JP2015168668A - エクオールを含有する抗糖化剤 - Google Patents

Abstract

【課題】新たなＡＧＥｓ生成抑制物質であるエクオールを含有する新たな抗糖化剤の提供。
【解決手段】エクオールを含有する抗糖化剤。
【選択図】図１

Description

本発明は、エクオールを含有する抗糖化剤に関する。

終末糖化産物ＡＧＥｓ（Advanced Glycation End-products）は、その生成過程に関し
ては未だ不明の点が多いが、生体内において、ブドウ糖などの還元糖とタンパク質との間で糖化反応(メイラード反応)により生成され、通常は、代謝によって体外へ排出されることが知られている。しかし、加齢に伴い代謝速度が遅くなって生体内の各組織に蓄積され、ＡＧＥｓの受容体と結合することにより、種々の症状を引き起こすといわれている。例えば、皮膚においてＡＧＥｓが蓄積すると、肌全体の衰えの一因になり、また、糖尿病患者では、高血糖により生じたＡＧＥｓが白内障、動脈硬化、腎機能障害などの合併症を引き起こす。そのため、ＡＧＥｓ生成を抑制する成分や、ＡＧＥｓ分解成分の探索が行われている（特許文献１〜４）。

しかし、ＡＧＥｓ産生抑制剤のような医薬品はまだ開発段階であり、また、従来このような合成化合物には予期せぬ副作用が伴うことが多く、合成医薬品による治療よりは食生活を通じて疾患を予防、抑制、改善及び治療できる機能を持った成分又は食品成分に対する研究が注目されるようになってきた。

一方で、大豆、葛などのマメ科の植物に多く含まれているイソフラボン類は、イソフラボンを基本骨格とする化合物群で、近年の調査により、イソフラボン類が女性ホルモン作用（エストロゲン）や抗酸化作用を有し、イソフラボン類を摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害などに対して予防効果があることが明らかとなっている（非特許文献１〜６）。

イソフラボン類は、たとえば大豆内では、主に糖と結合した配糖体の形で、ダイジン（daidzin）、グリシチン（glycitn）、ゲニスチン（genistin）と呼ばれる化合物として存在しており、さらにマロニル化、アセチル化されているものも存在する。これらの配糖体は、ヒトや動物の体内に入ると消化酵素又は腸内細菌の産生する酵素であるβ−グルコシダーゼ等の働きにより、それぞれダイゼイン（daidzein）、グリシテイン（glycitein）
、ゲニステイン（genistein）となる。さらにダイゼインの場合は、腸内細菌の働きによ
りジヒドロダイゼイン（dihydrodaidzein）を経て、Ｏ−デスメチルアンゴレンシン（O-desmethylangolensin：O-DMA）又はエクオール（equol）へと酵素的に変換されることが知られている。

エクオールは、これらの代謝産物の中でエストロゲン活性が高いことが知られている（非特許文献７及び８）。しかしながら、人が大豆を食べて、その中に含まれるダイジンを有効なエクオールにまで代謝する能力には個人差があり、日本人で約５割、欧米人で約３割程度の人しか代謝できないことが明らかとなっている（非特許文献９及び１０）。そのため、代謝のできない人には、有効成分であるエクオールを直接摂取することが必要となってくる。

特開２０１２−１９３１７４号公報 特開２０１１−２４６３５３号公報 特開２０１０−２４８１５０号公報 特開２００３−２１２７４９号公報

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この様な状況下、本発明者らは、食品由来のＡＧＥｓ生成抑制物質を探索した結果、エクオールにその活性があることを見出した。エクオールが高いエストロゲン活性を有することはこれまでに知られていたが、ＡＧＥｓ生成阻害活性を有することは知られていない。
本発明は、新たなＡＧＥｓ生成抑制物質であるエクオールを含有する新たな抗糖化剤の提供を課題とする。

本発明者らは、鋭意検討した結果、以下に示すような新たな抗糖化剤が上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下に示すとおりである。
〔１〕エクオールを含有する抗糖化剤。

