JP2016140291A - 抗菌物質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(a)特定のアミノ酸配列からなる蛋白質のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質、前記酵素DNAの発現を阻害又は抑制する工程を含む、ヘプテリジック酸の産生を制御する方法、該麹菌を用いた醸造食品を製造する方法、及びヘプテリジック酸を製造する方法。
【選択図】図7
Description
[態様1]
以下の(a)又は(b)の蛋白質:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b)(a)のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質。
[態様2]
以下の(a)、(b)又は(c)のDNA:
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるDNA、
(b)(a)の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、セスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA、
(c)(a)の塩基配列からなるDNAと80%以上の配列相同性を示す塩基配列からなるDNAであって、セスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA。
[態様3]
以下の(a)又は(b)の蛋白質:
(a)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b)(a)のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の転写を正に制御する機能を有する蛋白質。
[態様4]
以下の(a)、(b)又は(c)のDNA:
(a)配列番号3で表される塩基配列からなるDNA、
(b)(a)の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、ヘプテリジック酸の生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質をコードするDNA、
(c)(a)の塩基配列からなるDNAと80%以上の配列相同性を示す塩基配列からなるDNAであって、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質をコードするDNA。
[態様5]
糸状菌における態様1又は3記載の蛋白質、あるいは態様2又は4記載のDNAの発現を阻害又は抑制する工程を含む、ヘプテリジック酸の産生を減少させる方法。
[態様6]
糸状菌における態様3記載の蛋白質又は態様4記載のDNAの発現を促進する工程を含む、ヘプテリジック酸の産生を増大させる方法。
[態様7]
糸状菌における態様2又は4記載のDNAの少なくとも一部を欠失させ、又はその機能を阻害・抑制する工程を含む、ヘプテリジック酸の産生を減少させる方法。
[態様8]
ヘプテリジック酸の産生の消失又は増大のための遺伝子操作が、Ku遺伝子が破壊された糸状菌の菌株に対して行われる、態様5〜7記載の方法。
[態様9]
態様5若しくは7に記載の方法により得られる、ヘプテリジック酸の産生が消失していることを特徴とする糸状菌。
[態様10]
態様6記載の方法により得られる、ヘプテリジック酸の産生が増大していることを特徴とする糸状菌。
[態様11]
態様9又は10記載の糸状菌を用いることを特徴とする、醸造食品を製造する方法。
[態様12]
態様10記載の糸状菌を用いることを特徴とする、ヘプテリジック酸を製造する方法。
本発明は、1)ヘプテリジック酸の生合成に関与する蛋白質及び当該蛋白質をコードするDNA(XM_001825994.2);並びに2)ヘプテリジック酸生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質及び当該蛋白質をコードするDNA(XM_001826001.2)を提供する。
アスペルギルス・オリゼ RIB40を用いてしょうゆ諸味を作成し、乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラス D10(以下、D10)及びNBRC12172(以下、NBRC12172)を植菌して生育を観察する試験を行った。コントロールとしてアスペルギルス・ソーヤ NBRC4239を用いて作成したしょうゆ諸味についても同様の試験を行った。しょうゆ諸味の作製は、杉山らの方法(Sugiyama S. (1984) Food Microbiol., 1, 339−34(7))で行った。乳酸菌は、Bact Todd Hewitt培地(BD Falcon社製)にNaCl濃度が15%になるように添加した培地(以下、BTH15)で定常期初期まで培養したものを105 〜106 cfu/ml諸味になるように添加した。4日間培養した後、しょうゆ諸味を15%食塩水を用いて希釈系列を作製し、それをBTH15寒天培地に撒いて乳酸菌の生菌数の測定を行った。その結果、アスペルギルス・オリゼ RIB40を用いたしょうゆ諸味中では、NBRC12172は増殖できるが、D10は増殖できないことが確認された(図1)。
上述の杉山らの方法において、大豆は使用せずに小麦のみを用いた培地300gにアスペルギルス・オリゼ RIB40の分生子3x108胞子を植菌し30℃で2日間培養し、小麦製麹物を調製した。
実施例1の結果から、アスペルギルス・オリゼ RIB40がHAの生合成能を有することが明らかとなった。
RkuN16ptr1株のpyrG遺伝子のみを相補した株(control−1株)を対照とし、得られたhepA破壊株(以下、「ΔhepA」という場合がある。)及びhepR破壊株(以下、「ΔhepR」という場合がある。)を、それぞれMPP液体培地(maltose 3.0%, malt extract 2.0%, polypeptone 0.2%, pH 7.0)40mlに4×107胞子/mlに調整した胞子懸濁液100μlを植菌し30℃で5日間培養した。
