JP2013139392A - 皮膚老化抑制剤 - Google Patents

Abstract

【課題】新規で安全性が高い皮膚老化抑制剤の提供。
【解決手段】リンゴ未熟果実抽出物を有効成分とする皮膚老化抑制剤。リンゴ未熟果実抽出物はメラニン生成抑制作用を有し美白効果に優れ、抗糖化作用、ゼラチナーゼ抑制作用を有し、これを配合した安全性の高い皮膚老化抑制剤が得られ、該皮膚老化抑制剤の皮膚外用剤への利用により、皮膚のしみ、くすみ、シワ、タルミ、キメの消失、弾力性の低下予防および改善等、肌にすぐれた皮膚老化抑制効果を発揮することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、未熟なリンゴ果実より抽出された抽出物を配合してなる皮膚老化抑制剤に関し、本発明により得られた本皮膚老化抑制剤は安定的で相溶性に優れる。利用分野としては、例えば、化粧品類（人及びその他の動物用に用いる各種製剤）、医薬品類、医薬部外品類等に用いることが出来る。

リンゴ(Malus pumila Mill.)はバラ目バラ科ナシ亜科リンゴ属の落葉高木樹であり、亜寒帯、温帯、亜熱帯という広い地域で栽培することが可能で、その果実は食用とされている。また、日本では品種改良も盛んに行われ、世界で最も生産量の多いふじを始め、王林、紅玉、津軽等の多品種が栽培されている。リンゴの栽培過程において、５月中旬から７月にかけて、受粉後結実した未熟な状態の果実を選別し、成熟させる果実を残して他の果実を摘み取るという作業があり、この作業は摘果とよばれている。この摘果により多量の未熟果実が発生し、これまでその大部分が廃棄されてきた。

通常、摘果された未熟果実は農場にそのまま放置されるが、5月に摘果された果実が秋ごろになっても、腐敗せずに残っていることが知られている。また、未熟果実は成熟果実に比べ非常に苦く、切断面がすぐに褐変することから、未熟果実中にはポリフェノール化合物が多量に含まれていることが推測される。既に、リンゴ未熟果実より搾汁または抽出されたポリフェノール含有果汁が抗酸化活性、抗変異原性、ヒアルロニダーゼ阻害活性、ヒスタミン遊離抑制活性、GTase活性阻害作用等の効果を有することが明らかになっている（特許３５２１１５５号）。また、リンゴ未熟果実の搾汁果汁または抽出液から精製されたポリフェノール混合物が、血圧降下作用、アレルギー抑制作用、グルコシルトランスフェラーゼ作用などの機能を有することも明らかとなっており、リンゴ未熟果実、またはこれに含まれるポリフェノール化合物が広範な生理作用を有することが認知されつつある（特許４１４２８５９号）。
特許３５２１１５５号公報 特許４１４２８５９号公報

このようにリンゴ未熟果実の抽出物が広く生理作用を有することは知られているが、皮膚の老化に対する抑制作用を持つことは知られていない。皮膚老化は多くの因子が関与していることが知られているが、皮膚老化として特に重要とされている要素として、メラニン色素沈着、糖化作用、ゼラチナーゼによる柔軟性の喪失などがあげられる。

メラニンは、人の皮膚が紫外線に曝露されることで、皮膚に存在するメラニン生成細胞であるメラノサイトが活性化し、活性化されたメラノサイトから生成されたチロシナーゼという酵素によって生体内のチロシンが酸化されることによって産生される。このメラニンの過剰生成や加齢に伴う皮膚の代謝低下によってメラニン色素が沈着することが、皮膚のシミやくすみの原因として知られている。

また、老化と密接に関係する糖化作用は、タンパク質が糖と結合することで、糖化産物が生成される反応であり、生体中でも起こる反応である。糖化産物は最終的に最終糖化産物（Advanced Glycation
Endproducts；以下ＡＧＥｓと呼称する。）となる。生成したＡＧＥｓは代謝によって体外に排出されるが、加齢に伴う代謝速度の低下で体内に蓄積する。このＡＧＥｓが皮膚（表皮、真皮）で生成、蓄積すると、肌の張りや弾力の低下、シワ、タルミ、くすみ、透明感の低下、シミ等の一因になることから、皮膚の老化とＡＧＥsは密接に関係していることが知られている。

ヒトの皮膚に存在する酵素であるゼラチナーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼと呼ばれる細胞外マトリックスタンパク質（コラーゲンやゼラチン、エラスチン等）を主な基質とするプロテアーゼ群に属するプロテアーゼで、紫外線によって活性化することが知られている。このゼラチナーゼが活性化することで肌の柔軟性を担うコラーゲンなどの細胞外マトリックスが分解され、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等が引き起こされる。

皮膚老化抑制剤は皮膚老化防止剤とも呼ばれ、皮膚の老化によって生じる症状を防止又は改善することのできる薬剤又は化粧料として提供することが提案されている。

本発明者は、リンゴ未熟果実について鋭意研究を行った所、当該果実から抽出された抽出物に皮膚の老化に伴う変化、即ちシミ、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等を抑制する皮膚老化抑制の効果があること、特に他の品種に比較し王林に顕著な効果があることを見出し、本発明に到達した。