本発明によれば、新たなＡＧＥｓ生成抑制物質であるエクオールを含有する新たな抗糖化剤を提供できる。

実施例２におけるエクオール含有大豆胚芽抽出発酵物濃度と糖化反応阻害率との関係を示す図である。

＜１．エクオール＞
本発明に係る抗糖化剤は、エクオールを含有する。

上記エクオールを得る方法は特段限定されず、大豆発酵物や酪農産物から直接抽出してもよく、後述するように微生物を用いて生産してもよい。
大豆発酵物や酪農産物から抽出する場合、その原料は特段限定されないが、納豆、臭豆腐、味噌、醤油、卵や、牛乳、チーズ、ヨーグルトなどが挙げられる。該原料は、いずれか１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。該天然物からの抽出方法及び
抽出条件は特段限定されず、常法従えばよい。例えば、水抽出、熱水抽出、温水抽出、アルコール抽出、超臨界抽出等の公知の抽出方法を用いることができる。

溶媒抽出を行う場合、溶媒としては、例えば、水；メタノール、エタノール等の低級アルコールや、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール等のアルコール類（無水、含水の別を問わない）；アセトン等のケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル等のエステル類、キシレン等が挙げられ、好ましくは水、エタノール等である。これらの溶媒は、いずれか１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。

得られた抽出物をそのままの状態で使用することもできるが、乾燥させて粉末状のものを用いてもよい。また、必要に応じて得られた抽出物に精製、濃縮処理等を施してもよい。精製処理としては、濾過又はイオン交換樹脂や活性炭カラム等を用いた吸着、脱色といった処理を行うことができる。また、濃縮処理としては、エバポレーター等の常法を利用できる。

また、得られた抽出物（又は精製処理物若しくは濃縮物）を凍結乾燥処理に供して粉末化する方法、デキストリン、コーンスターチ、アラビアゴム等の賦形剤を添加してスプレードライ処理により粉末化する方法等、公知の方法に従って粉末化してもよい。さらにその後に、必要に応じて純水、エタノール等に溶解して用いてもよい。

一方で、微生物を用いて生産する場合には、その微生物がフラボン類を原料としてエクオールを生産できる限りその方法は特段限定されないが、大量のエクオールを得ることができることから嫌気性微生物を用いて生産することが好ましい。

本発明において好ましく用いられる嫌気性微生物は特段限定されないが、コーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌、ストレプトコッカセアエ（Streptococcaceae）科に分類される菌、又はこれらの類縁菌を、エクオール生産能を有するも
のとして例示することができる。

また、以下の群から選択される属に分類される嫌気性微生物を、エクオール生産能を有するものとして例示することができる。
・コーリオバクテリウム（Coriobacterium）属
・アドレクラウチア（Adlercreutzia）属
・アサッカロバクター（Asaccharobacter）属
・アトポビウム（Atopobium）属
・コリンゼラ（Collinsella）属
・クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属
・デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属
・エガセラ（Eggerthella）属
・エンテロハブダス（Enterorhabdus）属
・ゴードニバクター（Gordonibacter）属
・オルセネラ（Olsenella）属
・パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属
・スラッキア（Slackia）属
・ラクトコッカス(Lactococcus)属

中でも、上記属に分類された微生物のうち、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785又はそれと近縁である、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785の１６Ｓ ｒＤＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子配列
）と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有する１６Ｓ ｒＤＮＡを保有する微生物を使用することが好ましい。アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785の１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子配列は配列番号１である。

さらに上記微生物のうち、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属、スラッキア（Slackia）属、アドレクラウチア（Adlercreutzia）属に属する微生物は、本発明における
エクオール産生能を有する微生物としてより好ましい。

微生物がエクオールを生成することは、培養物中のダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、エクオール等を定量することにより確認することができる。これらの定量は、当業者であれば、例えば、ＷＯ２０１２／０３３１５０パンフレット、特開２０１２−１３５２１７号公報、特開２０１２−１３５２１８号公報、特開２０１２−１３５２１９号公報などの記載に基づき行うことができる。

さらに、以下の嫌気性微生物を利用することができる。
Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450
Enterorhabdus mucosicola DSM 19490
Slackia isoflavoniconvertens HE8（DSM 22006）
Slackia sp. TM-30 FERM P-20729
Eggerthella sp. KCCM-10490
Asaccharobacter celatus DSM 18785
Lactococcus garvieae DSM 6783

