JP6445884B2

JP6445884B2 - 抗菌物質

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Publication number: JP6445884B2
Application number: JP2015017626A
Authority: JP
Inventors: 靖智篠原; 増田　郁子; 郁子増田
Original assignee: 公益財団法人野田産業科学研究所
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2015-01-30
Publication date: 2018-12-26
Anticipated expiration: 2035-01-30
Also published as: JP2016140291A

Description

本発明は、麹菌の抗菌物質生合成に関与する蛋白質、該蛋白質の発現を制御する転写制御因子蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、及び麹菌の該化合物産生性を制御する方法等に関する。より詳細には、乳酸菌等の微生物の増殖を抑制する作用を有する抗菌物質（ヘプテリジック酸）の生合成に関与する蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子の転写を正に制御する転写制御因子蛋白質、及び該転写制御因子をコードする遺伝子の発現を促進又は抑制することにより当該抗菌物質の産生を制御する方法等に関する。

アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）及びアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅ）等の麹菌は、様々な酵素類（蛋白質加水分解酵素、アミラーゼ類等）を産生・分泌し、その優れた澱粉糖化能力及び蛋白質分解力等により、醤油、酒、味噌などの醸造食品の製造に工業的に用いられている。

近年の麹菌（アスペルギルス・オリゼ）の全ゲノム配列の決定やマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析などの進展に伴い、遺伝子工学的な改変、特に、染色体レベルの改変により酵素等の生産性や増殖速度の改良などの効果が期待される糸状菌である。また、アスペルギルス・オリゼには、二次代謝産物生合成の基本骨格を形成する遺伝子（バックボーン遺伝子）が多く存在することが明らかになっている（例えば、非特許文献１参照）。

実際に、アスペルギルス・オリゼは、上記のような醸造食品の製造に用いられるのみならず、フェリクロームなど産業的にも非常に重要な低分子化合物の生産能を有することが知られている（例えば、特許文献１参照）。また、アスペルギルス・オリゼを用いて、これら低分子化合物の産生を増大させる方法が報告されている（例えば、特許文献２参照）。

醤油醸造では麹菌以外にも乳酸菌等の微生物が醸造に関与しており、麹造りの際に麹菌が産生する抗菌活性を有する低分子化合物は、これらの微生物の生育に影響を及ぼす。従って、醤油醸造においては、抗菌活性を有する低分子化合物の産生を制御することが醤油の品質の安定化に寄与する。

Ｋｈａｌｄｉｅｔａｌ. （２０１０）ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔＢｉｏｌ. ４７, ７３６−７４１

特開２００２−３６０２６２号公報特開２０１３−０１７４０８号公報

乳酸菌増殖抑制活性を有する抗菌物質を麹菌の代謝産物より見出すとともに、該抗菌物質の生産に関与する新たな遺伝子を同定し、麹菌等の微生物の該化合物生産性を制御する新規な手段を提供することにある。

前記目的の達成のために、種々の検討を行った結果、アスペルギルス・オリゼ等の麹菌がヘプテリジック酸の生合成能を有することを初めて発見するとともに、その培養物から単離した抗菌物質ヘプテリジック酸が各種乳酸菌に対して増殖抑制作用を有していることを見出した。

さらに、アスペルギルス・オリゼのゲノム情報、及び遺伝子組み換え技術を活用することで、ヘプテリジック酸の生合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子（ＸＭ＿００１８２５９９４．２）、及び該遺伝子の発現を正に制御する転写制御因子をコードする遺伝子（ＸＭ＿００１８２６００１．２）を明らかとし、麹菌において該転写制御因子をコードする遺伝子の発現を制御することによって該化合物の生産量を制御することができること等を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の各態様に係わる。
［態様１］
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質。
［態様２］
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、セスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、セスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［態様３］
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の転写を正に制御する機能を有する蛋白質。
［態様４］
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ヘプテリジック酸の生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［態様５］
糸状菌における態様１又は３記載の蛋白質、あるいは態様２又は４記載のＤＮＡの発現を阻害又は抑制する工程を含む、ヘプテリジック酸の産生を減少させる方法。
［態様６］
糸状菌における態様３記載の蛋白質又は態様４記載のＤＮＡの発現を促進する工程を含む、ヘプテリジック酸の産生を増大させる方法。
［態様７］
糸状菌における態様２又は４記載のＤＮＡの少なくとも一部を欠失させ、又はその機能を阻害・抑制する工程を含む、ヘプテリジック酸の産生を減少させる方法。
［態様８］
ヘプテリジック酸の産生の消失又は増大のための遺伝子操作が、Ｋｕ遺伝子が破壊された糸状菌の菌株に対して行われる、態様５〜７記載の方法。
［態様９］
態様５若しくは７に記載の方法により得られる、ヘプテリジック酸の産生が消失していることを特徴とする糸状菌。
［態様１０］
態様６記載の方法により得られる、ヘプテリジック酸の産生が増大していることを特徴とする糸状菌。
［態様１１］
態様９又は１０記載の糸状菌を用いることを特徴とする、醸造食品を製造する方法。
［態様１２］
態様１０記載の糸状菌を用いることを特徴とする、ヘプテリジック酸を製造する方法。