本発明の課題は、リンゴ未熟果実の有効利用に関し、リンゴ未熟果実から抽出された抽出物を配合した、新規の安全性が高い皮膚老化抑制剤を提供することにある。

本発明はリンゴ未熟果実より水、アルコール又はこれらの混合溶媒で抽出して得られる未熟リンゴ果実抽出物配合の皮膚老化抑制剤を提供する。
詳しくは、以下のとおりである。
（１）リンゴの未熟果実より、水、アルコール又はこれらの混合溶媒で抽出して得られた抽出物を配合した皮膚老化抑制剤。
（２）リンゴの品種が王林であることを特徴とする（１）の皮膚老化抑制剤。
（３）リンゴの未熟果実が、摘果作業において採取されたものであることを特徴とする（１）及び（２）記載の皮膚老化抑制剤
（４）メラニン生成抑制効果を有してなる（１）〜（３）記載の皮膚老化抑制剤。
（５）抗糖化効果を有してなる（１）〜（４）記載の皮膚老化抑制剤。
（６）ゼラチナーゼ活性阻害効果を有してなる（１）〜（５）記載の皮膚老化抑制剤。

本発明によれば、リンゴ未熟果実抽出物はメラニン生成抑制作用を有し美白効果に優れ、抗糖化作用、ゼラチナーゼ抑制作用を有し、これを配合した安全性の高い皮膚老化抑制剤が得られ、該皮膚老化抑制剤の皮膚外用剤等への利用により、皮膚のしみ、くすみ、シワ、タルミ、キメの消失、弾力性の低下予防および改善等、肌にすぐれた皮膚老化抑制効果を発揮することができる。

本発明に用いるリンゴ未熟果実は、バラ科に属するリンゴであれば、栽培種、野生種などいずれのリンゴの種類であってもこれに使用することができる。また、品種についてはふじや王林、津軽、金星、紅玉等様々な品種を用いることができるが、王林を使用することが好ましい。また、このリンゴの未熟果実は、廃棄問題を解決するうえで、摘果作業時に採取されたものを用いることが好ましい。摘果を行う時期は毎年５月上旬から７月下旬にかけて行われており、品種によって摘果する時期は異なるものの、成熟させる果実を残して他の果実を摘み取る作業が行われる。本発明で利用する未熟果実は、上記摘果時期に採取される未熟果実であれば限定されないが、ヘタを頂点として直径１〜６ｃｍの未熟果実を利用し、好ましくは直径２〜４ｃｍの未熟果実を利用することが望ましい。

リンゴ未熟果実は表面に農薬が付着していることが多いため、界面活性剤を用いた洗浄処理を行うことが望ましい。リンゴ未熟果実からの抽出は、果実をそのまま用いることも可能であるが、切断したり、すり下ろして抽出作業に供することも可能である。好ましくは1/4に櫛切りにするのが望ましい。

抽出溶媒としては、水、アルコール又はこれらの混合溶媒を使用する。
水としては、純水、脱塩水、蒸留水、水道水等の他、緩衝液や、希酸および希アルカリを使用することも可能である。
アルコールとしては、一価アルコール、多価アルコールのいずれも使用できる。具体的には一価アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ベンジルアルコールなどが、多価アルコール類としては、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、1,3-ブチレングリコールなどが挙げられる。抽出溶媒として水とアルコールの混合溶媒を使用する場合は、アルコール濃度が10〜90%(重量比)とすることが望ましい。具体的には、エタノール濃度が20〜70%(重量比)の含水エタノール、1,3-ブチレングリコール濃度が20〜70%(重量比)の含水1,3-ブチレングリコールなどの溶媒が好適に使用される。

抽出操作は特に限定されないが、抽出溶媒に対し、5％〜100％（重量比）のリンゴ未熟果実を用いることができ、好ましくは10％〜50％（重量比）のリンゴ未熟果実を用いて行うことが望ましい。

抽出温度および抽出時間は特に限定されないが、抽出温度10〜80℃で、1日から6週間程度で抽出することができる。使用する抽出溶媒が含水エタノール（エタノール濃度20〜70%（重量比））を用いる場合では、抽出温度20〜60℃、抽出時間1時間〜3週間で抽出することができ、抽出温度20〜40℃で抽出時間1週間行うことが好ましい。抽出溶媒が含水1,3-ブチレングリコール（1,3-ブチレングリコール濃度20〜70%（重量比））を用いる場合では、抽出温度10〜80℃で抽出時間1日〜3週間程度で抽出することができ、抽出温度20〜60℃で抽出時間2週間行うことが好ましい。

抽出されたリンゴ未熟果実抽出物はそのままでも使用可能であるが、さらにろ過、遠心分離等の工程により精製するのが好ましい。精製することで皮膚老化抑制剤として好適に利用することができる。精製方法は特に限定されないが、メンブレンフィルターによりろ過するのが好ましい。さらに、ろ過後の抽出物についてウィンタリング処理を実施することが望ましく、温度は−30〜0℃、ウィンタリング処理時間は3日間〜30日間行うことが望ましい。

多くの場合は、そのままの状態で利用できるが、必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色などの精製処理を加えても良い。脱臭・脱色等の精製処理手段としては、活性炭カラムなどを用いることができ、抽出物質により一般的に適用される通常の手段を任意に選択して行えば良い。また、得られたリンゴ未熟果実抽出物を凍結乾燥法、スプレードライ法などの熱乾燥法により乾燥物として得ることも可能である。

本発明のリンゴ未熟果実抽出物が配合された皮膚老化抑制剤は、例えば化粧品に適用することができる。
適用する化粧品の例としては、化粧水、乳液、美容液、一般クリーム、クレンジングクリーム等の洗顔料、パック、髭剃り用クリーム、日焼けクリーム、日焼け止めクリーム、日焼け止めローション、日焼けローション、化粧石鹸、ファンデーション、おしろい、パウダー、口紅、リップクリーム、アイライナー、アイクリーム、アイシャドウ、マスカラ、浴用化粧品等、各種化粧品に利用可能である。その配合量は化粧品組成物中、0.001〜100％含むことができるが、好ましくは0.01〜20%であり、さらに好ましくは0.1〜10%である。

