WO2007148494A1 - テストステロン増加剤 - Google Patents

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WO2007148494A1
WO2007148494A1 PCT/JP2007/060341 JP2007060341W WO2007148494A1 WO 2007148494 A1 WO2007148494 A1 WO 2007148494A1 JP 2007060341 W JP2007060341 W JP 2007060341W WO 2007148494 A1 WO2007148494 A1 WO 2007148494A1
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vitamin
testosterone
food
increasing agent
menaquinone
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PCT/JP2007/060341
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Michio Komai
Hitoshi Shirakawa
Yusuke Ohsaki
Tadashi Takumi
Asagi Ito
Toshiro Sato
Rumi Ozaki
Original Assignee
J-Oil Mills, Inc.
Tohoku University
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Definitions

  • the present invention relates to a testosterone increasing agent, and more particularly to a composition for increasing endogenous testosterone.
  • Testosterone a type of male hormone, is widely involved in muscle building, cognitive function, vascular flexibility, lipid metabolism, sexual function, and the like. Testosterone secretion decreases with age, but the presence of environmental hormones also affects it. Recently, menaquinone-4 has been implicated in testosterone biosynthesis from DNA microarray analysis of sterile vitamin D-deficient rats! / Possibility of scolding was suggested (Non-patent document 1, Non-patent document 2).
  • hormone replacement therapy in which a testosterone preparation is injected.
  • injections can cause blood testosterone levels to rise sharply, which can cause upsets.
  • hormone replacement therapy may be administered slowly with a transdermal patch.
  • Patent Document 1 benzil darcosinolate and benzyl isothiocyanate
  • Patent Document 2 a mixture of ma force and antlers included in ma force that does not replenish external force test strons, etc.
  • Patent Document 3 a substituted pyrazole compound
  • Non-Patent Document 1 8th Vitamin K & Bone Study Group, pp 87-89, December 10, 2005, published by Eisai Co., Ltd.
  • Non-patent document 2 Shirakawa et al, Biochim. Biophys. Acta Vitamin K deficiency reduces testosterone production in the testis through down-regulation of the Cypl la a chol esterol side chain cleavage enzyme in rats, ARTICLE In Press, Accepted Manuscrip t, Available online 6 June 2006
  • Patent Document 1 JP 2005-306754
  • Patent Document 2 Special Table 2003-523945
  • Patent Document 3 Special Table 2005-504093
  • the compound having the testosterone increasing action described above is a crude drug or a chemically synthesized drug. No such substance is currently known where dietary and safe food ingredients or nutrients that increase blood testosterone levels are preferred. In this situation, it would be desirable to provide a safer and more experienced food ingredient that increases the amount of testosterone.
  • vitamin K1 or vitamin K2 ingested from food is converted to menaquinone-4 in the body tissue, and in particular, the testis has increased menaquinone-4 concentration.
  • the present inventors have found that the intake of vitamin K can increase the amount of blood testosterone, leading to the present invention. That is, the present invention provides a testosterone increasing agent containing vitamin K.
  • vitamin K Conventionally known functions of vitamin K are to maintain blood coagulation normally, promote bone formation, suppress bone resorption, prevent arterial calcification and prevent arteriosclerosis, liver disease Is to treat. It is not known at all that vitamin K has an estrogen increasing effect. Non-patent document 1 and non-patent document 2 suggest that vitamin K is involved in the biosynthesis of testosterone, but the increase in testosterone by vitamin K administration was completely foreseen.
  • the vitamin K is preferably vitamin K2.
  • the vitamin K is menaquinone-4 and Z or menaquinone-7.
  • the present invention provides a medicament for preventing, ameliorating, and / or treating a symptom or disease caused by a decrease in testosterone, comprising the testosterone increasing agent.
  • the present invention also provides supplements, health foods or functional foods to which the testosterone increasing agent is added.
  • the amount of testosterone in the blood can be easily increased by ingesting vitamin K, which is highly safe for the human body. Fat-soluble vitamin K is more likely to accumulate in the body than conventional testosterone preparations, so it lasts longer. Restoring normal levels of testosterone can maintain or improve the functions that testosterone is involved in (muscle strength, sexual function, etc.) or improve symptoms or illnesses such as male climacteric disorder that develops when testosterone decreases . Since the testosterone increasing agent of the present invention is extremely easy to be taken on a daily basis as a functional food or a health food, the prevention of the symptoms and diseases is also contemplated.
  • the recommended amount of vitamins that humans need per day is 55 to 80 g (2005, Japanese dietary intake standard), whereas the upper limit of acceptable intake is 30 mg. It is a highly specific substance. Therefore, the testosterone increasing agent of the present invention is conventionally known and is superior in safety to the testosterone increasing agent.
  • FIG. 1 Vitamin K analog in rat testis when the MK-4 diet group according to Example 1 of the present invention and the control diet group and the low K diet group as comparative examples were administered to rats. It is a figure comparing the concentrations.
  • FIG. 2 is a graph comparing the P450scc mRNA expression levels in the rat of FIG.
  • FIG. 3 is a diagram comparing the amount of P450scc protein in the rat of FIG. 1.
  • FIG. 4 is a comparison of plasma testosterone concentrations in the rat of FIG.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in body weight over time when a vitamin K1-added diet group and an MK-4-added diet group according to Example 2 and a control diet group, which is a comparative example, are administered to rats.
  • FIG. 6 is a graph showing daily changes in the intake of the rat in FIG. 5.
  • FIG. 7 is a graph comparing the testicular vitamin K concentration in the rat of FIG. 5.
  • FIG. 8 is a graph showing changes in blood testosterone levels in the rat of FIG. 5.
  • FIG. 9 is a graph comparing testosterone concentrations in the testis of the rat in FIG. 5.
  • Vitamin K that can be used in the testosterone increasing agent of the present invention includes vitamins K1 to K3.
  • Vitamin K1 also called phylloquinone
  • Vitamin ⁇ 2 also called menaquinone
  • Vitamin 2 is produced by microorganisms and is abundant in dairy products such as natto and cheese.
  • Vitamin ⁇ 2 is also produced by bacteria in the intestinal tract.
  • Vitamin 2 has homologues of menaquinone-4 ( ⁇ -4) to menaquinone-15 (MK-15) depending on the length of the side chain isoprenoid group attached to the naphthoquinone skeleton. For example, cheese contains ⁇ -6 to ⁇ -9 and natto contains a large amount of ⁇ -7.
  • Vitamin ⁇ 3 also called menadione
  • Vitamin ⁇ 3 is a synthetic product.
  • vitamin K1 extracted from vegetable power and fermented product power using natto bacteria are extracted from the past food experience. More preferably, it is vitamin 2 that can be produced inexpensively and easily.
  • the method for producing each vitamin koji is not particularly limited, and commercially available products can be used without limitation. Specifically, fermentation methods using microorganisms, extraction / purification from foods, and chemical synthesis methods can be used.
  • Vitamin K1 is blue shiso, sesame seeds, morohaya, parsley, spring chrysanthemum, komatsuna, spinach, three leaves, alfalfa, weeping leaves, chestnut leaves, young barley stalks, young stalks of wheat , Cabbage, broccoli, cauliflower, tomato, vegetable oil (soybean oil, rapeseed oil, sesame oil, peanut oil
  • Vitamin K1 can also be obtained synthetically.
  • Vitamin K1 is a light yellow oil soluble in fat and stable to heat and unstable to light.
  • Vitamin K1 may be acidic.
  • Vitamin 2 is, for example, disclosed in JP-A-08-073396, JP-A-11-92414, JP-A-10-295393, It is fermented and produced by microorganisms such as Bacillus natto according to the method described in Kai-2001-136959.
  • the content of vitamin K contained in the testosterone increasing agent of the present invention is a force that varies depending on the intake of the yarn and the composition. Usually, 0.0001 to 100% by weight is preferable, and 0.001% to 90% by weight is preferable. More preferably, it is in the range of 0.01 to 70% by weight, more preferably 1 to 50% by weight. When the content of vitamin K is a 0.0001 0/0 or less, Do can ingest the amount necessary to obtain the testosterone increasing effect, in some cases.