アスペルギルス・オリゼの代謝物から単離された抗菌物質（ヘプテリジック酸ＨｅｐｔｅｌｉｄｉｃＡｃｉｄ（以下、「ＨＡ」という場合がある。））は微生物の増殖抑制活性を有することから、これを有効成分として医薬品に用いることで、効果の高い新規な抗菌物質の提供を実現することができる。

また、本発明によって、ＨＡ生合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子が初めて同定された。さらに、該遺伝子の発現を正に制御する転写制御因子をコードする遺伝子も初めて同定された。この結果、ＨＡ生合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子の発現を正に制御する転写制御因子をコードする遺伝子の発現を負に制御しヘプテリジック酸の生産を消失させる、又は転写制御因子をコードする遺伝子を正に制御しヘプテリジック酸の産生量を増大させるなどヘプテリジック酸の産生を人為的に制御することが可能となる。例えば、ヘプテリジック酸産生の正の制御は抗菌物質としてのヘプテリジック酸の産生量の増大に寄与することができる。また、醸造食品の製造においては、ヘプテリジック酸の産生量を増大させた麹菌を用い防黴性の高い麹を作ることや、逆にヘプテリジック酸の産生が減少した麹菌を用いることで使用可能な乳酸菌等の幅を広げるなど、用途に応じて使い分けることで、醤油様調味料等の醸造食品を製造する際の品質向上に寄与することができる。

麹菌アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９及びアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０を用いたしょうゆ諸味中での乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）Ｄ１０及びＮＢＲＣ１２１７２の増殖。アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の小麦製麹抽出物からヘプテリジック酸を単離した際のＨＰＬＣクロマトグラム。矢印は、ヘプテリジック酸のピークを示す。乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスＤ１０を被検菌とした、ペーパーディスク法による分画物の抗菌活性の評価結果を示す写真。乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２及びＤ１０のＨＡに対する感受性を比較したグラフ。ｃｏｎｔｒｏｌ−１株及び各遺伝子破壊株の代謝物のＬＣ−ＭＳのトータルイオンクロマトグラム。ｃｏｎｔｒｏｌ−２株及びｈｅｐＲ強制発現株の代謝物のＬＣ−ＭＳのトータルイオンクロマトグラム。ｃｏｎｔｒｏｌ−２株のＨＡ産生量を基準とした相対的ＨＡ産生量を示すグラフ（ｎ＝３）。リアルタイムＰＣＲによるｈｅｐＲ破壊株及び強制発現株のｈｅｐＡ発現量を比較したグラフ（ｎ＝３）。

１．ヘプテリジック酸の発現及び生産に関連する蛋白質及びＤＮＡ
本発明は、１）ヘプテリジック酸の生合成に関与する蛋白質及び当該蛋白質をコードするＤＮＡ（ＸＭ＿００１８２５９９４．２）；並びに２）ヘプテリジック酸生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質及び当該蛋白質をコードするＤＮＡ（ＸＭ＿００１８２６００１．２）を提供する。

より具体的には、本発明により見出された１）及び２）の蛋白質は、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなり、それぞれヘプテリジック酸の生合成に関与する蛋白質、そして、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質をコードする。１）及び２）の蛋白質はＨＡの生合成に関与することから、本発明では、当該蛋白質をそれぞれ「ＨｅｐＡ」及び「ＨｅｐＲ」と呼ぶ。