このほか、本発明の皮膚老化抑制剤は医薬品や医薬部外品に適用することもできる。
薬用成分と併用し薬用クリーム等、用途に応じて上記と同様の形態とすることができる。

本発明の皮膚老化抑制剤には、以下に示すような通常、化粧品など皮膚外用剤において使用されている各種成分や添加剤の中から用途に適したものを任意に選択、配合して利用することができる。

例えば、アボガド油、アーモンド油、エゴマ油、オリブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、カカオ脂、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂などの油脂類またはこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）。

ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、セラックロウなどのロウ類。流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、マイクロクリスタンワックス、スクワレン、スクワラン、プリスタンなどの鉱物油類。ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、１２-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸などの天然脂肪酸。イソノナン酸、カプロン酸、２−エチルブタン酸、イソペンタン酸、イソペンタン酸などの合成脂肪酸。

エタノール、イソプロパノール、ラウリルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコールなどの天然アルコール。２−ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、２−オクチルドデカノールなどの合成アルコール。酸化エチレン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ポリエチレングリコール、酸化プロピレン、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、ソルビトール、マンニトールなどの多価アルコール。

ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコールなどのエステル。

ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛、ミリスチン酸マグネシウム、ラウリン酸亜鉛、ウンデシレン酸亜鉛などの金属セッケン。

アラビアゴム、グアヤク脂、アイルランド苔、カラヤゴム、トラガントゴム、キャロブゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖及びそのエステル、トレハロース及びその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、サクシニルキトサンまたはキトサン、エチレンオキサイドなどのアルキレン(C２〜C４)オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル(C２〜C４)キチンまたはキトサン、低分子キチンまたはキトサン、キトサン塩、硫酸化キチンまたはキトサン、リン酸化キチンまたはキトサン、アルギン酸及びその塩、ヒアルロン酸及びその塩、コンドロイチン硫酸及びその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイドなどのポリアルキレンオキサイドまたはその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミンなどのガム質、糖類及び水溶性高分子化合物。

アニオン界面活性剤（アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩）、カチオン界面活性剤（アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩）、両性界面活性剤：カルボン酸型両性界面活性剤（アミノ型、ベタイン型）、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、その他の界面活性剤（天然界面活性剤、タンパク質加水分解物の誘導体、高分子界面活性剤、チタン・ケイ素を含む界面活性剤、フッ化炭素系界面活性剤）などの界面活性剤。

レチノール、レチナール（ビタミンＡ１）、デヒドロレチナール（ビタミンＡ２）、カロチン、リコピン（プロビタミンＡ）、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、アスコルビン酸及びその誘導体、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、ジヒドロタキステロール、トコフェロール及びその誘導体、ユビキノン類、フィトナジオン（ビタミンＫ１）、メナキノン（ビタミンＫ２）、メナジオン（ビタミンＫ３）、メナジオール（ビタミンＫ４）、その他、必須脂肪酸（ビタミンＦ）、カルニチン、フェルラ酸、γ-オリザノール、オロット酸、ビタミンＰ類（ルチン、エリオシトリン、ヘスペリジン）、ビタミンＵなどのビタミン類。バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジンなどや、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩などのアミノ酸或いはピロリドンカルボン酸などのアミノ酸誘導体。

酵母代謝物、酵母菌抽出エキス、米発酵エキス、米糠発酵エキス、ユーグレナ抽出物やトレハロースまたはその誘導体などの微生物培養代謝物。グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸などのα-ヒドロキシ酸。無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、カオリン、ベントナイト、マイカ、雲母チタン、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、黄酸化鉄、ベンガラ、黒酸化鉄、グンジョウ、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、カラミンなどの無機顔料。

ｐ-アミノ安息香酸誘導体、サルチル酸誘導体、アントラニル酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導体、テトラゾール誘導体、イミダゾリン誘導体、ピリミジン誘導体、ジオキサン誘導体、カンファー誘導体、フラン誘導体、ピロン誘導体、核酸誘導体、アラントイン誘導体、ニコチン酸誘導体、ビタミンＢ６誘導体、ベンゾフェノン類、オキシベンゾン、アルブチン、グアイアズレン、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリン、ネオヘリオパン、ウロカニン酸誘導体、エスカロール、酸化亜鉛、タルク、カオリンなどの紫外線吸収・遮断剤。

ｐ-アミノ安息香酸誘導体、サルチル酸誘導体、アントラニル酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導体、テトラゾール誘導体、イミダゾリン誘導体、ピリミジン誘導体、ジオキサン誘導体、カンファー誘導体、フラン誘導体、ピロン誘導体、核酸誘導体、アラントイン誘導体、ニコチン酸誘導体、ビタミンＢ６誘導体、オキシベンゾン、ベンゾフェノン、アルブチン、グアイアズレン、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリンなどの美白剤。アスコルビン酸及びその誘導体、ハイドロキノン及びその配糖体、コウジ酸及びその誘導体、胎盤エキス、シルクペプチド、植物エキス（クワ、トウキ、ワレモコウ、ヨモギ、スイカズラ、キハダ、ドクダミ、マツホド、ハトムギ、オドリコソウ、サンザシ、ユーカリ、セイヨウノコギリソウ、アルテア、ケイヒ、マンケイシ、ハマメリス、ヤマグワ、延命草、桔梗、トシシ、続随子、射干、麻黄、センキュウ、ドッカツ、サイコ、ボウフウ、ハマボウフウ、オウゴン、シャクヤク、ゲンノショウコ、甘草、五倍子、アロエ、ショウマ、紅花、阿仙薬など）などチロシナーゼ活性阻害剤。