  • the testosterone-increasing agent of the present invention is a substance known to increase testosterone in addition to the essential ingredient vitamin K, for example, a plant such as mackerel, a crude drug such as a horn of horn One or more of these extracts, benzyl darcosinolate, benzyl isothiocyanate and substituted pyrazole compounds may be added.
  • the testosterone increasing agent of the present invention includes, in addition to the essential ingredient vitamin K and appropriate testosterone increasing agent, pharmacologically usable carriers, excipients, auxiliaries, etc. It can be added in a range without inhibition.
  • lactose sucrose, fructose, glucose, glucose hydrate, sucrose, purified sucrose, erythritol, xylitol, sorbitol, mannitol, palatinose, reduced palatinose, powdered reduced maltose, starch, Carmellose, dextrin, corn starch, alpha starch, partially alpha starch, potato starch, corn starch, hydroxypropyl starch, amino acids, kaolin, anhydrous key acid, key acid, aluminum keyeate, sodium bicarbonate, calcium phosphate , Calcium dihydrogen phosphate, calcium carbonate, magnesium oxide, aluminum hydroxide, fatty acid or salt thereof, fatty acid monoglyceride and diglyceride, alcohol, vegetable oil, olive oil, soybean oil, corn oil, fatty oil, fat and oil, Carriers or excipients such as viscous paraffin, propylene glycol, ethylene glycol, polyethylene glycol, glycerin;
  • the testosterone increasing agent of the present invention is processed into liquids, powders, granules, tablets, capsules, syrups and the like for use as pharmaceuticals, supplements, functional foods or health foods. Since vitamin K is fat-soluble, the form is tablets or capsules. preferable.
  • the testosterone increasing agent of the present invention may be added directly to the raw material during the production of general baked goods such as bread, cooked rice, soup, prepared dishes, confectionery, and candy.
  • the method of ingestion when the testosterone increasing agent of the present invention is used as a medicine is not particularly limited.
  • oral ingestion transdermal administration, infusion, injection (intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous or intravenous).
  • injection injection (intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous or intravenous).
  • tablets or capsules are taken orally in that the burden on the patient is small.
  • the pharmaceutical dosage of the testosterone increasing agent of the present invention can be determined in consideration of various factors that affect the patient's symptoms, body weight, administration interval, administration method, and other clinical effects.
  • the vitamin K intake per day for an adult male is usually 10 g to 100 mg and preferably g to 100 mg. When used for therapeutic purposes, 6 mg to 10 Omg can be used.
  • the intake of vitamin K per day for adult men is 10 ⁇ m in consideration of safety. g-30 mg is preferred 50 ⁇ g-6 mg is more preferred.
  • the testosterone increasing agent of the present invention may be used as a medicine or functional food to be ingested by animals other than humans such as male livestock animals and pet animals.
  • Administration methods include parenteral intake such as injection, and oral intake in the form of functional foods and mixed feed.
  • the testosterone increasing agent of the present invention can be expected to be effective as a therapeutic or prophylactic agent for primary or secondary testicular hypofunction or testosterone deficiency due to aging or environmental factors.
  • the testosterone increasing agent of the present invention can prevent, ameliorate, and / or treat various diseases caused by a decrease in testosterone, particularly muscle, cognitive function, concentration, motivation, vascular flexibility, lipid metabolism, Prevention, improvement and Z or treatment of decline in sexual function, male function, urination function, etc. can be expected.
  • the effect of enhancing the amount of testosterone in the blood by the testosterone increasing agent of the present invention was examined using a normal rat.
  • normal rats In normal rats, it absorbs vitamin K made by intestinal bacteria, so vitamin K is not included in the diet, and even if it is not, extreme vitamin K deficiency does not occur, rats are normal living It is a model that can be put on a human body.
  • the experimental animals and the breeding environment are as follows.
  • mice Normal rats (Wistar / Std, 8 weeks old male)
  • Breeding environment Breeding in a breeding room set at 12 hours light and dark with a temperature of 23 ° C, humidity of 50 ⁇ 5%, lighting at 8:00 am and turning off at 8:00 pm.
  • the amount of vitamin K1 in the control diet is the concentration of vitamin K1 used in the standard refined diet of AIN93G, and therefore the control diet group contains the amount of vitamin K taken by the normal diet of rats.
  • Vitamin K1 or menaquinone-4 (hereinafter also referred to as MK-4) was added to each experimental food so as to have the composition ratio shown in Table 1, and mixed uniformly.
  • Table 1 shows the composition of the experimental food used.
  • Vitamin B 12 0.25 mg
  • Vitamin K is not added to the low-K diet group, 7.5 mg of K1 is added to the control diet group, and 750 mg of MK-4 is added to the MK-4 diet group, and the total amount is 100 g with sucrose. Adjusted to mix vitamins.
  • MR Labstock manufactured by Nippon Agricultural Industry Co., Ltd.
  • preliminary breeding was performed with free feeding and free drinking for 3 to 5 days.
  • Four rats for each experimental diet group were reared in a wire mesh cage. After pre-breeding, the test food was fed and reared for 35 days with free feeding and free drinking. Blood collection and testis extraction were performed.
  • Tissue lg was accurately weighed into a brown centrifuge tube with a stopper, 2 ml of 66% IPA solution was added, and homogenized using a Biotron (polytron homogenizer) under ice cooling. At the time of homogenization, the homogenate on the shaft was washed off with 3 ml of 66% IPA and carved into the sample. To this, 1 ml of hexane solution containing 9.96 ng / ml or 996 ng / ml of MK-3 with 5 ml of hexane as an internal standard was added, and the mixture was extracted by shaking for 5 minutes.
  • Vitamin Ks in the prepared HPLC measurement sample are of non-fluorescent acid type. Therefore, the samples were separated by HPLC, and vitamins were quantified by the HPLC-reduction fluorescence method, which measures the fluorescence intensity as a fluorescent reduced form by using a platinum catalyst column. Vitamin K was determined relative to the internal standard MK-3.
  • the measurement system for vitamin K by HPLC is as follows.
  • Fluorescence detector F-1000 (Hitachi, detection wavelength Ex 240nm, Em 430nm) • Recorder: D-2000 (Hitachi)
  • HPLC-reduction is performed by measuring the fluorescence intensity of non-fluorescent acid-vitamin vitamin Ks present in a sample as a fluorescent reduced form by using a platinum catalyst column.
  • the fluorescence method is used. Therefore, in the state where oxygen is dissolved in the mobile phase, the reduction is adversely affected. Therefore, the moving bed previously removed the dissolved oxygen by applying ultrasonic waves under reduced pressure, and was bubbled with nitrogen gas (200 ml / min or more) from 2 hours before the measurement until the end.
  • RNA extraction reagent About 0.1 lg of the testis of each individual was placed in a special tube, and lml of ISOGEN (NIPP ONGENE), an RNA extraction reagent, was added and homogenized using a Polytron homogenizer. The homogenate was transferred to an Eppendorf tube and left at room temperature for 5 minutes. Thereafter, black mouth form 20001 was added and vigorously stirred for 15 seconds using a vortex. After allowing to stand for 2 to 3 minutes, centrifugation (13000 rpm, 4 ° C, 15 minutes) was performed, and only the upper layer separated into three layers was collected. IPA was added at 500 / zl to this, and after gently shaking it up and down, it was left for 10 minutes.
  • ISOGEN NIPP ONGENE
  • RNA sample was subjected to absorbance measurement (260 nm, 280 nm) and agarose gel electrophoresis (0.7% TA E agarose gel, 150 V, 35 minutes) to test the concentration and purity of RNA.
  • RNA obtained from each individual is dissolved in DEPC-dH 0 so that the concentration is 1 g / 1.