本明細書において「ヘプテリジック酸の生合成に関与する蛋白質」とは、微生物におけるヘプテリジック酸の産生量に影響を与え得る蛋白質であって、当該蛋白質をコードする遺伝子の発現量又は当該蛋白質の活性がヘプテリジック酸の産生量と相関し得るものが挙げられる。一例としてセスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質が挙げられる。

さらに、本発明に係る蛋白質には、該蛋白質に加えて、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１個又は数個、例えば２〜５個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列（上記アミノ酸配列と配列相同性を有するアミノ酸配列）からなり、それぞれヘプテリジック酸の生合成に関与する蛋白質、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質も含まれる。

１）及び２）のＤＮＡは、配列番号１又は３で表される塩基配列からなるＤＮＡであり、本発明では、当該ＤＮＡをそれぞれ「ｈｅｐＡ」及び「ｈｅｐＲ」遺伝子と呼ぶ。ここで、「配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ」又は「配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ」には、イントロンを含むゲノム由来のＤＮＡに加えて、アミノ酸をコードする領域のみからなる塩基配列（すなわち、エクソン部分のみが結合された塩基配列）からなるｃＤＮＡも含まれる。

このようなｃＤＮＡは、当業者に公知の任意の方法によって、本明細書に開示の塩基配列情報に基づき調製した適当なプライマーを用いて、麹菌のｍＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等により取得することが可能である。また、本発明のＤＮＡは当業者に公知の任意の方法によって化学合成することも可能である。

さらに、本発明のＤＮＡには、上記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、及び上記ＤＮＡと約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、それぞれヘプテリジック酸の生合成に関与する蛋白質、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡが含まれる。

ここで、ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｎｇｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）、又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄｂｙＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９８７））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。

本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５〜９００ｍＭ、好ましくは１５〜６００ｍＭ、さらに好ましくは１５〜１５０ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることができる。

従って、配列番号１又は３で表される塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることができる。

２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性を決定するために、配列は、比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。

上記の原理に従い、２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４−２２６８、１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７、１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムやＦＡＳＴＡプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。

上記のような塩基配列の配列相同性又はコードするアミノ酸配列の配列相同性を示すようなＤＮＡは、上記のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもでき、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群又は公共データベースの中から、当業者が通常用いている方法により、例えば、前述のＢＬＡＳＴソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。さらに、本発明遺伝子は種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。

本明細書で使用する場合、「相同性」は同一性を指す場合がある。「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つの塩基配列又はアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメントにおける、オーバーラップする全塩基又は全アミノ酸残基に対する、同一塩基又はアミノ酸残基の割合（％）を意味する。好ましくは、当該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方若しくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである。

２．ヘプテリジック酸非生産又は高生産形質転換体及びその用途

実施例で示されるように、ｈｅｐＡ遺伝子（配列番号１）及びｈｅｐＲ遺伝子（配列番号３）をそれぞれ相同組み換えにより破壊した麹菌を作製したところ、ｈｅｐＡの発現が消失又は著しく低下し、その結果、ヘプテリジック酸も生産されなくなることを確認した。

一方、ｈｅｐＲ遺伝子（配列番号３）の発現が増強された麹菌を作製したところ、ｈｅｐＡの発現が増加し、その結果、ヘプテリジック酸の産生量が親株の４倍以上に増加することを確認した。

従って、本発明は、糸状菌におけるｈｅｐＡ及び／又はｈｅｐＲ遺伝子、並びに／あるいはｈｅｐＡ及び／又はｈｅｐＲの発現を阻害又は抑制するか、当該遺伝子の少なくとも一部を欠失させ、又はその機能を阻害・抑制することによって、ヘプテリジック酸の産生を減少させる方法を提供する。本発明は、さらに、糸状菌におけるｈｅｐＲの発現を促進することを含む、ヘプテリジック酸の産生を増大させる方法を提供する。

本発明は、ヘプテリジック酸産生菌の該化合物非生産又は高生産変異体にも係る。本発明に係る変異体の作成に用いることができるヘプテリジック酸産生菌は、ヘプテリジック酸の生産能を有する微生物であれば特に限定されず、あらゆる微生物を用いて、本発明に係る化合物ヘプテリジック等を生産することができる。一例として、麹菌等のアスペルギルス属菌やトリコデルマ属菌などの糸状菌が挙げられる。