ハイドロキノンモノベンジルエーテル、フェニル水銀ヘキサクロロフェン、酸化第二水銀、塩化第一水銀、過酸化水素水、過酸化亜鉛などのメラニン色素還元・分解剤。ハイドロキノン、乳酸菌エキス、胎盤エキス、霊芝エキス、ビタミンＡ、ビタミンＥ、アラントイン、脾臓エキス、胸腺エキス、酵母エキス、発酵乳エキス、植物エキス（アロエ、オウゴン、スギナ、ゲンチアナ、ゴボウ、シコン、ニンジン、ハマメリス、ホップ、ヨクイニン、オドリコソウ、センブリ、トウキ、トウキンセンカ、アマチャ、オトギリソウ、キュウリ、タチジャコウソウ、ローズマリー、パセリなど）などのターンオーバーの促進作用・細胞賦活剤。コハク酸、アラントイン、塩化亜鉛、酸化亜鉛、カラミン、硫酸アルミニウムカリウム、レゾルシン、塩化第二鉄、タンニン酸（カテキン化合物を含む）などの収斂剤。

ＳＯＤ、カタラーゼ、グルタチオンパーオキシダーゼなどの活性酸素消去剤。アスコルビン酸及びその塩、ステアリン酸エステル、トコフェロール及びそのエステル誘導体、ノルジヒドログアセレテン酸、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ヒドロキシチロソール、パラヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、セサモール、セサモリン、ゴシポールなどの抗酸化剤。

β−カロチン、植物エキス（ゴマ培養細胞、アマチャ、オトギリソウ、ハマメリス、チョウジ、メリッサ、エンメイソウ、シラカバ、セージ、ローズマリー、南天実、キナ、エイジツ、イチョウなど）などの過酸化脂質生成抑制剤。イクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルレチン酸及びその塩、甘草エキス成分、シコンエキス、エイジツエキスなどの抗炎症剤。

アクリノール、イオウ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化メチルロザニリン、クレゾール、グルコン酸クロルヘキシジン、スルファミン、マーキュロクロム、ラクトフェリンまたはその加水分解物、塩化アルキルジアミノエチルグリシン液、イソプロピルメチルフェノール、トリクロサン、クジンなどの殺菌・消毒薬。

グリセリン、プロピレングリコール、1、3-ブチレングリコール、ヒアルロン酸及びその塩、ポリエチレングリコール、コンドロイチン硫酸及びその塩、水溶性キチン或いはキトサン誘導体、ピロリドンカルボン酸及びその塩、乳酸ナトリウム、ミニササニシキエキスなどの保湿剤。二硫化セレン、臭化アルキルイソキノリニウム液、ジンクピリチオン、ビフェナミン、トウガラシチンキ、塩酸キニーネ、強アンモニア水、臭素酸カリウム、臭素酸ナトリウム、チオグリコール酸などの頭髪用剤。卵胞ホルモン（エストロン、エストラジオール、エチニルエストラジオールなど）、イソフラボン、オキセンドロンなどの抗アンドロゲン剤。

ビタミンＥ及びその誘導体、センブリエキス、ニンニクエキス、人参エキス、アロエエキス、ゲンチアナエキス、トウキエキス、セファランチン、塩化カルプロニウム、ミノキシジルなどの末梢血管血流促進剤。トウガラシチンキ、ノニル酸バニルアミド、カンタリスチンキ、ショウキョウチンキ、ハッカ油、ｌ−メントール、カンフル、ニコチン酸ベンジルなどの局所刺激剤。

感光素３０１号、ヒノキチオール、パントテン酸及びその誘導体、アラントイン、胎盤エキス、ビオチン、ペンタデカン酸グリセリドなどの代謝活性剤。ピリドキシン及びその誘導体、イオウ、ビタミンＢ６などの抗脂漏剤。レゾルシン、サリチル酸、乳酸などの角質溶解剤。

過酸化水素水、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム、過ホウ酸ナトリウム、過酸化尿素、過炭酸ナトリウム、過酸化トリポリリン酸ナトリウム、臭素酸ナトリウム、臭素酸カリウム、過酸化ピロリン酸ナトリウム、過酸化オルソリン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム過酸化水素付加体、硫酸ナトリウム塩化ナトリウム過酸化水素付加体、β−チロシナーゼ酵素液、マッシュルーム抽出液などの酸化剤。

硫酸ストロンチウム、硫化ナトリウム、硫化バリウム、硫化カルシウムなどの無機系還元剤、チオグリコール酸またはその塩類（チオグリコール酸カルシウム、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリコール酸リチウム、チオグリコール酸マグネシウム、チオグリコール酸ストロンチウムなど）などの除毛剤。エタノールアミン、尿素、グアニジンなどの毛髪膨潤剤。

