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Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Coumermycin
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer neuen, als Coumermycin bezeichnetenSubstanz. Insbesondere bezieht sie sich auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanz durch Fermentation und auf die Gewinnung und Reinigung. Die Erfindung umfasst die Gewinnung dieses sauren, antibakteriellen Wirkstoffes und dessen Alkalisalzen in verdünnten Lösungen, als rohe Konzentrate, als gereinigte feste Substanzen und in reiner, kristalliner Form. Coumermycin hemmt das Wachstum grampositiver Bakterien. Es ist ungiftig und zeigt eine therapeutische Wirkung gegenüber mit grampositiven Bakterien infizierten Mäusen. Coumermycin ist gleichfalls bei der Behandlung von Infektionen bei Menschen, die durch grampositive Bakterien hervorgerufen wurden, wie beispielsweise Pneumonie wertvoll.
Coumermycin wurde auch als Notomycin und als Antibiotikum Bu 620 bezeichnet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung eines antibiotischen Wirkstoffes, der das Wachstum grampositiver Bakterien hemmt und aus einer sauren Substanz, dem Coumermycin, besteht, das sich leicht in Aceton, Dioxan und alkalischem Wasser löst, das mässig in Äthanol, Butanol, Äthylacetat, Butylacetat und Methylisobutylketon, wenig löslich in Benzol, Methanol und Chloroform und unlöslich in Tetrachlorkohlenstoff, Petroläther und angesäuertem Wasser ist, das ferner positive Fehling- und Molisch-Reaktionen ergibt, Brom entfärbt, negative Ninhydrin-, Tollens- und Anthronreaktionen ergibt,
EMI1.1
277) und in n/10 NaOH ein Maximum bei 280 mg (E1% = 766) hat, ein Neutralisatiomäquivalent von 1 c 548 aufweist und folgende durchschnittliche Elementaranalyse ergibt :
C 59, 1% t H 5, 35 ! : N 5, 90% und 0 (als Differenz) 29, 65lLr, beim Einschliessen in Kaliumbromid zeigt die Substanz eine charakteristische Absorption im Infrarotgebiet, wie in Fig. 1 gezeigt ist.
In den Zeichnungen ist Fig. 1 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums der freien Coumermycinsäure in Kaliumbromid.
Fig. 2 ist eine Kurve des Ultraviolett-Absorptionsspektrums des Coumermycins in einer Äthanollösung A in 0, 1 n Hel B und in 0, 1 n NaOH C.
Das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung zur Gewinnung des neuen Antibiotikums Coumermycin besteht in seinem Wesen darin, dass man den Stamm Streptomyces rishieriensis A. T. C. C. 14812 oder dessen Mutanten oder Varianten in einer wässerigen Kohlehydratlösung, die einen stickstoffhaltigen Nährstoff enthält, unter submersen aeroben Bedingungen züchtet, bis die Lösung eine wesentliche Aktivität gegenüber grampositiven Bakterien aufweist, und dass man anschliessend das Coumermycin aus der Lösung entfernt.
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Der das Antibiotikum Coumermycin erzeugende Organismus wurde aus einer Bodenprobe in Rishiri Island, Hokkaido, Japan, isoliert und ist eine neue Art der GattungStreptomyces, die als Streptomyces rishiriensis bezeichnet wird. Eine Kultur des lebenden Organismus mit der Laboratoriumsbezeichnung 404 Y 3 und A 9795 wurde in der American Type Culture Collection, Washington, D. C. hinterlegt und in die dortige Sammlung von Mikroorganismen aïs A. T. C. C. 14812 aufgenommen.
Der Stamm Nr. 404 Y 3 des S. rishiricnsis hat folgende Merkmale :
EMI2.1
<tb>
<tb> Kennzeichen <SEP> der <SEP> Kultur <SEP> : <SEP> W <SEP> = <SEP> Wachstum <SEP> P <SEP> = <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> L <SEP> = <SEP> Luftmycel <SEP> B <SEP> = <SEP> biologische <SEP> Eigenschaften
<tb> 1. <SEP> Czapek's <SEP> Agar <SEP> W <SEP> : <SEP> mässig, <SEP> gelbgrau <SEP> bis <SEP> hell <SEP> braungrau <SEP> oder
<tb> elfenbeinfarbig <SEP> gelb <SEP> ; <SEP>
<tb> L <SEP> gering, <SEP> pulverig, <SEP> weiss
<tb> P <SEP> : <SEP> keines <SEP>
<tb> 2. <SEP> Glycerin-Czapek's <SEP> Agar <SEP> W <SEP> : <SEP> mässig, <SEP> gelbgrau <SEP> oder <SEP> hell <SEP> braungrau <SEP> bis
<tb> blass <SEP> gelb <SEP> mit <SEP> undeutlichem <SEP> Braun <SEP> ;
<SEP>
<tb> L <SEP> gering, <SEP> pulverig, <SEP> weiss
<tb> P <SEP> keines <SEP> oder <SEP> blassgelb <SEP> mit <SEP> undeutlichem <SEP> Braun.
