JP7409644B2 - コウジ酸非生産生物によるコウジ酸の生産 - Google Patents
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Description
本明細書は、コウジ酸を本来的に生産しない生物におけるコウジ酸の生産に関する。
糸状菌であるコウジカビ Aspergillus oryzae の生産物は、食品、化学、医薬品産業など様々な分野で広く利用されている。例えば、A. oryzae は、酒、醤油、味噌、酢などの日本古来の食品生産に利用されてきている。
ここで、Aspergillus 属菌等が生産するコウジ酸は、これらの菌がグルコース等の糖を発酵する過程によって生成されることが知られており、例えば、美白効果、抗菌効果等が知られている。一方、かかるコウジ酸の生合成経路は未だ不明である（非特許文献１）。
A. oryzae の全ゲノム塩基配列が明らかにされたことから、コウジ酸生産菌である A. oryzae における発現解析により、その発現量を正に制御することによりコウジ酸の産生能が向上する遺伝子が判明してきている（特許文献１）。これらは、AO090113000136(以下、単に、ＡＯ１３６という。以下、同じ。）遺伝子、ＡＯ１３７遺伝子及びＡＯ０１３８遺伝子である。
J. Microbiol. 28: 1340－1346
しかしながら、特許文献１では、コウジ酸増産に貢献する遺伝子を特定したものの、本来的にコウジ酸産生能を有する A. oryzae において、ＡＯ１３６遺伝子の発現量を正に制御することでコウジ酸産生能を増強したことが確認されているに過ぎない。
また、現在においても、ＡＯ１３６をコウジ酸を生産しない他の生物種において発現させたとしても、コウジ酸を産生できることを期待できない。コウジ酸の生合成経路も当該経路を構成する酵素群は未だ特定されておらず、その詳細が不明である以上、コウジ酸非生産菌に一つの遺伝子を導入したからといって、当該非生産菌がコウジ酸を生産しない以上、ＡＯ１３６以外の生合成経路の全ての酵素又は代替経路を備えているとは考えられないからである。
また、ゲノム情報が公開されているほとんどの Aspergillus 属菌には、ＡＯ１３６のオルソログがコードされていないし、ＡＯ１３６～ＡＯ１３８以外にどのような遺伝子がコウジ酸の生合成経路に存在するのかは全く知られていない。
したがって、コウジ酸の生合成経路が不明である現状においても、ＡＯ１３６をコウジ酸非生産の他の生物種において発現させたとしても、コウジ酸を産生できるかどうかを予測することはできなかった。その結果として、コウジ酸非生産生物におけるコウジ酸を生産させた例は未だ報告されていない。
本明細書は、コウジ酸をコウジ酸非生産生物において生産させる方法及びそのための要素を提供する。
本発明者らは、A. oryzae においてコウジ酸高生産時に高発現する遺伝子である ＡＯ１３６に着目した。そして、当該遺伝子産物である ＡＯ１３６タンパク質の機能解析及びコウジ酸の生合成経路を探索するために、当該遺伝子をコウジ酸が生産されることが知られていないコウジ酸非生産生物である A. nidulans に導入した。その結果、意外にも、コウジ酸非生産生物においてもコウジ酸を生産できることを見出した。また、本発明者らは、ＡＯ１３６遺伝子をシロイヌナズナやカイコに導入した場合においても、同様に、コウジ酸を生産することを見出した。本明細書は、これらの知見に基づき以下の手段を提供する。
［１］コウジ酸の生産方法であって、
コウジ酸非生産生物（ただし、ヒトを除く。）において、
以下の（ａ）～（ｄ）；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを発現させてコウジ酸を生産する工程、を備える、方法。
［２］前記コウジ酸非生産生物は、Aspergillus属菌及びPenicillium 属菌以外の生物である、［１］に記載の方法。
［３］前記コウジ酸非生産生物は、原核生物、Aspergillus 属菌及び Penicillium 属菌以外の真核微生物、植物及び動物からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］遺伝的改変生物であって、
コウジ酸非生産生物（ただし、ヒトを除く。）において、
以下の（ａ）～（ｄ）；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを発現可能に保持する、生物。
［５］前記コウジ酸非生産生物は、原核生物、Aspergillus 属菌及び Penicillium 属菌以外の真核微生物、植物及び動物からなる群から選択される少なくとも１種である、［４］に記載の生物。
［６］機能の付与方法であって、
前記機能は、コウジ酸非生産生物（ヒトを除く。）におけるコウジ酸生産能であり、
前記コウジ酸非生産生物に、
以下の（ａ）～（ｄ）；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを導入する工程、
を備える、方法。
［７］機能付与剤であって、
前記機能は、コウジ酸非生産生物（ヒトを除く。）におけるコウジ酸生産能であり、
以下の（ａ）～（ｄ）；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
を、前記コウジ酸非生産生物において作動可能なプロモーターの制御下に発現可能に備える、付与剤。
コウジ酸非生産生物（ただし、ヒトを除く。）において、
以下の（ａ）～（ｄ）；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを発現させてコウジ酸を生産する工程、を備える、方法。
［２］前記コウジ酸非生産生物は、Aspergillus属菌及びPenicillium 属菌以外の生物である、［１］に記載の方法。
［３］前記コウジ酸非生産生物は、原核生物、Aspergillus 属菌及び Penicillium 属菌以外の真核微生物、植物及び動物からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］遺伝的改変生物であって、
コウジ酸非生産生物（ただし、ヒトを除く。）において、
以下の（ａ）～（ｄ）；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを発現可能に保持する、生物。
［５］前記コウジ酸非生産生物は、原核生物、Aspergillus 属菌及び Penicillium 属菌以外の真核微生物、植物及び動物からなる群から選択される少なくとも１種である、［４］に記載の生物。