このアスペルギルス属菌は、本発明に係る化合物ヘプテリジック酸等の生産能を有するものであれば、特に限定されないが、例えば、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株及びその変異株を好適に用いることができる。

上記のヘプテリジック酸非生産又は高生産変異体は、当業者に公知の任意の相同組み換え等で作製することができる。アスペルギルス菌は相同組換え頻度が低いため、相同組換えで本発明の変異体を作製する場合には、非相同組換えに関与するＫｕ７０及びＫｕ８０等のＫｕ遺伝子が抑制された形質転換菌を使用することが好ましい。

このようなＫｕ遺伝子の抑制は、当業者に公知の任意の方法で実施することができる。例えば、Ｋｕ遺伝子破壊ベクターを使用したＫｕ遺伝子を破壊又は、Ｋｕ遺伝子のアンチセンス発現ベクターを利用するアンチセンスＲＮＡ法によって、Ｋｕ遺伝子を不活化することが可能である。こうして得られる形質転換菌は、このようなＫｕ遺伝子の抑制に関する遺伝子操作が施される前の元の菌と比較して、相同組み換え頻度が顕著に上昇している。具体的には、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも約６０倍上昇している。

このような相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌の例として、特許文献４に記載されているアスペルギルス・ソーヤＡＳＫＵＰＴＲ８株（ｗｈ， ΔｐｙｒＧ，ｋｕ７０：：ｐｔｒＡ）、及び、アスペルギルス・オリゼＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株を上げることができる。なお、アスペルギルス・ソーヤＡＳＫＵＰＴＲ８株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１６年１２月２日付で寄託され、受領番号ＦＥＲＭＰ−２０３１１が付されている。その後、平成１７年１１月１７日付で特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１０４５３が付与されている。

本発明に係るヘプテリジック酸を生産しないか、生産能が低下した変異体、及びヘプテリジック酸を高生産する変異体は、醸造食品を製造する際の品質向上に寄与することができる。本明細書において、醸造食品とは、かかる変異体を用いて製造される、あらゆる醸造食品を意味し、例えば、醤油、酒、味噌などが挙げられる。

ヘプテリジック酸を高生産する変異体の場合、変異体を当業者に公知の任意の方法で培養することにより、より多量のヘプテリジック酸を効率的に取得することができる。例えば、本発明の麹菌を、固体培地若しくは液体培地で培養した培養物からヘプテリジック酸を取得することが可能である。このような生産方法における、培養系・培地の選択、培養温度・時間等の培養条件及び、ヘプテリジック酸の抽出方法は、以下の実施例等を参考に、当業者が適宜設定することができる。

以下、実施例に則して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの記載によって何等制限されるものではない。

なお、以下の実施例における各遺伝子操作の手段・条件等は、特に断わりがない限り、例えば、特開平８−８０１９６号公報等に記載されている当業者に公知の一般的な方法に従い実施した。

＜アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０乳酸菌増殖抑制物質の探索＞
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０を用いてしょうゆ諸味を作成し、乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスＤ１０（以下、Ｄ１０）及びＮＢＲＣ１２１７２（以下、ＮＢＲＣ１２１７２）を植菌して生育を観察する試験を行った。コントロールとしてアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９を用いて作成したしょうゆ諸味についても同様の試験を行った。しょうゆ諸味の作製は、杉山らの方法（ＳｕｇｉｙａｍａＳ. （１９８４）ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ., １, ３３９−３４（７））で行った。乳酸菌は、ＢａｃｔＴｏｄｄＨｅｗｉｔｔ培地（ＢＤＦａｌｃｏｎ社製）にＮａＣｌ濃度が１５％になるように添加した培地（以下、ＢＴＨ１５）で定常期初期まで培養したものを１０⁵ 〜１０⁶ ｃｆｕ/ｍｌ諸味になるように添加した。４日間培養した後、しょうゆ諸味を１５％食塩水を用いて希釈系列を作製し、それをＢＴＨ１５寒天培地に撒いて乳酸菌の生菌数の測定を行った。その結果、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０を用いたしょうゆ諸味中では、ＮＢＲＣ１２１７２は増殖できるが、Ｄ１０は増殖できないことが確認された（図１）。

