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Herstellung und Gewinnung eines neuen, mit
Moenomycin bezeichneten Antibiotikums
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gen mit heissen polaren organischen Lösungsmitteln, z. B. Methanol, extrahiert und das Antibiotikum aus dem im Vakuum eingeengten Extrakt durch Fällung mit einem unpolaren organischen Lösungsmittel, z. B.
Diäthyläther, Diisopropyläther oder Äthylacetat, ausgefällt.
Die Isolierung aus dem Mycelextrakt kann auch in der Weise geschehen, dass die Substanz aus dem nach Abdampfen des organischen Lösungsmittels verbleibenden wässerigen Rückstand entweder durch Ein- stellen eines pH-Wertes von 1 bis 5, vorzugsweise 2 bis 3, mittels Mineralsäuren ausgefällt und abge- trennt, oder durch Extraktion mit einem nicht oder beschränkt wassermischbaren Lösungsmittel, z. B. Bu- tanol, aus der angesäuerten wässerigen Lösung gewonnen wird. Man kann auch das Antibiotikum aus dem wässerigen Rückstand in an sich bekannter Weise an Adsorptionsmittel, z. B. Bleicherden, adsorbieren.
Die Elution erfolgt zweckmässig mit Hilfe von wässerigen organischen Lösungsmitteln, z. B. Gemischen aus Methanol und Wasser, Methylglycol und Wasser oder Pyridin und Wasser. Der Wassergehalt beträgt dabei zwischen 30 und 70gO, vorzugsweise 50%. Aus dem Eluat wird das rohe Antibiotikum durch Eindampfen und Ausfällen, wie oben beschrieben, gewonnen.
Das beschriebene Adsorptionsverfahren kann auch zur Reinigung des Rohproduktes verwendet werden, wobei die Elution zweckmässig in mehreren Fraktionen erfolgt.
Zur Reinigung kann auch die Gegenstromverteilung angewandt werden, beispielsweise mit dem System Butanol/Wasser.
Das neue Antibiotikum, das sich durch seine Eigenschaften von den bisher in der Literatur beschriebenen antibiotisch wirksamen Substanzen unterscheidet, ist eine farblose Säure und bildet mit 1 Mol Metallhydroxyd die betreffenden Salze.
Die Säure ist löslich in Wasser, niederen Alkoholen, Pyridin und Dimethylformamid sowie in Methanol, wenig löslich in höheren Alkoholen, unlöslich in Äther, Essigester und andern unpolaren organischen Lösungsmitteln.
Die Substanz ist in neutraler wässeriger und methanolischer Lösung stabil, wird jedoch in sauren und vor allem alkalischen Lösungen langsam abgebaut.
Folgende Reaktionen sind negativ : Ninhydrin, Biuret, Fehling, Ehrlich, Sakaguchi, Anilinphthalat, Eisen (III)-chlorid. Eine charakteristische UV-Absorption im Bereich von 220 bis 400 mli fehlt.
Das Antibiotikum wird von Menschen und Warmblütern sehr gut vertragen und besitzt eine hohe Wirksamkeit sowohl in vitro als auch in vivo gegen grampositive Erreger, insbesondere gegen Staphylokokken, die gegen Tetracyclin, Penicillin, Streptomycin, Novobiocin und Erythromycin resistent sind. Es zeigt an der mit Streptokokken infizierten Maus eine 100% igue Schutzwirkung bei dreimaliger subcutaner Verabreichung von je 3 mg/kg.
Das Wirkungsspektrum ist aus Tabelle 3 ersichtlich.
Beispiel : I. Herstellung des Impfmaterials.
Ein 300 ml-Erlenmeyerkolben wird mit 80 ml der nachstehend aufgeführten Nährlösung beschickt, auf den pH-Wert 6, 6 eingestellt, 30 min bei 1210C im Autoklaven sterilisiert und nach dem Erkalten mit einer Sporensuspension von S. bambergiensis nov. spec. 3263, die durch Abschwemmen einer HaferflockenAgar-Rouxflasche gewonnen wurde, beimpft.
Nährlösung enthaltend : Sojamehl 10/0
Glukose l% NaCl 0, 25%.
Die beimpften Kolben werden anschliessend 48 h in einer Schüttelmaschine bei 280C kultiviert und dann zur Beimpfung der nachstehend aufgeführten Fermenterkultur verwendet.
