Composto B o qual aumentou por um peso molecular de 32 em comparação com o piripiropeno E foi detectado. Além disso, a partir de uma amostra obtida a partir do meio B, Composto C que aumentou por um peso molecular de 32 em comparação com piripiropeno O foi detectado. Além disso, como os resultados da medição LC-NMR, foi confirmado que o Composto C foi um hidróxido de posição 7 e posição 13 de piripiropeno O. Foi confirmado que o Citocromo P450 monoxigenase (2) acima mencionado tinha uma atividade de hidroxilase da posição 7 e posição 13 de cada um de piripiropeno E ou piripiropeno O.
[0194] Propriedades físico-químicas do Composto B acima mencionado são mostradas abaixo: 1. Espectro de massa: ES-MS 484M / Z (M + H) + 2. Fórmula molecular: C27H33NO7 3. HPLC: Coluna: coluna Waters C18 XTerra (5 mm, 4,6 mm x 50 mm), 40°C, Fase móvel: De solução aquosa de acetonitrila a 20% a 100% de acetonitrila em 10 minutos (gradiente linear), taxa de fluxo: 0,8 ml / min, Detecção: tempo de retenção 5,614 minutos a UV 323 nm
[0195] Propriedades físico-químicas do Composto C acima mencionado são mostradas abaixo: 1. Espectro de massa: ES-MS 542M / Z (M + H) + 2. Fórmula molecular: C29H35NO9 3. HPLC: Coluna: coluna Waters C18 XTerra (5 mm, 4,6 mm x 50 mm), 40°C, Fase móvel: Da solução aquosa de acetonitrila a 20% a 100% de acetonitrila em 10 minutos (gradiente linear), taxa de fluxo: 0,8 ml / min, Detecção: tempo de retenção 5,165 minutos, a UV 323 nm 4. Espectro 1H-NMR (CD3CN, 1H 4,858 H-13), (CD3CN, 1H 3,65 H-7)
[0196] Os gráficos do espectro 1H-NMR de piripiropeno O e o composto C acima mencionado são mostrados na Figura 10 e Figura 11, respectivamente. (8) Análise de Função e Teste de Cultura Adicional de Preniltransferase
[0197] A um meio YPD (1% (p / v) extrato de levedura, 2% (p / v) de peptona, 2% (p / v) Dextrose) contendo 1% (p / v) maltose, um volume 1/100 de 2 mg / mL de solução de sulfóxido de dimetila do Composto D (4-oxo-6-(3-piridil)-α-pirona, este aplica-se a seguir) (ver Exemplo de Referência 1) foi adicionado para fornecer meio C. Da flora de Aspergillus oryzae PP6 cultivada em meio de ágar Czapek Dox, conídios do mesmo foram coletados e suspensos em água esterilizada. Esta suspensão de conídios foi ajustada para 104 esporos / mL. Além disso, 200 μL desta foi adicionada a 20 mL de meio C e cultivadas com agitação a 25 ° C durante 96 horas. A esta solução cultura, 20 mL de acetona foi adicionado e a mistura foi bem misturada. Posteriormente, a acetona foi removida usando um concentrador centrífugo. Para isso, 20 mL de acetato de etila foi adicionado e a mistura resultante foi bem misturada e, em seguida, apenas a camada de acetato de etila foi recuperada. Um produto seco obtido por remoção de acetato de etila usando o concentrador centrífugo foi dissolvido em 1000 μL de metanol. Este foi utilizado como uma amostra e analisado por LC-MS (Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, 2695 módulo de separação, Coluna: Waters XTerra C18 (Φ4,5 * 50 mm, 5 μm)).
