DE1188760B

DE1188760B - Herstellung neuer Antibiotica R 451

Info

Publication number: DE1188760B
Application number: DESCH32328A
Authority: DE
Inventors: George M Luedemann; Marvin J Weinstein
Original assignee: Scherico Ltd
Current assignee: Scherico Ltd
Priority date: 1962-04-02
Filing date: 1962-11-13
Publication date: 1965-03-11

Description

Herstellung neuer Antibiotica R 451 Die Erfindung betrifft die Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Micromonospora zur Herstellung neuer Antibiotica R 451 auf mikrobiologischem Weg sowie deren Anreicherung, Isolierung, Reinigung und Aufarbeitung.
Die neuen Antibiotica werden hergestellt, indem man gewisse Arten der Gattung Micromonospora (Ordnung Actinomycetales), insbesondere die Art Micromonospora carbonacea (einschließlich ihrer Mutanten und Varianten) züchtet, bis sich antibiotisch aktive Substanzen gebildet haben, und ans der Kultur das Antibioticum isoliert, gegebenenfalls in seine Komponenten zerlegt und aufarbeitet.
Die erfindungsgemäß durch Bebrütung geeigneter Micromonosporaarten gewonnenen iieueii Aiitibiotica werden als » _A ntibiotica der R-451-Gruppe« bezeichnet.
Kulturen der erfindungsgemäß vorzugsweise verwendeten Mikroorganismen wurden in der Kulturensar_Imlung des Landwirtschaftsministeriums (Department of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerika, Northern Utilization Research <_ nd Devolepment Division, Peoria, Illinois, hinterlegt, wo sie unter ihren r'1:RL-Nummern allgemein erhältlich sind.
Ein Sta min der Art Mieromoiiosliora car bonacea n. sp. hat die NPRL-i@,,iiiiinier 2972 und wurde ursprünglich aus einer Bodenprobe aus Olean, N. Y., USA., erhalten - M. carbonacea zeichnet sich, wenn er unter 26tägiger Bebrütung bei 2Ö°C in einem Medium aus 0,5°/o Hefeextrakt, l'/, Dextrose, 0,1'/, Calc'uincai-boi,P>t und 1,5°/o Agar kultiviert wird, durch koi-lschwarze, auf Sporenhäufung zurückzuführeii@!3 Flecheni iiz einem sonst vegetativen MScel aus. Die Sporen von iVi. carGOnarea sind idaglich bis ellipscai, und die Dimensionen reifer Sporen 'betragen durchschnittlich 1,0: 1,5 u. Die vollreifen Sporen. sind bei iiüi@=o@hopischer Betrachtung im hindurchgehenden Licht dunkel 2eiärbt. Sporophoren trete., nicht einigermaße n statistisch--leichmä ßig (»randomly<c) über das gesanite Mycel verteilt auf, sondern stark konzentriert in bestimmten Gebieter. des vegetativen Mycels. Dieses scheint sich normalerweise nicht in polymorphe Elemente (Fragmente) aufzuteilen, sondern bleibt ein Ganzes bis zu einer etwaigen Autclyse. Das vegetative Mycel hat einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,6 ;.e, ist nicht säurefest. granipositiv. Der Organismus nährt sich von gewissen Protein- und Stärkearten, ist aerob und gedeiht gut im Bereich von 16 bis 37°C, aber nicht bei 50°C oder darüber. Form und orange Farbe (mit braunschwarzen Flecken) sind typisch für frische Isolate aus dem Boden, doch können diese Merkmale zeitweilig oder dauernd verlorengehen, wenn. Stämme wiederholt isoliert und übertragen werden.
zur Isolierurig des genannten wird etwas von der betreffenden Bodenprobe iii sterilem destilliertem Wasser geschüttelt, und nach Herstellung geeigneter Verdünnungen wird die Suspension auf ein Agarmedium aufgestrichen. Das Medium enthält zweckmäßig 0,501" T ryptose, /'-,0"/, lösliche S:ärke, 0,3°/, Caiciumpropionat und 2,0"/0 `>gar, alles in destilliertem Vlasser.
Die Kulturen werden auf antibiotische Aktivität geprüft, indem inai,, sie zunächst bis zu 60 Tage bei 26°C in dem folgenden Medium wacliseii läßt:.0,3°/0 Rindfleische xtrakt, 0,50/, Tryptose, 0,10/, Dextrose, 2,4.°/0 lösliche Stärke, 0,5 °/o Hefeextrakt, 1,5 °/o Agar, alles in Leitutigsv,'asser. Dann extrahiert man den ganzen wäßrigen Agar mit Butanol, und eng< den Butanol -V 'üsser-Extrakt ein. Durch das Butanol-V lasser-GGemisch wird genügend Antibioticum extrahiert, um ein Konzentrat zu liefern, das in einem Scheibentest das Wachstum von Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis verhindert. Eine antibiotische Aktivität gegen die gleichen Organismen läßt sich beobachten, wenn man 96 Stunden in einem wäßrigen Medium submers bebrütet, das geeignete Nährstoffe enthält: z. B. 0,5 °/o Hefeextrakt, 0,1 °/o lösliche Fischbestandteile, 0,1 °/o Calciumcarbonat, 0,1 °/o durch Versprühen getrockneten corn steep liquor und 3,0 °/o Lactose.