<tb>
3. <SEP> Glycerin-Ammoniumsalz-Agar <SEP> W <SEP> : <SEP> mässig, <SEP> leicht <SEP> gelbgrau <SEP> bis <SEP> gelbweiss <SEP> ; <SEP>
<tb> L <SEP> kärglich, <SEP> pulverig, <SEP> leicht <SEP> gelbgrau <SEP> bis <SEP> hellgrau
<tb> P <SEP> keines
<tb> 4. <SEP> Glukose-Asparagin-AGAR <SEP> W <SEP> gering, <SEP> dünn, <SEP> glänzend, <SEP> hell <SEP> gelbgrau <SEP> ; <SEP>
<tb> L <SEP> keines
<tb> P <SEP> keines
<tb> 5. <SEP> Stärke-Agar <SEP> W <SEP> gut, <SEP> hell <SEP> gelbbraun <SEP> bis <SEP> elfenbeinfarben <SEP> ; <SEP>
<tb> L <SEP> mässig, <SEP> pulverig, <SEP> ausgedehnt, <SEP> undeutlich
<tb> braun <SEP> bis <SEP> hellbraun <SEP> mit <SEP> Grau
<tb> P <SEP> keines
<tb> B <SEP> Hydrolyse <SEP> ist <SEP> mässig <SEP> stark
<tb> 6. <SEP> Nährmittel-Agar <SEP> W <SEP> :
<SEP> mässig, <SEP> rehbraun
<tb> L <SEP> gering, <SEP> pulverig, <SEP> weiss
<tb> P <SEP> dunkelbraun
<tb> 7. <SEP> Bennett's <SEP> Agar <SEP> W <SEP> mässig, <SEP> grau-olivbraun <SEP> bis <SEP> graubraun
<tb> L <SEP> : <SEP> mässig, <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> hellbraun <SEP> oder <SEP> graubraun
<tb> P <SEP> : <SEP> gelbbraun <SEP> ; <SEP>
<tb> 8. <SEP> Hafermehl-Soyton-Agar <SEP> W <SEP> gut, <SEP> hellgelb <SEP> mit <SEP> undeutlichem <SEP> Braun
<tb> L <SEP> mässig, <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> grau <SEP> mit <SEP> undeutlichem <SEP> Braun
<tb> P <SEP> hellgelb <SEP> mit <SEP> undeutlichem <SEP> Braun <SEP> ; <SEP>
<tb> 9. <SEP> Kartoffelpfropfen <SEP> W <SEP> : <SEP> gut, <SEP> glänzend, <SEP> faltige <SEP> Oberfläche
<tb> L <SEP> keines
<tb> P <SEP> Pfropfen <SEP> wird <SEP> braunschwarz
<tb> 10. <SEP> Gelatinestab <SEP> W <SEP> :
<SEP> braunschwarze <SEP> Kolonie <SEP> auf <SEP> der <SEP> Oberfläche <SEP>
<tb> L <SEP> keines
<tb> P <SEP> dunkelbraun
<tb> B <SEP> negative <SEP> Verflüssigung <SEP>
<tb> 11. <SEP> Tyrosin <SEP> - <SEP> Hefe- <SEP> Gelatinestab <SEP> W <SEP> : <SEP> braunschwarze <SEP> Kolonie <SEP> auf <SEP> der <SEP> Oberfläche <SEP>
<tb> L <SEP> : <SEP> keines <SEP>
<tb> P <SEP> dunkelbraun
<tb> B <SEP> : <SEP> negative <SEP> Verflüssigung <SEP>
<tb> 12. <SEP> Milch <SEP> W <SEP> braune <SEP> Ringbildung <SEP>
<tb> L <SEP> keines
<tb> P <SEP> undeutlich <SEP> braun
<tb> B <SEP> nicht <SEP> aufgeschlossen <SEP>
<tb> 13. <SEP> Nitrallösung <SEP> W <SEP> : <SEP> weisse, <SEP> kugelige <SEP> Masse <SEP> an <SEP> der <SEP> Oberfläche
<tb> B <SEP> positive <SEP> Reduktion <SEP> zu <SEP> Nitrit
<tb> 14. <SEP> Melanin <SEP> bildendes <SEP> Medium <SEP> W <SEP> :
<SEP> gering, <SEP> dünn, <SEP> grauschwarz <SEP>
<tb> L <SEP> : <SEP> kärglich, <SEP> weiss <SEP>
<tb> P <SEP> braungrau <SEP> bis <SEP> graubraun
<tb> B <SEP> Melanîn <SEP> positiv
<tb>
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EMI3.1
<tb>
<tb> 15. <SEP> Kartoffel-Dextrose-Agar <SEP> W <SEP> : <SEP> gut, <SEP> glanzend, <SEP> braunschwarz
<tb> L <SEP> : <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> hellrosa <SEP> bis <SEP> hellbraun <SEP> mit <SEP> undeutlichem <SEP> Grau <SEP> ; <SEP>
<tb> P <SEP> : <SEP> grau <SEP> bis <SEP> tiefgrau.
<tb>
EMI3.2
<tb>
<tb>
Ausnutzung <SEP> der <SEP> Kohlenstoffquellen
<tb> Xylose <SEP> ++ <SEP> Imulin <SEP> ++
<tb> Arabinose <SEP> ++ <SEP> Salicin <SEP> ++ <SEP>
<tb> Glucose <SEP> ++ <SEP> Mannit <SEP> Galactose <SEP> ++ <SEP> Sorbit <SEP> ¯
<tb> Fructose <SEP> ++ <SEP> Cellobiose <SEP> + <SEP>
<tb> Sorbose-Rhamnose <SEP> ++
<tb> Sucrose <SEP> ++ <SEP> Natriumcitrat <SEP> + <SEP>
<tb> Maltose <SEP> ++ <SEP> Natriumsuccinat <SEP> + <SEP>
<tb> Lactose <SEP> ++ <SEP> Inosit <SEP> ++ <SEP>
<tb> Raffinose <SEP> ++ <SEP> Kontrolle <SEP>
<tb>
++ gutes Wachstum + mittleres Wachstum geringes Wachstum kein Wachstum Mycologische Kennzeichcn.
Die morphologischen Eigenschaften des Stammes wurden an StSrkeagarundBennett's Agar festge- stellt. Die mikroskopische Untersuchung des Luftmycels ergab ein verwickeltes und verzweigtes Hyphen, das gelegentlich büschelig war, und Sporenträger, die linksgerichtete Spiralen bildeten. Die elektronenmikroskopische Untersuchung ergab eine elliptisch bis ovale Form der Sporen und eine glatte Oberfläche.