2. Fermentation.
Die Kultivierung in grösserem Massstab erfolgt im Fermenter unter Verwendung einer Nährlösung, enthaltend :
Stärkezucker 4 %
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3. Isolierung durch neutrale Extraktion.
Nach dem Abernten wird das Mycel durch Zentrifugieren oder Filtration von der Fermentationslösung abgetrennt und unter gutem Rühren mit etwa 10 1 Methanol extrahiert. Der vom Mycel abgetrennte me-
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thanolische Extrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit 1, 5 I siedendem Methanol unter Rückfluss extrahiert. Nach Abkühlen wird der inaktive Rückstand abfiltriert und die Methanollösung auf etwa 50 ml eingeengt. Beim Zusatz von 250 ml Diäthyläther wird das rohe Antibiotikum ausgefällt.. Es wird abzentrifugiert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt etwa 20 g eines hellgrauen amorphen Produktes.
Zur Reinigung wird dieses Produkt in 2 l Wasser gelöst, und hiezu werden 200 g Bleicherde eingerührt, wobei die aktive Substanz an das Adsorptionsmittel gebunden wird. Die Lösung wird filtriert und das Adsorptionsmittel zweimal nacheinander unter Rühren mit je 2 l 50% gem wässerigem Äthylenglycolmonomethyläther (Methylglycol) bei Zimmertemperatur extrahiert. Die Extrakte werden abfiltriert, im Vakuum auf etwa 40 ml eingeengt, und die aktive Substanz wird durch Zusatz von 200 ml Äther ausgefällt. Aus den Extrakten werden auf diese Weise 6 g eines farblosen, amorphen Pulvers gewonnen. Die in vitro-Aktivität beträgt das 2-bis 3fache der Aktivität des Rohproduktes (vgl. Tabelle 3).
4. Isolierung durch Säurefällung.
Aus dem nach 3. erhaltenen Methanolextrakt wird das Methanol im Vakuum abdestilliert und der verbleibende wässerige Rückstand mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 bis 2,5 eingestellt.
Das hiebei ausfallende Antibioticum wird nach Einrühren von 50 g Kieselgur abgesaugt, mit Wasser gewaschen und der Filterkuchen im Vakuum getrocknet. Die das Antibioticum enthaltende Kieselgurschicht wird nun zweimal mit je 100 ml Methanol bei Raumtemperatur extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum auf 20 ml eingeengt. Durch Zusatz von 50 ml Diäthyläther wird das Antibioticum ausgefällt.
Nach Abzentrifugieren, Waschen mit Äther und Trocknen werden 8-10 g Moenomycin erhalten.
5. Isolierung durch saure Extraktion.
Der nach 4. erhaltene wässerige Rückstand wird mit verdünnterSchwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 bis 3 eingestellt und zweimal mit je einem Viertel Volumen n-Butanol extrahiert. Nach Abdampfen des Butanols im Vakuum auf ein kleines Volumen (zirka 20 ml) wird das Rohprodukt durch Zusatz von Di- äthyläther (50-100 ml) oder Petroläther ausgefällt. Die Ausbeute beträgt 10-12 g Moenomycin.
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Tabelle 1 Gegenüberstellung der in der Literatur beschriebenen grünversporenden Streptomyceten
EMI4.1
EMI4.2
<tb>
<tb>
Merkmale <SEP> S. <SEP> bamberg. <SEP> S. <SEP> virido- <SEP> S.glaucus* <SEP> S.viridans* <SEP> S.albovi- <SEP> S.prasinus** <SEP> S.hirsutus** <SEP> S.prasino-
<tb> 3263 <SEP> chrom* <SEP> ridis* <SEP> pilosus**
<tb> Sporophor <SEP> Retina-Spira <SEP> Spira <SEP> Spira <SEP> Spira <SEP> Spira <SEP> R.- <SEP> Spira <SEP> (3) <SEP> Spira <SEP> (1-3)
<tb> culum <SEP> ap. <SEP> (bis <SEP> 10) <SEP> (3-5) <SEP> (5-12) <SEP> (3-4) <SEP> apert <SEP> (1-2)
<tb> Sporenform <SEP> oval, <SEP> oval, <SEP> sta-oval <SEP> zylindr. <SEP> zylindr. <SEP> langoval, <SEP> oval, <SEP> oval,
<tb> behaart <SEP> chelig <SEP> stachelig <SEP> stachelig <SEP> behaart
<tb> Sporenfarbe <SEP> grün-dkl. <SEP> hellgrün- <SEP> grün- <SEP> dkl.grau- <SEP> graugrünlich <SEP> grün-dkl. <SEP> grün <SEP> dkl. <SEP> grün <SEP> dkl. <SEP> grün
<tb> grün <SEP> gr. <SEP> grün- <SEP> grau <SEP> gr.