［６］機能の付与方法であって、
前記機能は、コウジ酸非生産生物（ヒトを除く。）におけるコウジ酸生産能であり、
前記コウジ酸非生産生物に、
以下の（ａ）～（ｄ）；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを導入する工程、
を備える、方法。
［７］機能付与剤であって、
前記機能は、コウジ酸非生産生物（ヒトを除く。）におけるコウジ酸生産能であり、
以下の（ａ）～（ｄ）；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
を、前記コウジ酸非生産生物において作動可能なプロモーターの制御下に発現可能に備える、付与剤。
本明細書の開示は、コウジ酸非生産生物におけるコウジ酸生産に関し、コウジ酸の生産方法、コウジ酸を生産するための遺伝子改変生物、コウジ酸を生産するための剤、コウジ酸生産のための方法に関する。
本明細書に開示されるコウジ酸の生産方法及び遺伝子改変生物によれば、従来からのコウジ酸生産に用いられてきた A. oryzaeなどのコウジ酸生産生物によらなくても、コウジ酸を生産することができる。必要に応じてコウジ酸を生産する生物を選択することできるため、工業的なコウジ酸生産に貢献できる。
本明細書に開示される機能の付与方法及び機能付与剤によれば、コウジ酸非生産生物に対してコウジ酸生産能を付与できる。
本明細書に開示される遺伝子のスクリーニング方法によれば、コウジ酸生産に貢献できる遺伝子をスクリーニングできる。
以下、新たに見出された知見に基づく種々の実施形態について説明する。
（コウジ酸の生産方法）
本明細書に開示されるコウジ酸の生産方法（以下、単に、本生産方法ともいう。）は、所定の態様に人工的に改変されたコウジ酸非生産生物（ただし、ヒトを除く。）において、ＡＯ１３６タンパク質をコードするＤＮＡ又はこれと同等のＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡをまとめて本ＤＮＡともいう。）からなる群から選択される少なくとも１種を発現させてコウジ酸を生産する工程を備えることができる。
本明細書に開示されるコウジ酸の生産方法（以下、単に、本生産方法ともいう。）は、所定の態様に人工的に改変されたコウジ酸非生産生物（ただし、ヒトを除く。）において、ＡＯ１３６タンパク質をコードするＤＮＡ又はこれと同等のＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡをまとめて本ＤＮＡともいう。）からなる群から選択される少なくとも１種を発現させてコウジ酸を生産する工程を備えることができる。
本生産方法において用いるコウジ酸非生産生物は、ＡＯ１３６タンパク質をコードするＤＮＡ又はこれと同等のＤＮＡを保持している。こうしたコウジ酸非生産生物を、以下、本生物ともいう。
コウジ酸非生産生物は、コウジ酸生産生物以外の生物である。ここで、コウジ酸生産生物としては、A. oryzae ほか、コウジ酸を生産することが確認されている生物である。例えば、A. oryzae ほか、A. flavus、A. tamari 等のAspergillus 属及び Penicillium dalae などの Penicillium 属に属する真核微生物；Gluconobacter suboxydans, roseus などの Gluconobacter 属に属する原核微生物が挙げられる。コウジ酸生産生物は、典型的には、コウジ酸を生産する Aspergillus 属菌、Penicillium 属菌及び Gluconobacter 属菌である。
また、コウジ酸非生産生物とは、ＡＯ１３６タンパク質をコードするＤＮＡを本来的に備えていないか、ＡＯ１３６タンパク質をコードするＤＮＡを備えているが、発現が抑制されている生物である。この観点からは、生物につき、発現解析を行って、ＡＯタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現が対照と比較して、例えば３０％以下、また例えば２５％以下、また例えば２０％以下、また例えば１５％以下、また例えば１０％以下、また例えば５％以下、また例えば３％以下、また例えば２％以下、また例えば１％以下の生物を、コウジ酸非生産生物ということもできる。なお、発現解析は、当業者において周知の解析方法であり、ＡＯタンパク質をコードするｍＲＮＡの逆転写ＤＮＡを補足する特異的プローブは、配列番号１で表される塩基配列に基づいて適宜設計することができる。
したがって、コウジ酸非生産生物は、これらのコウジ酸生産生物を除く生物である。コウジ酸非生産生物は、例えば、コウジ酸を生産する Aspergillus 属菌、Penicillium 属菌及び Gluconobacter 属菌を除く生物であり、より簡易には、例外があるものの、コウジ酸を生産する Aspergillus 属菌、Penicillium 属菌及び Gluconobacter 属菌を除く生物である。また、コウジ酸非生産生物は、具体的には、Aspergillus 属菌及びPenicillium 属菌以外の酵母やカビなどの真核微生物；Gluconobacter 属以外の原核微生物；植物；昆虫類；魚類；鳥類；は虫類；両生類；哺乳類等の動物挙げられる。また例えば、原核生物、Aspergillus 属菌及び Penicillium 属菌以外の真核微生物、植物及び動物からなる群から選択されてもよい。
コウジ酸生産微生物以外の真核微生物としては、特に限定するものではないが、上記したコウジ酸生産 Aspergillus 属以外の Aspergillus 属菌、上記したコウジ酸生産Penicillium 属以外の Penicillium 属及びその他の真核微生物が挙げられる。例えば、Aspergillus 属に属するコウジ酸非生産菌としては、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Aspergillus terreus等が挙げられる。また、Penicillium 属に属するコウジ酸非生産菌としては、Penicillium chrysogenum、Penicillium citrinum 等が挙げられる。
また、他の真核微生物としては、特に限定するものではないが、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、カンジダ（Candida albicans）等が挙げられる。