Tabellen I und II vergleichen die vorstehend beschriebenen neuen mit gewissen bekannten Micromonosporaarten. Sofern sich in einzelnen Tabellenfeldern Striche befinden, bedeutet dies, daß entsprechende Daten entweder fehlen oder nicht in die Tabellen aufgenommen wurden.
Die in Tabelle I aufgenommenen Koloniebeobachtungen wurden nach 14tägiger Bebrütung der betreffenden Medien bei 24 bis 26°C angestellt. Die gewählten Farbbezeichnungen beziehen sich auf die folgenden Systeme: Die jeweils erste Farbbezeichnung besteht aus einem Farbnamen gemäß dem »Descriptive Color Name Dictionary« von T a y 1 o r, K n o c h e und G r a n v i 11 e, herausgegeben durch die Container Corporation of America, 1950, in Verbindung mit einer diesem Namen entsprechenden Nummer, welche dem »Color Harmony Manual«, 4. Auflage (1958), herausgegeben ebenfalls von der Container Corporation of America, entnommen ist; die zweite Bezeichnung besteht aus einem Farbnamen und einer Nummer gleicher Bedeutung, gemäß National Bureau of Standards (USA.), Circular 553 vom 1. November 1955.
Tabelle II vergleicht die charakteristischen Eigenschaften von Kolonien der erfindungsgemäß bevorzugt verwendeten und einiger bekannter Arten der Gattung Micromonospora bei Verwendung verschiedener Medien nach 14tägiger Bebrütung bei 26°C. Die Daten für die bekannten Arten, mit denen die erfindungsgemäß verwendeten verglichen werden, sind aus Bergeys »Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage, 1957, herausgegeben von der Williams & Wilkins Company, Baltimore, entnommen.
Ein Beispiel einer Variante, die sich von der oben beschriebenen Art in untergeordneter Weise, z. B. morphologisch oder biochemisch, unterscheidet, ist M. carbonacea var. arantiaca. Eine Kultur davon wurde ebenfalls in der Kulturensammlung des Landwirtschaftsministeriums (Department of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerika, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, USA., hinterlegt und ist dort unter ihrer NRRL-Nummer 2997 verfügbar. Diese Variante wurde ebenfalls ursprünglich aus einer in Olean, N. Y., entnommenen Bodenprobe isoliert und ist taxonomisch gleich mit M. carbonacea, mit den folgenden Unterschieden: M. carbonacea var. aurantiaca reduziert Nitrat nicht; bildet mitunter ein gelbes diffundierbares Pigment, wenn es in einem Kohlehydratmedium auf Basis von Mannose oder Xylose kultiviert wird, und bildet .Sporen in begrenztem Umfang. Die Koloniefarbe auf den meisten Agarmedien ist orange mit einer Tendenz, mit zunehmendem Alter orangebraun zu werden. Die orange Oberfläche besteht hauptsächlich aus vegetativem Mycel und enthält gelegentlich kleine schwarze Felder, die beinahe zur Gänze aus dunkel gefärbten Sporen bestehen. Auf Bennetts Agar ist das Wachstum dieser Variante gut; die Kolonie erhöht. Ihre Farbe istfeuerrot-g 5 NC, intensivrotorange-35. Auf Tomatenmark-Hafermehl-Agarmiteinem0,1 °/jgen Natriumcarbonatgehalt ist das Wachstum mittelmäßig; die Kolonie erhöht. Ihre Farbe entspricht der Blume »Bittersweet«/g5PC, tieforange-51.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Mikroorganismen liefern mit Hilfe der im folgenden beschriebenen Fermentationsverfahren antibiotisch aktive Substanzen. Nach der Züchtung finden sich diese sowohl im Mycel als auch in der Brühe; nach Abtrennung des Mycels von der Brühe wird als Quelle zu ihrer Gewinnung vorzugsweise die Brühe verwendet.
Aus papierchromatographischen Untersuchungen hat sich. ergeben, daß die durch M. carbonacea und deren Äquivalente gebildeten antibiotischen Substanzen mindestens aus fünf Komponenten bestehen, die im folgenden als R-451 A, R-451 B, R-4.51 C, R-451 D und R-451 E bezeichnet werden. Das Ausmaß ihrer Trennung hängt von der angewandten Methode ab. In einem bestimmten verteilungschromatographischen System werden die Stoffe mit den den Komponenten A, B, C und D entsprechenden Wanderungseigenschaften als eine Gruppe und E für sich isoliert. Eine der Hauptkomponenten dieser Gruppe scheint R-451 D zu sein.