  • the solution was dispensed into two PCR tubes. One was prepared for RT (-) with no reverse transcriptase added and for confirming the presence or absence of genomic DNA contamination.
  • a reverse transcription reaction was performed at 50 ° C, 60 minutes ⁇ 70 ° C, 15 minutes to obtain a cDNA sample.
  • a 100-fold diluted cDNA solution prepared by reverse transcription was used as a sample.
  • the reaction reagent used was SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (TaKaRa). Add SYBR Premix Ex Taq 25 ⁇ 1, Rox Reference Dye 1 ⁇ 1, forward and reverse primer solutions 1.5 1 each, dH 0 17 1 to sample or standard cDNA 41
  • reaction solution was dispensed into Microwell optical 96-well Reaction Plates in a volume of 24 1 in 2 wells and set in the ABI PRISM 7000 Sequence Detection System.
  • GAPDH and eukaryotic cell elongation factor 1a1 are used as internal standard genes for gene expression, and the expression level of each gene is expressed as target gene expression level / internal standard gene expression. The amount was calculated and expressed as a relative value with the value of the control food group being 1.
  • Anti-P450scc antibody was purchased from Chemicon.
  • SDS buffer 100 ⁇ 1 was added to tissue homogenate (200 ⁇ 1) and left in a boiling water bath for 5 minutes to form SDS.
  • the membrane was washed with TBS-T ( e ), and blocked with TBS-T (skim milk solution) containing 5% skim milk for 1 hour.
  • the primary antibody reaction was performed for 1 hour in skim milk solution containing anti-P450SCC antibody (1/5000).
  • the secondary antibody reaction was performed for 1 hour in a skim milk solution containing anti-Rabbit IgG-HRP antibody (1/5000).
  • Anti- ⁇ -actin antibody was used as a control.
  • ECL TM Western blotting detection reagent manufactured by Amersham
  • Luminescent signal for Las-1000 imaging s Images were obtained with ystem (manufactured by FUJIFILM) and quantified with ImageGauge (trademark) image processing software.
  • the protein concentration in the tissue homogenate was measured by the Bradford method. Appropriately diluted 20 ⁇ l of the sample solution was placed in an Eppendorf tube, to which 1 ml of 5-fold diluted Bio-Rad protein assay was added and mixed by vortexing. After 5 minutes at room temperature, the absorbance at 595 nm was measured. As standard curve, ushi serum albumin (BSA) was used.
  • BSA ushi serum albumin
  • Testosterone EIA kit (Cayman cnemical)
  • the recovered ether layer was dried under reduced pressure using a centrifugal vacuum concentrator (TAITEC).
  • TITEC centrifugal vacuum concentrator
  • the obtained concentrate was dissolved in 0.5 ml of EIA buffer attached to the kit, and this was used as a plasma sample.
  • Testicular tissue lOOmg was homogenized using Biotron while cooling with ice in 5 ml of phosphate buffered saline. 1 ml of this homogenate was placed in a test tube, 5 ml of jetyl ether was added, and the mixture was vortexed for about 1 minute and centrifuged (3000 rpm, 4 ° C., 5 minutes).
  • Figure 1 shows the low K diet group (without vitamin K added), the control diet group (Kl 0.75 mg / kg added diet), and the M K-4 added diet group (MK-4 75 mg / kg added diet).
  • the results of analysis of vitamin K 1 (Right) and MK-4 (Left) concentrations in the testis are shown below. In all cases, it was confirmed that testicular vitamin K was changed to MK-4 regardless of the administration form. Force with no significant difference between low K diet group and control diet group MK-4 concentration was significantly increased in MK-4 diet group.
  • FIG. 2 shows the mRNA expression level of P450scc, which is a steroid hormone synthesis pathway gene.
  • the low K diet group was slightly lower than the control diet group and the MK-4 supplemented diet group
  • FIG. 3 shows the amount of P450scc protein. There was no significant change in the control diet group and the low K diet group, but there was a significant increase in the MK-4 supplemented diet group.
  • FIG. 4 shows plasma testosterone concentrations. MK-4 supplemented food group compared to control food group As a result, plasma testosterone concentration increased significantly.
  • Vitamin K concentration in the control diet contains the necessary amount of vitamin K, which is the amount that can be consumed in daily diets, and a lack of vitamin K rarely reduces blood testosterone. It is not considered.
  • blood testosterone was increased by actively taking vitamin K according to the present invention. Therefore, if blood testosterone is reduced for some reason, blood testosterone is increased by taking vitamin K. be able to.
  • Example 1 the laboratory animals and the rearing environment are normally 12 hours of HWistar / Std (8-week-old male) at 23 ° C, 50 ⁇ 5% humidity, 8 am on, 8 pm off. The animals were reared in a breeding room set for light and dark cycles.
  • Control diet group (vitamin 0.75mg / kg supplemented diet)
  • Vitamin K1 added food group (Vitamin Kl 75 mg / kg added food)
  • Vitamin K1 was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Menaquinone-4 was manufactured by Nisshin Faluma. Each experimental diet should have vitamin K1 or MK-
  • the breeding period was 35 days, and blood was collected from the tail vein at 18:00 every week. Measurement items include body weight, food intake, testicular vitamin K content, testicular testosterone concentration, and plasma testosterone concentration.
  • the analysis method is the same as in Example 1.
  • Testicular vitamin K and testosterone data were analyzed using the Tukey method. Two-way analysis of variance (with repetitions) was used to analyze changes in blood testosterone concentration over time. In all cases, a significant difference was P 0.05.
  • FIG. 7 shows the results of testicular vitamin K concentration (Right: vitamin Kl, Left: MK-4). In both the vitamin K1 and MK-4 diet groups, testicular MK-4 concentrations increased markedly. It is thought that vitamin K1 was converted to MK-4 in the body.
  • FIG. 8 shows changes in blood testosterone levels.
  • the blood testosterone level in the vitamin K1-supplemented group was strong at the 4th and 5th weeks with no difference from the control group. In the second and third weeks, it was stronger than the control diet group.
  • a two-way analysis of variance analysis was performed throughout, and a significant difference was found at P 0.01. In the MK-4 addition group, a significant difference was observed in the results of two-way analysis of variance (P 0.01) in which the blood testosterone concentration was high between 2 and 5 weeks after administration.
  • FIG. 9 shows the testosterone concentration results in the testis.
  • the testosterone level also increased.
  • vitamin K1 and vitamin K2 were found to increase the amount of testosterone in blood and testis.
  • vitamin K2 is administered. Since no changes in body weight or changes in dietary intake were observed, increasing testosterone with vitamin K is a safe method.
  • Testosterone enhancer containing vitamin K as an active ingredient.
  • Testosterone consisting of a testosterone enhancer containing vitamin K as an active ingredient A drug to prevent, ameliorate, and / or treat symptoms or diseases caused by a decrease in
  • vitamin K is vitamin K2.
  • symptom and illness are muscle, cognitive function, concentration, motivation, vascular flexibility, lipid metabolism, sexual function, male function or decreased urinary function.