[0198] Tal como os resultados da medição LC-MS, Composto F (4-hidroxi-6- (piridin-3-il) -3 - ((2E, 6E) -3,7,11-trimetildodeca-2, 6 ,10-trienil)-2H-piran-2-ona, este aplica-se a seguir) em que um grupo farnesil é adicionado ao Composto D foi detectado. Foi confirmado que este composto tinha o mesmo tempo de retenção, os picos de íons moleculares e de absorção de UV em LC-MS como o Composto F descrito no Exemplo de Referência 2. A partir disto, confirmou-se que Preniltransferase tinha uma atividade preniltransferase para adicionar o grupo farnesil para o Composto D. (9) Análise de Função e Teste de Cultura Adicional de Acetiltransferase-1
[0199] A um meio YPD (1% (p / v) extrato de levedura, 2% (p / v) de peptona, 2% (p / v) Dextrose) contendo 1% (p / v) maltose, um volume 1/100 de 2 mg / mL de solução de sulfóxido de dimetila de deacetil piripiropeno E (ver Exemplo de Referência 3), foi adicionado para fornecer meio D; um volume 1/100 de 2 / mL mg solução sulfóxido de dimetila de 11-deacetil piripiropeno O (ver Exemplo de Referência 4) foi adicionado para fornecer meio E e 2 mg / mL de solução de sulfóxido de dimetila de 7-deacetil piripiropeno A (ver Exemplo de Referência 5) foi adicionado para fornecer meio F da flora de Aspergillus oryzae PP7 cultivada em meio de agar Czapek Dox, conídios da mesma foram coletados e suspensos em água esterilizada. Esta suspensão de conídios foi ajustada para 104 esporos / mL. Além disso, 200 μL deste foi adicionado a 20 mL de meio de D, meio E, ou meio F e cultivados com agitação a 25 ° C durante 96 horas. A esta solução de cultura, 20 mL de acetona foi adicionado e a mistura foi bem misturada. Posteriormente, a acetona foi removida usando um concentrador centrífugo. Para isso, 20 mL de acetato de etila foram adicionados e a mistura resultante foi bem misturada e, em seguida, apenas a camada de acetato de etila foi recuperada. Um produto seco obtido por remoção de acetato de etila usando o concentrador centrífugo foi dissolvido em 1000 μL de metanol. Este foi usado como uma amostra e analisado por LC-MS (Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, 2695 módulo de separação, Coluna: Waters XTerra C18 (Φ4,5 * 50 mm, 5 μm)).
[0200] Tal como os resultados da medição LC-MS, um composto único que aumentou um peso molecular de 42 em comparação com o deacetil piripiropeno E foi detectado a partir do meio D. Foi confirmado que o composto tinha o mesmo tempo de retenção, os picos de íons moleculares e de absorção de UV como piripiropeno E (ver Exemplo de Referência 6). Entretanto, nenhum composto recém-gerado foi detectado a partir do meio de E e meio F. A partir deste meio, foi confirmado que Acetiltransferase-1 tinha uma atividade acetiltransferase cujo acetilado especificamente, a posição 1 do deacetil piripiropeno E. (10) Análise de Função e Teste de Cultura Adicional de Acetiltransferase-2
[0201] A um meio YPD (1% (p / v) extrato de levedura, 2% (p / v) de peptona, 2% (p / v) Dextrose) contendo 1% (p / v) maltose, um volume 1/100 de 2 mg / mL de solução de sulfóxido de dimetila de deacetil piripiropeno E (ver Exemplo de Referência 3), foi adicionado para fornecer meio D; um volume 1/100 de 2 / mL mg solução sulfóxido de dimetila de 11-deacetil piripiropeno O (ver Exemplo de Referência 4) foi adicionado para fornecer meio E e 2 mg / mL de solução de sulfóxido de dimetila de 7-deacetil piripiropeno A (ver Exemplo de Referência 5) foi adicionado para fornecer meio F. Da flora de Aspergillus oryzae PP9 cultivada em meio de agar Czapek Dox, conídios da mesma foram coletados e suspensos em água esterilizada. Esta suspensão de conídios foi ajustada para 104 esporos / mL. Além disso, 200 μL deste foram adicionados a 20 mL de meio de D, meio E, ou meio F e cultivadas com agitação a 25 ° C durante 96 horas. A esta solução cultura, 20 mL de acetona foi adicionada e a mistura foi bem misturada. Posteriormente, a acetona foi removida usando um concentrador centrífugo. Para isso, 20 mL de acetato de etila foram adicionados e a mistura resultante foi bem misturada e, em seguida, apenas a camada de acetato de etila foi recuperada. Um produto seco obtido por remoção de acetato de etila usando o concentrador centrífugo foi dissolvido em 1000 μL de metanol. Este foi utilizado como uma amostra e analisado por LC-MS (Waters, Micromass ZQ, 2996PDA, 2695 módulo de separação, Coluna: Waters XTerra C18 (Φ4.5 * 50 mm, 5 mm)).