Der Streptomyces 404 Y 3 weist ein braungraues Luftmycel auf und erzeugt in organischen Medien ein braunes oder dunkelbraunes Pigment. Die Gelatineverflüssigung ist sowohl beim Gelatinestab als auch beim Tyrosin-Hefe-Gelatincstab negativ, und Milch wird nicht aufgeschlossen. Aus Nitrat wird Nitrit er zeugt, und Stärke wird hydrolysiert. Der Stamm 404 Y-3 ähnelt dem
S. diastatochromogenes,
S. griseoruber,
S. olivochromogenes,
S. aureus,
S. griseochromogenes,
S. hawaiiensis und dem
S. naganishi in mancher Beziehung wie der Spiralenbildung, der Farbe des Luftmycels und des melanoiden Pigment3, unterscheidet sich aber in gewissen Kultur- und physiologischen Eigenschaften, wie nachstehend gezeigt wird :
S. diastatochromogenes.
Nach Waksman und Curtis sind die Sporenträger gerade und nach Jensen werden linksgerichtete Spiralen gebildet. Die Farbe des Luftmycels wird als weiss bis aschgrau auf Czapek's Agar und grau auf Glucose-Asparagin-Agar beschrieben. Die Verflüssigung am Gelatinestab verläuft ziemlich schnell.
S. griseoruber.
Die Form der Sporen wird als zylindrisch beschrieben. Die Farbe der Kultur ist rotlich orange auf Czapek's und hell rötlich orange bis purpurrot auf Stärkeagar. Unterschiede wurden auch bei der Ausnutzung der Kohlenstoffquellen wie Sucrose, Raffinose, Citrat und Succinat gefunden.
S. olivochromogenes Untersch'de wurde in der Farbe der Kultur, dem löslichen Pigment auf Glucose-Asparagin-Agar und der ! dauung von Gelatine und Milch festgestellt.
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S. aureus.
Die Farbe der Kultur ist dunkelbraun aufCzapek's und hellorangefarben aufGlucose-Asparagin-Agar.
Die Gelatineverflüssigung lässt später schnell nach.
S. griseochromogenes.
Die Farbe des Luftmycels ist weiss bis leicht grau. Die Gelatineverflüssigung ist mässig. Milch wird ohne Koagulation abgebaut. Unterschiede sind auch in der Ausnutzung der Kohlenstoffquellen wie Rhamnose, Inulin, Salicin, Citrat und Succinat festzustellen.
S. naganishi.
Die Farbe der Kultur auf Stärkeagar ist-cremefarben bis purpurrot, und das lösliche Pigment auf Stärkeagar ist undeutlich rosa. Gelatine wird mässig verflüssigt. Milch wird koaguliert und abgebaut. Unterschiede werden in der Ausnutzung der Kohlenstoffquellen wie Sucrose und Sorbit festgestellt.
Um Stämme hoher Produktivität auszuwählen, wurde der ursprüngliche Stamm ultraviolett bestrahlt und die durch Mutation entstandenen Stämme ausgesondert. Einige dieser Stämme grosser Produktivität wurden mycologisch untersucht, wobei jedoch merkliche Unterschiede nicht festgestellt werden konnten, ausser dass einige Stämme mit weissem Luftmycel erhalten wurden.
Im Hinblick auf die oben genannten Kennzeichen des Stammes wurde der Streptomyces 404 Y 3 als neue Art bestimmt und mit Streptomyces rishiriensis nov. sp. bezeichnet.
ImRahmen der vorliegenden Erfindung ist nicht nur der Stamm Streptomyces rishiriensis ATCC 14812 anwendbar, sondern auch dessen Subkulturen, einschliesslich der Coumermycin bildenden Mutanten und Varianten.
Unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, erzeugen der Streptomyces rishiriensis ATCC 14812 sowie dessen Mutanten und Varianten Coumermycin. Eine Coumermycin enthaltende Fermentationsbrühe wird durch Impfen mit Sporen oder Mycelen des Coumermycin bildenden Organismus in einem geeigneten Medium und anschliessendem Züchten unter aeroben Bedingungen hergestêllt. Die Herstellung einer Coumermycinkultur in einem festen Medium ist möglich, doch ist die Herstellung einer grösseren Kultur in einem flüssigen Medium vorzuziehen. Die Temperatur der Kultur kann sehr schwanken, u. zw. von 20 bis 350 ; vorzugsweise beträgt sie jedoch zwischen 26 - 300C bei einem im wesentlichen neutralen pH-Wert.
Bei der submersen aeroben Fermentation des Organismus zur Erzeugung von Coumermycin enthält das Medium als Kohlenstoffquelle ein im Handel erhältliches Glycerinöl oder ein Kohlenhydrat wie Glycerin, Glucose, Maltose, Sucrose, Lactose, Dextrin, Stärke usw. in reinem oder rohem Zustand und als Quelle für den Stickstoff eine organische Substanz wie Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Hefeextrakt, Maisquellwasser usw. und, falls erforderlich, anorganische Stickstoffquellen, wie Nitrate und Ammoniumsalze und Mineralsalze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Magnesiumsulfat und Pufferstoffe. wie Calciumcarbonat oder-phosphat und Spuren von Schwermetallsalzen ; diese Bestandteile sind in der kanadischen Patentschrift Nr. 513324, in den brit.
Patentschriften Nr. 730, 341 und Nr. 736, 325, und in den USA-PatentschriftenNr. 2, 691, 618, Nr. 2, 658, 018, Nr. 2, 653, 899, Nr. 2, 586, 762, Nr. 2, 516, 080, Nr. 2, 483, 892, Nr. 2, 609,329 und Nr. 2, 709, 672 aufgeführt. Bei der belüfteten submersen Züchtung wird ein Antischaummittel wie beispielsweise ein flüssiges Paraffin, Fettöl oder ein Silikon verwendet. Zur Herstellung von Coumermycin kann mehr als eine Art von Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle oder Antischaummittel verwendet werden. Im allgemeinen wird die Züchtung fortgesetzt, bis sich mindestens mehrere 100 g/ml Coumermycin im Medium angesammelt haben. In einigen Fällen fällt der PH-Wert der Brühe am Anfang und steigt dann allmählich wieder.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie einzuschränken.
