JP2013128414A - エクオールの製造方法 - Google Patents
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Abstract
嫌気性微生物の作用を利用して、より最適な培地条件によりイソフラボン類を発酵させ、従来よりも効果的にエクオールを製造できる方法を提供することにある。
【解決手段】
次の工程を含むエクオール生産能を有する嫌気性微生物によるエクオールの製造方法;
(1)イソフラボン類及び多価アルコールを含有する培地で該嫌気性微生物を培養し、該嫌気性微生物にイソフラボン類からエクオールを発酵させる工程、及び
(2)工程(1)で嫌気性微生物により生産されたエクオールを培地から回収する工程。
【選択図】図2
Description
と、を含む混合微生物を、ダイゼイン類を含む培地中で培養してダイゼイン代謝物を製造する際に、原料であるダイセイン類の可溶化剤として、(1)シクロデキストリン、又は、(2)ポリエチレングルコール鎖を有し、水及びエタノール溶解可能でありHLB値が11以上である界面活性剤を、培地中に添加することが記載されている。
以上の知見に基づき、本発明者らは、エクオール生産菌を用いたエクオール製造におけるより好適な培養条件の確立に成功し、これにより本発明を完成するに至った。
[態様1]
次の工程を含むエクオール生産能を有する嫌気性微生物によるエクオールの製造方法:
(1)イソフラボン類及び多価アルコールを含有する培地で該嫌気性微生物を培養し、該嫌気性微生物にイソフラボン類からエクオールを発酵させる工程、及び
(2)工程(1)で嫌気性微生物により生産されたエクオールを培地から回収する工程。
[態様2]
イソフラボンがダイゼインである、態様1記載の方法。
[態様3]
多価アルコールが糖類及び/又は糖アルコール類から選ばれる少なくとも一種である態様1又は2に記載の製造方法。
[態様4]
糖類がグルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、デンプン、アミロース、デキストリン、シュクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、セロビオース、メリビオース、パラチノース、イソマルトース、ラクツロース、コージビオース、パラチノース、ソホロース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース、及び、ラフィノースから選ばれる少なくとも一種であり、糖アルコール類がグリセリン、エリスリトール、ソルビトール、イノシトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、ラクチトール、及びアラビニトールから選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする態様1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
[態様5]
多価アルコールがデキストリンである、態様4記載の製造方法。
[態様6]
培地中に更にシクロデキストリンを含有させる、態様1〜5のいずれか一項に記載の製造方法。
[態様7]
嫌気性微生物がアサッカロバクター・セラツス、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス、スラッキア・イソフラビニコンバーテンスより選ばれる少なくとも一種の菌である、態様1〜6のいずれか一項に記載の製造方法。
[態様8]
水素を含む1種類以上の気体からなる気相下で嫌気性微生物を培養する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の製造方法。
次の工程を含むエクオール生産能を有する嫌気性微生物によるエクオールの製造方法に関する。
(1)イソフラボン類及び多価アルコールを含有する培地で該嫌気性微生物を培養し、該嫌気性微生物にイソフラボン類からエクオールを発酵させる工程、及び
(2)工程(1)で嫌気性微生物により生産されたエクオールを培地から回収する工程。
等の糖アルコール類を挙げることができる。
コーリオバクテリウム(Coriobacterium)属
アドレクラウチア(Adlercreutzia)属
アサッカロバクター(Asaccharobacter)属
アシネトバクター(Acinetobacter)属
アトポビウム(Atopobium)属
コリンゼラ(Collinsella)属
クリプトバクテリウム(Cryptobacterium)属
デニトロバクテリウム(Denitrobacterium)属
エガセラ(Eggerthella)属
エンテロハブダス(Enterorhabdus)属
ゴードニバクター(Gordonibacter)属
オルセネラ(Olsenella)属
パラエゲセエラ(Paraeggerthella)属
スラッキア(Slackia)属
ラクトコッカス(Lactococcus)属
ユーバクテリウム(Eubacterium)属
シャーペア(Sharpea)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
バクテロイデス(Bacteroides)属
具体的には以下の微生物を利用することができる。
Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450
Enterorhabdus mucosicola DSM 19490