また、コウジ酸生産微生物以外の原核微生物としては、例えば、大腸菌（E. coli）などのエスケリヒア（Escherichia）属；ラクトバシラス属；エンテロコッカス属；ラクトコッカス属；ペディコッカス属；ロイコノストック属；ストレプトコッカス属などの乳酸菌類、ビフィドバクテリウム属などのビフィズス菌、枯草菌（B. subtilis）や納豆菌（Bacillus natto）などの Bacillus 属に属する原核微生物が挙げられる。
植物としては、特に限定するものではないが、例えば、シロイヌナズナを含む各種双子葉植物、イネを含む各種単子葉植物が挙げられる。昆虫類としては、特に限定するものではないが、例えば、カイコ（幼虫）などが挙げられる。また、魚類としては、特に限定するものではないが、例えばサケ、マス等が挙げられる。また、鳥類としては、特に限定するものではないが、例えば、ニワトリ、カモ、七面鳥、ウズラ等が挙げられる。また、哺乳類としては、特に限定するものではないが、例えば、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウシ等が挙げられる。
ＡＯ１３６タンパク質をコードするＤＮＡは、以下の（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される。ここで、ＡＯ１３６タンパク質は、Joint Genome Institute (https://mycocosm.jgi.doe.gov/Aspor1/Aspor1.info.html)において、AO090113000136によって特定される塩基配列によってコードされるタンパク質であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有している。この ＦＡＤ 依存酸化還元酵素であることが推定されている。
ＡＯ１３６タンパク質は、そのタンパク質としての機能は、A. oryzae などのコウジ酸生産生物や、A. nidulans、大腸菌等のコウジ酸非生産生物において、どのような反応に関わって最終的にコウジ酸の生産に貢献しているかどうかは全く判明していない。
ＡＯ１３６タンパク質をコードするＤＮＡとしては、（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、このＤＮＡと同等のＤＮＡとしては、（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と一定以上の同一性を有する塩基配列を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、同等ＤＮＡとしては、（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、同等ＤＮＡとしては、（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
前記（ｂ）において、前記一定以上の同一性としては、特に限定するものではないが、例えば、配列番号１で表される塩基配列と８０％以上であり、また例えば、同８５％以上あり、また例えば、同９０％以上であり、また例えば、９５％以上であり、また例えば９６％以上であり、また例えば９７％以上であり、また例えば９８％以上であり、また例えば９９％以上であり、また例えば９９．５％以上である。
前記（ｄ）において、前記一定以上の同一性としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列とまた例えば、８０％以上であり、また例えば、同８５％以上あり、また例えば、同９０％以上であり、また例えば、９５％以上であり、また例えば９６％以上であり、また例えば９７％以上であり、また例えば９８％以上であり、また例えば９９％以上であり、また例えば９９．５％以上である。
本ＤＮＡに対応するタンパク質としては、以上のことから、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の他、配列番号２で表されるアミノ酸配列と一定以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質であるといえる。以下、これらのタンパク質をまとめて、本タンパク質ということもある。
なお、本明細書において、塩基配列又はアミノ酸配列の同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果において Similarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、Altschul らによるＢＬＡＳＴ (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997)) を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
例えば、（ｂ）のＤＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列のコドン用法が変更されたもの、このタンパク質のアミノ酸配列において保存的置換また例えば他のアミノ酸の置換や、その他の、１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、挿入、付加などを含む改変されたアミノ酸配列をコードするもの等が挙げられる。
なお、アミノ酸の保存的置換としては、例えば、以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
本生物は、本ＤＮＡの少なくとも１種を、染色体内に備えていてもよいし、染色体外に保持していてもよい。コウジ酸非生産生物において、本ＤＮＡを発現させるには、コウジ酸非生産生物を宿主生物として、本ＤＮＡを発現可能に形質転換した形質転換生物を作製して用いることができる。このような形質転換生物の作製、そのための剤等については、後段で詳述する。
本生産方法は、本生物において本ＤＮＡの少なくとも１種を発現させることで、コウジ酸を生産できる。すなわち、本タンパク質を生産させることで、コウジ酸生産を開始させることができる。本生物にコウジ酸を生産させる条件は、特に限定するものではないが、本生物に一般的に適用される生育条件を適用することができる。例えば、コウジ酸非生産生物が大腸菌の場合には、大腸菌に一般的に適用される培地、温度、ガス条件が適用される。例えば、本生物の宿主であるコウジ酸非生産生物が本来的に備える代謝能により、グルコースを少なくとも生産できる生育条件を採用することもできる。本生物に適用する生育条件は、当業者であれば、宿主であるコウジ酸非生産生物の生育についての公知の情報に基づいて適宜設定することができる。