5−アミノオルトクレゾール、2−アミノ−4−ニトロフェノール、2−アミノ−5−ニトロフェノール、1−アミノ−4−メチルアミノアントラキノン、3,3'−イミノジフェノール、塩酸2,4−ジアミノフェノキシエタノール、塩酸2,4−ジアミノフェノール、塩酸トルエン−2,5−ジアミン、塩酸ニトロパラフェニレンジアミン、塩酸パラフェニレンジアミン、塩酸Ｎ−フェニルパラフェニレンジアミン、塩酸メタフェニレンジアミン、オルトアミノフェノール、酢酸Ｎ−フェニルパラフェニレンジアミン、1,4−ジアミノアントラキノン、2,6−ジアミノピリジン、1,5−ジヒドロキシナフタレン、トルエン−2,5−ジアミン、トルエン−3,4−ジアミン、ニトロパラフェニレンジアミン、パラアミノフェノール、パラニトロオルトフェニレンジアミン、パラフェニレンジアミン、パラメチルアミノフェノール、ピクラミン酸、ピクラミン酸ナトリウム、N、N'−ビス（4−アミノフェニル）−2,5−ジアミノ−1,4−4−キノンジイミン、5−（2−ヒドロキシエチルアミノ）−2−メチルフェノール、N−フェニルパラフェニレンジアミン、メタアミノフェノール、メタフェニレンジアミン、硫酸２−アミノ−5−ニトロフェノール、硫酸オルトアミノフェノール、硫酸オルトクロルパラフェニレンジアミン、硫酸4,4'−ジアミノジフェニルアミン、硫酸2,4−ジアミノフェノール、硫酸トルエン−2,5−ジアミン、硫酸ニトロパラフェニレンジアミン、、硫酸パラフェニレンジアミン、硫酸パラメチルアミノフェノール、硫酸メタアミノフェノール、硫酸メタフェニレンジアミン、カテコール、ジフェニルアミン、α−ナフトール、ヒドロキノン、ピロガロール、フロロログルシン、没食子酸、レゾルシン、タンニン酸、2−ヒドロキシ−5−ニトロ−2',4'−ジアミノアゾベンゾゼン−5'−スルホン酸ナトリウム、ヘマテインなどの染料剤。

ジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリスなどの天然動物性香料、アニス精油、アンゲリカ精油、イランイラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カナンガ精油、カラウェー精油、カルダモン精油、グアヤクウッド精油、クミン精油、黒文字精油、ケイ皮精油、シンナモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、コリアンデル精油、ジャスミン精油、ジンジャーグラス精油、杉精油、スペアミント精油、西洋ハッカ精油、大茴香精油、チュベローズ精油、丁字精油、橙花精油、冬緑精油、トルーバルサム精油、バラ精油、パルマローザ精油、檜精油、ヒバ精油、白檀精油、プチグレン精油、ベイ精油、ベチバ精油、ベルガモット精油、ペルーバルサム精油、ボアドローズ精油、芳樟精油、マンダリン精油、ユーカリ精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油、和種ハッカ精油などの植物性香料、その他合成香料などの香料。

赤キャベツ色素、赤米色素、アカネ色素、アナトー色素、イカスミ色素、ウコン色素、エンジュ色素、オキアミ色素、柿色素、カラメル、金、銀、クチナシ色素、コーン色素、タマネギ色素、タマリンド色素、スピルリナ色素、ソバ全草色素、チェリー色素、海苔色素、ハイビスカス色素、ブドウ果汁色素、マリーゴールド色素、紫イモ色素、紫ヤマイモ色素、ラック色素、ルチンなどの色素・着色剤。

また植物やクロレラ・ブルガリスなどの緑藻、及びコンブ（マコンブ、リシリコンブ、ホソメコンブ、ミツイシコンブ）などの褐藻、及びヒジリメン、マクサ(テングサ)、ヒラクサなどの紅藻に代表される海藻やクラミドモナスなどの緑藻類やスイゼンジノリなどの藍藻類やピラエラ、ナガミシオミドロなどの褐藻類やウシケノリなどの紅藻類や、シャジクモ車軸藻類や、ヒカリモなどの黄色藻類などに代表されるその他の藻類や鶏冠抽出物。牛・人の胎盤抽出物、豚・牛の胃や十二指腸或いは腸の抽出物若しくはその分解物、豚・牛の脾臓の抽出物若しくはその分解物、豚・牛の脳組織の抽出物、水溶性コラーゲン、アシル化コラーゲンなどのコラーゲン誘導体、コラーゲン加水分解物、エラスチン、エラスチン加水分解物、水溶性エラスチン誘導体、ケラチン及びその分解物またはそれらの誘導体、シルク蛋白及びその分解物またはそれらの誘導体、豚・牛血球蛋白分解物（グロビンペプチド）、豚・牛ヘモグロビン分解物（ヘミン、ヘマチン、ヘム、プロトヘム、ヘム鉄など）、牛乳、カゼイン及びその分解物またはそれらの誘導体、脱脂粉乳及びその分解物またはそれらの誘導体、ラクトフェリンまたはその分解物、鶏卵成分、魚肉分解物など。
上記添加物を使用する場合には、添加しようとする製品種別、形態に応じて常法的に行われる加工（例えば、粉砕、製粉、洗浄、加水分解、醗酵、精製などを任意に選択、組み合わせた処理）を行い、各種の素材から任意に選択して供すればよい。尚、抽出に用いる溶媒については、後に行う加工処理等を考慮した上で選択すれば良いが、通常では、水、水溶性有機溶媒（例えば、エタノール、プロピレングリコールなど）の中から選ばれる１種もしくは２種以上の混液を用いるのが望ましい。

但し、用途により有機溶媒の含有が好ましくない場合においては、水のみを使用したり、あるいは抽出後に除去しやすいエタノールを採用し、単独または水との任意の混液で用いたりすれば良い。

その他、保湿剤、ホルモン類、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、防腐・防バイ剤、清涼剤、安定化剤、乳化剤、動・植物性蛋白質及びその分解物、動・植物性多糖類及びその分解物、動・植物性糖蛋白質及びその分解物、血流促進剤、消炎剤・抗アレルギー剤、細胞賦活剤、角質溶解剤、創傷治療剤、増泡剤、増粘剤、口腔用剤、消臭・脱臭剤、苦味料、酵素などが挙げられ、これらとの併用によって、相加的及び相乗的な各種の効果が期待できる。