上記微生物のうち、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株、もしくは、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス（Slackia isoflavoniconvertens）DSM 22006株、又はこれらの菌と同様の種としての性質を有する類縁の菌を
より好ましい嫌気性微生物として挙げることができる。

上記嫌気性微生物は、その寄託番号に示された寄託機関から入手することができる。各受託番号は、当該嫌気性微生物が、それぞれ次の寄託機関に寄託されていることを示す。
FERM 特許生物寄託センター；International Patent Organism Depositary (IPOD)
http://unit.aist.go.jp/pod/ci/index.html
DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)
http://www.dsmz.de/
KCCM Korean Culture Center of Microorganisms

本発明で好ましく用いられる嫌気性微生物は、培地中に含まれるフラボン類を原料として、発酵によってエクオールを産生するのに適した条件で培養される。エクオールを生産するのに適した条件とは、エクオール生成活性を持つ嫌気性微生物の生存と活動が維持されることをいう。より具体的には、嫌気性微生物の生存が可能な気相条件（嫌気性条件）が維持され、該嫌気性微生物の活性と増殖を支持するための栄養素が与えられることをいう。嫌気性微生物の生存に適した種々の培地組成が公知である。したがって、先に示したエクオール生産能を有する嫌気性微生物について、当業者は、適切な培地組成を選択することができる。たとえば、実施例において用いた日水製薬社製のＧＡＭブイヨン培地や、Ｄｉｆｃｏ社製のＢＨＩ培地等を使用することができる。

本発明で用いられる培地には、例えば、水溶性の有機物を炭素源として加えることができる。水溶性の有機物として、ソルボース、フラクトース、グルコース、並びに、吉草酸
、酪酸、プロピオン酸、酢酸、及びギ酸など有機酸類等の化合物を挙げることができる。

炭素源としての培地に加える有機物の濃度は、効率的に培地中の嫌気性微生物を発育させるために適宜調節することができる。一般的には、０．１〜１０ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲から添加量を選択することによって、過不足を避けることができる。

上記の炭素源に加えて、培地には、窒素源を加えることができる。本発明において、窒素原としては通常の発酵に用いうる各種の窒素化合物を用いることができる。好ましい無機窒素源は、アンモニウム塩、及び硝酸塩である。好ましい有機窒素源はアミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類、肉エキス、肝臓エキス、消化血清末などである。より好ましい無機窒素源は、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、硝酸カリウム及び硝酸ソーダである。より好ましい窒素源はアルギニン、シトルリン、オルニチン、リジン、酵母エキス、ペプトン類である。

更に、炭素源や窒素源に加えて、偏性嫌気性微生物の培養に適した他の有機物あるいは無機物を培地に加えることもできる。例えば、ビタミンなどの補因子や各種の塩類等の無機化合物を培地に加えることによって、偏性嫌気性微生物の増殖や活性を増強できる場合もある。例えば、無機化合物、ビタミン類、動植物由来の微生物増殖補助因子として以下のものを挙げることができる。

無機化合物として、例えば、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、塩化コバルト、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、明ばん、モリブデン酸ソーダ、塩化カリウム、ホウ酸等、塩化ニッケル、タングステン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、硫酸第一鉄アンモニウムが挙げられる。

また、ビタミン類として、例えば、ビオチン、葉酸、ピリドキシン、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸、パントテン酸、ビタミンＢ１２、チオオクト酸、ｐ−アミノ安息香酸が挙げられる。さらに、ポルフィリン化合物であるヘミンを添加するとよい場合がある。

これらの無機化合物やビタミン類、あるいは増殖補助因子を添加して培養液を製造する方法は公知である。培地は、液体、半固体、あるいは固体とすることができる。本発明において好ましい培地の形態は、液体培地である。

本発明で好ましく用いられる嫌気性微生物は、公知の微生物の培養方法にしたがって培養することができる。工業的な製造には、培地や基質ガスを連続的に供給することができ、かつ培養物を回収するための機構を備えた連続培養システム（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）が好適である。