Slackia isoflavoniconvertens HE8(DSM 22006)
Slackia sp. TM-30 FERM AP-20729
Eggerthella sp. KCCM-10490
Asaccharobacter celatus DSM 18785
Lactococcus garvieae DSM 6783
Sharpea azabuensis DSM 18934
Lactococcus 20-92 FERM BP-10036
Bacteroides E-23-15 FERM BP-6435
Streptococcus E-23-17 FERM BP-6436
Streptococcus A6G225 FERM BP-6437
Eubacterium limosum ATCC 8486
上記の中で、特に、Asaccharobacter celatus DSM 18785、Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450 、Slackia isoflavoniconvertens HE8(DSM 22006)が好ましい。
FERM 特許生物寄託センター;International Patent Organism Depositary (IPOD)
http://unit.aist.go.jp/pod/ci/index.html
DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)
http://www.dsmz.de/
KCCM Korean Culture Center of Microorganisms
ATCC American Type Culture Collection
http://www.atcc.org/
以下、各実施例においては、以下の方法により、濁度の測定、ダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、エクオールの定量を行った。
培養液を純水で3倍に希釈した液の660 nmの濁度を測定し、3倍して元の培養液の濁度とした。
培養液0.5 mLに対し、酢酸エチル1.5 mLを加えて、激しく攪拌した後、3000 rpmで10秒遠心し、酢酸エチル層をパスツールピペットで可能な限り取り出した。同培養液に同様の操作をあと2回行い、それら酢酸エチル層を合わせてエクオール抽出液を得た。この抽出液をエバポレーターで減圧下に濃縮、乾固し、1.0 mLのメタノールに溶解させた。これを0.45 μmのPTFE膜でろ過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィー測定サンプルとした。
カラム:J’sphere ODS M-80, 2.0(直径)×250 mm(ワイエムシィ製)
移動相:水/アセトニトリル/酢酸[70:30:0.1, v/v]
流速:0.2 mL/min
カラム温度.:40 ℃
検出:UV280 nm
保持時間:ダイゼイン 14.1分、ジヒドロダイゼイン 15.1分、エクオール 26.3分
GAMブイヨン培地(日水製薬製)5.9 gとL-アルギニン塩酸塩1.2 gを純水100 mLに溶かし、窒素ガスを通じながら10 mLずつ嫌気性菌培養用18 mm試験管(三紳工業製)に分注し、ブチルゴム栓、プラスチックキャップをして115℃、15分間滅菌した。
この培地に-80℃で凍結保存していたアサッカロバクター・セラツス(Asaccharobacter celatus) DSM 18785株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を2分間以上置換した後、37℃、250 spmで16時間振とう培養を行った。以下に示すようなエクオール生産培地(実験培地)を調製後、115℃、15分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却後、この種培養液0.1 mLを植菌し、気相を水素ガスで無菌的に2分間以上置換した後、37℃、250 spmの条件で振とう培養を行った。24時間後、培養液を取り出し、高速液体クロマトグラフィーによりエクオールを定量した。
結果を表1に示す。デキストリン単独添加でも無添加に比べ2倍以上にエクオール生産量が増えるが、β-シクロデキストリンとデキストリンを同時に添加することにより、無添加にくらべ約10倍のエクオールが生産され、β-シクロデキストリンとデキストリンを単独で添加した場合と比較して顕著な相乗効果があることが分かった。
1リットル当たりの量
ポリペプトン(日本製薬) 3 g
酵母エキス(極東製薬) 5 g
KH2PO4 2.5 g
L-システイン塩酸塩 0.5 g
L-アルギニン塩酸塩 12.1 g
ヘミン 0.002 g
ダイゼイン(LKT社製)5.5 g
精製水を加え、pHを7.1に調整する。
比較例1:エクオール生産培地A
比較例2:エクオール生産培地A+β-シクロデキストリン 24.8 g/L
実施例1:エクオール生産培地A+デキストリン 40 g/L
実施例2:エクオール生産培地A+β-シクロデキストリン 24.8 g/L+デキストリン 40 g/L
GAMブイヨン培地(日水製薬製)5.9 gとL-アルギニン塩酸塩1.2 gを純水100 mLに溶かし、窒素ガスを通じながら10 mLずつ嫌気性菌培養用18 mm試験管(三紳工業製)に分注し、ブチルゴム栓、プラスチックキャップをして115℃、15分間滅菌した。