Zur Bildung der antibiotischen Substanzen wird der Mikroorganismus M. carbonacea in üblicher Weise bei einer Temperatur von etwa 25 bis 40°C unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert, das eine assimilierbare Kohlenstoff und Stickstoffquelle enthält. Geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie Stärke, Dextrin, gewisse Zucker u. dgl. Geeignete Stickstoffquellen können sowohl organischer als auch anorganischer Natur sein, vorzugsweise sind es aber organische Produkte, wie Sojabohnenmehl, Peptone u. dgl.
Die Bebrütung erfolgt bei einem pH im Bereich von etwa 6 bis 8, über einen Zeitraum von etwa 60 bis 72 Stunden. Gegen Ende dieser Zeitspanne ist maximale Antibioticabildung erreicht.
Da sich der überwiegende Anteil antibiotisch aktiver Substanzen in der Brühe befindet, wird das Mycel abfiltriert und verworfen. Die antibiotischen Substanzen werden aus der Brühe durch Lösungsmittelextraktion isoliert. Sie können durch verteilungschromatographische Methoden in ihre Komponenten aufgetrennt werden.
Die antibiotischen Substanzen werden zunächst aus dem von der Brühe erhaltenen Extrakt durch Abdampfen des Lösungsmittels in Form eines Rückstandes abgetrennt. Der Rückstand wird papierchromatographisch untersucht, was als Anhaltspunkt für die Verteilungschromatographie dient. Die Papierchromatogramme werden in verschiedenen Lösungsmittelsystemen aufgenommen und die RF-Werte für die einzelnen Komponenten nach bioautographischen Standardmethoden ermittelt, die darin bestehen, daß man ein Papierchromatogrammentwlckelt und trocknet und es dann über eine mit Staphylococcus aureus beimpfte Agarplatte legt. Nach einer Kontaktdauer von 15 Minuten wild das Papier von der Platte getrennt, die man dann 16 bis 20 Stunden bei 37°C bebrütet. Aus der Lage der Inhibitionszonen läßt sich auf die RF-Werte der antibiotisch aktiven Komponenten schließen.
Tabelle III zeigt die verwendeten Lösungsmittelsysteme und die darin für die Antibioticakomponenten ermittelten RF-Werte. Bei allen Systemen wurden absteigende Lösungsmittel verwendet. Die isolierten Antibiotica können in üblicher Weise aufgearbeitet, z. B. in ihre Derivate, wie N- oder O-Acylverbindungen, übergeführt werden.
Es ist bereits bekannt, ein Antibioticum unter dem Namen MicromonosporindurchZüchtung eines Mikroorganismus der GattungMicromonospora herzustellen. Die Erfinder des Micromonosprin haben die Eigenschaften dieses Antibioticums in den Literaturstellen Soil Science, 54, S. 281 bis 296 (1942), und Journal of Bacteriology, 53, S. 355 bis 357 (1947), beschrieben. Diese Beschreibung zeigt, daß das Micromonosporin sich in allen Eigenschaften weitgehend von den Antibiotica der R-451-Gruppe unterscheidet. Aus der ersten Arbeit geht aus Tabelle VI auf Seite 291 und aus dem Text im letzten Absatz der Seite 290 hervor, daß Micromonosporingegenüber B. Mycoides und B. Cercus inaktiv ist. Demgegenüber geht aus den Tabellen X und XVI hervor, daß die Antibiotica R-451 gegenüber diesen Bakterien wirksam sind. Auf Seite 291 der erstgenannten Literaturstelle wird angegeben, daß das Micromonosporin mit Äther bei pH-Werten zwischen 3 und 8,5 nicht extrahiert werden kann. Hingegen sind die Antibiotica R-451 mit Äther gut bei BebrütungspH-Werten von 6 bis 7 extrahierbar. Schließlich wird in der zweiten Literaturstelle angegeben, daß das Micromonosporin bei pH-Werten unter 3 und über 9 nicht stabil ist und auf Seite 753, daß es sich bei Micromonosporin um ein hoch pigmentiertes stabiles Protein handelt. Die Antibiotica der R-451-Gruppe sind, wie auf Seiten 25 und 32 der neuen Beschreibung angegeben ist, bei pH-Werten über 7 bis zu 14 stabil und sind weder pigmentiert noch von Proteincharakter.