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Abstract

　より安全で食経験豊富な食品成分であって、テストステロン量を増加させる物質を提供する。本発明のテストステロン増加剤は、ビタミンKを有効成分として含有する。ビタミンは、メナキノン-4および／またはメナキノン-7であることが好ましい。この増加剤は、テストステロンが低下することにより生じる症状または疾病を予防、改善および／または治療するための医薬やサプリメント、健康食品または機能性食品として有用である。

Description

明 細 書
テストステロン増加剤
技術分野
[0001] 本発明は、テストステロン増加剤に関し、より詳細には内因性テストステロンを増量 するための組成物に関する。
背景技術
[0002] 男性ホルモンの一種であるテストステロンは、筋肉を作る働き、認知機能、血管の柔 軟性、脂質代謝、性機能などに広く関与している。テストステロン分泌量は、加齢によ り減少するが、環境ホルモンの存在も影響している。最近では、極端なビタミン K欠乏 状態にした無菌ラットの DNAマイクロアレイ解析から、メナキノン- 4がテストステロン生 合成に関与して！/ヽる可能性が示唆された (非特許文献 1、非特許文献 2)。
[0003] テストステロンの分泌量が減少すると、集中力や意欲が低下し、物覚えも悪くなり、 また、筋力、排尿機能、男性機能も衰えることが指摘されている。近年は、性腺機能 低下症により血中テストステロン量が低下して、上記のような症状が現れる男性更年 期障害の患者が増えている。
[0004] 男性更年期障害などの治療の一つとして、テストステロン製剤を注射するホルモン 補充療法がある。しかし、注射は、血中のテストステロンレベルを急激に上昇させ、か えって不調をきたすことがある。急激なホルモンレベルの上昇によって、前立腺、血 管、肝臓、肺などに有害な副作用をきたすことも懸念される。そのため、ホルモン補充 療法を経皮パッチで徐放的に行う場合がある。
[0005] 上記のように外部力 テストストロンを補充するのではなぐマ力などに含まれるベン ジル類ダルコシノレートおよびベンジル類イソチオシァネート（特許文献 1)、マ力と枝 角との混合物 (特許文献 2)、または置換ピラゾールイ匕合物 (特許文献 3)を摂取する ことによって、体内のテストステロン量を強化する方法が提案されて 、る。
非特許文献 1：第 8回 Vitamin K & Bone研究会 記録集、 pp 87-89、 2005年 12月 10日 、エーザィ株式会社発行
非特干文献 2： Shirakawa et al, Biochim. Biophys. Acta Vitamin K deficiency reduces testosterone production in the testis through down-regulation of the Cypl la a chol esterol side chain cleavage enzyme in rats, ARTICLE In Press, Accepted Manuscrip t, Available online 6 June 2006
特許文献 1：特開 2005-306754
特許文献 2：特表 2003-523945
特許文献 3：特表 2005-504093
発明の開示
[0006] 上記したテストステロン増加作用を有する化合物は、生薬あるいは化学合成した薬 物である。食経験豊富で安全な食品成分または栄養素で、血中テストステロン量を 増加させるものが好ましいところ、そのような物質は現在知られていない。このような 状況で、より安全で食経験豊富な食品成分であって、テストステロン量を増加させる 物質を提供することが望まれて 、る。
[0007] 発明者らは、食品から摂取されたビタミン K1あるいはビタミン K2が体内組織におい てメナキノン- 4へ変換されることを見出し、特に精巣でメナキノン- 4濃度が高くなつて いることから、精巣中でのビタミン Kの機能解明を試みてきた。これらの研究を経て、 本発明者らは、ビタミン Kを摂取することで、血中テストステロン量を増加できることを 見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、ビタミン Kを含有するテストステロン 増加剤を提供する。
[0008] ビタミン Kの従来知られている機能は、血液凝固を正常に維持する、骨形成を促進 する、骨吸収を抑制する、動脈の石灰化を防止して動脈硬化を予防する、肝疾患を 治療することである。ビタミン Kにエストロゲン増加作用があることは全く知られていな い。非特許文献 1や非特許文献 2からは、テストステロンの生合成にビタミン Kが関与 することが示唆されるものの、ビタミン Kの投与によってテストステロンが増加すること は全く予見されていな力つた。
[0009] 前記ビタミン Kは、ビタミン K2であることが好ましい。
[0010] より好ましくは、前記ビタミン Kは、メナキノン- 4および Zまたはメナキノン- 7である。
[0011] 本発明は、上記テストステロン増加剤からなる、テストステロンが低下することにより 生じる症状または疾病を予防、改善および Zまたは治療するための医薬を提供する [0012] 本発明は、また、上記テストステロン増加剤を添加したサプリメント、健康食品または 機能性食品もまた提供する。
[0013] 本発明によれば、人体にとって安全性の高いビタミン Kを摂取することにより、血中 テストステロン量を容易に増加させることができる。脂溶性のビタミン Kは従来のテスト ステロン製剤よりも体内に蓄積されやすいため、効果が長続きする。テストステロン量 の正常なレベルの回復によって、テストステロンが関与する機能 (筋力、性機能など） を維持、改善し、あるいはテストステロンが減少して発症する男性更年期障害などの 症状または疾病を改善することができる。本発明のテストステロン増加剤は、機能性 食品や健康食品として日常的に摂取することが極めて容易であるので、前記症状や 疾病の予防も企図される。
[0014] ヒトがー日あたり必要とされるビタミン の目安量は 55〜80 g (日本人の食事摂取 基準 2005年版)であるのに対し、許容上限摂取量は 30mgと極めて高ぐビタミン ま 安全性の高い物質である。したがって、本発明のテストステロン増加剤は、従来知ら れて 、るテストステロン増加剤よりも安全性の点で優れて 、る。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]本発明の実施例 1に従う MK-4食群、ならびに比較例であるコントロール食群お よび低 K食群を、ラットへ投与したときの、ラット精巣中のビタミン Kアナログ濃度を比 較した図である。
[図 2]図 1のラットの P450sccの mRNA発現レベルを比較した図である。
[図 3]図 1のラットの P450sccのタンパク質量を比較した図である。
[図 4]図 1のラットの血漿中テストステロン濃度を比較した図である。
[図 5]実施例 2に従うビタミン K1添加食群および MK-4添加食群、比較例であるコント ロール食群を、ラットへ投与したときの、体重の経日変化を示す図である。
[図 6]図 5のラットの摂取量の経日変化を示す図である。
[図 7]図 5のラットの精巣中ビタミン K濃度を比較した図である。
[図 8]図 5のラットの血中テストステロン値の変化を示す図である。
[図 9]図 5のラットの精巣中のテストステロン濃度を比較した図である。 発明を実施するための最良の形態
[0016] 以下に、本発明のテストステロン増加剤の一実施形態を詳細に説明する。本発明 のテストステロン増加剤に使用可能なビタミン Kには、ビタミン K1〜K3がある。ビタミン K1 (フイロキノンともいう）は、緑黄色野菜、豆類、植物油、海藻類、魚介類などに多く 含まれる。ビタミン Κ2 (メナキノンともいう）は、微生物が産生し、納豆や、チーズなどの 乳製品に多く含まれる。ビタミン Κ2は腸管内の細菌によっても作り出される。ビタミン 2には、ナフトキノン骨格につく側鎖イソプレノイド基の長さに応じてメナキノン- 4 (ΜΚ- 4)からメナキノン- 15 (MK-15)の同族体が存在する。例えばチーズには ΜΚ-6〜ΜΚ- 9が、納豆には ΜΚ-7が多量に含まれている。ビタミン Κ3 (メナジオンともいう）は合成 物である。
[0017] ビタミン Κ3は、多量に摂取すると副作用が心配される。よって、これまでの食経験か ら、野菜力 抽出精製されるビタミン K1や納豆菌などを用いた発酵物力 抽出される ビタミン Κ2力 安全性がより高い点で好ましい。さらに好ましくは、安価かつ容易に生 産可能なビタミン Κ2である。食品添加物として認可されて 、るメナキノン- 4および Ζま たは食品素材として利用されているメナキノン- 7が特に好ましい。なお、食品から摂 取されたビタミン K1および Κ2は、生体内でメナキノン- 4に転換されることが知られて いる。