[0202] Tal como os resultados da medição de LC-MS, um composto único que aumentou um peso molecular de 42 em comparação com 11-deacetil piripiropeno O foi detectado a partir mo meio E. Foi confirmado que este composto tinha o mesmo tempo de retenção, picos de íon molecular e de absorção de UV como piripiropeno O (ver Exemplo de Referência 7). Além disso, um composto único que aumentou um peso molecular de 42 em comparação com 7-deacetil piripiropeno A foi detectado a partir do meio F. Foi confirmado que o composto tinha o mesmo tempo de retenção, os picos de íons moleculares e de absorção de UV como piripiropeno A (ver referência Exemplo 8). Entretanto, nenhum composto recém-gerado foi detectado a partir do meio D. A partir disto, confirmou-se que Acetiltransferase-2 têm uma atividade de acetiltransferase cujo acetilado especificamente, a posição 11 do 11-deacetil piripiropeno O e posição 7 de 7-deacetil piripiropeno A. Exemplo de Referência 1: Síntese do Composto D (4-oxo-6-(3-piridil)-α-pirona)
[0203] O composto D acima mencionado foi obtido pelo método descrito em J. Org. Chem. Chem. 1983. 48. 3945. Exemplo de Referência 2: Análise de obtenção e estrutural de Composto F (4-hidroxi- 6-(piridin-3-il) -3 - ((2E, 6E) -3,7,11-trimetildodeca-2, 6, 10-trienil)-2H-piran-2-ona)
[0204] Um caldo de cultura contendo piripiropenos obtido pelo método descrito em Journal of Technical Disclosure 500997/2008 (Documento de Patente 3), foi extraído com acetato de butila e depois filtrado usando Celite. Celite (2,5 g) usado durante a filtração foi removido e metanol (30 mL) foi adicionado. O resultante foi agitado à temperatura ambiente durante 23 horas. Matéria insolúvel foi removida por filtração e o metanol foi evaporado sob pressão reduzida, obtendo-se assim Composto F (191 mg).
[0205] ESI-MS, 394 m / z (M + H) +
[0206] 1H-NMR (DMSO) δ (ppm) 1,48 (3H, s), 1,51 (3H, s), 1,55 (3H, s), 1,69 (3H, s), 1,85 (2H, t, J = 7,5 Hz), 1,91-1,95 (4H, m), 2,01 (2H, dt, J = 6,9, 6,9 Hz), 3,03 (2H, d, J = 7,1 Hz), 4,98 (1H, t, J = 7,0 Hz), 5,02 (1H , t, J = 6,9 Hz), 5,13 (1H, t, J = 7,0 Hz), 6,75 (1H, s), 7,54 (1H, dd, J = 4,8, 8,2 Hz), 8,09 (1H, ddd, J = 1,4, 1,9, 8,2 Hz), 8,66 (1H, dd, J = 1,4, 4,8 Hz), 8,91 (1H, d, J = 1,9 Hz) Referência Exemplo 3: Síntese e Análise Estrutural de deacetil piripiropeno E
[0207] Piripiropeno E (29 mg) foi dissolvido em metanol-água (19:01, 1 ml) e carbonato de potássio (53 mg) foi adicionado ao mesmo. O resultante foi agitado durante 44 horas. Em seguida, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida e um solvente misto de clorofórmio-metanol (10:1) foi adicionado. Matéria insolúvel foi removida por filtração e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida, obtendo-se assim um produto em bruto. O produto bruto foi purificado por cromatografia em camada fina preparativa (sílica gel Merck 60F254, 0,5 mm, clorofórmio: metanol = 10:1), obtendo-se assim deacetil piripiropeno E (18 mg).