上述の杉山らの方法において用いる原料の比率を変え、抗菌物質の生産に関与している原料を探った結果、関与しているのは小麦であった。

以上の結果から、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０は、乳酸菌の菌株特異的な何らかの抗菌物質を生産している可能性が考えられたので、次に、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の培養物から抗菌物質の単離・同定を行うこととした。

＜ヘプテリジック酸の単離・精製＞
上述の杉山らの方法において、大豆は使用せずに小麦のみを用いた培地３００ｇにアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の分生子３ｘ１０⁸胞子を植菌し３０℃で２日間培養し、小麦製麹物を調製した。

得られた小麦製麹物２００ｇにアセトンを５５０ｍｌ加え抽出を行い、次いで、アセトン抽出物を減圧濃縮し、分子量分画で３，０００以下の画分をプールした。

得られた画分を凍結乾燥で濃縮し、ＨＰＬＣ（島津製作所社製ＬＣ−８Ａ）に接続したＯＤＳカラム（ナカライテスク社製Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ２０×２５０ｍｍ）に供し分画を行った。

溶離液Ａは、超純水＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、溶離液Ｂは、アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡとし、Ａを１０ｍｉｎアイソクラティックで流した後に、ＡからＢまで５０ｍｉｎのリニアグラジエントで溶出した。流速は２．５ｍｌ／ｍｉｎとし、５ｍｌずつのフラクションを得た。クロマトグラムを図２に示す。

各フラクションを減圧濃縮及び凍結乾燥し、２５０μｌの水に溶解した分画物を用いて抗菌活性の測定を行った。

活性の測定は、ペーパーディスク法を用いて行った。被検菌をＮＢＲＣ１２１７２及びＤ１０とし、それぞれ１０⁶〜１０⁷ｃｆｕ／ｍｌで植菌したＢＴＨ１５培地上に８０μｌの分画物をしみ込ませたディスクフィルター（アドバンテック社製）を置き３０℃で２−３日間培養した後、形成された阻止円を観察した。その結果、アセトニトリル濃度約６０％で溶出されるピークにＮＢＲＣ１２１７２の増殖は阻害せず、Ｄ１０の増殖のみを阻害する活性が見られた。Ｄ１０を被検菌とした測定結果を図３に示す。このＤ１０の阻止円は、ＢＴＨ１５培地でのみ明瞭に形成され、ＢＴＨ５（上述のＢａｃｔＴｏｄｄＨｅｗｉｔｔ培地にＮａＣｌ濃度が５％になるように添加した培地）では形成されなかった。

ＯＤＳカラム後の活性を有するフラクションを−２０℃にて３時間静置した後に、上層のアセトニトリルフラクションを減圧濃縮することで、活性を有する物質を得た。

得られた物質のＮＭＲ解析の結果、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルが、ＣａｌｈｏｕｎＬ. Ａ. ｅｔａｌ. （１９９２）Ｍｙｃｏｌ. Ｒｅｓ. ９６, ２８１−２８６に記載のヘプテリジック酸のスペクトルと一致したことから、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の産生する乳酸菌増殖抑制物質は、ヘプテリジック酸であることが明らかとなった。

アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０が生産する抗菌物質として、ＨＡが同定されたため、ＮＢＲＣ１２１７２及びＤ１０のＨＡに対する感受性を調べた。しょうゆ諸味中のＨＡ濃度を推測したところ、０．０２−０．０４ｍｇ/ｍｌであったため、０．０１５あるいは０．０３０ｍｇ/ｍｌの標準品ＨＡ（コスモ・バイオ社製）を添加したＢＴＨ１５培地２０ｍｌにＮＢＲＣ１２１７２及びＤ１０を１０⁶〜１０⁷ｃｆｕ／ｍｌになるように接種して、生育を観察した。生育はＯＤ６００でモニターした。その結果、ＮＢＲＣ１２１７２は、ＨＡの濃度依存的に生育が遅れる程度であったが、Ｄ１０は、０．０１５ｍｇ／ｍｌのＨＡの存在で、生育が著しく低下し、０．０３０ｍｇ／ｍｌでは生育が阻害された（図４）。

＜ＨＡ生合成遺伝子及び転写制御遺伝子破壊株の作製＞
実施例１の結果から、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０がＨＡの生合成能を有することが明らかとなった。