<SEP> grün
<tb> rauchblau
<tb> veget. <SEP> creme-grünbraun <SEP> farblos <SEP> grünbraun <SEP> grünbraun <SEP> hellbraun <SEP> farblos-ziegelrot
<tb> Mycel <SEP> hellbraun <SEP> weissgelb
<tb> lösl. <SEP> braun <SEP> braun <SEP> braun <SEP> grün
<tb> Pigment
<tb> Melanin <SEP> +--.pigment
<tb> Stärke- <SEP> +++ <SEP> + <SEP> ++++ <SEP> + <SEP> ++++ <SEP> + <SEP> +
<tb> hydrolyse
<tb> Caseinhydro- <SEP> +(schwach) <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> (langsam)
<tb> lyse
<tb>
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Tabelle 1 (Fortsetzung)
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<tb>
<tb> Merkmale <SEP> S. <SEP> bamberg.
<SEP> S.virido- <SEP> S.glaucus* <SEP> S.viridans* <SEP> S.albovi- <SEP> S.prasinus** <SEP> S.hirsutus** <SEP> S.prasino-
<tb> 3263 <SEP> chrom* <SEP> ridis* <SEP> pilosus** <SEP>
<tb> Gelatine- <SEP> + <SEP> + <SEP> (langs.) <SEP> + <SEP> ++++ <SEP> +(langs.) <SEP> - <SEP> +(langs.) <SEP> +(langs.)
<tb> abbau
<tb> Nitrat- <SEP> ++++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP>
<tb> reduktion
<tb> Lackmus <SEP> blau <SEP> blau <SEP> blau <SEP> farblos <SEP> rot
<tb> Ca-Malat-creme <SEP> kupferrot <SEP> weiss <SEP> ziegelrot
<tb> Agar <SEP> (Farbe
<tb> d. <SEP> veg. <SEP> Mycels)
<tb> Antibiot. <SEP> vorhanden <SEP> fehlt <SEP> vorhanden <SEP> keine <SEP> keine <SEP> keine <SEP> schwach <SEP> gegen
<tb> Wirksamk. <SEP> od. <SEP> schwach <SEP> grampositive
<tb> Bakterien
<tb>
*) nach N. A. Krassilnikov **) nach Ettlinger et al.
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Tabelle 2 Morphologische und physiologische Eigenschaften des neubeschriebenen Streptomyceten
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<tb>
<tb> Nährboden <SEP> Eigenschaften <SEP> S. <SEP> bambergiensis <SEP> nov. <SEP> sp.