本生物がコウジ酸を生産する態様は、宿主たるコウジ酸非生産生物によっても様々である。例えば、A. nidulansは、菌体外にコウジ酸を分泌し、大腸菌は、細胞内にコウジ酸を生産する。また、多細胞真核生物の場合には、生物体内において代謝産物として生産される。
本生物が生産したコウジ酸は、適宜、分離、抽出、精製することができる。
（人工的改変生物及びその作製）
本明細書に開示される人工的改変生物は、コウジ酸非生産生物（ただし、ヒトを除く。）において、本ＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを発現可能に保持することができる。すなわち、この人工的改変生物は、上記した本生物である。本ＤＮＡは、染色体に対して組み込まれて複製可能に設けてもよいし、染色体外において一過的発現するように保持されてもよい。
本明細書に開示される人工的改変生物は、コウジ酸非生産生物（ただし、ヒトを除く。）において、本ＤＮＡからなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを発現可能に保持することができる。すなわち、この人工的改変生物は、上記した本生物である。本ＤＮＡは、染色体に対して組み込まれて複製可能に設けてもよいし、染色体外において一過的発現するように保持されてもよい。
本生物は、既述のとおりのコウジ酸非生産生物に本ＤＮＡを発現可能に保持している。コウジ酸非生産生物において、本ＤＮＡを備える生物は、現在までにおいて見出されていない。
本生物は、より具体的には、本ＤＮＡを、本生物の宿主生物であるコウジ酸非生産生物の種類に応じて、当該コウジ酸非生産生物において作動可能な調節領域の制御下に備えている。調節領域としては、例えば、プロモーター、ターミネーター他、各種のエレメント等である。
プロモーター、ターミネーター等の調節領域は、本生物におけるコウジ酸の生産量や生産タイミング等において適宜選択することができる。例えば、本ＤＮＡを高発現させてコウジ酸を高生産した場合には、構成的かつ強力なプロモーターを使用することができる。また、発現を増強するターミネーターを利用することができる。これらの調節領域は、コウジ酸非生産生物の種類に応じて当業者において周知である。また、こうした調節領域は、コウジ酸非生産生物の染色体上に本来的に備えるプロモーターやターミネーターを利用してもよい。
本ＤＮＡをコウジ酸非生産生物において発現させるためのＤＮＡコンストラクトは、少なくとも、本ＤＮＡの少なくとも１種を有しているが、さらに、以下の要素を備えることができる。例えば本ＤＮＡが、宿主となるコウジ酸非生産生物がその染色体上に本来的に備える内在性プロモーターやターミネーターによって作動されるように組み込むためのＤＮＡコンストラクトは、本ＤＮＡの少なくとも１種をこれらの領域に相同組換えにより導入するための染色体との相同組換え領域を備えることができる。相同組換え領域は、プロモーター領域やターミネーター領域を含んでいてもよい。また、かかるＤＮＡコンストラクトは、プロモーターやターミネーター領域を含み、さらに、その外側に、染色体との相同組換え領域を備えていてもよい。
また、本ＤＮＡを、染色体上の任意の位置で発現させる場合には、ＤＮＡコンストラクトは、本ＤＮＡのほか、コウジ酸非生産生物において作動可能な任意のプロモーター等の調節領域を備えることができる。また、本ＤＮＡを染色体外において発現させる場合には、ＤＮＡコンストラクトは、染色体外において保持可能な一定の要素を備えることができる。
種々の生物において相同組換えにより染色体の特定部位に本ＤＮＡの少なくとも１種を発現可能に組み込む方法、染色体上のランダムな位置に本ＤＮＡ発現可能を組み込む方法、も当業者において周知である。必要に応じて、こうしたＤＮＡコンストラクトが導入されたことを判定できるマーカー遺伝子を備えるようにしてもよい。
本生物は、コウジ酸非生産生物の細胞（未受精卵及び受精卵を含む）に、こうした発現カセットを導入することによって作製することができる。導入方法は、用いるコウジ酸非生産生物の種類等によっても異なるが、種々の方法が周知である。発現カセットは、例えば、コスミドベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、裸のＤＮＡコンストラクト及び、人工染色体（トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション等）、パーティクルガンのための遺伝子導入用粒子等が挙げられる。
以上説明した本ＤＮＡを備える発現カセットを含む各種形態のＤＮＡ構築物は、本明細書に開示される機能付与剤といえる。また、以上説明した本生物の作製方法は、本明細書に開示される機能付与方法でもある。
以下、本開示に関する実験例及び具体例について説明するが、本開示は、以下の具体的記載によって制限されるものではない。
（ＡＯ１３６遺伝子を高発現したAspergillus nidulans株の作製及びコウジ酸の生産の確認）
RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) を用いて、ＡＣＭ培地 (０．２％ｍａｌｔｅｘｔｒａｃｔ，０．１％ｐｅｐｔｏｎｅ，０．２％Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）で生育させたA. oryzae RIB40 株からＲＮＡを抽出し、PrimeScriptTM 1st cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)によりＲＮＡを逆転写することでｃＤＮＡを得た。合成したｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＡ (5’-CTTGAGCAGACATCACAATGCGTGTCGCGACACAGCT-3’)（配列番号３）, プライマーＢ (5’-CTATGTTTCACTAGTGACTGCAAACGGTGGAGGTGGAGGT-3’) （配列番号４）を用いてＰＣＲすることで、ＡＯ１３６（AO090113000136）遺伝子を増幅した。アガロースゲル電気泳動により、PCR 産物を泳動後、目的遺伝子断片を切り出し、UltraClean（登録商標） 15ＤＮＡPurification Kit(MO BIO) により、アガロースゲルからＤＮＡを抽出、精製した。GAPDH(gapA)プロモーターとタカアミラーゼ(taaG2)ターミネーターを挿入した pBSpyrG ベクターに NEBuilder (New England Biolabs Japan) を用いて連結し、ＡＯ１３６発現用プラスミド(pBSpyrGAO136) を構築した(図1)。
RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) を用いて、ＡＣＭ培地 (０．２％ｍａｌｔｅｘｔｒａｃｔ，０．１％ｐｅｐｔｏｎｅ，０．２％Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）で生育させたA. oryzae RIB40 株からＲＮＡを抽出し、PrimeScriptTM 1st cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)によりＲＮＡを逆転写することでｃＤＮＡを得た。合成したｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＡ (5’-CTTGAGCAGACATCACAATGCGTGTCGCGACACAGCT-3’)（配列番号３）, プライマーＢ (5’-CTATGTTTCACTAGTGACTGCAAACGGTGGAGGTGGAGGT-3’) （配列番号４）を用いてＰＣＲすることで、ＡＯ１３６（AO090113000136）遺伝子を増幅した。アガロースゲル電気泳動により、PCR 産物を泳動後、目的遺伝子断片を切り出し、UltraClean（登録商標） 15ＤＮＡPurification Kit(MO BIO) により、アガロースゲルからＤＮＡを抽出、精製した。GAPDH(gapA)プロモーターとタカアミラーゼ(taaG2)ターミネーターを挿入した pBSpyrG ベクターに NEBuilder (New England Biolabs Japan) を用いて連結し、ＡＯ１３６発現用プラスミド(pBSpyrGAO136) を構築した(図1)。
ＭＭＧＢＰＵ寒天培地（１０ｍＭＮａＮＯ3，１０ｍＭＫＨ2ＰＯ4，７ｍＭＫＣｌ，２ｍＭＭｇＳＯ4，２ｍｌ／ｌ Hutner's trace elements, １．０％Ｄ－glucose，１．５％ａｇａｒ（ｐＨ６．５），０．１ｍｇ／l pyridoxine, １．１２ｇ／ｌ uracil, １．２ｇ／ｌ uridine、０．２５ｍｇ／ｌ biotin）において、コウジ酸非生産生物である Aspergillus nidulans BPU1株(BPU1株)を３７℃で４日間培養した。得られた胞子を懸濁し、ＹＡＧ培地（０．５％ bacto yeast extract、０．２５％ＭｇＳＯ4、０．１％Hutner's trace elements,１% D-glucose、０．１mg/l pyridoxine、１．１２ｇ／ｌuracil，１．２ｇ／ｌ uridine，０．２５ｍｇ／ｌ biotin,０．２ｍｇ／ｌ arginine）で３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートし発芽させた。発芽した菌体に酵素液（１０ｍＭ Na phosphate（ｐＨ６．０），０．３％ yatalase，０．０３％ lysing enzyme，０．１％ＢＳＡ，０．８Ｍ ＮａＣｌ）を加え、プロトプラストを調製した。プロトプラストにｐＢＳａｒｇＡＯ１３６プラスミドを加え、ＰＥＧ法にて形質転換した後、ＭＭＧ ＢＰ 寒天培地に塗布した。生育したA.nidulans ＢＰＵ１株のゲノムＤＮＡにＡＯ１３６が導入されているものをＡＯ１３６高発現株（Ａｎ－ＡＯ１３６株）とした。
（コウジ酸生産の確認）
A.oryzae野生株（ＡｏＷＴ）、A.nidulans野生株（ＡｎＷＴ）、A.nidulansＡＯ１３６高発現株（Ａｎ－ＡＯ１３６株）を，コウジ酸検出用寒天培地（１ｍＭＦｅＣｌ3を含むＣＤ寒天培地（０．２５％yeast extract，０．１％ＫＨ2ＰＯ4，０．０５％ＭｇＳＯ４－７Ｈ2Ｏ，１０％Ｄ－glucose））にて固体培養した。結果を図２に示す。
A.oryzae野生株（ＡｏＷＴ）、A.nidulans野生株（ＡｎＷＴ）、A.nidulansＡＯ１３６高発現株（Ａｎ－ＡＯ１３６株）を，コウジ酸検出用寒天培地（１ｍＭＦｅＣｌ3を含むＣＤ寒天培地（０．２５％yeast extract，０．１％ＫＨ2ＰＯ4，０．０５％ＭｇＳＯ４－７Ｈ2Ｏ，１０％Ｄ－glucose））にて固体培養した。結果を図２に示す。
図２に示すように、ＡｏＷＴおよびＡｎ－ＡＯ１３６株では培地がオレンジ色を呈したことから、ＡＯ１３６遺伝子のみを導入したコウジ酸非生産生物であるA. nidulans がコウジ酸を生産することが示唆された。
（Ａｎ－ＡＯ１３６株からのＡＯ１３６タンパク質の分離同定）
Ａｎ－ＡＯ１３６株の菌体をバッファーＡ（１０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａＣｌ，０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）に懸濁し、液体窒素を用いて凍結破砕した。破砕後、サンプルを遠心分離しフィルター（０．２２μｍ）に通すことで、不溶性のものを除去した。その後リコンビナントＡＯ１３６を抗ＦＬＡＧＭ２抗体アフィニティーゲルに吸着させ、バッファーＡで三回洗浄し、１５０ｎｇ／μｌの３ｘＦＬＡＧペプチドを含むバッファーＡで溶出することでリコンビナントＡＯ１３６を精製しＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。結果を、図３に示す。
Ａｎ－ＡＯ１３６株の菌体をバッファーＡ（１０ｍＭＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭＮａＣｌ，０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）に懸濁し、液体窒素を用いて凍結破砕した。破砕後、サンプルを遠心分離しフィルター（０．２２μｍ）に通すことで、不溶性のものを除去した。その後リコンビナントＡＯ１３６を抗ＦＬＡＧＭ２抗体アフィニティーゲルに吸着させ、バッファーＡで三回洗浄し、１５０ｎｇ／μｌの３ｘＦＬＡＧペプチドを含むバッファーＡで溶出することでリコンビナントＡＯ１３６を精製しＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。結果を、図３に示す。