[0018] 各ビタミン Κの製造法は、特に限定されず、市販のものも制限なく使用することがで きる。具体的には、微生物による発酵法、食品からの抽出 ·精製、化学合成法を使用 することができる。
[0019] ビタミン K1は、青しそ、エゴマ、モロヘイヤ、パセリ、春菊、小松菜、ほうれん草、三 つ葉、アルファルファ、はしばみの葉、栗の葉、大麦の若茎、力 す麦の若茎、キヤべ ッ、ブロッコリ一、カリフラワー、トマト、植物油（大豆油、ナタネ油、ゴマ油、落花生油
、コーン油、サフラワー油、ひまわり油、米ぬか油、ォリーブ油）などから、公知の方法 (例えば特開平 5-155803)によって抽出および精製される。ビタミン K1は、合成によつ ても得られる。ビタミン K1は、脂肪に可溶な淡黄色油状であって、熱に対し安定であ る力 光に対しては不安定である。ビタミン K1は、酸ィ匕物であってもよい。
[0020] ビタミン Κ2は、例えば特開平 08-073396、特開平 11-92414、特開平 10-295393、特 開 2001-136959などに記載の方法に従って、納豆菌などの微生物によって発酵生産 される。
[0021] 本発明のテストステロン増加剤に含有されるビタミン Kの含有量は、糸且成物の摂取 量によって変わってくる力 通常、 0.0001〜100重量％でよぐ好ましくは 0.001%〜90 重量％、より好ましくは 0.01〜70重量％、さらに好ましくは 1〜50重量％の範囲である 。ビタミン Kの含有量が 0.0001重量0 /0以下であると、テストステロン増加効果を得るの に必要な量を摂取できな 、場合がある。
[0022] 本発明のテストステロン増加剤には、必須成分のビタミン Kにカ卩えて、テストステロン を増加させることが知られている物質、例えばマ力などの植物、シ力の角枝などの生 薬、これらの抽出物、ベンジル類ダルコシノレート、ベンジル類イソチオシァネートお よび置換ピラゾールイ匕合物の一種または二種以上を添加してよい。
[0023] 本発明のテストステロン増加剤には、必須成分のビタミン Kや適宜のテストステロン 増加作用物質のほかに、薬理学上使用可能な担体、賦形剤、助剤などを、本発明の 効果を阻害しな 、範囲で添加することができる。
[0024] 具体的には、乳糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、ブドウ糖水和物、白糖、精製白糖、エリ スリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、パラチノース、還元パラチノー ス、粉末還元麦芽糖、水ァメ、カルメロース、デキストリン、トウモロコシデンプン、アル ファー化デンプン、部分アルファ一化デンプン、バレイショデンプン、コーンスターチ 、ヒドロキシプロピルスターチ、アミノ酸、カオリン、無水ケィ酸、ケィ酸、ケィ酸アルミ- ゥム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二水素カルシウム、炭酸カルシウム 、酸化マグネシウム、水酸ィ匕アルミニウム、脂肪酸またはその塩、脂肪酸モノグリセリド およびジグリセリド、アルコール、植物油、ォリーブ油、ダイズ油、トウモロコシ油、脂肪 油、油脂、粘性パラフィン、プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレング リコール、グリセリンなどの担体または賦形剤；結晶セルロース、結晶セルロース 'カル メロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロ キシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチ ノレセルロースフタレート、ヒドロキシプロピノレメチノレセルロースアセテートサクシネート、 カノレメロースナトリウム、ェチノレセノレロース、カノレボキシメチノレエチノレセノレロース、ヒド ロキシェチルセルロース、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレ イショデンプン、アルファ一化デンプン、部分アルファ一化デンプン、ヒドロキシプロピ ルスターチ、デキストリン、プルラン、ポリビニルピロリドン、アミノアルキルメタタリレート コポリマー E、アミノアルキルメタクリレートコポリマー RS、メタクリル酸コポリマー L、メ タクリル酸コポリマー、ポリビュルァセタールジェチルァミノアセテート、ポリビニルァ ルコール、アラビアゴム、アラビアゴム末、寒天、ゼラチン、白色セラック、トラガント、 マクロゴールなどの結合剤；コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、合 成ケィ酸アルミニウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、メタケイ酸アルミン酸マグネシゥ ム、リン酸水素カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、ロウ類、水素添加植物油、ポ リエチレングリコール、軽質無水ケィ酸、合成ケィ酸アルミニウム、ステアリン酸、マク 口ゴール、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、含水二酸化ケ ィ素、ショ糖脂肪酸エステルなどの滑沢剤;潤滑剤；結晶セルロース、メチルセルロー ス、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、 カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、コムギデンプン、コメデンプン、ト ゥモロコシデンプン、バレイショデンプン、部分アルファ一化デンプン、ヒドロキシプロ ピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、トラガントなどの崩壊剤；大豆レ シチン、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒ マシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、セスキォレイン酸ソルビ タン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタ ン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫 酸ナトリウム、ラウロマクロゴールなどの界面活性剤；乳化剤；リン酸ナトリウムなどの溶 解補助剤；吸収促進剤;塩酸、クェン酸、クェン酸ナトリウム、酢酸、酒石酸、水酸ィ匕 ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、乳酸などの pH調整 剤；天然榭脂などの光沢剤；安定化剤；酸化防止剤；保存剤；湿潤剤；着色剤；芳香 剤;無痛化剤などが挙げられる。
本発明のテストステロン増加剤は、医薬、サプリメント、機能性食品または健康食品 として使用するために、液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤などの 形態に加工される。ビタミン Kは脂溶性であるため、形態は錠剤またはカプセル剤が 好ましい。
[0026] 本発明のテストステロン増加剤は、パン、米飯、スープ、惣菜、菓子、キャンディなど の一般カ卩工食品の製造時に原料に直接添加されてもよい。
[0027] 本発明のテストステロン増加剤を医薬として使用する場合の摂取方法は、特に限定 されない。例えば、経口摂取、経皮投与、輸液、注射 (筋肉内、腹腔内、皮下または 静脈)などである。好ましくは、患者の負担が少ない点で、錠剤またはカプセル剤の 経口摂取である。
[0028] 本発明のテストステロン増加剤の医薬としての用量用法は、患者の症状、体重、投 与間隔、投与方法、ならびに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考慮して決 定され得る。典型的には、成人男性一日あたりのビタミン K摂取量として、通常、 10 g〜100mgでよぐ g〜100mgが好ましい。治療目的で使用する場合は、 6mg〜10 Omgで使用可能である。
[0029] 本発明のテストステロン増加剤をサプリメント、機能性食品、健康食品または一般の 食品に用いる場合には、安全性を考慮して、成人男性一日あたりのビタミン Kの摂取 量として、 10 μ g〜30mgが好ましぐ 50 μ g〜6mgがさらに好ましい。