Beispiel 1 : Die für die Herstellung des Antibiotikums Coumermycin geeigneten Fermentationsbedingungen wurden untersucht, und es wurde folgende Zusammensetzung des Mediums als vorteilhaft festgestellt : 1, 5% lösliche Stärke,
EMI4.1
Coumermycin wird in 3 - 5 Tagen Fermentation unter hinreichender Belüftung und Rühren erzeugt, und sowohl in der Filtratbrühe als auch im Mycel wurde eine Aktivität festgestellt. Coumermycin wurde gegenüber Staphylococcus aureusFDA 209 P durch die Papierscheiben- oder Zylinderplattenmethode geprüft.
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B e i s p i e l 2: Die submerse a erobe Fermentation von S. rishiriensis (Stamm 404 Y 3) in einem SchUt- telkolben und einem 6% Stärke (Staclipse I), 3% entbitterte Brauereihefe und % CaCOs enthaltenden Medium ergab 300 - 400/-Ig/ml Coumermycin.
Beispiel 3 : Die submerse aerobe Fermentation von S. rishiriensis (Stamm 404 Y 3) in einem Schüttelkolben und einem 6% Stärke (Staclipse I), 3% Baumwollsamenmehl (Pharmamedia), 2, 5% Destillers solubles un 10/0 CaCO enthaltenden Medium ergab 150-200 g/ml Coumermycin.
Beispiel 4 : Die submerse aerobe Fermentation vonS. rishiriensis (Stamm 404 Y 3) in einem Schüttelkolben und einem 10/0 Sojabohnenmehl, 2% Baumwollsamenmehl (Pharmamedia), 2% lösliche Stärke,
EMI5.1
EMI5.2
<tb>
<tb> Zeit <SEP> PH- <SEP> Wert <SEP> Wirksamkeit <SEP> in <SEP> J1. <SEP> g/ml <SEP>
<tb> 5 <SEP> Tage <SEP> 7,8 <SEP> 70
<tb> 6 <SEP> Tage <SEP> 8, <SEP> 1 <SEP> 80
<tb> 7 <SEP> Tage <SEP> 8,3 <SEP> 120
<tb>
Beispiel 5 :
EMI5.3
<tb>
<tb> Zusammensetzung <SEP> des <SEP> Mediums:
<SEP> Sojabohnemehl <SEP> 2,0 <SEP> %
<tb> Glycerin <SEP> 1,5 <SEP> %
<tb> Hefeextrakt <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> %
<tb> Kaliumphosphat, <SEP> dibasisch <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP>
<tb> Calciumchlorid <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> %
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> %
<tb> Zinksulfat <SEP> 0, <SEP> 001% <SEP>
<tb> pH-Wert <SEP> 7, <SEP> 0
<tb>
Ein die obigen Bestandteile aufweisendes Kulturmedium (100 ml) wurde in einem Kolben mit 500 ml Inhalt sterilisiert, mit einer Kultur von Streptomyces rishiriensis, Stamm 404 Y 3, angeimpft und bei 270 i 1 C 6 Tage unter Schütteln bebrütet, wobei die Bildung von Coumermycin in der Fermentationsbrühe 150/lg/ml erreichte.
Beispiel 7 : Ein dieselben Substanzen wie in Beispiel 6 enthaltendes Kulturmedium (30 1) wurde in einem 50 1-Tank aus rostfreiem Stahl sterilisiert, mit einer Kultur von Streptomycesrishiriensisgeimpft und bei 280 1 C 90 h bebrütet, wobei die Bildung von Coumermycin in der Fermentationsbrühe 120 jLtg/ml erreichte.
Die Fermentationsflüssigkeit (5 1) wurde bei einem PH- Wert von 8,0 filtriert, das Filtrat auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und mit 2 1 Methylisobutylketon extrahiert. Der Mycelkuchen wurde unter heftiger rühren mit 500 ml Aceton extrahiert und das Extrakt im Vakuum zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. Das sich ergebende wässerige Konzentrat wurde bei einem pH-Wert von 6, 0 mit 200 ml Methylisobutylketon extrahiert. Die beiden Ketonextrakte wurden vereinigt und mit 500 ml Wasser gewaschen, worauf die Aktivität in 1000 ml kaltes Wasser, das mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 10,0 eingestellt war, übertragen wurde. Der wässerige Extrakt wurde auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und erneut mit 300 ml Äthylacetat extrahiert, worauf das Konzentrat im Vakuum auf 30 ml eingeengt wurde.
Bei Zusatz von 150 ml Petroläther zu dem Konzentrat bildete sich ein hellbrauner Niederschlag, der aufgenommen, mit wenig Methanol zur Entfernung der Verunreinigungen gewaschen und getrocknet wurde, wobei sich 750 mg/mi Coumermycin als Pulver ergaben.
Das so erhaltene Coumermycinpulver (400 mg) wurde in 100 ml Äthylacetat gelöst und an einer mit 20 g Aluminiumoxyd beschickten, vorher mit Schwefelsäure behandelten Säule absorbiert. Die Säule wurde mit 200 ml Äthylacetat gewaschen und mit Methanol eluiert. Das Eluat wurde in Anteilen von 10 ml aufgeteilt, die aktiven Fraktionen vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das hellgelbe, feste Coumermycin wurde zweimal aus Methanol umkristallisiert und ergab 70 mg weisses, kristallines Coumermycin, das bei 218 - 2200C unter Zersetzung schmolz.
Das Coumermycin wurde weiter nach der Methode von Craig der Gegenstromverteilung unter Ver-
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wendung von einem Lösungsmittelsystem aus 5 Teilen (Vol. -Teile) Tetrachlorkohlenstoff, 1 Teil Chloroform, 5 Teilen Methanol und 1 Teil Wasser gereinigt. Nach 50 Übertragungen wurde die Spitzenkonzentration durch die biologische Kurve, die UV-Kurve und die Gewichtskurve in Rohr 26 gefunden ; diese Kurven stimmen mit der theoretischen Kurve überein. Die Gefriertrocknung von 10 Röhren um die Spitze ergab reines Coumermycin.
Coumermycin wurde auch durch Umkristallisieren aus wässerigem Aceton und anschliessend aus absolutem Methanol gereinigt, wobei eine bei 2200C unter Zersetzung schmelzende Substanz erhalten wurde.