In den folgenden Beispielen sind Prüfwerte der betreffenden antibiotischen Substanzen, ausgedrückt in Einheiten pro Milligramm als Maßstab ihrer Aktivität angegeben, wobei als Einheit eine solche Menge Testsubstanz gilt, die erforderlich ist, um bei einem Stahlzylinder von 6,5 mm Außendurchmesser eine Inhibitionszone von 15 mm Durchmesser hervorzurufen. Die Prüfung erfolgt mikrobiologisch nach einem standardisierten Agar-Diffusionsprüfverfahren (»cup Type«; vgl. Donald C. G r o v e und William A. R a n d e 11, »Assay Methods of Antibiotics - A Laboratory Manual«, New York [1955]), unter Verwendung von Staphylococcus aureus (ATCC 6538P) als Testorganismus. Es wird eine Kurve aufgenommen, indem man die erzielte Wirkung gegen die Dosierung der betreffenden antibiotischen Substanz (verdünnt in Phosphatpuffer bei pH = 8) in dem folgenden Medium aufträgt: Pepton ......................... 0,6 °/o Pankreatisches Caseinhydrolysat.... 0,4 °/o Hefeextrakt...................... 0,3 °/o Rindfleischextrakt . . . . . . . . . . . . . . . 0,15010 Dextrose ....................... 0,15°/o Agar ........................... 1,5 °/o pH .......... ä................ 6,6 Die verwendete Suspension des Testorganismus (Staphylococcus aureus) wird derart standardisiert, daß sie in einem Kolorimeter Licht mit einer Wellenlänge von 660 m#t zu 20 °/o durchläßt.
Beispiel l Gewinnung von R-451 durch Bebrütung von M. carbonacea im Laboratoriumsmaßstab A. Keimung Man bringt eine lyophilisierte Kultur von M. carbonacea aseptisch in einen 300-ml-Schüttelkolben ein, der 100 ml des folgenden sterilen Mediums enthält: Bacto Rindfleischextrakt . . . . . . . . . 3 g Tryptose ....................... 5 g Dextrose ...................... 1 g Lösliche Stärke . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 g Hefeextrakt..................... 5 g Leitungswasser ................. 1000 ml*) *) In diesem und in ähnlichen Rezepten durch die ganze Beschreibung hindurch ist das Lösungsmittel (meist Wasser) einmal als absolute Menge, ein andermal mit dem. Vorsatz »ad« angegeben. Obwohl dies, genau genommen, unterschiedliche Angaben sind, so können doch im Rahmen der für diese Rezepte erforderlichen Genauigkeit diese beiden Ausdrücke beliebig gegeneinander ausgetauscht werden. Man bebrütet den Kolben samt Inhalt 4 Tage bei 37°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Touren je Minute, 5 cm Rüttelbewegung).
B. Bebrütung Man überträgt je 25 ml des durch die vorstehende Keimung gewonnenen Inoculums auf vier 2-1-Kolben, deren jeder 500 ml des folgenden Mediums enthält: Hefe .......................... 5 g Lösliche Fischbestandteile ....... 1 g Corn steep liquor (getrocknet)..... 1 g Calciumcarbonat ............... 1 g Lactose ........................ 30 g Leitungswasser ................. 1000 ml Man bebrütet die Kolben samt Inhalt 2 bis 3 Tage bei 26°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine und vereinigt dann die Kolbeninhalte.
C. Extraktion der antibiotischen Substanzen Zu dem vereinigten Substrat nach Teil B dieses Beispiels fügt man eine Filterhilfe (Diatomeenerde), filtriert und wäscht das Filtrat mit Äthylacetat oder Chloroform, wobei man das pH der wäßrigen Phase bei oder oberhalb 7 (jedoch vorzugsweise so nahe an 7 wie möglich) hält. Aus dem Extrakt wird das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, das zurückbleibende Öl in überschüssigem Chloroform gelöst und durch Filtrieren geklärt. Die klare Chloroformlösung wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und die so erhaltene konzentrierte Lösung unter Rühren zu dem zehnfachen Volumen Petroläther (Siedebereich 30 bis 60°C) gefügt. Der dabei ausfallende Niederschlag wird abfiltriert (es kann nötig sein, ein- oder mehrmals aus Chloroform umzufällen, falls zunächst an Stelle eines filtrierbaren Feststoffes ein Öl ausfällt) und enthält die Hauptmenge der gebildeten antibiotischen Substanzen. Er ist aktiv gegen Staphylococcus aureus, wenn Lösungen mit einem Gehalt von nur 10 pg/ml dem Scheibendiffusionstest unterzogen werden.
D. Reinigung der nach Teil C dieses Beispiels erhaltenen rohen antibiotischen Substanz Hier wird eine Reinigung durch Säulenchromatographie an Aluminiumoxyd angewandt. Das Haupteluat wird als R-451 bezeichnet und scheint von der Komponente R-451 E frei zu sein. Die Aluminium oxydreinigung liefert ein wasserlösliches Produkt und ermöglicht so die Bereitung wäßriger Dosierungsformen oder besser löslicher Formen des Antibiotikums.
Man bereitet eine Aluminiumoxyd-Adsorptions-Chromatographiesäule, indem man eine Suspension von reinem Aluminiumoxyd in Chloroform-Methanol (3.- 1) in eine Glassäule von etwa 51 mm lichter Weite gießt, bis die Aluminiumoxydschicht eine Höhe von etwa 61 cm erreicht hat.