[0030] 本発明のテストステロン増加剤は、ヒト以外にも、雄の家畜動物、愛玩動物などの動 物へ摂取する医薬や機能性食品として用いてもよい。投与方法は、注射などの非経 口摂取、機能性食品や配合飼料の形態の経口摂取がある。
[0031] 本発明のテストステロン増加剤、該増加剤からなる医薬および該増加剤を添加した 食品を、ヒトを含む雄の哺乳動物が摂取した場合に、ビタミン Kによってテストステロン 量が増加する。よって、本発明のテストステロン増加剤は、原発性または続発性精巣 機能低下症や、加齢または環境因子によるテストステロン欠乏症の治療薬または予 防薬としての効果が期待できる。本発明のテストステロン増加剤は、テストステロンの 低下に起因する各種疾病を予防、改善および Zまたは治療することができ、特に、筋 肉、認知機能、集中力、意欲、血管の柔軟性、脂質代謝、性機能、男性機能、排尿 機能などの低下の予防、改善および Zまたは治療を期待できる。
[0032] 以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例 に限定されるものではない。 〔実施例 1〕
本発明のテストステロン増加剤による血中テストステロン量の増強効果を、通常のラ ットを用いて調べた。通常のラットとは、腸内細菌の作るビタミン Kを吸収しているため 餌にビタミン Kが含まれて 、なくても極端なビタミン K欠乏は起こらな 、ラットで、通常 の生活して 、るヒトに外揷できるモデルである。
[0033] (材料および方法）
I モデル動物の作製
(実験動物の飼育）
実験動物および飼育環境は、以下のとおりである。
実験動物：通常ラット (Wistar/Std、 8週齢の雄）
飼育環境:温度 23°C、湿度 50±5%、午前 8時点灯、午後 8時消灯の 12時間の明暗サ イタルに設定された飼育室で飼育した。
[0034] 実験食群として、以下の 3群を設けた。
(1)低 K食群 (ビタミン K無添加食）
(2)コントロール食群（ビタミン Kl 0.75mg/kg添加食）
(3) MK-4添加食群 (メナキノン- 4 75mg/kg添加食）
ここで、コントロール食中のビタミン K1量は、 AIN93Gの標準精製飼料で使用されて いるビタミン K1濃度であって、よってコントロール食群は、ラットの通常の飼料力 摂 取されるビタミン K量を配合した標準食を意味する。 MK-4添加食群に添加したメナキ ノン- 4には、製品名：メナテトレノン（日清フアルマ社製)を使用した。
[0035] 各実験食は、表 1の組成割合となるように、ビタミン K1またはメナキノン- 4(以下、 MK -4ともいう)を添加して、均一に混ぜ合わせた。用いた実験食の組成を表 1に示す。
[0036] [表 1] 実験食の組成
組成（％)
コーンスターチ 52.9486
カゼイン 20
スクロース 10
大豆油 7
セルロース 5
ミネラル混合 3.5
ビタミン混合 (独自調製） 1
レシスチン 0.3
重酒石酸コリン 0.25
第三ブチルヒドロキノン 0.0014 ビタミン混合の組成
Vitamin A 40000 1U
Vitamin B12 0.25 mg
Vitamin D3 10000 IU
Vitamin E 750 IU
塩酸チアミン 60 mg
リボフラビン 60 mg
塩酸ピリドキシン 70 mg
ニコチン酸 300 mg
D-パントテン酸 Ca 160 mg
葉酸 20 mg
D-ビォチン 2 mg
Vitamin K
※Vitamin Kは、低 K食群には無添加、コントロール食群には K1を 7.5mg、そして MK -4添加食群には MK-4を 750mg添カ卩し、さらに全量をスクロースで 100gに調整してビ タミン混合とした。
[0037] 飼育方法は、市販の固型飼料 (製品名： MRラボストック、日本農産工業株式会社製 )を用いて、 3〜5日間自由摂食、自由摂水で予備飼育を行った。各実験食群に供す るラットは、それぞれ 4匹ずつ金網ケージ内にて集団飼育を行った。予備飼育後、実 験食を給餌し、自由摂食と自由摂水で 35日間飼育を行った。採血及び精巣の摘出 を行った。
[0038] II ビタミン K含量の測定
(HPLC測定用サンプルの調製） 共栓付き褐色遠沈管に、組織 lgを正確に量り取り、 66% IPA溶液を 2mlカ卩え、氷冷 下においてバイオトロン（ポリトロン型ホモジナイザー）を用いてホモジナイズした。ホ モジナイズ時に、シャフトについたホモジネートを 66% IPA 3mlで洗い落とし、サンプ ルにカロえた。これに、へキサン 5mlを内部標準として MK-3を 9.96ng/mlあるいは 996ng /ml含むへキサン溶液を lml加え、 5分間振とう抽出を行った。
[0039] その後、遠心分離（3000rpm、 4°C、 5分）を行 、、上層のへキサン層 5mlを褐色試験 管に分取した。これを遠心型濃縮機で減圧留去し、乾固させたものを再びへキサン 2 mlに溶解した。このサンプルを、あらかじめへキサン'エーテル（96 :4、 v/v)溶液 10ml とへキサン 10mlで洗浄してお!、た Sep- Pakシリカカートリッジ（Waters社）にアプライし た。
[0040] へキサン 10mlでカートリッジを洗浄した後に、へキサン ·エーテル (96： 4、 v/v)溶液 5 mlを用いて K類を溶出させた。再び、遠心型濃縮機で乾固させた後、残留物にエタノ ール 200 /ζ 1 (ΜΚ-3、 996ng/mlの内部標準を用いた場合は 2ml)をカ卩えて溶解し、 0.5 μ mのフィルター（DISMIC03JP050AN、 ADVANTEC)で微粒子を除去し、これを HPL C測定用サンプルとした。
[0041] (HPLCの測定条件）
作製した HPLC測定用サンプル中でのビタミン K類は、非蛍光性の酸ィ匕型である。 そこで、サンプルを HPLCによって分離し、白金触媒カラムを用いることによって蛍光 性の還元型として、その蛍光強度を測定する HPLC-還元蛍光法によって、ビタミン 類の定量を行った。ビタミン K類は、内部標準である MK-3との相対値として求めた。
[0042] (HPLCによるビタミン Kの測定系）
HPLCによるビタミン Kの測定系は、以下のとおりである。
•HPLC用機器： Waters 600E system (Waters社）
'カラム： Puresil C18、 5 m、 120Aゝ 4.6nm X 50mm (Waters社）
•カラムヒーター： Column heater (Bio— Rad社)
•カラムヒーター温度： 50°C
'還元装置：白金還元カラム IRICA-RC-10-1 (IRICA社）
•蛍光検出器： F-1000 (日立社、検出波長 Ex 240nm、 Em 430nm) •記録計: D-2000 (日立社）
•分析条件：移動層 MeOH- EtOH (8 : 2)、流速 1.Oml/min
[0043] この方法では、サンプル中に存在する非蛍光性の酸ィ匕型のビタミン K類を、白金触 媒カラムを用いることにより蛍光性の還元型として、その蛍光強度を測定する HPLC- 還元蛍光法を用いている。そのため、移動相中に酸素が溶存している状態では、還 元化に悪影響を及ぼす。そこで、移動層は、予め減圧下で超音波をかけることによつ て溶存酸素を除去し、測定 2時間前から終了時まで窒素ガス (200ml/min以上）をバ プリングした。
[0044] III RNAの測定
(Total RNAの調製）
各個体の精巣を専用のチューブに約 0. lgとり、 RNA抽出試薬である ISOGEN (NIPP ONGENE社）を lmlカ卩え、ポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジ ネートをエツペンドルフチューブに移し、室温で 5分間置いた。その後、クロ口ホルム 2 00 1を加え、ボルテックスを用いて 15秒間激しく攪拌した。 2〜3分間静置後、遠心分 離（13000rpm、 4°C、 15分）し、 3層に分離したものの上層のみを分取した。これに IPA を 500 /z l加え、軽く上下に振った後、 10分間放置した。
[0045] 再び、遠心分離（13000rpm、 4°C、 15分）を行!、、得られた沈殿を 75%エタノールで 1000 μ 1、 500 μ 1と 2回エタノールリンスした。沈殿を 300 μ 1の DEPC- dH 0で溶解させ
2
、その一部を吸光度測定（260nm、 280nm)およびァガロースゲル電気泳動（0.7%TA Eァガロースゲル、 150V、 35分）に供し、 RNAの濃度および純度の検定を行った。
[0046] (逆転写反応による cDNAの調製）