図３に示すように、ＡＯ１３６タンパク質の分子量に一致する分子量にバンドが検出された)。また、そのバンドをトリプシンによるゲル内消化後 MALDI-TOF-MS にて解析したところ、ＡＯ１３６が同定されたことから、ＡＯ１３６が発現していることが明らかになった。
（ＡＯ１３６遺伝子を高発現したAspergillus nidulans株の培養上清のGC-MS 分析）
Ａｎ－ＡＯ１３６株とＢＰＵ１株（ＡｎＷＴ株）を、コウジ酸検出用寒天培地にて３７℃で７日間静置培養した。また、ＭＭＧ液体培地（０．０５％ＫＣｌ，０．０５％ＭｇＳＯ4－７Ｈ2Ｏ，０．１５％ＫＨ2ＰＯ4，０．６％ＮａＮＯ3，１％Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ，０．２％ Hunter’sTraceelements，０．１％ＮａＯＨ）を用いて３７℃、２００ｒｐｍで培養した。
Ａｎ－ＡＯ１３６株とＢＰＵ１株（ＡｎＷＴ株）を、コウジ酸検出用寒天培地にて３７℃で７日間静置培養した。また、ＭＭＧ液体培地（０．０５％ＫＣｌ，０．０５％ＭｇＳＯ4－７Ｈ2Ｏ，０．１５％ＫＨ2ＰＯ4，０．６％ＮａＮＯ3，１％Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ，０．２％ Hunter’sTraceelements，０．１％ＮａＯＨ）を用いて３７℃、２００ｒｐｍで培養した。
Ａｎ－ＡＯ１３６株とＡｎＷＴ株をＭＭＧ液体培地で培養して得られた培養ろ液 ０．５mL をそれぞれエッペンドルフチューブに取り、凍結乾燥した。凍結乾燥したサンプルに、オキシム化剤（メトキシアミン２０ｍｇを含むピリジン１ｍｌ）を５０μｌずつ入れ、３７℃で９０分間静置した。その後、ＴＭＳ化剤（N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoroacetamide)を５０μｌずつ入れ、３７℃で３０分間静置した。１５０，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離後、得られた上清をＧＣ－ＭＳ分析に供した。ＧＣ－ＭＳ(GCMS-QP2010, Shimadzu) を用いてコウジ酸を検出した。カラムには３０－ｍ fused silica column (DB-5; J&W Scientific) を用いた。コウジ酸の標品を用いて検量線を作成し生成量を定量した。結果を図４及び図５に示す。
図４に示すように、Ａｎ－ＡＯ１３６株ではリテンションタイム３１．８６分に特異的なピークが検出された。ＮＩＳＴのシミラリティ検索およびコウジ酸標品との比較の結果、このピークはコウジ酸であると同定された。これまでにコウジ酸はグルコースから多段階の反応を経て生合成されると推測されていたが（非特許文献１）、ＡＯ１３６遺伝子のみを導入することでコウジ酸を生産したことは驚異的であった。培養ろ液中のコウジ酸の生産量を経時的に追跡したところ、図５に示すように、培養１２時間後では２．４ｍＭであった。
（ＡＯ１３６遺伝子を高発現した大腸菌株の作製及びコウジ酸生産の確認）
コウジ酸生産生物であるA.oryzae野生株からＲＮＡを抽出し、逆転写することでｃＤＮＡを得た。合成したｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＣ(5’-GATTTCACATATGTCCATGGGCGGCCGCCGTGTCGCGACACAGCTAAG-3’)（配列番号５）, プライマーＤ(5’-CGGATCCGTCGACGATATCGCGGCCGCTTAGTTTGCAGTCACTAGTG-3’)（配列番号６）を用いてＰＣＲすることで、ＡＯ１３６を増幅した。アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を泳動後、目的遺伝子断片を切り出し、UltraClean（登録商標）15ＤＮＡPurification Kit (MO BIO)により、アガロースゲルからＤＮＡを抽出、精製した。増幅したＡＯ１３６を、大腸菌タンパク質発現用のｐＭＡＬ－ｃ５ｘベクターにＮＥＢｕｉｌｄｅｒを用いて連結し、図６に示す、ＡＯ１３６発現用プラスミド（ｐＭＡＬＡＯ１３６）を構築した。これを大腸菌ＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ株に形質転換することで、ＡＯ１３６発現大腸菌（Ｅｃ－ＡＯ１３６株）とした。
コウジ酸生産生物であるA.oryzae野生株からＲＮＡを抽出し、逆転写することでｃＤＮＡを得た。合成したｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＣ(5’-GATTTCACATATGTCCATGGGCGGCCGCCGTGTCGCGACACAGCTAAG-3’)（配列番号５）, プライマーＤ(5’-CGGATCCGTCGACGATATCGCGGCCGCTTAGTTTGCAGTCACTAGTG-3’)（配列番号６）を用いてＰＣＲすることで、ＡＯ１３６を増幅した。アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を泳動後、目的遺伝子断片を切り出し、UltraClean（登録商標）15ＤＮＡPurification Kit (MO BIO)により、アガロースゲルからＤＮＡを抽出、精製した。増幅したＡＯ１３６を、大腸菌タンパク質発現用のｐＭＡＬ－ｃ５ｘベクターにＮＥＢｕｉｌｄｅｒを用いて連結し、図６に示す、ＡＯ１３６発現用プラスミド（ｐＭＡＬＡＯ１３６）を構築した。これを大腸菌ＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ株に形質転換することで、ＡＯ１３６発現大腸菌（Ｅｃ－ＡＯ１３６株）とした。
５ｍＬの２５ｍＭのグルコースを含むＬＢ培地（アンピシリン、クロラムフェニコール添加）が入った試験管でＥｃ－ＡＯ１３６株を前培養（１００ｒｐｍ）しＯＤ６００が０．６程度まで上がったら、培養液５０μＬを新しい５０ｍＬのＬＢ培地（アンピシリン、クロラムフェニコール、０．１ｍＭＩＰＴＧ添加）が入った３００ｍＬの三角フラスコに移して本培養した。Ｅｃ－ＡＯ１３６株の菌体をバッファーＢ（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４），２００ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、ソニケーションすることで破砕した。破砕後、破砕液を遠心分離しフィルター（０．２２μｍ）に通すことで、不溶性のものを除去した。その後Amylose Resin(NEWENGLAND BioLabs）を充填したカラムにサンプルを通し、リコンビナントＡＯ１３６をカラムに吸着させ、バッファーＢで三回洗浄し、１０ｍＭのマルトースを含むバッファーＢで溶出することでリコンビナントＡＯ１３６を精製しＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。結果を図７に示す。