以下、本発明を実施例により説明するが、本実施例によって本発明が限定されるものではない。

製造例１
リンゴ未熟果実（表１）を水で十分洗浄した後、水気を十分に拭き取り、適宜カットした100gを65％エタノール水溶液360.5gに浸漬し25℃で1週間抽出した。液体部分を取り出し、ガラス濾紙（Advantec 社製、Grade：DP70）による濾過で不溶解分を除去し、淡黄褐色の清澄なリンゴ未熟果実抽出物を得た。

製造例２
製造例１で得たリンゴ未熟果実抽出物を必要に応じてエバポレーターを用いて溶媒を取り除いた後、真空凍結乾燥してリンゴ未熟果実抽出物凍結乾燥粉末を得た。

製造例３
製造例１と同品種の各リンゴ未熟果実を水で十分洗浄した後、水気を十分に拭き取り、適宜カットした後、100gを65%1,3-ブチレングリコール水溶液310.5gに浸漬し25℃で2週間抽出した。液体部分を取り出し、ガラス濾紙（Advantec 社製、Grade：DP70）による濾過で不溶解分を除去し、50％1,3-ブチレングリコール水溶液217gを加え攪拌した。この溶液をメンブレンフィルター(Advantec社製、Grade：A045A142C)でろ過滅菌し、淡黄褐色の清澄なリンゴ未熟果実抽出物を得た。

製造例４
リンゴ成熟果実の品種は、王林とふじを使用し、それぞれのリンゴ成熟果実を皮ごと擦り下ろしたもの100gを65％エタノール水溶液360.5gに浸漬し25℃で1週間抽出した。液体部分を取り出し、ガラス濾紙（Advantec 社製、Grade：DP70）による濾過で不溶解分を除去し、淡黄褐色の清澄な各リンゴ成熟果実抽出物を得た。

製造例５
製造例４で得たリンゴ成熟果実抽出物を、エバポレーターを用いて溶媒を取り除いた後、真空凍結乾燥してリンゴ成熟果実抽出物凍結乾燥粉末を得た。

試験例１＜チロシナーゼ活性阻害試験＞
(試料調製)
製造例２で調製したリンゴ未熟果実抽出物凍結乾燥粉末を50％(v/v)エタノール水溶液に溶解し、それぞれ濃度が2000、4000、6000、10000ppmとなるように調製し試料液とした。

(試験方法)
チロシナーゼ阻害活性は、L-チロシンを基質として以下のように測定した。すなわち、試料液0.15mLにチロシナーゼ溶液（Sigma社製、マッシュルーム由来、1000U/mLに1/15Mリン酸緩衝液で希釈）0.1mL及びリン酸緩衝液（1/15M、pH6.8）を総量が2.6mLとなるように加え、25℃で10分間静置した。コントロールとして、試料液の代わりに50％(v/v)エタノール水溶液を添加して同様の操作を行った。その後、この溶液にL-チロシン溶液（1.5mM）0.4mLを加えて25℃で10分間反応させた後、得られた溶液の470nmの吸光度を測定し、以下の数１に示す数式によりチロシナーゼ阻害活性を算出した。なお、ブランクとして基質溶液であるL-チロシン溶液の代わりにリン酸緩衝液を添加し、同様にして吸光度を測定した。

（試験結果）
リンゴ未熟果実抽出物のチロシナーゼ阻害活性測定結果を図１に示した。全ての品種のリンゴ未熟果実抽出物が濃度依存的なチロシナーゼ阻害活性を示した。中でも王林の未熟果実抽出物は特に高いチロシナーゼ阻害活性を有していることが判明した。以上より、リンゴ未熟果実抽出物はチロシナーゼ阻害活性を有していることから、シミやくすみの原因となるメラニンの生成抑制効果が期待できる。

次に、上記の試験で最も高いチロシナーゼ阻害活性を示した王林の未熟果実抽出物と、王林の成熟果実抽出物のチロシナーゼ活性を比較した。王林の成熟果実は一般的に店頭で売られている食用のものを用い、抽出物の凍結乾燥品の調製は上記の製造例１、製造例２に従って行った（以下、王林成熟果実抽出物と呼称する）。試験結果を図２に示した。図２より、同じ品種であっても王林成熟果実抽出物はチロシナーゼ阻害活性をほとんど示さなかったことから、リンゴ未熟果実抽出物はリンゴ成熟果実抽出物にはないチロシナーゼ阻害効果、即ちメラニン生成抑制効果を有することが判明した。

試験例２
＜B16メラノーマ細胞を用いたメラニン生成抑制試験＞
試験例1において高いチロシナーゼ阻害活性を示した王林の未熟果実抽出物について、メラニンを生成する細胞をガン化させたB16メラノーマ細胞を用いたメラニン生成抑制試験に供した。

(試験方法)
表面積25cm²の細胞培養用プラスチックボトルにDMEM培地（日水製薬社製、10%FBS添加）9mL及びB16細胞懸濁液1.0mL（細胞数2.5×10⁵個/mL）を加えて、37℃、5%CO₂の条件下で24時間培養した。細胞接着を確認後、製造例2で調製したリンゴ未熟果実抽出物凍結乾燥粉末を100、300、500ppmとなるよう添加し、72時間培養した。その後、トリプシン-EDTA処理により細胞を剥離後、得られた細胞を遠心分離し、細胞の状態を遠沈管底部より観察した。メラニン生成抑制効果は以下の基準により評価した。なお、陰性コントロールは試験液を加えないものとし、陽性コントロールとしてコウジ酸を用いた。
(評価基準)
「５」：コントロールと同程度、及びそれ以上の黒色
「２〜４」：数字が小さいほど白色化した色調
「１」：白色に極近い灰色で黒色と認められない色調
「０」：白色