次に、その生合成に関与する遺伝子クラスターの探索を行うこととした。ＨＡの基本骨格がセスキテルペンであることからセスキテルペンサイクラーゼをコードすると予測される遺伝子の解析を行ったところ、ｈｅｐＡを含むセスキテルペン生合成遺伝子クラスターを見出した。このセスキテルペン生合成遺伝子クラスターには隣接してコードされる転写制御因子（ｈｅｐＲ）が存在していたことから、ｈｅｐＡ及びｈｅｐＲをそれぞれ破壊した株を作製し、ＨＡの産生能を評価した。

以下、ｈｅｐＡの遺伝子破壊断片を作製した方法を具体的に挙げる。

アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のゲノムを鋳型として、ＰｒｉｍｅｒｈｅｐＡのＬＵ（配列番号５）及びＬＬ（配列番号６）を用いて、ｈｅｐＡの上流側配列を含む断片をＰＣＲにより増幅した。

同様に、ｈｅｐＡの下流側配列を含む断片をＰｒｉｍｅｒｈｅｐＡのＲＵ（配列番号７）及びＲＬ（配列番号８）を用いて増幅した。

さらに、選択マーカーｐｙｒＧ遺伝子の断片をＰｒｉｍｅｒＰＵ（配列番号９）及びＰＬ（配列番号１０）で増幅した。

ＰｒｉｍｅｒｈｅｐＡのＬＬ及びＲＵは、上記で増幅したｐｙｒＧ遺伝子断片に相補的な配列を有しているため、これら３つの断片を混合したものを鋳型とし、ｈｅｐＡのＬＵ−２（配列番号１１）及びＲＬ−２（配列番号１２）のプライマーを用いたＰＣＲ反応を行うことにより、３つの断片が融合した１つの断片を得た。

この断片は、ｈｅｐＡの上流及び下流の部分配列がｐｙｒＧ遺伝子の両端に存在する構造をしているため、相同組み換えによる置換破壊を行う遺伝子破壊断片となる。

同様の手順で、ｈｅｐＲの遺伝子破壊断片を調製した。用いたプライマー配列を表１に示す。

こうして得られた遺伝子破壊断片を用いて、アスペルギルス・オリゼＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株（特開２００６−１５８２６９号参照）を宿主とした形質転換を行い、遺伝子破壊株を取得した。

遺伝子破壊の確認は、各遺伝子のＬＵ及びＲＬ（ｈｅｐＡ：配列番号５及び８、ｈｅｐＲ：配列番号１３及び１６）のプライマーを用いたＰＣＲにより、選択マーカーの遺伝子に相当する増幅断片長の変化を指標に行った。

＜ヘプテリジック酸産生量の定性的評価＞
ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株のｐｙｒＧ遺伝子のみを相補した株(ｃｏｎｔｒｏｌ−１株)を対照とし、得られたｈｅｐＡ破壊株（以下、「ΔｈｅｐＡ」という場合がある。）及びｈｅｐＲ破壊株（以下、「ΔｈｅｐＲ」という場合がある。）を、それぞれＭＰＰ液体培地（ｍａｌｔｏｓｅ３．０％, ｍａｌｔｅｘｔｒａｃｔ２．０％, ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ０．２％, ｐＨ７．０）４０ｍｌに４×１０⁷胞子／ｍｌに調整した胞子懸濁液１００μｌを植菌し３０℃で５日間培養した。

培養終了後、菌体をメッシュサイズ７０μｍのセルストレイナー（ＢＤＦａｌｃｏｎ社製）で除去し培養液を得た。次に、この培養液１ｍｌをガラスバイアルに移し、酢酸エチル溶液２ｍｌで抽出を行った。得られた酢酸エチル層（１．６ｍｌ）を遠心濃縮機に供し濃縮乾固させ、１６０μｌのアセトニトリルに再溶解させたものをサンプルとした。

検出は、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析装置）（アジレント社製１１００シリーズ高速液体クロマトグラフィー、及びアプライドバイオシステム社製ＱＳＴＡＲＥｌｉｔｅ質量分析装置）を用いて行った。