[0208] ESI-MS, 410 m / z (M + H) +
[0209] 1H-NMR (CDCl3) δ (ppm) 0,82 (3H, s), 0,92 (3H, s), 1,00-1,03 (1H, m), 1,04 (3H, s), 1,12 (1H, dt, J = 4,0, 13,2 Hz), 1,27 (3H, s), 1,41-1,53 (2H, m), 1,59-1,75 (3H, m), 1,80-1,84 (2H, m), 2,15 (1H, dt, J = 3,2, 12,4 Hz ), 2,18-2,29 (1H, m), 2,54 (1H, dd, J = 3,2, 17,6 Hz), 3,25 (1H, dd, J = 4,4, 11,2 Hz), 6,43 (1H, s), 7,39 (1H, dd, J = 4,8, 8,0 Hz), 8,11 (1H, d, J = 8,0 Hz), 8,65 (1H, d, J = 4,8 Hz), 8,99 (1H, d, J = 1,6 Hz)
Referência Exemplo 4: Síntese e Análise Estrutural de 11-deacetil Piripiropeno O
[0210] Piripiropeno O (30 mg) foi dissolvido em metanol-água (19:01, 2 mL) e carbonato de potássio (20 mg) foi adicionado a este. O resultante foi agitado durante 22 horas, e, posteriormente, ácido acético (0,1 mL) foi adicionado e solvente foi evaporado sob pressão reduzida. Acetato de etila e água foram adicionados e, em seguida, extração foi realizada com acetato de etila. A camada de acetato de etila foi lavada com solução saturada de cloreto de sódio e secou-se com sulfato de sódio anidro. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, obtendo-se assim um produto bruto de 1,11-dideacetil piripiropeno O (30 mg).
[0211] O produto bruto de 1,11-dideacetil piripiropeno O (23 mg) foi dissolvido em N, N-dimetilformamida (0,4 mL) e trietilamina (8 mg) e anidrido de ácido acético (7 mg) foram adicionados ao mesmo. Depois, a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 23 horas, foi adicionada água e depois extração foi realizada com acetato de etila. A camada de acetato de etila foi lavada com solução saturada de cloreto de sódio e secou-se com sulfato de magnésio anidro. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, obtendo-se assim um produto bruto de 1-deacetil piripiropeno O (28 mg).
[0212] O produto bruto de 1-deacetil piripiropeno O (28 mg) foi dissolvido em tolueno e 1,8-diazabiciclo [5,4,0]-7-undeceno (20 mg) foi adicionado. A mistura foi agitada a 70 °C durante 20 horas e deixada para resfriar. Acetato de etila e água foram adicionados e, em seguida, extração foi realizada com acetato de etila. A camada de acetato de etila foi lavada com solução saturada de cloreto de sódio e secou-se com sulfato de magnésio anidro. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, obtendo- se assim um produto bruto de 11-deacetil piripiropeno O (20 mg).
[0213] Após dissolvido em metanol, este foi utilizado como uma amostra e HPLC (fabricado por Shimadzu, LC-6AD, SPD-M20A PDA, CBM-20A, Coluna; XTerra Waters C18 (Φ4,5 * 50 mm, 5 mm, fase móvel 30 % de solução de acetonitrila aquosa a solução de acetonitrila 55% aquosa em 25 minutos (gradiente linear), taxa de fluxo: 1,0 ml / min, tempo de retenção de 18 a 19 minutos) foi repetido para separação preparativa, obtendo-se assim 11-deacetil piripiropeno O (4,0 mg).
[0214] ESI-MS, 468 m / z (M + H) +
[0215] 1H-NMR (CDCl3) δ (ppm); 0,68 (3H, s), 0,95 (3H, s), 1,21-2,21 (10H, m), 1,25 (3H, s), 2,05 (3H, s), 2,20 ( 1H, dd, J = 4,63, 17,3 Hz), 2,50 (1H, dd, J = 4,63, 17,3 Hz), 2,94 (1H, d, J = 12,5 Hz), 3,33 (1H, d, J = 12,5 Hz), 4,87 (1H, dd, J = 4,6, 12,2 Hz), 6,48 (1H, s), 7,57 (1H, dd, J = 5,1, 8,1 Hz), 8,29 (1H, d, J = 8,3 Hz), 8,68 (1H , d, J = 4,6 Hz), 9,04 (1H, s)
Exemplo de Referência 5: Síntese de 7-deacetil Piripiropeno A
[0216] 7-deacetil piripiropeno A foi sintetizado pelo método descrito na Publicação de Patente Japonesa disponível ao público No. 259569/1996.