Coumermycin wurde ferner durch Chromatographie an Aluminiumoxyd gereinigt, wobei 39,7 mg (Wirksamkeit 500 jLtg/mg) in Äthylacetat gelöst und an 2 g AlrO" (pH-Wert 4,7, behandelt mit H SO) absorbiert wurden. Nach Waschen mit Äthylacetat wurde die Säule anschliessend mit Methanol und ange- säuertem Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, neutralisiert, im Vakuum eingeengt und dann der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 12, 4 mg als hellgelbes Pulver (Wirksamkeit 700 ug/mg) erhalten wurden.
Das Coumermycin (480 mg) wurde mit einer geringen Menge Aktivkohle in Acetonlösung behandelt und anschliessend aus heissem Äthanol umkristallisiert, wobei 230 mg kristallines Coumermycin erhalten wurden, die im Vakuum 3 h bei 500C getrocknet wurden. Schmelzpunkt 222 - 2240C (Zers.), pKa 6,32
EMI6.1
Aceton, Titrationsäquivalent 526,Novobiocin unter denselbenBedingungen. Coumermycin ergab eine negative (braun) Anthronreaktion, während Novobiocin eine positive (grün) Reaktion ergab.
Eine Lösung von 100 mg Coumermycin in 120 ml absolutem Äthanol wurde mit 0,25 g Katalysator nach Adams unter Atmosphärendruck von Wasserstoff 30 min bei Raumtemperatur verrührt. Eine Wasserstoffaufnahme wurde nicht beobachtet. Nach Entfernung des Katalysators wurden dem Filtrat 35 ml Wasser unter heftigem Rühren zugesetzt. Durch Zufügen von 0,5 ml einer n-Salzsäure zu der entstandenen Emulsion wurde eine feste, weisse Substanz ausgefällt, die aufgenommen und getrocknet wurde ; das Gewicht betrug 88, 7 mg, und die Papierchromatographie ergab, dass es sich um das ursprüngliche Ausgangsmaterial, d. h. Coumermycin, handelt. Unter denselben Bedingungen ergaben gemäss der papierchromatographischen Analyse (F. I. Wolf et al., Antibiotics Annual [1956 - 1957], S. 1035) 1000 mg Novobiocin 946 mg Dihydronovobiocin.
Coumermycin gibt positive Fehling- und Molischreaktionen und entfärbt Brom.
Die Papierstreifen-Chromatographie des Coumermycins lieferte folgende Ergebnisse : Lösungsmittelsystem Rf-Werte Wässeriges Butanol 0, 15 Beiges wässeriges Ammoniumchlorid 0,03 75% iges Phénol 0,95 50% igues Aceton 0,75 Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2) + 2% Methylorange 0,45 Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2) 0,40 Benzol-Methanol (4 : 1) 0,05 Destilliertes Wasser 0, 05 Butanol-Wasser (4 : 1) + 0, 25% p-Toluolsulfonsäure 0,30 Butanol-Wasser-Essigsäure (2 : 1 : 1) 0,50
Butanol-Wasser (4 :
1) + 21o Piperidin 0,25
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Coumermycin ist leicht in Aceton, Dioxan und alkalischem Wasser, mässig in Äthanol, Butanol, Äthylacetat, Butylacetat und Methylisobutylketon, wenig in Benzol, Methanol und Chloroform löslich
EMI7.1
EMI7.2
Wie aus Fig. 1 zu entnehmen ist, zeigt Coumermycin in Kaliumbromid charakteristische Infrarot-Absorptionsmaxima bei folgenden Wellenlängen in Mikron : 2, 99 ; 3,36 (Schulter) ; 3, 45 ; 5. 88 (Schulter),
EMI7.3
12, 65 ; 13, 1 ; 13,35.
Damit sind Coumermycin und Novobiocin deuthch voneinander verschieden, beispielswcirc durch den Schmelzpunkt, die Elementaranalyse, die spezifische Drehung, die Ultraviolett- und Infrarot-Absorptionsspektren. die Anthronreaktion und das Verhalten bei der Papierstreifenchromatographie.
Coumermycin ist eine saure organische Verhindung, die sich leicht in alkalischen Lösungen, wie wässerigen Lösungen der Alkali- und Erdalkalimcthallhydroxyde lost. Die Lösung des von Coumermycin in wasserigerNatronlauge oder Calciumhydroxyd bildct das Natrium-bzw. Calciumsalz, das beispielsweise durch Gefriertrocknung, falls erwünscht, isoliert werden kann. In gleicher Weise werden Salze mit orga- nischen Basen gebildet ; ein Zusatz von Streptomycin undDihydrostreptomycin zu Coumermycin bildet die Streptomycin-bzw. Dihydrostreptomycinsalze desCoumermycins ; bei dieser Reaktion wird vorteilhaften organisches Lösungsmittel, wie Äthylacetat verwendet.
Andere Aminsalze, die verwendet werden können, sind die in der Therapie als Salze des Benzylpenicillins benützten, z. B. Procain, N-Benzyl-ss-phenÅathylamin, Hydrabamin, Ephenamin, N, N'-Di- benzylathylendiamin, Dehydroabietylamin und Dicyclohexylamin. Ansäuern einer wässerigen Lösung von Natrium-Coumermycin dient zur Ausfällung des gereinigten Coumermycins als freie Säure.
Eine bevorzugte Methode zur Isolierung von Coumermycin aus einer Fermentationsflussigkeit besteht im Extrahieren der gesamten Flüssigkeit bei einem pH-Wert von 6, 0 mit dem halben Volumen Methylisobutylketon, Rückextraktion bei einem pH-Wert von 10,0 in Wasser (1/4 des Volumens der Methylisobutylketonphase) und erneuter Extraktion bei einem PH- Wert von 6, 0 in Äthylacetat oder Methylisobutyl- keton (1/3 des Volumens der letzten wässerigen Phase). Die schliesslich konzentrierte Lösung von Coumermycin in dem organischen Lösungsmittel wird dann auf1/10 oder 1/20 des ursprünglichen Volumens durch Destillation im Vakuum eingeengt. Das Coumermycin wird dann, wenn es nicht gleich ausfällt, durch Zusatz einer Mischung niederer Alkane ausgefällt, z.