(試験結果)
表２にリンゴ未熟果実抽出物のメラニン生成抑制の結果を示した。リンゴ未熟果実抽出物には濃度依存的なメラニン生成抑制効果が認められた。

試験例１及び試験例２の結果より、リンゴ未熟果実抽出物はリンゴ成熟果実抽出物にはない優れたメラニン生成抑制効果を有することが判明した。また、「王林」は他品種に比べ特に高い効果を有していた。以上より、本発明で得られるリンゴ未熟果実抽出物、特に王林未熟果実からの抽出物はメラニン生成抑制効果を有する皮膚老化抑制剤として有効なものである。

試験例３
＜抗糖化試験＞
(試料調製)
製造例2で調製したリンゴ未熟果実抽出物凍結乾燥粉末を脱塩水に溶解して1000、2000、4000ppmに調整し、試験に供した。リンゴ未熟果実の品種は王林を用いた。

（試験方法）
リンゴ未熟果実抽出物の抗糖化効果は、糖化の反応生成物であるAGEs（Advanced Glycation Endproducts）の生成抑制率を測定することで評価した。すなわち、光を透過しない遮光マイクロチューブに250mMリン酸緩衝液（pH7.4）580μLを加え、これに各濃度の試料溶液20μlを添加した(コントロールとして脱塩水を添加した)。次に2.5Mグルコース水溶液200μLを添加し、さらにBSA溶液（Sigma社製，A9418-5G，Albumin
from bovine serum，10mg/mLとなるようにリン酸緩衝液で調製）200μLを添加した。試験溶液を攪拌後、60℃で18時間加温した後、マイクロチューブを氷浴に浸漬し降温した。100%（w/v）トリクロロ酢酸溶液100μLを加えて攪拌した後、4℃で15分冷却した。次に遠心分離（4℃，11000rpm，10分）して上澄みを除去し、アルカリPBS（137mM NaCl, 8.1mM
Na2HPO4, 2.68mM KCl, 1.47mM KH2PO4, 0.25N NaOHでpH10に調製）1000μLを加え、攪拌して沈殿を溶解し、蛍光強度計にて励起波長（Ex）370nm，蛍光波長（Em）440nmを測定し、以下の式よりリンゴ未熟果実抽出物のAGEs生成抑制率を求めた。なお、ブランクとしてグルコース水溶液の代わりに脱塩水を添加して同様の操作を実施した。 上記のようにして測定した結果をもとに数２に示す数式により各試料の糖化抑制率を計算した。

(試験結果)
図３にリンゴ未熟果実抽出物の糖化抑制率（AGEs生成抑制率）測定結果を示した。図３より、リンゴ未熟果実抽出物は濃度依存的な抗糖化効果を示すことが認められた。以上より、本発明で得られるリンゴ未熟果実抽出物は抗糖化効果を持つ皮膚老化抑制剤として有効なものである。

試験例４
＜ゼラチナーゼ活性阻害作用＞
(試料調製)
製造例２で調製したリンゴ未熟果実抽出物凍結乾燥粉末（品種は王林、ふじ、津軽、金星）をTris／HCl緩衝液に溶解し、それぞれ濃度が、150、300、600、1200ppmとなるように調製し試料液とした。

(試験方法)
試験は市販されるコラゲノキット（コラーゲン技術研修会製、CLN-100）を用いて行った。すなわち、まず蛍光標識されたコラーゲンを含む溶液を付属の0.1M Tris／HCl緩衝液と混合し、沸騰浴中で煮沸した後に冷却して基質溶液とした。褐色のマイクロチューブに予め調製しておいたゼラチナーゼ溶液（MP Biomedicals,LLC、
Collagenase Type 4）および試料溶液を添加して37℃で10分間恒温とした。その後、基質溶液を加えて混合し、再び37℃で2時間恒温とした。リン酸緩衝液およびエタノールを加えて激しく攪拌して反応を停止した後、遠心分離して上澄溶液を回収し、蛍光強度（Em=520nm，Ex=495nm）を測定した。試験溶液の代わりに緩衝液を添加した場合のゼラチナーゼ活性を基準（コントロール）とし、以下の数３に示す数式より試験溶液のゼラチナーゼ活性阻害率を求めた。なお、ブランクとして酵素溶液の代わりに緩衝液を添加した場合の蛍光強度を測定した。

（試験結果）
リンゴ未熟果実抽出物のゼラチナーゼ阻害活性測定結果を図４に示した。図４より、全ての品種のリンゴ未熟果実抽出物が濃度依存的なゼラチナーゼ阻害活性を示した。中でも王林の未熟果実抽出物は特に高いゼラチナーゼ阻害活性を有していることが判明した。

次に、上記の試験で最も高いゼラチナーゼ阻害活性を示した王林の未熟果実抽出物と、王林成熟果実抽出物を比較した。王林成熟果実抽出物は試験例1と同じ凍結乾燥品を用いた。試験結果を図５に示した。同じ品種であっても王林成熟果実抽出物はゼラチナーゼ阻害活性をほとんど示さなかったことから、リンゴ未熟果実抽出物はリンゴ成熟果実抽出物にはないゼラチナーゼ活性阻害効果を有することが判明した。以上より、リンゴ未熟果実抽出物、特に王林未熟果実からの抽出物は高いゼラチナーゼ阻害活性を有する皮膚老化抑制剤として有効なものであることがわかった。