Exemplo de Referência 6: Obtenção de Piripiropeno E
[0217] Piripiropeno E foi obtido pelo método descrito na Publicação de Patente Japonesa disponível ao público No. 239385/1996
Exemplo de Referência 7: Obtenção de Piripiropeno O
[0218] Piripiropeno O foi obtido pelo método descrito em J. Antibiot. 1996, 49, 292. Exemplo de Referência 8: Síntese de piripiropeno A
[0219] Piripiropeno A foi obtido pelo método descrito em WO94/09147. [Números de Acesso]
[0220] FERM BP-11133
[0221] FERM BP-11.137
[0222] FERM BP-11.141
[0223] FERM BP-11218
[0224] FERM BP-11219
[0225] FERM BP-11220

Claims (4)

1. Método para produzir piripiropeno A, caracterizado pelo fato de compreender a cultura de um microorganismo pertencendo ao gênero Aspergillus na presença de piripiropeno E para produzir piripiropeno A e isolando piripiropeno A, em que dito microorganismo é transformado com pelo menos um polinucleotídeo heterólogo em (I) abaixo, ou um vetor recombinante compreendendo dito polinucleotídeo heterólogo: (1) um polinucleotídeo heterólogo tendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das sequências de nucleotídeo em (a) a (b) abaixo: (a) a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266, (b) a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 266 em que um a quatro nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados.
2. Método para produzir piripiropeno A, caracterizado pelo fato de compreender a cultura de um microorganismo pertencendo ao gênero Aspergillus na presença de piripiropeno E para produzir piripiropeno A e isolar o piripiropeno A, em que dito microorganismo é transformado com pelo menos um polinucleotídeo heterologo em (I) abaixo ou um vetor recombinante compreendendo dito polinucleotídeo heterologo: (1) um polinucleotídeo heterólogo tendo uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleotídeo em (1) a (2) abaixo: (1) a sequência de nucleotídeo compreendendo (a) a (c) abaixo: (a) uma sequência de nucleotídeo compreendendo posições 13.266 a 15.144 da sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, (b) uma sequência de nucleotídeo compreendendo posições 16.220 a 18.018 da sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, e (c) uma sequência de nucleotídeo compreendendo posições 25.824 a 27.178 da sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, (2) a sequência de nucleotídeo em (1) em que um a quatro nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados.
3. Método para produzir piripiropeno A, caracterizado pelo fato de compreender a cultura de um microorganismo pertencendo ao gênero Aspergillus na presença de deacetil piripiropeno E para produzir piripiropeno A e isolar o piripiropeno A, em que dito microorganismo é transformado com pelo menos um polinucleotídeo heterologo em (I) abaixo ou um vetor recombinante compreendendo dito polinucleotídeo heterologo: (1) um polinucleotídeo heterólogo tendo uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleotídeo em (1) a (2) abaixo: (2) a sequência de nucleotídeo compreendendo (a) a (d) abaixo: (a) uma sequência de nucleotídeo compreendendo posições 13.266 a 15.144 da sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, (b) uma sequência de nucleotídeo compreendendo posições 16.220 a 18.018 da sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, (c) uma sequência de nucleotídeo compreendendo posições 23.205 a 24773 da sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, e (d) uma sequência de nucleotídeo compreendendo posições 25.824 a 27.178 da sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, (3) a sequência de nucleotídeo em (1) em que um a quatro nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados.
4. Método para produzir 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11- trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-pirano-2-ona, caracterizado pelo fato de compreender a cultura de um microorganismo pertencendo ao gênero Aspergillus na presença de 4-oxo-6-(3-piridil)-α-pirona e isolando 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E, 6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-pirano-2-ona para produzir 4-hidroxi-6- (piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2-ona e isolar o 4-hidroxi-6-(piridin-3-il)-3-((2E,6E)-3,7,11-trimetildodeca-2,6,10-trienil)-2H-piran-2- ona, em que dito microorganismo é transformado com pelo menos um polinucleotídeo heterólogo em (I) abaixo ou um vetor recombinante compreendendo dito polinucleotídeo heterólogo: (I) um polinucleotídeo heterólogo tendo uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo das sequências de nucleotídeo em (1) a (2) abaixo: (1) uma sequência de nucleotídeo compreendendo posições 21793 a 22877 da sequência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 266, (2) a sequência de nucleotídeo em (1) em que um a quatro nucleotídeos são suprimidos, substituídos, inseridos ou adicionados.
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