Man löst 10 g nach Stufe C dieses Beispiels erhaltenen rohen antibiotischen Substanz in 50 ml Chloroform und gibt diese Lösung langsam auf die Säule auf. Diese eluiert man dann zunächst mit Chloroform-Methanol (3:1), wobei man zwölf Fraktionen zu 500 ml auffängt, sowie anschließend mit Methanol-Chloroform (3: 1), wobei man weitere siebenunddreißig Fraktionen zu 500 ml sammelt. Die Fraktionen werden durch Eindampfenlassen kleiner Proben an der Luft und Testen von deren Rückständen gegen Staphylococcus aureus untersucht und nach Maßgabe ihrer Aktivität gegen diesen Organismus zu Gruppen vereinigt. Die Hauptmenge eluierter Substanz und die Hauptaktivität befinden sich in den Fraktionen 13 bis 30. Diese werden vereinigt, im Vakuum eingeengt und die gelöste Substanz durch Zugabe zu Petroläther ausgefällt. Der Niederschlag, bestehend aus 1,7 g R-451, wird abfiltriert und an der Luft getrocknet. Er zeigt eine Aktivität gegen Staphylococcus aureus (im Scheibendiffusionstest) bei Konzentrationen von 1 ,ug/ml aufwärts.
In Tabelle IV ist gezeigt, wie die einzelnen Fraktionen vereinigt werden und in welcher Weise aus ihnen die feste antibiotische Substanz isoliert wird, zusammen mit den Ergebnissen der Scheibentests gegen Staphylococcus aureus und den RF-Vvrerten der vereinigten Fraktionen in dem betreffenden System. Die RF-Werte wurden in der üblichen Weise durch Bioautographie des entwickelten Papierchromatogramms gegen Staphylococcus aureus ermittelt.
Die lyophilisierte Kultur von M. carbonacea gemäß Teil A dieses Beispiels kann durch eine entsprechende Kultur von M. carbonacea vat. aurantiaca ersetzt werden.
Beispiel 2 Gewinnung von R-451 durch Bebrütung von M. carbonacea in technischem Maßstab A. Keimung Man bringt eine lyophilisierte Kultur von M. carbonacea aseptisch in einen 300-ml-Schüttelkolben ein, der 100m1 des folgenden sterilen Nährmediums enthält Bacto-Rindfleischextrakt ......... 3 g Tryptose ....................... 5 a Dextrose ...................... 1 a Lösliche Stärke . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 g Hefeextrakt..................... 5 g Calciumcarbonat ............... 1 a Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000M1 Der Kolben samt Inhalt wird 4 Tage bei 35'C (oder bis gute Keimung erfolgt ist) auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Touren je Minute, 5 cm Rüttelbewegung) bebrütet.
B. Vorimpfung Man fügt je 5 ml des durch obige Keimung erhaltenen ersten Inoculums zu drei 300-ml-Schüttelkolben, deren jeder 100 ml des obigen sterilen Nährmediums enthält, und bebrütet die Kolben samt Inhalt 72 Stunden bei 30°C auf der rotierenden Schüttelmaschine.
C. Bereitung des Inoculums Man überträgt je 25 ml des durch obige Vorimpfung erhaltenen zweiten Inoculums auf zehn 2-1-Kolben, deren jeder 500 ml des für die Keimung verwendeten sterilen Nährmediums enthält, und bebrütet die Kolben samt Inhalt 72 Stunden bei 30°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Touren je Minute, 5 cm Rüttelbewegung). Dann werden die Kolbeninhalte vereinigt und aseptisch in einen sterilen Inoculumkolben mit seitlichem Ansatzrohr übertragen (Gesamtvolumen etwa 51).
D. Tankfermentation Man überträgt die 51 des nach Stufe C erhaltenen Inoculums aseptisch in einen etwa 1301 fassenden Fermenter, der 901 des für die Keimung verwendeten sterilen Nährmediums enthält, und bebrütet 20 bis 30 Stunden aerob (bis das kompakte Zellvolumen - bestimmt durch 5 Minuten langes Zentrifugieren einer 10 ml-Probe bei 2800-Umdrehungen je Minute -etwa 2 bis 3 ml, d. h. 20 bis 30°/o beträgt), unter den folgenden Bedingungen: Temperatur. . . . . . . . . . . 35`C Zufuhr an steriler Luft etwa 1531 pro Minute Druck . . . . . . . . . . . . . . . etwa 0,5 atü Rührbewegung ....... 180 Umdrehungen je Minute Sobald das kompakte Zellvolumen mindestens 2 mI e rreicl.' , ' that, überträg man den Inhalt des Fermenters aseptisen in einen etwa 250J 1 fassenden Fermentationstank, der etwa 16651 des folgenden sterilen Mediums enthält: Hefeextrakt..................... 8,5 kg Lösliche Fischbestandteile ....... 1,7 kg Corn steep liduor (getrocknet) .... 1,7 kg Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . 1,7 kg Lactose ........................ 51,0 kg Schaumbekämpiungsmittei (GE 60) 500 ml Weiches Wasser . . . . . . . . . . . . . . . . . 16651 Man bebrütet unter Rühren mit 120 Umdrehungen je @in<it,° etwa 50 bis 70 Stunden bei 35yC. ;i@obei man je Mlliute etwa 425 1 L lif t rillt einem Druck voll etwa 0,5 atü zufÜhrt. Geg.°n Ende der Bebriaangszeit erreicht die Aktivität des aei@ileeten Aiitibiotil,:ums ein Maximum, das im wesentlichen kcnstailt bleibt, wie sich durch PC@enalli"ile und Testen gegen Staphviococct.s aureus ermitteln läßt.