B. durch Zusatz von 10 Volumen der im Handel unter der Bezeichnung Skellysolve B befindlichen Substanz.
Coumermycin kann auch vollständig aus den filtrierten Brühen durch Adsorption an Aktivkohle (Darco KB) und anschliessendem Eluieren gewonnen werden ; dieses Verfahucn ist der Lösungsmittelextraktion der gesamten Brühe jedoch nicht überlegen, da in vielen Brühen das Coumermycin sich im Mycel befindet.
Mikrobiologische Untersuchungen des Coumermycins.
Antibakterielle Aktivität in vitro. Die minimale Hemmungskonzentration (MHK) von Coumermycin gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen wurde durch eine Agarverdünnungsreihe unter Verwendung von Pferdeblutagar für hämolytische Streptokokken und Pneumokokken, Glucose-Hefeextrakt-Pepton-Agar für
EMI7.4
Kirchners Flüssigkeit für Tuberkelbazillen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabellenform nachstehend zusammen mit den mit Novobiocin erhaltenen aufgeführt.
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EMI8.1
<tb>
<tb>
Antibakterielles <SEP> Spektrum <SEP> des <SEP> Coumermycins.
<tb>
(Agar-Verdünnungsmethode)
<tb> Testorganismen <SEP> Hemmende <SEP> Konzentration <SEP> fJgI <SEP> cm5 <SEP>
<tb> Coumermycin <SEP> Novobiocin
<tb> Gram-negativ
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> NUll" <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> P01495 <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 50
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> Type. <SEP> A <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 12,5
<tb> Salmonella <SEP> typhi <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 6, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Shigella <SEP> flexneri <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 6,25
<tb> Shigella <SEP> dysenteriae <SEP> A <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 25
<tb> Neisseria <SEP> sp.
<SEP> (CP-R) <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 12,5
<tb> Bordetella <SEP> bronchiseptica <SEP> ATCC <SEP> 4617 <SEP> > <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 50
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> > <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 50
<tb> Vibrio <SEP> metchinikovii <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Gram-positiv
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> FDA <SEP> 209P <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP> 0, <SEP> 049 <SEP>
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> FDA <SEP> 209P <SEP> (SM,. <SEP> ST-R) <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP> 0, <SEP> 049 <SEP>
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> FDA <SEP> 209P <SEP> (NB-R) <SEP> 1,56 <SEP> 6,25
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> 52 <SEP> - <SEP> 34 <SEP> (TC, <SEP> EM, <SEP> CM, <SEP> PC-R) <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> strain <SEP> 0, <SEP> 006 <SEP> 0, <SEP> 049 <SEP>
<tb> S.
<SEP> aureus <SEP> 193 <SEP> (PC, <SEP> TC-R) <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP> 0, <SEP> 049 <SEP>
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> 193 <SEP> (PC, <SEP> TC, <SEP> EM, <SEP> CM-R) <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> 193 <SEP> (PC, <SEP> TC, <SEP> EM-R) <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP> 0, <SEP> 049
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Terajima <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP> 0, <SEP> 012
<tb> S. <SEP> albus <SEP> 0, <SEP> 006 <SEP> 0, <SEP> 049
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> 0, <SEP> 006 <SEP> 0, <SEP> 049 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> PCI <SEP> 1001 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> PCI <SEP> 219 <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> B. <SEP> sphericus <SEP> 122 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> B. <SEP> mycoides"0"0, <SEP> 78 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP>
<tb> B.
<SEP> cereus <SEP> ATCC <SEP> 10702 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP>
<tb> B. <SEP> anthracis <SEP> : <SEP> 115 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Lactobacillus <SEP> casei <SEP> ATCC <SEP> 7469 <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> L. <SEP> acidophilus <SEP> B-406-1 <SEP> > <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> B-40203 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP>
<tb> S.
<SEP> pyogenes <SEP> Type <SEP> 3 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> Type <SEP> II <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP>
<tb> Mycobacterium <SEP> 607 <SEP> 50 <SEP> 50
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 50 <SEP> 12,5
<tb> Pilze
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> van <SEP> Tieghem <SEP> > <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 50
<tb> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> > <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 50
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> > <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 50
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> ATCC <SEP> 9763 <SEP> > <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 50
<tb> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> > <SEP> 50 <SEP> > <SEP> 50
<tb> Abkürzungen <SEP> :
-R <SEP> = <SEP> Resistent <SEP> SM <SEP> = <SEP> Streptomycin <SEP> ST <SEP> = <SEP> Streptothricin <SEP>
<tb> NB <SEP> = <SEP> Novobiocin <SEP> TC <SEP> = <SEP> Tetracyclin <SEP> PC <SEP> = <SEP> Penicillin <SEP>
<tb> EM <SEP> = <SEP> Erythromycin <SEP> CM <SEP> = <SEP> Carbomycin
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
Die minimalen Hemmungskonzentrationen des Coumermycins wurden auch in einem zweifachenRöh- renverdfinnungsverfahren unter Verwendung von Nährstofflüssigkeit ausser für hämolytische Streptokokken und Pneumokokken untersucht, die mit einem Him-Herz-Aufguss geprüft wurden. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammen mit dem Aktivitätsverhältnis von Coumermycin und Novobiocin aufgeführt.
EMI9.1
<tb>
<tb>
Antibakterielles <SEP> Spektrum <SEP> des <SEP> Coumermycins.