この培地に-80℃で凍結保存していたアサッカロバクター・セラツス(Asaccharobacter celatus) DSM 18785株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を2分間以上置換した後、37℃、250 spmで16時間振とう培養を行った。以下に示すようなエクオール生産培地(実験培地)を調製後、115℃、15分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却後、この種培養液0.1 mLを植菌し、気相を水素ガスで無菌的に2分間以上置換した後、37℃、250 spmの条件で振とう培養を行った。24時間後、培養液を取り出し、高速液体クロマトグラフィーによりエクオールを定量した。結果を図2に示す。デキストリンのみならず、二糖類、糖アルコール類とβ-シクロデキストリンの両者を培地に添加することでもエクオールの生産が顕著に増加(2〜3倍)するという相乗効果があることが明らかになった。
エクオール生産培地Aにβ−シクロデキストリン 24.8 g/Lを加えた培地
(実験培地)
添加物(いずれも40 g/Lの濃度で加えた)
比較例3:無添加
実施例3:セロビオース
実施例4:マルトース
実施例5:トレハロース
実施例6:エリトリトール
実施例7:ソルビトール
実施例8:myo-イノシトール
実施例9:デキストリン
GAMブイヨン培地(日水製薬製)5.9 gとL-アルギニン塩酸塩1.2 gを純水100 mLに溶かし、窒素ガスを通じながら10 mLずつ嫌気性菌培養用18 mm試験管(三紳工業製)に分注し、ブチルゴム栓、プラスチックキャップをして115℃、15分間滅菌した。
この培地に-80℃で凍結保存していたアサッカロバクター・セラツス(Asaccharobacter celatus) DSM 18785株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を2分間以上置換した後、37℃、250 spmで16時間振とう培養を行った。以下に示すようなエクオール生産培地(実験培地)を調製後、115℃、15分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却後、この種培養液0.1 mLを植菌し、気相を水素ガスで無菌的に2分間以上置換した後、37℃、250 spmの条件で振とう培養を行った。24時間後、培養液を取り出し、高速液体クロマトグラフィーによりエクオールを定量した。結果を表2に示す。実施例3〜9の結果と同様に、アルコール、二糖類でエクオール生産が増加することが明らかになった。デキストリンのみならず、二糖類、糖アルコール類とβ-シクロデキストリンの両者を培地に添加することでもエクオールの生産が顕著に増加(2〜3倍)するという相乗効果があることが明らかになった。
エクオール生産培地Bの内、ダイゼインを3.7 g/L、β-シクロデキストリンを 16.9g/Lに変更した培地
(実験培地)
添加物(いずれも40 g/Lの濃度で加えた)
比較例4: 無添加
実施例10:グリセリン
実施例11:シュクロース
実施例12:ラクトース
実施例13:デキストリン
Claims (8)
- 次の工程を含むエクオール生産能を有する嫌気性微生物によるエクオールの製造方法:
(1)イソフラボン類及び多価アルコールを含有する培地で該嫌気性微生物を培養し、該嫌気性微生物にイソフラボン類からエクオールを発酵させる工程、及び
(2)工程(1)で嫌気性微生物により生産されたエクオールを培地から回収する工程。 - イソフラボンがダイゼインである、請求項1記載の方法。
- 多価アルコールが糖類及び/又は糖アルコール類から選ばれる少なくとも一種である請求項1又は2記載の製造方法。
- 糖類がグルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、デンプン、アミロース、デキストリン、シュクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、セロビオース、メリビオース、パラチノース、イソマルトース、ラクツロース、コージビオース、パラチノース、ソホロース、ゲンチオビオース、ラミナリビオース、及び、ラフィノースから選ばれる少なくとも一種であり、糖アルコール類がグリセリン、エリスリトール、ソルビトール、イノシトール、マルチトール、マンニトール、キシリトール、ラクチトール、及びアラビニトールから選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 多価アルコールがデキストリンである、請求項4記載の製造方法。
- 培地中に更にシクロデキストリンを含有させる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の製造方法。
- 嫌気性微生物がアサッカロバクター・セラツス、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス、スラッキア・イソフラビニコンバーテンスより選ばれる少なくとも一種の菌である請求項1〜6のいずれか一項に記載の製造方法。
- 水素を含む1種類以上の気体からなる気相下で嫌気性微生物を培養する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の製造方法。
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