本発明で好ましく用いられる嫌気性微生物の培養においては、連続培養システム内への酸素の混入を防ぐことが必要である。培養器は通常用いられる培養槽がそのまま利用できる。嫌気性微生物の培養にも利用することができる培養タンクは市販されている。培養槽内に混入する酸素を、窒素などの不活性気体あるいは水素ガスなどで置換することにより、嫌気的な雰囲気を作ることができる。

例えば、嫌気培養ジャー（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｊａｒ）を、嫌気性微生物を培養するためのバイオリアクターとすることができる。嫌気培養ジャーは、金属、ガラス、あるいは合成樹脂製の気密容器で構成され、内部を大気中の酸素から遮断することができる。さらに、嫌気培養ジャーは、嫌気培養ジャー内部の空間や培養液中に含まれる分子状酸素を除去するための機構を備えることができる。たとえば、嫌気培養ジャー内部を吸引する真
空ポンプを接続して吸引し、酸素以外の気体を供給することで、内部を嫌気状態に維持することができる。

本発明においては、培養槽に付加的な機能を与えることができる。たとえば、通常使用される撹はん混合槽のほか、気泡塔型、ドラフトチューブ型の培養槽も利用できる。液体培地に吹き込まれる混合気体によって微生物は遊離分散され、微生物と培地を十分に接触させることができる。また、バイオトリックリングフィルター（ｂｉｏｔｒｉｃｋｌｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ）のように通気性の高いスラグ、その他セラミック系の無機充てん物、あるいはポリプロピレン等の有機合成物質の充てん層に、水分を滴らせながら微生物を生息させ、そこにガスを通気しながら培養することもできる。さらに、使用する微生物は常法によりカラギーナンゲル、アルギン酸ゲル、アクリルアミドゲル、キチン、セルロース、寒天などに固定化して用いることもできる。

上記の基質ガスからなる気相を構成する気体の組み合わせは特に制限されるものではなく、水素、二酸化炭素、窒素等から選択される１種類以上の気体を構成成分として用いることが可能である。当該気相においては、水素が構成成分として含まれていることが好ましい。

上記の場合、当該気相において、水素の分圧パーセント濃度が２〜１００％であることが好ましい。たとえば、２％、４％、６％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、１００％、又はこれらから選択される２点の分圧パーセント濃度を下限（「〜以上、又は、〜より高い）及び上限（〜以下、又は、〜より低い）、とする濃度範囲により示される分圧パーセント濃度であることが好ましい。

また、効率よくエクオールを生成させるためには、気相を構成する混合気体の培養槽への通気量は０．０１〜２．０ Ｖ／Ｖ／Ｍガス量／液量／分であることが好ましい。

本発明で好ましく用いられる嫌気性微生物は、通常３７℃付近（３０〜４２℃）の温度でエクオール生産能を有する嫌気性微生物である。

本発明で好ましく用いられる嫌気性微生物を培養する際の加圧条件は、当該微生物が生育できる条件であれば特に限定されるものではないが、好ましい加圧条件としては、０．０２〜０．２ＭＰａの範囲を挙げることができる。

微生物の十分な生育のため、培養物のｐＨは、３．０〜８．０が好ましく、４．５〜７．５がより好ましい。また、エクオールの回収量を増加させるため、培養槽の温度は特に制限されるものではないが、３７℃を好ましい温度として挙げることができる。

当業者は、生成した嫌気性微生物と培養生成液を分離するために公知の任意の方法を用いることができる。好ましい分離の方法は、ろ過性能、濃縮性能を有するホローファイバー型限外ろ過あるいは精密ろ過膜を利用する方法である。また、微生物と該生成液の分離に十分なろ過速度を得るためには使用する微生物に応じて適当な分画分子量の膜を選択すればよい。生産されたエクオールは当業者に公知の任意の手段で培地から回収することができる。例えば、培養槽から限外ろ過膜を通して分離された培養液からエクオールを回収することができる。エクオールの精製方法は公知である。たとえば、培養物を遠心分離などで菌体を除き、上清を減圧下に濃縮、乾固後、７０％エタノールあるいはメタノールで抽出する。抽出液をさらにシリカゲルクロマトグラフィーや晶析などの操作を行うことで精製できる。また、アンバーライトやセパビーズなどスチレン−ジビニルベンゼンの吸着樹脂も用いることができる。