<tb>
(Röhren-Verdünnungsmethode)
<tb> Testorganismen <SEP> Coumermycin <SEP> Novobiocin <SEP> Verhältnis
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 3,13 <SEP> g/ml <SEP> 6,25 <SEP> g/ml <SEP> 2
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> FDA <SEP> 209P <SEP> 0,0015 <SEP> 0,049 <SEP> 32
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Terajima <SEP> 0, <SEP> 00075 <SEP> 0, <SEP> 012 <SEP> 16
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> 0, <SEP> 0015 <SEP> 0, <SEP> 024 <SEP> 16
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> PCI <SEP> 1001 <SEP> 0,006 <SEP> 0,049 <SEP> 8
<tb> Corynebacterium <SEP> xerosis <SEP> 53-K-1 <SEP> 0, <SEP> 00075 <SEP> 0, <SEP> 024 <SEP> 32
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> ATCC <SEP> 10702 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 1
<tb> Bacillus <SEP> anthracis <SEP> 115 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 19é <SEP> 1/2
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> Type <SEP> 3 <SEP> 0,
<SEP> 049 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 8
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> Type <SEP> II <SEP> 0, <SEP> 098 <SEP> 0, <SEP> 098 <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Coumermycin hemmt das Wachstum verschiedener Gram-positiver Bakterien ausser dem Bacillus subtilis und Milchsäurebakterien, die gegenüber Novobiocin empfindlich sind. Coumermycin ist beson- ders aktiv gegen Staphylokokken, wobei die Aktivität zehn- bis dreissigmahl grösser als die desNovobiocins ist. Es besitzt jedoch gegenüber den im Laboratorium gegen Novobiocin resistent gemachten Staphylokokken verringerte Aktivität.
Wirkung der Impfstammgrösse auf die Hemmungskonzentration.
Unter Verwendung von Staph. aureus Smith und Staph. aureus, Stamm 193 als Testorganismen in Nährlösung wurden Röhrenverdünnungen mit verschiedenen Impfstoffgrössen durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend in einer Tabelle aufgeführt, und es ist zu sehen, dass die Wirkung grosser Impfstoffmengen ähnlich der von Novobiocin ist.
EMI9.2
<tb>
<tb>
Wirkung <SEP> der <SEP> Impfstoffgrösse <SEP> auf <SEP> die <SEP> Hemmungksonzentration.
<tb> mpfstoffgrösse <SEP> (Zelle/ml)
<tb> Testorganismen <SEP> Antibiotikum <SEP> 107 <SEP> 10 <SEP> 1010 <SEP> 104 <SEP> 10'102 <SEP>
<tb> (MHK <SEP> in <SEP> g/ml)
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Srnith <SEP> Coumermycin <SEP> 0,012 <SEP> 0, <SEP> 012 <SEP> 0,003 <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP> 0,003 <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP>
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> Novobiocin <SEP> 0,39 <SEP> 0,39 <SEP> 0,195 <SEP> 0,098 <SEP> 0,098 <SEP> 0,098
<tb> S. <SEP> aureus <SEP> strain <SEP> 193 <SEP> Coumermycin <SEP> 0, <SEP> 024 <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP> 0, <SEP> 0015 <SEP> 0,0015 <SEP> 0,0015 <SEP> 0,0015
<tb> S.
<SEP> aureus <SEP> strain <SEP> 193 <SEP> Nov <SEP> obi <SEP> ocin <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 0, <SEP> 195 <SEP> 0,098 <SEP> 0, <SEP> 098 <SEP> 0, <SEP> 098 <SEP> 0, <SEP> 098 <SEP>
<tb>
Wirkung des PH-Wertes des Mediums auf die Hemmungskonzentration.
Die MHK des Coumermycins wurde durch die Mediumsverdünnungsmethode bestimmt, wobei der PH-Wert auf verschiedene Werte eingestellt wurde. Als Testmedium wurde Nährlösung und Difco's Hirn- Herz-Aufgussbrdhe verwendet, und eine 104 fache Verdünnung einer eine Nacht alten Kultur von Staph. aureus Smith (10 Zellen/ml) wurde in jede Röhre geimpft. Wie nachfolgend zu sehen ist, steigt die Ak-
<Desc/Clms Page number 10>
tivität von Coumermycin bei saurem PH-Wert und fällt bei alkalischem PH-Wert. Die vergleichsweisen Daten mit Novobiocin ergeben, dass Coumcrmycin durch den pH-Wert des Mediums stärker als Novobiocin beeinflusst wird.
EMI10.1
<tb>
<tb>
Einwirkung <SEP> des <SEP> pH-Wertes <SEP> des <SEP> Mediums <SEP> auf <SEP> die <SEP> MHK
<tb> pH- <SEP> des <SEP> Mediums <SEP> Coumermycin <SEP> Novobiocin
<tb> (MHK <SEP> in <SEP> g.'ml)
<tb> NB* <SEP> HHA** <SEP> NB <SEP> HHA
<tb> 6, <SEP> 3 <SEP> 0,0001 <SEP> 0,00005 <SEP> 0,024 <SEP> 0,024
<tb> 7, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 003 <SEP> 0, <SEP> 006 <SEP> 0, <SEP> 098 <SEP> 0, <SEP> 098 <SEP>
<tb> 7,6 <SEP> 0, <SEP> 049 <SEP> 0, <SEP> 098 <SEP> 0, <SEP> 195 <SEP> 0, <SEP> 39
<tb> 8, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP>
<tb> 8, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 3, <SEP> 13 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP> 1, <SEP> 56 <SEP>
<tb>
EMI10.2
verwendeten Medien nicht beeinflusst, solange der pH-Wert eingestellt wurde.
Einfluss des Serums auf die Hemmungskonzentration.
Es wurden steigende Konzentrationen an menschlichem Serum der Nährbrühe zugesetzt, die einen Phosphatpuffer von 1/10 m Konzentration enthielt, um den pH-Wert des Mediums auf 7,2 zu halten. Als Testorganismus wurde Staph. aurcus Smith verwendet.
Die Impfmenge betrug 105 Zellen/ml. Wie nachfolgend zu sehen ist, wurde die MHK durch das Serum merklich beeinflusst.