また、培養液３ｍＬをファルコンチューブに回収し、遠心分離によって培養ろ液を集めた。上記と同様に、得られた培養ろ液５ｍＬをそれぞれエッペンドルフチューブに取り凍結乾燥、誘導体化後、ＧＣ－ＭＳ分析に供した。結果を、図８に示す。
図７に示すように、可溶性画分において、マルトース結合ドメインと融合したＡＯ１３６の分子量と一致する分子量にバンドが検出された。このことから、ＡＯ１３６が発現していることが示された。また、図８に示すように、リテンションタイム３１．８６分にコウジ酸が検出されたことから、大腸菌によってコウジ酸が生産されたことが明らかになった。
（ＡＯ１３６を高発現したシロイヌナズナ、カイコによるコウジ酸の生産の確認）
（ＡＯ１３６遺伝子を発現したシロイヌナズナ株の作製）
pMALAO136 ベクターを鋳型として、プライマーＥ(5’-CACCATGCGTGTCGCGACACAGCTAA-3’)（配列番号７）, プライマーＦ(5’-GTTTGCAGTCACTAGTGAAACATAGGTCTG-3’)（配列番号８）を用いてＰＣＲすることで、ＡＯ１３６を増幅した。増幅したＡＯ１３６を、pENTRTM/D-TOPO(R) (invitrogen) にクローニングした。pENTRTM/D-TOPO(R)にクローニングされたAO136 をシロイヌナズナタンパク質発現用の pGWB402Ω ベクターに、Gateway LR clonaseII (Invitrogen)を用いた相同組換えを行い、ＡＯ１３６植物発現用プラスミド (AO136/pGWB402Ω)を構築した。これを Agrobacterium tumefaciens C58C1 (pMP90) 株に導入し、AO136/pGWB402Ωを保持する Agrobacterium をFloral Dip法により、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold, Col-0株)に形質転換することで、ＡＯ１３６発現シロイヌナズナ（Ａｔ－ＡＯ１３６株）を作製した。
（ＡＯ１３６遺伝子を発現したシロイヌナズナ株の作製）
pMALAO136 ベクターを鋳型として、プライマーＥ(5’-CACCATGCGTGTCGCGACACAGCTAA-3’)（配列番号７）, プライマーＦ(5’-GTTTGCAGTCACTAGTGAAACATAGGTCTG-3’)（配列番号８）を用いてＰＣＲすることで、ＡＯ１３６を増幅した。増幅したＡＯ１３６を、pENTRTM/D-TOPO(R) (invitrogen) にクローニングした。pENTRTM/D-TOPO(R)にクローニングされたAO136 をシロイヌナズナタンパク質発現用の pGWB402Ω ベクターに、Gateway LR clonaseII (Invitrogen)を用いた相同組換えを行い、ＡＯ１３６植物発現用プラスミド (AO136/pGWB402Ω)を構築した。これを Agrobacterium tumefaciens C58C1 (pMP90) 株に導入し、AO136/pGWB402Ωを保持する Agrobacterium をFloral Dip法により、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold, Col-0株)に形質転換することで、ＡＯ１３６発現シロイヌナズナ（Ａｔ－ＡＯ１３６株）を作製した。
形質転換させたＡｔ－ＡＯ１３６株の選抜には２５ｍｇ／ｌＫａｎａｍｙｃｉｎ、５０ｍｇ／ｌカルベニシリンを加えた選抜用ＭＳ培地（１ｘムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地用混合塩類（日本製薬）に０．０５％ＭＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ５．７）、０．７％植物育成用寒天（Ｗａｋｏ））を使用した。４℃、暗所に一晩おいて春化処理したＴ１種子を、７０％エタノールに浸した後、１０％次亜塩素酸ナトリウム溶液（Ｗａｋｏ）、０．００２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む滅菌液に１０分間浸し種子表面を滅菌し、滅菌水を用いて４回以上洗浄後、選抜用培地に約１０００粒播種した。その後生育チャンバー（ＳＡＮＹＯ）で２２℃、白色蛍光灯（光量：３０μＥ／ｍ2ｓ）による長日条件（１６ｈＬｉｇｈｔ／８ｈＤａｒｋ）で生育した。抗生物質耐性を示し、本葉が形成された形質転換体のみをＫａｎａｍｙｃｉｎを含まないＭＳ培地に移しかえ、播種後１４日目に土植えした。土植えさせた植物を２ヶ月生育させ、乾燥後後代のＴ2種子を得た。
Ｔ2種子は、種子の休眠打破のために滅菌水に浸し、１～３日間４℃暗所で低温処理を行った後、滅菌液に種子を１０分間浸して種子表面を滅菌した。その後、滅菌水で３回洗浄した。ＭＳ基本培地（１ｘムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地用混合塩類に０．０５％ＭＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ５．７）、１％スクロース（ナカライ）、１％植物育成用寒天）に播種し１４日間生育チャンバーで２２℃、白色蛍光灯（光量：３０μＥ／ｍ2ｓ）による長日条件（１６ｈＬｉｇｈｔ／８ｈＤａｒｋ）で生育させた。ＧＣ－ＭＳ分析の比較対象として、シロイヌナズナＣｏｌ－０株を同様の条件で播種・生育させた。
液体窒素にて破砕したシロイヌナズナＡｔ－ＡＯ１３６株とＣｏｌ－０株から５０％メタノール溶液を用いて代謝物を抽出し、凍結乾燥、誘導体化後、ＧＣ－ＭＳ分析に供した。結果を図９に示す。
（ＡＯ１３６遺伝子を発現した Bombyx mori（カイコ）株の作製）
シスメックス株式会社の ProCube サービス(http://procube.sysmex.co.jp/service/detail/)を利用して、ＡＯ１３６発現カイコ（Ｂｍ－ＡＯ１３６株）を作製した。５０％メタノール溶液を用いて破砕したカイコの抽出液を凍結乾燥、誘導体化後、ＧＣ－ＭＳ分析に供した。結果を、合わせて図９に示す。