分離カラムは、ＯＤＳカラム（財団法人化学物質評価研究機構Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ粒子径５μｍ、内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ）を用い、溶離液は、０．１ｖｏｌ％蟻酸水をＡ液、０．１ｖｏｌ％蟻酸−アセトニトリルをＢ液とし、０分から５分までをＡ液９５％、Ｂ液５％で流し、２５分までにＡ液５％、Ｂ液９５％に達するように濃度勾配をかけ、その後３５分から３６分でＡ液９５％、Ｂ液５％とする方法でサンプル５μｌを分離した。流速は、毎分０．２ｍｌで行った。

質量分析は、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ）をイオン化法として用い、イオンスプレー電圧は５５００Ｖ、ヒーターガス温度は４５０℃、ネブライザーガス（ＧＳ１）は５０ｐｓｉ、ターボガス（ＧＳ２）は５０ｐｓｉ、カーテンガス（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ）は３０ｐｓｉとし、正イオン検出モードより検出した。

その結果、ＨＡ標品(１００μＭ)を用いて同様に測定したスタンダードと対比し、ｃｏｎｔｒｏｌ-１株ではＨＡのピークが確認できるものの、ｈｅｐＡ破壊株及びｈｅｐＲ破壊株はいずれもＨＡのピークが消失していることが明らかとなった。

トータルイオンクロマトグラムを図５に示す。

＜転写制御遺伝子強制発現株の作製＞
実施例２の結果より、転写制御因子（ＨｅｐＲ）はＨＡ生合成遺伝子の転写制御能を有している可能性が強く示唆された。ＨｅｐＲが生合成遺伝子クラスター全体の発現を制御している転写制御因子であるならば、ｈｅｐＲのみを強制発現させるだけで、ＨＡの産生量が増加すると考えられる。そこで、次に、ｈｅｐＲ遺伝子の強制発現株を作製しＨＡ産生能の評価を行った。

ｈｅｐＲ遺伝子を麹菌内で発現させるために用いる発現プラスミドを構築するため、アミラーゼ遺伝子プロモーター及びターミネーター、遺伝子挿入用マルチクローニングサイト、マーカー遺伝子としてアスペルギルス・オリゼｎｉａＤ遺伝子を含むプラスミドｐＡＰＴＬＮ（特開２００８−１６１０６４号参照）を使用した。

以下に、発現用のプラスミドの構築方法を示す。
まず、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株のゲノムを鋳型として、ＰｒｉｍｅｒｈｅｐＲ−ＣｌａＵ（配列番号１９）及びＳｐｅＬ（配列番号２０）を用いて、ｈｅｐＲのＯＲＦ断片をＰＣＲにより増幅した。

ＰＣＲ反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した後、ｐＡＰＴＬＮのマルチクローニングサイト上のＣｌａＩ−ＳｐｅＩ部位にＩｎ-ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、ｈｅｐＲ発現用プラスミドｐＡＰ−ｈｅｐＲを得た。
ライゲーションは、キットの所定のプロトコールに従って行った。

得られたｐＡＰ−ｈｅｐＲを用いて、アスペルギルス・オリゼＲｋｕＡＦＮ株（ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣＣＥＬＬ,（２０１１）１０（７）：９４５−９５５）を宿主とした形質転換を行い、ｈｅｐＲ強制発現株（以下、「ＯＥ−ｈｅｐＲ」という場合がある。）を取得した。

また、コントロールとしてマーカー遺伝子（ｎｉａＤ）のみを相補した形質転換体を得るためにｐＡＰＴＬＮを用いた形質転換も同様に行った。

得られた形質転換体の確認は、プラスミド上のマルチクローニングサイトが増幅されるプライマーｐＡＰ−Ｆ及びｐＡＰ-Ｒ（配列番号２１、２２）を用いたＰＣＲにより、ｈｅｐＲ遺伝子に相当する増幅断片長の変化を指標に行った。

用いたプライマー配列を表２に示す。

ＲｋｕＡＦＮ株のｎｉａＤ遺伝子のみを相補した株(ｃｏｎｔｒｏｌ−２株)及びｈｅｐＲ強制発現株を実施例２と同様の方法で培養、抽出を行いＬＣ／ＭＳによるＨＡ産生量の検討を行った。その結果、ｈｅｐＲ強制発現株は、ｃｏｎｔｏｒｏｌ-２株に比べＨＡ産生量が４倍以上に増加していた。