EMI10.3
<tb>
<tb>
Serumseinfluss <SEP> auf <SEP> die <SEP> MHK
<tb> MHK <SEP> in <SEP> g/ml <SEP>
<tb> Serumskonzentration <SEP> Coumermycin <SEP> NovobiocÚ1
<tb> ohne <SEP> Serum <SEP> 0,003 <SEP> 0,098
<tb> 2,5% <SEP> 0,024 <SEP> 0,195
<tb> 5 <SEP> % <SEP> 0, <SEP> 098 <SEP> 0,195
<tb> 10 <SEP> % <SEP> 0, <SEP> 098 <SEP> 0, <SEP> 39 <SEP>
<tb> 20 <SEP> % <SEP> 0,098 <SEP> 0,18
<tb> 50 <SEP> % <SEP> 0, <SEP> 195 <SEP> 3,13
<tb>
Aktivität von Coumermycin gegenüber klinisch isolierten Staphylokokken.
Eine Anzahl von Staph. aureus-Kulturen (126 Stämme), die aus klinischen Quellen isoliert wurden, wurden in Vitro gegenüber Coumermycin und sechs handelsüblichen Antibiotica untersucht, nämlich Benzylpenicil1in, Dihydrostreptomycin, Tetracyclin, Erythromycin, Kanamycin und Novobiocin. Die durch 10fache Agar-Reihen-Verdünnung erhaltenen MHK-Werte waren folgende :
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb>
<tb> Empfindlichkeit <SEP> klinisch <SEP> isolierter <SEP> Staphylokokken, <SEP> gegenüber <SEP> Coumermycin <SEP> und
<tb> handelüblichen <SEP> Antibiotica.
<tb>
Antibiotica
<tb> MHK <SEP> in <SEP> lig/ml <SEP> Coumermycin <SEP> PC <SEP> DSM <SEP> TC <SEP> EM <SEP> KM <SEP> NB
<tb> > 100 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 100 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 16 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 103 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 1
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 89 <SEP> 2 <SEP> 8 <SEP> 117 <SEP> 123 <SEP> 0
<tb> 0,1 <SEP> I* <SEP> 21 <SEP> 0 <SEP> 114 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 122
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 52 <SEP> 7 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP>
<tb> 0,001 <SEP> 48 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 2
<tb> 0, <SEP> 0001 <SEP> 21 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 0,
<SEP> 00001 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> C
<tb>
* = gleicher Stamm
PC = Benzylpenicillin
DSM = Dihydrostreptomycin
TC = Tetracyclin
EM = Erythromycin
KM = Kanamycin
NB = Novobiocin
Die Ergebnisse zeigen, dass Coumermycin gegen Staphylokokken hochwirksam ist und mit andern Antibiotica keine überlagerte Resistenz aufweist. Nur einer der 126 Stämme, der gegenüber Novobiocin resistent war, war gegen Coumermycin weniger empfindlich ; der MHK-Wert des Coumermycins bei diesem Stamm betrug jedoch auch 0, 1 ug/ml.
In vivo-Versuche an Coumermycin.
EMI11.2
500 mg/kg an Mäusen festgestellt.
Chemotherapeutische Wirkung. Die Aktivität von Coumermycin in vivo wurde an Mäusen bei experi- mentellerInfektion mitStaph. aureusSmith festgestellt. Die Mäuse wurden intraperitoneal mit 100 xID des Krankheitserregers infiziert, und das Antibiotikum wurde intramuskulär oder oral sofort nach der bakteriellen Infektion. Ein einzelner intramuskulärer CD50-Wert (50% heilende Dosis) von 0,3 mg/kg und ein einzelner oraler CD-Wert von 4, 5 mg/kg wurde erhalten. In einem Vergleichsversuch wurden die intramuskulären und oralen CD 50 -Werte des Novobiocins zu 6,0 mg/kg und 10,0 mg/kg ermittelt. Die Daten werden nachstehend aufgeführt.
EMI11.3
<tb>
<tb>
Chemotherapeutische <SEP> Wirkung <SEP> des <SEP> Coumermycins
<tb> (Intramuskuläre <SEP> Therapie)
<tb> Dosis <SEP> in <SEP> mg/kg <SEP> Coumermycin <SEP> Novobiocin
<tb> 50 <SEP> 5/5 <SEP> * <SEP> 6/6 <SEP>
<tb> 25 <SEP> 5/5 <SEP> 6/6
<tb> 12,5 <SEP> 5/5 <SEP> 4/6
<tb> 6, <SEP> 25 <SEP> 11/11 <SEP> 4/6
<tb> 3, <SEP> 12 <SEP> 6/6 <SEP> 1/6
<tb> 1,56 <SEP> 6/6 <SEP> 0/6
<tb>
<Desc/Clms Page number 12>
Ta belle (Fortsetzung)
EMI12.1
<tb>
<tb> Dosis <SEP> in <SEP> mg/kg <SEP> Coumermycin <SEP> Novobiocin
<tb> 0,78 <SEP> 12/12 <SEP> 016
<tb> 0, <SEP> 39 <SEP> 4/6
<tb> 0,19 <SEP> 1/6
<tb> 0, <SEP> 10 <SEP> 1/6 <SEP>
<tb> 0,05 <SEP> 0/6
<tb> Kontrolle <SEP> 0/12 <SEP> 0/12
<tb>
* = Zahl der ilberlebenden Mäuse/Zahl der infizierten Mäuse.
EMI12.2
<tb>
<tb>
Chemotherapeutische <SEP> Wirkung <SEP> von <SEP> Coumermycin
<tb> (Orale <SEP> Therapie)
<tb> Dosis <SEP> in <SEP> mg/kg <SEP> Coumermycin <SEP> Novobiocin
<tb> 100 <SEP> 5/5
<tb> 50 <SEP> 11/11 <SEP> 6/6
<tb> 25 <SEP> 6/6 <SEP> 6/6
<tb> 12,5 <SEP> 6/6 <SEP> 5/6
<tb> 6,25 <SEP> 10/12 <SEP> 1/6
<tb> 3, <SEP> 12 <SEP> 1/6 <SEP> I <SEP> 1/6 <SEP>
<tb> 1,56 <SEP> 0/6 <SEP> 0/6
<tb> 0, <SEP> 78 <SEP> 0/6 <SEP> 0/6
<tb> Kontrolle <SEP> 0/12 <SEP> 0/12
<tb>
EMI12.3