<tb>
Nährboden <SEP> Eigenschaften <SEP>
<tb> 3263
<tb> Bouillon <SEP> -Gelatine <SEP> Wachstum <SEP> +++ <SEP>
<tb> veg. <SEP> Mycel <SEP> creme
<tb> Luftmycel <SEP> u. <SEP> Sporen <SEP> weiss
<tb> lösl. <SEP> Pigment
<tb> Verflüssigung <SEP> ++
<tb> Stärke-Agar <SEP> Wachstum <SEP> +++ <SEP>
<tb> veg. <SEP> Mycel <SEP> creme
<tb> Luftmycel <SEP> u. <SEP> Sp. <SEP> grün
<tb> lösl. <SEP> Pigment
<tb> Stärkeabbau <SEP> +++ <SEP> K <SEP> : <SEP> Z <SEP> = <SEP> 22 <SEP> :
<SEP> 53
<tb> Glukose-Agar <SEP> Wachstum <SEP> ++
<tb> veg. <SEP> Mycel <SEP> creme
<tb> Luftmycel <SEP> u. <SEP> Sp. <SEP> weiss
<tb> lösl. <SEP> Pigment <SEP>
<tb> Synthet. <SEP> Agar <SEP> Wachstum <SEP> +++ <SEP>
<tb> veg. <SEP> Mycel <SEP> hellbraun
<tb> Luftmycel <SEP> u. <SEP> Sp. <SEP> blassbraun
<tb> lösl. <SEP> Pigment <SEP> hellbraun
<tb> Nitratreduktion <SEP> ++++
<tb> Ca-Malat-Agar <SEP> Wachstum <SEP> ++
<tb> veg. <SEP> Mycel <SEP> creme
<tb> Luftmycel <SEP> u. <SEP> Sp. <SEP> grün
<tb> lösl. <SEP> Pigment
<tb> Malat-Abbau <SEP> + <SEP> K <SEP> : <SEP> Z <SEP> = <SEP> 23 <SEP> :
<SEP> 29
<tb> Glukose-Asparagin-Agar <SEP> Wachstum <SEP> +
<tb> veg. <SEP> Mycel <SEP> creme
<tb> Luftmycel <SEP> u. <SEP> Sp. <SEP> grün
<tb> lösl. <SEP> Pigment <SEP>
<tb> Nähr-Agar <SEP> Wachstum <SEP> +++
<tb> veg. <SEP> Mycel <SEP> creme
<tb> Luftmycel <SEP> u. <SEP> Sp. <SEP> weiss
<tb> lösl. <SEP> Pigment
<tb> Emerson-Agar <SEP> Wachstum <SEP> ++
<tb> veg. <SEP> Mycel <SEP> gelb
<tb> Luftmycel <SEP> u. <SEP> Sp. <SEP> grün
<tb> lösl. <SEP> Pigment
<tb> Cellulose-Agar <SEP> Wachstum <SEP> +
<tb> veg. <SEP> Mycel <SEP> weiss
<tb> Luftmycel <SEP> u. <SEP> Sp. <SEP> grün
<tb> lösl. <SEP> Pigment
<tb> Cellulose-Abbau
<tb>
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Tabelle 2 (Fortsetzung)
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<tb>
<tb> Nährboden <SEP> Eigenschaften <SEP> S. <SEP> bambergiensis <SEP> nov. <SEP> sp. <SEP>
<tb>
3263
<tb> Casein <SEP> -Lackmus <SEP> -Agar <SEP> Wachstum <SEP> +++ <SEP>
<tb> veg. <SEP> Mycel <SEP> hellgrau
<tb> Luftmycel <SEP> u. <SEP> Sp. <SEP> hellgrau
<tb> Lackmus-Farbe <SEP> blau
<tb> Casein-Abbau <SEP> + <SEP> K <SEP> : <SEP> Z <SEP> = <SEP> 22 <SEP> : <SEP> 28
<tb> Pepton-Schräg-Agar <SEP> Melaninpigment <SEP>
<tb> Kartoffelscheibe <SEP> Wachstum <SEP> ++ <SEP>
<tb> veg. <SEP> Mycel <SEP> gelbbraun
<tb> Luftmycel <SEP> u. <SEP> Sp. <SEP> fehlen
<tb> lösl. <SEP> Pigment
<tb> Sporophoren-Typ <SEP> Retinaculum <SEP> apertum <SEP> (Rectus)
<tb> Sporen <SEP> oval, <SEP> behaart
<tb>
Zeichenerklärung :
K = Koloniedurchmesser in mm
Z = Zonendurchmesser in mm
Tabelle 3
Antibiotisches Wirkungsspektrum
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<tb>
<tb> Hemmung <SEP> (Bakteriostase)
<tb> Testorganismus
<tb> bei <SEP> γ/ml
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> P <SEP> 209 <SEP> 0, <SEP> 5-1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> tetracyclinresistent <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> -1, <SEP> 0
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> streptomycinresistent <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> penicillinresistent <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> -1, <SEP> 0
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> novobiocinresistent <SEP> 0,5 <SEP> -1,0
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> erythromycinresistent <SEP> 0, <SEP> 5-1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 5
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> > <SEP> 50
<tb> Bac.
<SEP> subtilis <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> -1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> E. <SEP> coli <SEP> > <SEP> 50
<tb>