以上述べたとおり、本発明によれば、摘果時期に採取されるリンゴの未熟果実抽出物は、メラニン生成抑制効果、抗糖化効果、ゼラチナーゼ活性阻害効果等の生理活性を有し、皮膚老化抑制剤として優位に利用することができる。
また、原料となるリンゴ未熟果実には様々な品種を用いることができるが、本発明において、数ある品種の中でも「王林」を用いることで高い皮膚老化抑制作用が得られるという結果が実験により得られた。

（実施例１）
＜化粧水の製造＞
表３に示す処方に従い、(1)〜(9)を攪拌、溶解し、化粧水を製造した。得られた化粧水はいずれも40℃、RH75%の条件下において３ヶ月間安定であった。また、得られた化粧水は優れた保湿作用及び肌荒れ抑制作用を示した。さらに、使用中に肌のトラブルを起こしたものは皆無であった。

（実施例２）
＜クリームの製造＞
表４に示す処方に従い、(1)〜(8)を80℃で混合攪拌したものに別途(9)〜(12)を80℃で混合攪拌したものを加え、ホモジナイズし、攪拌しながら冷却し、クリーム剤を製造した。得られた製品は使用中にべたつかず、肌をしっとりとさせるものであった。

＜美白効果試験＞
表４に示す処方にて、調製したクリームを用いて、美白効果試験を実施した。
7月〜8月の晴れた日に2時間の屋外活動を2日間連続で実施したモニター20名の上腕部に、3日目より各クリームを一日2回、定められた場所に1ヶ月間塗布した。塗布終了後、色素沈着に対する抑制効果を目視で調べた。色素沈着に対する抑制効果は以下の基準に基づいて評価した。平均値を算出し、結果を表５に示した。

（評価基準）
色素沈着が比較例２−１に比較して著しく抑制された。・・・・・・2点
色素沈着が比較例２−１に比較して抑制された。・・・・・・・・・1点
色素沈着が比較例２−１に比較して変わらない。・・・・・・・・・0点
色素沈着が比較例２−１に比較して増大した。・・・・・・・・・−1点
色素沈着が比較例２−１に比較して著しく増大した。・・・・・・−2点

（試験結果）
表５から明らかなように、本発明に係わるリンゴ未熟果実抽出物を添加したクリームの美白効果は、ビタミンC誘導体であるリン酸アスコルビルマグネシウム配合の場合よりも、効果的に色素沈着を防止・改善することが認められた。また、使用中に肌のトラブルを起こしたものは皆無であった。

実施例３
＜ボディジェルの製造＞
表６に示す処方に従い、(1)〜(8)を80℃で混合攪拌し、ボディジェル剤を得た。得られた製品は使用中にべたつかず、肌をしっとりとさせるものであった。また、使用中に肌のトラブルを起こしたものは皆無であった。

実施例４
＜乳液の調製＞
表７に示す処方に従い、(1)〜(10)を80℃で混合撹拌し、別途(11)〜(14)を80℃で混合攪拌したものに徐々に加えて混合撹拌し、撹拌しながら冷却し、乳液を調製した。

＜抗シワ試験＞
表７に示す処方にて、調製した乳液を用いて、抗シワ試験を実施した。
モニター20名の目尻に、各乳液を一日2回、目尻に14日間塗布した。塗布終了後、シワを二次元画像解析法で、影面積より調べた。結果を表８に示した。

表８から明らかなように、本発明に係わるリンゴ未熟果実抽出物(品種は王林)を添加した乳液の抗シワ効果はリンゴ未熟果実抽出物が無添加である比較例４と比較して、効果的にシワを改善することが認められた。また、使用中に肌のトラブルを起こしたものは皆無であった。

実施例５
＜シャンプーの調製＞
表９に示す処方に従い、(1)〜(4)、(6)〜(8)を70℃で混合攪拌し、30℃まで冷却させた後、(5)を加え混合攪拌し、シャンプー剤を得た。得られた製品を用いて洗髪したところ、髪の感触が滑らかで、髪に潤いを与えるものであった。

各品種におけるリンゴ未熟果実抽出物の試験溶液中の濃度とチロシナーゼ阻害活性の関係を示すグラフ。 王林の未熟果実抽出物及び成熟果実抽出物の試験溶液中の濃度とチロシナーゼ阻害活性の関係を示すグラフ。 王林の未熟果実抽出物の試験溶液中の濃度と糖化抑制率の関係を示すグラフ。 各品種におけるリンゴ未熟果実抽出物の試験溶液中の濃度とゼラチナーゼ阻害活性の関係を示すグラフ。 王林の未熟果実抽出物及び成熟果実抽出物の試験溶液中の濃度とゼラチナーゼ阻害活性の関係を示すグラフ。

Claims (6)

1. リンゴの未熟果実より、水、アルコール又はこれらの混合溶媒で抽出して得られた抽出物を配合した皮膚老化抑制剤。
2. リンゴの品種が王林であることを特徴とする請求項１記載の皮膚老化抑制剤。
3. リンゴの未熟果実が、摘果作業において採取されたものであることを特徴とする請求項１及び請求項２記載の皮膚老化抑制剤
4. メラニン生成抑制効果を有してなる請求項１乃至請求項３記載の皮膚老化抑制剤。
5. 抗糖化効果を有してなる請求項１乃至請求項４記載の皮膚外用剤。
6. ゼラチナーゼ活性阻害効果を有してなる請求項１乃至請求項５記載の皮膚老化抑制剤。