Während der Bebrütung bleibt Glas PH im wesentlichen kolistant im Bereich von 7,0 bis 7.3. Das kompakte Zellvolumen erreicht einen konstanten @i'ert von etwa 2,0 n il.
E. Isolierung der antibiotischen Substanzen aus der Tankfermentation Zu den etwa 18501 Fermentationsbrühe nach Teil D dieses Beispiels fügt man 25 kg einer Filterhilfe (Celite), durchmischt und filtriert. Der Mycelkuchen vvi:d vervrorfen, das Filtrat zweimal mit einem gleich großen Volumen Toluol extrahiert, die Toltiolextrakte vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei ein dunkelbrauner öliger Rückstand hinterbieibt. Dieser wird in 1000 ml Chloroform suspendiert, filtriert und die Chloroformlösung unter heftigem Rühren zu dem zehnfachen Volumen Petroläther gefügt. Man setzt das Rühren 5 Minuten lang fort, trennt den entstandenen halbfesten öligen Niederschlag durch Dekantieren von der überstehenden Flüssigkeit, löst ihn in 600 ml Chloroform neuerlich auf und fügt die erhaltene Lösung unter heftigem Rühren zu dem fünffachen Volumen Petroläther. Der dabei ausfallende amorphe Niederschlag wird abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und an der Luft getrocknet. Ausbeute: 12,6 g; minimale Inhibitionskonzentration gegen Staphylococcus aureus: 1 bis 5 (tg/ml.
F. Alternativverfahren zur Isolierung der antibiotischen Substanzen aus der Tankfermentation An Stelle des Verfahrens von Teil E dieses Beispiels kann auch das Extraktionsverfahren von Beispiel l (Teil C) angewandt werden. Dabei erhält man etwa 125 g eines festen Produktes mit einer Aktivität, die derjenigen des Produktes von Beispiel 1, C vergleichbar ist.
G. Auftrennung der antibiotischen Substanzen in Komponenten Hier wird im Gegensatz zu der Methode des Beispiels 1, D eine Säulenchromatographie an Diatomeenerde angewandt, mit deren Hilfe die antibiotischen Substanzen aufgetrennt und die Komponenten R-451 A, R-451 B, R-451 D, R-451 E sowie die weitere Komponente R-451 Cl isoliert werden können.
Die Auftrennung der gemäß Teil E oder - weniger vorteilhaft - Teil F dieses Beispiels anfallenden antibiotischen Substanzen erfolgt dusch Verteilungsehromatographie mit Hilfe eines Zweiphasen-Lösungsmittelsystems und gereinigter Diatomeenerde (Handelsprodukt Chromosorb W der Firma Johns Manville & Co., nicht mit Säure gewaschen, Korngröße 60 bis 100 mesh) als inerten Träger für die schwere Phase. Man bereitet zunächst ein Zweiphasen-Lösungsmittelsystem der folgenden Zusammensetzung: Petroläther (Siedebereich 60 bis 90°C) ..... 25 Teile Äthylacetat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 Teile Methylalkohol . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 Teile Destilliertes Wasser . . . . . . . . . . . . . 30 Teile Dann bringt man 1,9 kg des inerten Trägers mit 950 ml der schwereren Phase des obigen Zweiphasen-Lösungsmittelgemisches ins Gleichgewicht und gießt das Gemisch langsam in eine 9 cm weite, am Boden mit einer Frittenscheibe versehene Glassäule ein, die vorher zu drei Vierteln mit der leichteren Phase gefüllt wurde. Man läßt die Diatomeenerde sich in der Säule zu einem kompakten Bodensatz absetzen und komprimiert dann weiter mittels eines Stickstoffdrucks von etwa 0,07 bis 0,15 atü (die Höhe der so hergestellten Säule ist 137 cm).
Nun löst man 7,0 g der amorphen Mischung aus Teil E bzw. F dieses Beispiels in 38 ml der schwereren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelsystems, versetzt die Lösung mit 19 g Diatomeenerde, bringt die so erhaltene Mischung oben auf die Füllung der Säule auf und komprimiert fest. Man eluiert mit der leichteren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelsystems.