各個体から得られた RNAを、 1 g/ 1となるように DEPC-dH 0に溶解し、この RNA
2
溶液を PCRチューブに 4 1ずつ 2本に分注した。 1本は、逆転写酵素加えない RT (-) 用、ゲノム DNA混入の有無の確認用に作製した。
[0047] DEPC-dH 0 10 ^ 1に、 Oligo(dT) (50 μ Μ)を 1 μ 1、 10mM dNTPmix (dATPゝ dGTP、
2 20
dCTP、 dTTP)を 1 μ 1カ卩えたものを、それぞれのチューブに分注した。チューブを PCR Thermal cycler (TaKaRa社製）にセットし、 65。C、 5分間加温した。
[0048] 加温後、氷上に 1分間以上置!、た後、スピンダウンを行!、、これに、 5 X First-Stran d Bufferを 4 μ 1、 0.1M DTTを 1 μ 1、 RNase OUTを 0.5 μ 1、 Super Script III (RT (-)では dH Oを用いた）を 0.5 μ 1ずつ混和したものを加えた。再び、 Thermal cyclerにセットし
2
、 50°C、 60分→ 70°C、 15分間で逆転写反応を行い、 cDNAサンプルを得た。
[0049] (定量 RT-PCR)
逆転写反応により調製した cDNA溶液を 100倍希釈したものを、サンプルとして用い た。反応試薬は、 SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (TaKaRa)を用いた。サン プルまたはスタンダード用 cDNA 4 1に、 SYBR Premix Ex Taq 25 μ 1、 Rox Reference Dye 1 μ 1、フォワードおよびリバースプライマー溶液を各 1.5 1、 dH 0 17 1を加え
2
た。 MicroAmp Optical 96— well Reaction Plateに、上記反応溶液を 24 1ずつ 2wellに 分注し、 ABI PRISM 7000 Sequence Detection Systemにセットした。
[0050] PCR反応サイクルは、（60°C、 2分間） X 1→ (95°C、 10分間） X 1→ (95°C、 15秒 → 60°C、 1分間） X 50サイクルで行った。表 2に、定量 RT-PCRで使用したプライマー の塩基配列 (フォワード：配列番号 1、リバース:配列番号 2)を示す。
[表 2]
Figure imgf000014_0001
[0051] 本方法では、遺伝子発現量の内部標準遺伝子として GAPDHおよび真核細胞伸長 因子 1 a 1 (EF-1)を用い、各遺伝子の発現量は、対象遺伝子発現量/内部標準遺伝 子発現量で算出し、コントロール食群の値を 1として相対値で示した。
[0052] IV ウェスタンブロット法による P450sccタンパク質量の測定
(生体組織試料および抗体）
解剖後、 -80°Cで保存しておいた上記各群の精巣を用いた。抗 P450scc抗体は、 Ch emicon社力ら 入した。
[0053] (組織ホモジネートの調製） 精巣 0.2gを、 1mlの 1 X Phosphate buffered saline (PBS, 10 μ 1の lOOmM phenyl meth ane sulfonyl fluoride (PMSF)を含む）中で氷冷しながら、バイオトロン（ポリトロン型ホ モジナイザー）でホモジナイズした。これを 3000rpm、 5分間、 4°Cの遠心分離により未 破砕細胞を取り除いた上清を回収し、組織ホモジネートとした。この一部をタンパク質 定量に用いた。
[0054] (サンプルの SDS化）
組織ホモジネート 200 μ 1に 3 X SDS buffer ) 100 μ 1を加え、沸騰湯浴中で 5分間放置 し、 SDS化を行った。
[0055] (SDS-PAGE)
SDS化したサンプルをタンパク質濃度力 S1 μ g/ 1となるように、 1 X SDS bufferで希釈 した後、その 15 μ 1をポリアクリルアミドゲル (b)に供し、電気泳動 (e) (100V、 90分）を行つ た。
[0056] (トランスファー）
泳動終了後、ブロット用パット上に陽極側から transfer buffer(d)に浸した 3MM (What man社） 3枚、ゲル、 ImmobilonTM (PVDF transfer membrane (MILLIPORE社）、予め メタノール、 transfer bufferで平衡化した）、 3MM 3枚をのせた。これらをパットで挟み、 transfer bufferが入ったブロッテイング槽（Bio- Rad社）に入れ、トランスファーを行った (250mA, 180分間）。
[0057] (ブロッキング）
トランスファー終了後の membraneを TBS-T(e)で洗 、、 5%スキムミルクを含む TBS- T (スキムミルク溶液)で 1時間ブロッキングを行った。
[0058] (抗体反応）
一次抗体反応は、抗 P450SCC抗体（1/5000)を含むスキムミルク溶液中で 1時間行つ た。二次抗体反応は、抗 Rabbit IgG-HRP抗体（1/5000)を含むスキムミルク溶液中で 1時間行った。コントロールとして抗 β -actin抗体を用いた。
[0059] (検出'解析）
ECLTM Western blotting検出試薬（Amersham社製） 1mlを、 membraneに全体に行 き渡るようにかけ、遮光下で、 5分間反応させた。発光シグナルを Las-1000 imaging s ystem (FUJIFILM社製)で画像ィ匕し、 ImageGauge (商標）画像処理ソフトで定量を行つ た。
[0060] (a)SDS buffer
70mM Tris-HCl (pH 6.8)、 33mM NaCl、 ImM Na2EDTA、 2% SDS (w/v)、
40mM DTTゝ 0.01% bromophenol blue (w/v)、 10% glycerol
(b)ポリアクリルアミドゲル
分離ゲル： 12.5%アクリルアミド、 375mM Tris-HCl (pH 8.8)、 0.1% SDS、
0.05% TEMED、 0.075% APS (w/v)
濃縮ゲル： 3.8%アクリルアミド、 125mM Tris- HCl(pH 6.8)、 0.1% SDS
0.05% TEMED、 0.075% APS (w/v)
(c)泳動 buffer
25mM Tris, 0.19M glycineゝ 0.1% SDS (w/v)
(d) Transfer buffer
48mM Tris, 39mM glycine, 20% methanol
(e) TBS-T buffer
0.1M Tris-HCl (pH 7.5)、 0.37M NaCl、 0.5% Tween 20
[0061] (組織ホモジネート中のタンパク質の定量分析）
組織ホモジネート中のタンパク質濃度を、 Bradford法により測定した。適宜希釈した サンプル溶液 20 μ 1をエツペンドルフチューブにとり、そこへ 5倍希釈した Bio-Rad prot ein assayを lml加え、ボルテックスにより混和した。室温で 5分間放置後、 595nmの吸 光度を測定した。標準曲線は、ゥシ血清アルブミン (BSA)を用いた。
[0062] V テストステロンの測定
本測定では、以下のキットを用いた。
Testosterone EIA kit (Cayman cnemical社製)
[0063] (サンプルの調製）
血漿中および精巣ホモジネート中に、アツセィを阻害する物質が含まれている可能 性があるため、予め、エーテルによるステロイドホルモンの抽出を行った。
[0064] (血漿からの抽出） 血漿 0.5mlを試験管に取り、ジェチルエーテル 2.5mlを加え、ボルテックスで約 1分間 混和し、遠心分離を行った (3000rpm、 4°C、 5分間）。得られたエーテル層（上層）を回 収後、再び、血漿サンプルにジェチルエーテルを 2.5mlカ卩え、同様の操作を行った。
[0065] 回収したエーテル層は、遠心型減圧濃縮機 (TAITEC社製)で減圧乾固した。得ら れた濃縮物を、 kitに付属の EIA buffer 0.5mlに溶解し、これを血漿サンプルとした。
[0066] (精巣からの抽出）
精巣組織 lOOmgを、 phosphate buffered saline 5ml中で氷冷しながらバイオトロンを 用いてホモジナイズした。このホモジネート lmlを試験管に取り、ジェチルエーテル 5m 1を加え、ボルテックスで約 1分間混和し、遠心分離を行った（3000rpm、 4°C、 5分間）。