実施例2の結果より、転写制御因子(HepR)はHA生合成遺伝子の転写制御能を有している可能性が強く示唆された。HepRが生合成遺伝子クラスター全体の発現を制御している転写制御因子であるならば、hepRのみを強制発現させるだけで、HAの産生量が増加すると考えられる。そこで、次に、hepR遺伝子の強制発現株を作製しHA産生能の評価を行った。
まず、アスペルギルス・オリゼ RIB40株のゲノムを鋳型として、Primer hepR−ClaU(配列番号19)及びSpeL(配列番号20)を用いて、hepRのORF断片をPCRにより増幅した。
ライゲーションは、キットの所定のプロトコールに従って行った。
hepR破壊株及び強制発現株におけるhepA遺伝子の発現変動を、定量的リアルタイムPCRを用いて測定した。実施例2及び3の結果から、control-1株及びcontrol-2株のHA産生量に大きな差は見られなかったことから、control-1株のみを対照株とした。
Claims (12)
- 以下の(a)又は(b)の蛋白質:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b)(a)のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質。 - 以下の(a)、(b)又は(c)のDNA:
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるDNA、
(b)(a)の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、セスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA、
(c)(a)の塩基配列からなるDNAと80%以上の配列相同性を示す塩基配列からなるDNAであって、セスキテルペンサイクラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA。 - 以下の(a)又は(b)の蛋白質:
(a)配列番号4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b)(a)のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の転写を正に制御する機能を有する蛋白質。 - 以下の(a)、(b)又は(c)のDNA:
(a)配列番号3で表される塩基配列からなるDNA、
(b)(a)の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、ヘプテリジック酸の生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質をコードするDNA、
(c)(a)の塩基配列からなるDNAと80%以上の配列相同性を示す塩基配列からなるDNAであって、ヘプテリジック酸生合成遺伝子の発現を正に制御する機能を有する蛋白質をコードするDNA。 - 糸状菌における請求項1又は3記載の蛋白質、あるいは請求項2又は4記載のDNAの発現を阻害又は抑制する工程を含む、ヘプテリジック酸の産生を減少させる方法。
- 糸状菌における請求項3記載の蛋白質又は請求項4記載のDNAの発現を促進する工程を含む、ヘプテリジック酸の産生を増大させる方法。
- 糸状菌における請求項2又は4記載のDNAの少なくとも一部を欠失させ、又はその機能を阻害・抑制する工程を含む、ヘプテリジック酸の産生を減少させる方法。
- ヘプテリジック酸の産生の消失又は増大のための遺伝子操作が、Ku遺伝子が破壊された糸状菌の菌株に対して行われる、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項5若しくは7に記載の方法により得られる、ヘプテリジック酸の産生が消失していることを特徴とする糸状菌。
- 請求項6記載の方法により得られる、ヘプテリジック酸の産生が増大していることを特徴とする糸状菌。
- 請求項9又は10記載の糸状菌を用いることを特徴とする、醸造食品を製造する方法。
- 請求項10記載の糸状菌を用いることを特徴とする、ヘプテリジック酸を製造する方法。
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JPS5677281A (en) * | 1979-11-29 | 1981-06-25 | Sankyo Co Ltd | Antibiotic heptelidic acid and its preparation |
JP2005176602A (ja) * | 2001-12-27 | 2005-07-07 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 麹菌遺伝子 |
JP2006158269A (ja) * | 2004-12-06 | 2006-06-22 | Noda Inst For Scient Res | 相同組換え頻度が上昇した形質転換菌 |
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2015
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Patent Citations (3)
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JP2006158269A (ja) * | 2004-12-06 | 2006-06-22 | Noda Inst For Scient Res | 相同組換え頻度が上昇した形質転換菌 |
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Title |
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"ASPERGILLUS ORYZAE RIB40 C2H2 TYPE ZINC FINGER DOMAIN PROTEIN, MRNA]" [03-MAR-2011] RETRIEVED FROM, JPN6018015781, ISSN: 0003901590 * |
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