トータルイオンクロマトグラム、及び実施例２で得られた破壊株の結果も合せたＨＡ産生量の相対値を図６、７にそれぞれ示す。

＜転写制御因子によるＨＡ生合成遺伝子制御能評価＞
ｈｅｐＲ破壊株及び強制発現株におけるｈｅｐＡ遺伝子の発現変動を、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて測定した。実施例２及び３の結果から、ｃｏｎｔｒｏｌ-１株及びｃｏｎｔｒｏｌ-２株のＨＡ産生量に大きな差は見られなかったことから、ｃｏｎｔｒｏｌ-１株のみを対照株とした。

各株をＭＰＰ液体培地４０ｍｌに植菌し３０℃で２日間培養した。

培養後、ろ過により菌体を回収し液体窒素で凍結させ乳鉢と乳棒を用いて破砕した。得られた破砕菌体からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）によるＲＮＡの抽出、ＲＮａｓｅＦｒｅｅＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）によるＤＮＡの分解を行い、最後にＲＮｅａｓｙＭｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた精製によりｔｏｔａｌＲＮＡを得た。各工程は、キットの所定のプロトコールに従って行なった。

得られたｔｏｔａｌＲＮＡ１μｇをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^TM ＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて逆転写しｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを５倍希釈したものを鋳型とし、ＳｙｂｒＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）により定量的リアルタイムＰＣＲを行った。

ｈｅｐＡ遺伝子及び内部標準として、Ｈiｓｔｏｎｅ２Ｂ（Ｈ２Ｂ）遺伝子(ＡＯ０９００２００００００６)を、それぞれ検量線法を用いて測定した。

定量的リアルタイムＰＣＲに使用したプライマーの配列を表１１に記した。

定量的リアルタイムＰＣＲの結果、ｈｅｐＡ遺伝子の発現量は、ＨＡの産生量と高い相関を示しており、ｈｅｐＲ破壊株では発現量がｃｏｎｔｒｏｌ-１株に比べ著しく低下し、強制発現株では４倍以上の発現増加が見られることが明らかとなった（図８）。

以上の結果から、ＨｅｐＲは、ｈｅｐＡ遺伝子の正の転写制御因子であり、ｈｅｐＡ遺伝子の発現制御を介してＨＡの産生を制御していることが強く示唆された。

Claims

糸状菌における以下の（ａ１）又は（ｂ１）の蛋白質：
（ａ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ１）（ａ１）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質、又は
以下の（ａ２）又は（ｂ２）の蛋白質：
（ａ２）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ２）（ａ２）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の転写を正に制御する機能を有する蛋白質、
あるいは
以下の（ａ１）又は（ｂ１）のＤＮＡ：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ１）（ａ１）の塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、セスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は
以下の（ａ２）又は（ｂ２）のＤＮＡ：
（ａ２）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ２）（ａ２）の塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
の発現を阻害又は抑制する工程を含む、ヘプテリジック酸の産生を減少させる方法。
糸状菌における以下の（ａ２）又は（ｂ２）の蛋白質：
（ａ２）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ２）（ａ２）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の転写を正に制御する機能を有する蛋白質、
又は
以下の（ａ２）又は（ｂ２）のＤＮＡ：
（ａ２）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ２）（ａ２）の塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡの発現を促進する工程を含む、ヘプテリジック酸の産生を増大させる方法。
糸状菌における以下の（ａ１）又は（ｂ１）のＤＮＡ：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ１）（ａ１）の塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、セスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
又は
以下の（ａ２）又は（ｂ２）のＤＮＡ：
（ａ２）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ２）（ａ２）の塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡの少なくとも一部を欠失させ、又はその機能を阻害又は抑制する工程を含む、ヘプテリジック酸の産生を減少させる方法。
ヘプテリジック酸の産生の減少又は増大のための遺伝子操作が、Ｋｕ遺伝子が破壊された糸状菌の菌株に対して行われる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
請求項１又は３に記載の方法により得られる、ヘプテリジック酸の産生が減少していることを特徴とする糸状菌。
請求項２記載の方法により得られる、ヘプテリジック酸の産生が増大していることを特徴とする糸状菌。
請求項５又は６記載の糸状菌を用いることを特徴とする、醸造食品を製造する方法。
請求項６記載の糸状菌を用いることを特徴とする、ヘプテリジック酸を製造する方法。