効率よくエクオールを回収するため、培養槽に供給される新鮮な培地の量は、培養槽内の培養物における希釈率が時間当たり０．０４〜２／ｈｒが好ましい。より好ましい希釈率は０．０８〜１／ｈｒである。

＜２．抗糖化剤＞
本発明は、上述したエクオールを含有する抗糖化剤である。該抗糖化剤は、ＡＧＥｓの生成に至るまでに、３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）、グリオキサール（ＧＯ）、グリコアルブミン（ＧＡ）、メチルグリオキサール（ＭＧ）、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）、ペントシジン、ピラリン等の中間体が生成するので、それらの中間体を抑制したり、ＡＧＥｓへの結合またはＡＧＥｓの生成を阻害することにより、体内でのＡＧＥｓの蓄積を抑制することができる。
このことから、本発明に係る抗糖化剤は、化粧料や医薬品、食品に用いられ、特に化粧料や食品として好ましく用いられる。

本願発明に係る抗糖化剤は、エクオールを単独で使用することもできるが、上記成分以外に公知の賦形剤、香料、着色料、乳化剤、安定化剤、増粘剤、酵素、防腐剤、滑沢剤、界面活性剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、結合剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、可溶化剤、保存剤、風味剤、甘味剤等を、本発明の効果を損なわない範囲で必要に応じて配合することができる。

抗糖化剤全量に対する上記エクオールの含有量は、本発明の所望の効果が奏される限り特に限定されないが、通常０．０００１〜３０質量％であり、好ましくは０．００１〜２０質量％であり、より好ましくは０．００１〜１０質量％である。

＜３．化粧料＞
本発明に係る抗糖化剤を化粧料の素材として用いる場合、該抗糖化剤を水溶液、ローション、スプレー液、懸濁液および乳化液などの液状；粉末、顆粒およびブロック状などの固体状；クリームおよびペーストなどの半固体状；ゲル状等の各種所望の剤形の化粧料に調製することができる。このような化粧料は、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック・マスク等の基礎化粧料、ファンデーション、口紅等のメーキャップ化粧料、毛髪化粧料、ボディ化粧料等の各種化粧料として有用である。本発明により得られるエクオールを含有する抗糖化剤を含む化粧料は、特に、美白用、ニキビ改善用、しわ改善用などの皮膚改善化粧品として使用される。
本発明に係る抗糖化剤を含有する化粧料は、常法に従って製造することができる。また、化粧料への抗糖化剤の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。さらに、必要に応じて、瓶、袋、缶、スプレー缶、噴霧容器、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。

本発明に係る抗糖化剤を化粧料の素材として用いる場合、化粧料全量に対する上記抗糖化剤の含有量は、本発明の所望の効果が奏される限り特に限定されないが、エクオールとして、通常０．００００５〜１０質量％であり、好ましくは０．０００１〜１０質量％であり、より好ましくは０．０００１〜５質量％である。

＜４．医薬品＞
本発明に係る抗糖化剤を医薬品の素材として用いる場合、その剤形は、予防または治療しようとする疾患や医薬品の使用形態、投与経路等に応じて選択することができる。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、浸剤、煎剤、チンキ剤等が挙げられる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に対して必要に応じて充填剤、増量剤、賦形剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医
薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また、この医薬製剤中に着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させてもよい。
本発明の抗糖化剤は、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、心疾患、更年期障害の予防や治療のために使用することができる。

本発明に係る抗糖化剤を医薬品の素材として用いる場合、医薬品全量に対する上記抗糖化剤の含有量は、本発明の所望の効果が奏される限り特に限定されないが、エクオールとして、通常０．００１〜３０質量％であり、好ましくは０．０１〜２０質量％であり、より好ましくは０．１〜１０質量％である。

＜５．食品＞
本発明に係る抗糖化剤を食品の素材として用いる場合、一般の食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品、食品添加物等として使用できる。食品の形態としては、本発明に係る抗糖化剤を含む清涼飲料、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、グミ、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、アイスクリーム、アイスキャンデー、パン、ケーキ、シュークリーム、ハム、ミートソース、カレー、シチュー、チーズ、バター、ドレッシング等を例示することができる。