Die Eluate werden mit einer Geschwindigkeit von 50 ml je Minute entnommen. Die Anzahl einzelner Fraktionen ist beliebig, hängt aber von dem >»Hold-up-Volumen e(HUV) der Säule ab. (Das HUV ist definiert als dasjenige Volumen, das die leichtere Phase des Zweiphasensystems innerhalb der gesamten Säulenfüllung einnimmt). In der vorstehend beschriebenen Säule beträgt das HUV etwa 3500 ml. Das erste gesammelte HUV wird verworfen. Von den darauffolgenden Fraktionen wird je eine Probe mittels des oben beschriebenen Lösungsmittelsystems I (Tabelle III) papierchromatographiert und das entwickelte und getrocknete Papierchromatogramm gegen Staphylococcus aureus bioautographisch getestet. Die Fraktionen werden entsprechend dem Testergebnis zu Gruppen vereinigt, die Fraktionsgruppen im Vakuum zur Trockne eingedampft, die Rückstände gewogen und zur Ermittlung ihrer relativen Zusammensetzung neuerlich papierchromatographisch und bioautographisch untersucht. So gelangt man zu den Ergebnissen der Tabelle V.
1 g des aus HUV 3 bis 10 erhaltenen Produktes wird dann neuerlich chromatographiert, wobei man den inerten Träger (Chromosorb W) für die schwerere Phase des folgenden Zweiphasen-Lösungsmittelsystems verwendet: Petroläther (Siedebereich 30 bis 60°C) ..... 10 Teile Toluol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 Teile n-Butylalkohol . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Teile Äthylalkohol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Teile Destilliertes Wasser . . . . . . . . . . . . . 70 Teile Man bringt zunächst 600 g des Diatomeenerdeträgers mit 300 ml der schwereren Phase des letztgenannten Zweiphasen-Lösungsmittelsystems ins Gleichgewicht, gießt das Gemisch langsam in eine teilweise mit der leichteren Phase dieses Zweiphasen-Lösungsmittelsystems gefüllte Glassäule mit einem Durchmesser von 5 cm, läßt den Träger sich durch seine Schwere zu einem kompakten Bodensatz absetzen und komprimiert weiter durch einen Stielcstof druck von etwa 0,07 bis 0,15 atü. Die Höhe der so bereiteten Säule beträgt 107 cm, und ihr Hold-up-Volumen beträgt 900 ml. Darauf wird das zu chromatographierende Produkt in 10 ml der schwereren Phase gelöst, die Lösung mit 5 g des inerten Trägers versetzt und durchgemischt. Die Mischung wird dann auf die Füllung der Säule aufgebracht und fest angepreßt. Man eluiert anschließend mit der leichteren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelsystems bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 100 ml je Minute. Man entnimmt dabei kontinuierlich Fraktionen von 50 bis 900 ml (entsprechend 1/18 bis 1/1 des HUV der Säule). Das erste HUV, das unmittelbar nach dem Aufbringen des Produktes anfällt, wird verworfen, das zweite und die folgenden werden gesammelt.
Eine Probe jeder gesammelten Fraktion wird sofort mittels des Lösungsmittelsystems I (Tabelle III) papierchromatographiert und das entwickelte und getrocknete Papierchromatogramm gegen Staphylococcus aureus bioautographisch getestet. (Lösungsmittelsystem I wird bevorzugt, weil es am raschesten wandert). Die Fraktionen werden entsprechend ihren papierchromatographischen Daten gruppenweise vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft, die Rückstände gewogen und neuerlich einer Papierchromatographie und bioautographischen Testung unterzogen, um ihre Zusammensetzung zu bestätigen. Das Ergebnis der so erfolgten säulenchromatographischen Auftrennung ist in Tabelle VI gezeigt.
Die lyophilisierte Kultur von M. carbonacea, wie sie in Teil A dieses Beispiels verwendet wird, kann durch eine entsprechende Kultur von M. carbonacea var. aurantiaca ersetzt werden.
Beispiel 3 Abtrennung von Komponente R-451 D aus R-451 Man suspendiert 100 mg des Rückstandes aus HUV 1,5 bis 14 gemäß Tabelle VI (Beispiel 2, G) bei Zimmertemperatur unter heftigem Rühren in 40 ml Äther, filtriert und läßt das Filtrat über Nacht in der Kälte stehen. Der dabei ausfallende Niederschlag wird abfiltriert, mit eiskaltem Äther gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei man etwa 81 mg R-451 D in Form eines nahezu farblosen Pulvers mit einem Prüfwert von 1155 Einheiten je Milligramm erhält.
Das so erhaltene R-4.51 D erweist sich bei quantitativer Prüfung gegen Staphylococcus aureus als biologisch homogen. Wenn man es nach der Methodik von Stahl unter Verwendung von Aceton-Benzol (1 :1) als Elutionsmittel an einer dünnen Schicht Silikagel chromatographiert und die entwickelte und getrocknete Platte anschließend mit Schwefelsäure behandelt, so läßt sich keine andere Substanz als R-451 D entdecken.
Beispiel 4 Das Produkt von Beispiel 3 kann weitergereinigt werden, wie folgt: Man löst in möglichst wenig heißem Isopropanol, fügt Aktivkohle (etwa 10°/o des Gewichtes der zu reinigenden Substanz) zu, filtriert und kühlt in einem Eisbad. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit kaltem Isopropanol gewaschen und im Hochvakuum bei Zimmertemperatur getrocknet. Das so gereinigte Produkt hat einen Prüfwert von 1450 Einheiten je Milligramm.