シスメックス株式会社の ProCube サービス(http://procube.sysmex.co.jp/service/detail/)を利用して、ＡＯ１３６発現カイコ（Ｂｍ－ＡＯ１３６株）を作製した。５０％メタノール溶液を用いて破砕したカイコの抽出液を凍結乾燥、誘導体化後、ＧＣ－ＭＳ分析に供した。結果を、合わせて図９に示す。
（コウジ酸生産の確認）
図９に示すように、それぞれの生体から代謝物を抽出し凍結乾燥、誘導体化後、ＧＣ－ＭＳ分析に供したところ、同様にコウジ酸が検出されたことから、シロイヌナズナ、カイコでもコウジ酸が生産されたことが明らかになった。
図９に示すように、それぞれの生体から代謝物を抽出し凍結乾燥、誘導体化後、ＧＣ－ＭＳ分析に供したところ、同様にコウジ酸が検出されたことから、シロイヌナズナ、カイコでもコウジ酸が生産されたことが明らかになった。
それぞれの生物でのコウジ酸生産量を図１０及び表１に示す。大腸菌と比べて、培地中に生産されるコウジ酸量は A. nidulans の方が多かった。シロイヌナズナとカイコでは一概に比較できないがほぼ同程度のコウジ酸を生産していた。
以上のことから、本研究は本来コウジ酸を生産できる麹菌等以外の生物でコウジ酸を生産させることが初めて見出された。
配列番号３～８：プライマー
Claims (7)
- コウジ酸の生産方法であって、
以下の（ａ）～（ｄ）；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含みタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
のいずれのＤＮＡも備えていないコウジ酸非生産生物（ただし、ヒトを除く。）において、
前記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを導入し発現させてコウジ酸を生産する工程、
を備える、方法。 - 前記コウジ酸非生産生物は、Aspergillus属菌及びPenicillium属菌以外の生物である、請求項１に記載の方法。
- 前記コウジ酸非生産生物は、原核生物、Aspergillus属菌及びPenicillium属菌以外の真核微生物、植物及び動物からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の方法。
- 遺伝的改変生物であって、
以下の（ａ）～（ｄ）；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含みタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
のいずれのＤＮＡも備えていないコウジ酸非生産生物（ただし、ヒトを除く。）において、
前記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを発現可能に保持してコウジ酸生産能が付与された、生物。 - 前記コウジ酸非生産生物は、原核生物、Aspergillus属菌及びPenicillium属菌以外の真核微生物、植物及び動物からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の生物。
- 機能の付与方法であって、
前記機能は、コウジ酸非生産生物（ヒトを除く。）におけるコウジ酸生産能であり、
前記コウジ酸非生産生物は、
以下の（ａ）～（ｄ）；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含みタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
のいずれのＤＮＡも備えていないコウジ酸非生産生物であり、
前記コウジ酸非生産生物に、前記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを導入する工程、
を備える、方法。 - 機能付与剤であって、
前記機能は、コウジ酸非生産生物（ヒトを除く。）におけるコウジ酸生産能であり、
前記コウジ酸非生産生物は、
以下の（ａ）～（ｄ）；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含みタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、コウジ酸生産量を増大させるタンパク質をコードするＤＮＡ
のいずれのＤＮＡも備えていないコウジ酸非生産生物であり、
前記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択される少なくとも１種のＤＮＡを、前記コウジ酸非生産生物において作動可能なプロモーターの制御下に発現可能に備える、付与剤。
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| JP2020006343A Active JP7409644B2 (ja) | 2019-12-25 | 2020-01-17 | コウジ酸非生産生物によるコウジ酸の生産 |
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| JP (1) | JP7409644B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010246532A (ja) | 2009-03-23 | 2010-11-04 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | コウジ酸の産生に必須の遺伝子を利用してコウジ酸の産生量を向上する方法 |
-
2020
- 2020-01-17 JP JP2020006343A patent/JP7409644B2/ja active Active
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 生物工学，2012年，Vol.90, No.6，pp.298-301 |
| 醸協，2017年，Vol.112, No.1，pp.9-14 |
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| JP2021106562A (ja) | 2021-07-29 |
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