本発明に係る抗糖化剤は、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができる。タンパク質としては、例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、及びこれらの加水分解物、バターなどが挙げられる。糖質としては、糖類、加工澱粉（デキストリンのほか、可溶性澱粉、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンA、カロチン類、ビタミンB群、ビタミンC、ビタミンD群、ビタミンE、ビタ
ミンK群、ビタミンP、ビタミンQ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、
イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、乳清ミネラルなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用してもよく、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。

本発明に係る抗糖化剤を含有する食品は、常法に従って製造することができる。また、食品への抗糖化剤の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。さらに、必要に応じて、瓶、袋、缶、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。
本発明に係る抗糖化剤を食品の素材として用いる場合、食品全量に対する上記抗糖化剤の含有量は、本発明の所望の効果が奏される限り特に限定されないが、エクオールとして、通常０．０００１〜３０質量％であり、好ましくは０．００１〜２０質量％であり、より好ましくは０．００１〜１０質量％である。

以下、具体的な実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

＜１．エクオールを含む大豆胚芽抽出発酵物の製造＞
ＧＡＭブイヨン培地（日水製薬製）５．９ｇとＬ−アルギニン塩酸塩１．２１ｇ（培地に対してアルギニンで１％）を純水１００ｍＬに溶かし、炭酸ガスを通じながら１０．０
ｍＬずつ嫌気性菌培養用１００ｍＬバイヤルビン（株式会社エルエム製）に分注し、ブチルゴム栓、アルミキャップをして１１５℃、１５分間滅菌した。この培地に−８０℃凍結保存していたアサッカロバクター・セラツス（Ａｓｓａｃｃｈａｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｌａｔｕｓ） ＤＳＭ １８７８５株を０．２ｍＬ植菌し、無菌フィルターを通した水素
／炭酸ガス（４：１，ｖｏｌ／ｖｏｌ）で気相を３分間以上置換した後、３７℃、２００ｓｐｍで１６時間振とう培養（種培養）を行った。

ＧＡＭブイヨン＋１％アルギニン培地に、発酵大豆胚芽抽出物であるＡｇｌｙＭａｘ−３０（ニチモウバイオテックス社製）１９．１ｇ／Ｌを加えた培地を１６０ｍＬ調製し、２０ｍＬずつ８本の１００ｍＬ容バイヤルビン（株式会社エルエム製）に分注し、ブチルゴム栓、アルミキャップをして１１５℃、１５分間滅菌した。それらに上記種培養液を０．２ｍＬ植菌し、水素／炭酸ガス（４：１，ｖｏｌ／ｖｏｌ）で無菌的に３分間以上置換した後、３７℃、２００ｓｐｍの条件で振とう培養を行った。９６時間後、培養液を取り出し、高速液体クロマトグラフィーにより生成したエクオールを以下の分析条件で定量したところ、エクオールが平均２．６２ｇ／Ｌ生成していた。これらを１０５℃で１分間加熱した後、室温まで冷却後、１４０ｍＬを集め、遠心分離（１００００ｒｐｍ，１０分間）にて上清を分離した。得られた上清中のエクオール濃度は培養液とほぼ変わらず、エクオールがすべて溶解していることが明らかになった。

一方、上清中の他のアグリコンであるダイゼイン、グリシテイン、ゲニステインの濃度は０．１ｇ／Ｌ程度でエクオールが特異的に溶解していること、本条件で調製した発酵液はエクオールを分離するのに極めて好適であることが判明した。上清液をエバポレーターにて減圧下に濃縮し、約１／３の重量にした。これの２倍重量のエタノールを加え、攪拌後、不溶物をろ紙でろ過した。再びろ液をエバポレーターにて減圧下に濃縮乾固し、残渣（エクオール含有大豆胚芽抽出発酵物）５．１ｇを得た。高速液体クロマトグラフィーで残渣を分析した結果、４．９重量％のエクオールが含まれていた。