[0067] 得られたエーテル層（上層）を回収後、再び、精巣ホモジネートにジェチルエーテ ルを 5ml加え同様の操作を行った。回収したエーテル層を、遠心型減圧濃縮機 (TAI TEC社)で減圧乾固した。得られた濃縮物を、 kitに付属の EIA buffer 1mlに溶解し、こ れを精巣サンプルとした。
[0068] VI 統計解析
データは、一元配置分散分析による群間差を確認後、 Scheffeの多重比較検定によ り行った。
[0069] 図 1に、低 K食群（ビタミン K無添加）、コントロール食群（Kl 0.75mg/kg添加食）、 M K-4添加食群 (MK-4 75mg/kg添加食）をラットに 35日間投与し、精巣中のビタミン K 1 (Right)と MK-4 (Left)の濃度を分析した結果を示す。全例において、精巣中のビタ ミン Kは、投与形態にかかわらず MK-4に変化していることが確認された。低 K食群と コントロール食群とは有意差がな力つた力 MK-4添加食群では MK-4濃度が顕著に 増加していた。
[0070] 図 2に、ステロイドホルモン合成経路遺伝子である P450sccの mRNA発現レベルを示 す。低 K食群が、コントロール食群および MK-4添加食群と比べて若干低下していた
[0071] 図 3に、 P450sccのタンパク質量を示す。コントロール食群と低 K食群では変化はみ られな力つた力 MK-4添加食群で顕著に増加して 、た。
[0072] 図 4に、血漿テストステロン濃度を示す。 MK-4添加食群は、コントロール食群と比較 して血漿テストステロン濃度が有意に増加した。
[0073] 以上のことから、ビタミン Kを投与することによって、血中テストステロン量が増加する ことがわ力つた。コントロール食のビタミン K濃度は、ビタミン K必要量を配合しており、 これは日常の食事で摂取できる量であり、ビタミン Kが不足することによって血中テス トステロンが減少することはまれにしか起こらないと考えられる。一方、本発明に従い ビタミン Kを積極的に摂取することによって、血中テストステロンが増加したことから、 何らかの原因により血中テストステロンが減少している場合は、ビタミン Kの摂取により 血中テストステロンを増加させることができる。
[0074] 〔実施例 2〕
(材料および方法）
実験動物および飼育環境は、実施例 1と同様に、通常ラッ HWistar/Std、 8週齢の 雄)を温度 23°C、湿度 50±5%、午前 8時点灯、午後 8時消灯の 12時間の明暗サイク ルに設定された飼育室で飼育した。
[0075] 実験食群として、以下の 3群を設けた。
(1)コントロール食群（ビタミン 0.75mg/kg添加食）
(2)ビタミン K1添加食群（ビタミン Kl 75mg/kg添加食）
(3) MK-4添加食群 (メナキノン- 4 75mg/kg添加食）
ビタミン K1は、和光純薬 (株)から購入した。メナキノン- 4は、 日清フアルマ社製を使 用した。各実験食は、実施例 1の表 1の組成割合となるように、ビタミン K1または MK-
4を添加して、均一に混ぜ合わせた。
[0076] 飼育期間は 35日であり、毎週 18時に尾静脈採血を行なった。測定項目は、体重、 摂餌量、精巣中ビタミン K含量、精巣中テストステロン濃度、血漿中テストステロン濃 である。分析法は、実施例 1と同様である。
[0077] (統計解析）
精巣中のビタミン K濃度およびテストステロン濃度のデータについては、 Tukey法に より解析した。血中テストステロン濃度の経時変化の解析は、二元配置分散分析 (繰 り返しあり）法で行った。いずれも、 Pく 0.05を有意差とした。
[0078] (結果） コントロール食群（Kl 0.75mg/kg添加食）、ビタミン K1添加食群、 MK- 4添加食群 間で、体重および摂食量は差が認められな力つた（図 5、 6)。
[0079] 図 7に、精巣中のビタミン K濃度（Right:ビタミン Kl、 Left:MK-4)の結果を示す。ビタ ミン K1添加食群、 MK-4添加食群ともに、精巣中の MK-4濃度が顕著に増加した。ビ タミン K1が体内で MK-4に転換したものと考えられる。
[0080] 図 8に、血中テストステロン値の変化を示す。ビタミン K1添カ卩群の血中テストステロン 値は、 4週目、 5週目でコントロール群と差が認められな力つた。 2週目および 3週目 では、コントロール食群よりも高力つた。全体を通して二元配置分散分析解析を行な つたところ、 Pく 0.01で有意差が認められた。 MK-4添加群では、投与後 2週間目〜 5 週間目で、血中テストステロン濃度が高ぐ二元配置分散分析の結果 Pく 0.01で有意 差が認められた。
[0081] 図 9に、精巣中のテストステロン濃度の結果を示す。ビタミン K1添加食群ならびに M
K-4添加食群の 、ずれも、テストステロン値が高くなつた。
[0082] 以上のことから、ビタミン K1ならびにビタミン K2 (メナキノン- 4)のいずれも、血中およ び精巣中のテストステロン量が増加することがわ力つた。好ましくは、ビタミン K2の投 与である。体重変化および食事摂取量の変ィ匕も認められないことから、ビタミン Kによ るテストステロン増加は、安全性の高い方法であると言える。
[0083] 以上、本発明をその好ましい実施態様について詳細に説明してきた。しかし、当業 者は本願の開示を考慮することによって、本発明の範囲および精神の範囲内で変形 および改良を行い得ることが理解される。本発明の実施態様には、以下が挙げられ る。
1.ビタミン Kを有効成分として含有するテストステロン増加剤。
2.ビタミン Kの含有量が 0.0001〜100重量0 /0である、上記 1項に記載のテストステロン 増加剤。
3.前記ビタミン Kがビタミン K2である、上記 1項に記載のテストステロン増加剤。
4.前記ビタミン Kカ^ナキノン- 4および Zまたはメナキノン- 7である、上記 1項に記載 のテストステロン増加剤。
5.ビタミン Kを有効成分として含有するテストステロン増加剤からなる、テストステロン が低下することにより生じる症状または疾病を予防、改善および Zまたは治療するた めの医薬。
6.前記症状および疾病が、筋肉、認知機能、集中力、意欲、血管の柔軟性、脂質代 謝、性機能、男性機能または排尿機能の低下である、上記 5項の医薬。
7.ビタミン Kを有効成分として含有するテストステロン増加剤を配合したサプリメント、 健康食品または機能性食品。
8.筋肉、認知機能、集中力、意欲、血管の柔軟性、脂質代謝、性機能、男性機能ま たは排尿機能の低下の予防、改善および Zまたは治療に用いる上記 7項のプリメント 、健康食品または機能性食品。
9.ビタミン Kを有効成分として含有するテストステロン増加剤の有効量を患者へ投与 することからなる、テストステロンが低下することにより生じる症状または疾病を、予防
、改善および Zまたは治療する方法。
10.ビタミン Kの含有量が 0.0001〜100重量％である、上記 9項に記載の方法。
11.前記ビタミン Kがビタミン K2である、上記 9項に記載の方法。
12.前記ビタミン Kカ^ナキノン- 4および Zまたはメナキノン- 7である、上記 9項に記 載の方法。
13.前記症状および疾病が、筋肉、認知機能、集中力、意欲、血管の柔軟性、脂質 代謝、性機能、男性機能または排尿機能の低下である、上記 9項の方法。
14.テストステロンが低下することにより生じる症状または疾病を予防、改善および Z または治療するテストステロン増加剤を製造するためのビタミン Kの使用。
15.ビタミン Kの含有量が 0.0001〜100重量％である、上記 14項に記載の使用。
16.前記ビタミン Kがビタミン K2である、上記 14項に記載の使用。
17.前記ビタミン Kカ^ナキノン- 4および Zまたはメナキノン- 7である、上記 14項に記 載の使用。
1.前記症状および疾病が、筋肉、認知機能、集中力、意欲、血管の柔軟性、脂質代 謝、性機能、男性機能または排尿機能の低下である、上記 14項に記載の使用。

Claims

請求の範囲
[1] ビタミン κを有効成分として含有するテストステロン増加剤。
[2] 前記ビタミン Κがビタミン Κ2である、請求項 1に記載のテストステロン増加剤。
[3] 前記ビタミン Κカ^ナキノン- 4および Ζまたはメナキノン- 7である、請求項 1に記載の テストステロン増加剤。
[4] ビタミン Κを有効成分として含有するテストステロン増加剤からなる、テストステロンが 低下することにより生じる症状または疾病を予防、改善および Ζまたは治療するため の医薬。
[5] ビタミン Κを有効成分として含有するテストステロン増加剤を配合したサプリメント、 健康食品または機能性食品。
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