＜２．ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、エクオールの定量＞
培養液０．５ｍＬに対し、酢酸エチル１．５ｍＬを加えて、激しく攪拌した後、３０００ｒｐｍで１０秒遠心し、酢酸エチル層をパスツールピペットで可能な限り取り出した。同培養液に同様の操作をあと２回行い、それら酢酸エチル層を合わせてエクオール抽出液を得た。この抽出液をエバポレーターで減圧下に濃縮、乾固し、１．０ｍＬのメタノールに溶解させた。これを０．４５μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜で濾過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィー測定サンプルとした。

［高速液体クロマトグラフィー条件］
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｘ Ｌｕｎａ ５ｕＣ１８、２．０ｍｍ×１５０ｍｍ（島津
ジーエルシー）
移動相：水／メタノール［５５：４５，ｖ／ｖ］
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
保持時間：ジヒドロダイゼインが１３．８分、ダイゼインが１９．６分、グリシテインが２２．５分、エクオールが２５．６分、ゲニステインが３５．０分である。

＜３．ＡＧＥｓ生成抑制能の測定＞
［試験例１］
４０ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）水溶液０．２ｍＬ、２Ｍのグルコース水溶液０．１ｍＬ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬおよび蒸留水０．１ｍＬを混合した。この混合液に製造例１で調製したエクオール含有大豆胚芽抽出発酵物
を終濃度０．３、３、３０ｍｇ／ｍＬとなるよう５０％エタノールに溶解したエクオール含有大豆胚芽抽出発酵物溶液０．１ｍＬを添加し、６０℃で４０時間インキュベーションした。その後、この反応液の糖化反応生成物量を、蛍光強度として、測定波長を励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで測定した。
また、上記グルコースを含まない混合液を用いたこと以外は試験例１と同様にしたものを比較試験例１とした。

エクオール含有大豆胚芽抽出発酵物溶液の代わりに蒸留水を添加したものを用いたこと以外は試験例１と同様にしたものを比較試験例２とした。
また、上記グルコースを含まない混合液を用いたこと以外は比較試験例２と同様にしたものを比較試験例３とした。
糖化反応阻害率は下記式（１）により算出した。

糖化反応阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００ ・・・（１）
Ａ：試験例１の糖化反応生成物量
Ｂ：比較試験例１の糖化反応生成物量
Ｃ：比較試験例２の糖化反応生成物量
Ｄ：比較試験例３の糖化反応生成物量

これらの結果から、反応液におけるエクオール含有大豆胚芽抽出発酵物の濃度と糖化反応阻害率との関係を表すグラフを図１に示す。図１に示すように、試験例１のエクオール含有大豆胚芽抽出発酵物は、０．０３〜３ｍｇ／ｍＬの濃度で糖化反応生成物の生成を抑制することが確認された。

＜４．官能試験＞
（１）化粧クリームの官能試験
［実施例１、比較例１］
表１に記載の処方に基づいて調製したクリームを用いて官能試験を実施した。

パネラーは、小じわや皮膚のハリが気になると自覚する４０代の女性パネラー１５名で、１日２回朝夕洗顔後、右目尻周辺には実施例１のクリームを、また左目尻周辺には比較例１のクリームを３週間使用した。その後、触診で両目尻の皮膚表面の「滑らかさ」およ
び「ハリのよさ」を比較した。その結果を表２に示す。

表２の結果より、エクオール含有大豆胚芽抽出発酵物を含む実施例１のクリームを使用することで、目尻の皮膚表面の「滑らかさ」および「ハリのよさ」が改善されることが分かった。

（２）化粧ローションの官能試験
［実施例２、比較例２］
表３に記載の処方に基づいて調製した化粧ローションを用いて官能試験を実施した。

パネラーは、小じわや皮膚のハリが気になると自覚する４０代の女性パネラー１５名で、１日２回朝夕洗顔後、顔右半分には実施例２のローションのみを適量使用、また、顔左半分には比較例２のローションのみを同量使用した。１か月経過後、触診で左右のほほの皮膚表面の「滑らかさ」および「ハリのよさ」を比較した。その結果を表４に示す。

表４の結果より、エクオール含有大豆胚芽抽出発酵物を含む実施例２のローションを使用することで、ほほの皮膚表面の「滑らかさ」や「ハリのよさ」が改善されることが分かった。

本発明は、化粧料や医薬、食品等の製剤技術に適用できる。

Claims (1)

1. エクオールを含有する抗糖化剤。

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