Beispiel s Herstellung von R-451 D-Acetat Man löst 25 mg R-451 D in 1 ml Pyridin, versetzt mit 0,4 ml Essigsäureanhydrid und läßt die Mischung über Nacht stehen. Dann wird der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, zur Entfernung des Pyridins und der entstandenen Essigsäure mit Wasser gewaschen und über Nacht im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute: 11 mg eines farblosen amorphen Pulvers, Fp. = 135 bis 136°C. Eine zweite Menge läßt sich aus der Mutterlauge des genannten Niederschlages durch Kühlen über Nacht im Eisschrank WC), C), Abfiltrieren des Niederschlages, Freiwaschen von Pyridin und Essigsäureanhydrid sowie Trocknen, wie oben angegeben, erzielen. Ausbeute: 6 mg eines farblosen, amorphen Pulvers.
Wenn man das Produkt an einer dünnen Schicht chromatographiert, wobei man als Adsorbens Silikagel und als Eluierungssystem Aceton-Benzol (1 : 1) verwendet, und die entwickelte und getrocknete Platte mit Schwefelsäure besprüht, so läßt sich nur eine einzige Komponente mit dem RF-Wert 0,87 feststellen. (Unter diesen Bedingungen hat R-451 D einen RF-Wert von 0,49). Bei alkalischer Hydrolyse in Methanol wird aus R-451 D-Acetat das eingesetzte R-451 D rückgebildet.
Beispiel 6 Das Produkt von Beispiel 5 läßt sich weiterreinigen wie folgt: Man löst in Methylenchlorid, fügt Aktivkohle zu, filtriert und versetzt das klare Filtrat mit Hexan. Der Niederschlag wird abfiltriert und an der Luft getrocknet.
Beispiel ? Abtrennung der Komponente R-451 E Diese unpolare Komponente der Antibioticamischung findet sich gewöhnlich in hoher Konzentration in der überstehenden Flüssigkeit der Chloroform-Petroläther-Fällung, die in Teil E des Beispiels 2 beschrieben ist. In geringerer Menge ist sie auch in den ausgefällten antibiotischen Substanzen enthalten und kann von da mit Hilfe des Säulenchromatographieverfahrens, das in Teil G des Beispiels 2 beschrieben ist, isoliert werden. Zur Gewinnung von R-451 E wird die Fraktion HUV 1 bis 1,5 (Tabelle VI) im Vakuum zur Trockne eingedampft und an der Luft getrocknet. So erhält man etwa 320 mg einer bernsteinfarbenen Substanz, von der man weiter durch Umfällen aus Äther-Hexan zu 280 mg eines nahezu farblosen amorphen Pulvers, gereinigtem R-451 E, gelangt. Nach dem Ergebnis einer papierchromatographischen Untersuchung in System I (Tabelle III) und anschließender Bioautographie gegen Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis zu schließen, ist das so hergestellte Antibioticum R-451 E biologisch homogen.
Beispiel 8 Abtrennung der Komponenten R-451 B, R-451 Cl und R-451 A A. Vortrennung Die Abtrennung der obengenannten Komponenten aus der rohen Antibioticamischung wird durch eine Verteilungschromatographie ähnlich der in Teil G des Beispiels 2 beschriebenen eingeleitet, wobei man ein Zweiphasen-Lösungsmittelsystem und eine gereinigte Diatomeenerde (Handelsprodukt Chromosorb®, nicht mit Säure gewaschen, Korngröße 60 bis 100 mesh) als inerten Träger für die schwerere Phase verwendet: Man stellt zunächst das Zweiphasensystem (Petroläther, Äthylacetat, Methanol, Wasser) her, wie im Beispiel 2, G beschrieben. Dann bringt man 2,5 kg des inerten Trägers mit 1250 ml der schwereren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelgemisches ins Gleichgewicht und füllt die Säule, wie im Beispiel 2, G beschrieben. Das HUV dieser Säule beträgt etwa 8000 ml.
Nun löst man 7,4 g der amorphen Mischung nach Beispiel 2, E erhaltenen Fraktion in 40 ml der schwereren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelsystems, fügt 20 g Diatomeenerde zu, gibt die feste Mischung oben auf die Säulenfüllung auf und komprimiert fest. Man eluiert mit der leichteren Phase des Zweiphasen-Lösungsmittelsystems. Nach dem im Beispiel 2, G beschriebenen säulenchromatographischen Trennverfahren gelangt man zu den Ergebnissen der Tabelle VII. Wie man sieht, werden die Komponenten R-451 B und R-451 Cl in der Fraktionengruppe HUV 1,9 bis 2,8, die Komponente R-451 A in der Fraktionengruppe HUV 4,0 bis 5,0 angereichert.
B. Trennung von R-451 B und R-451 Cl voneinander Man chromatographiert 1,8 g des Rückstandes der bei der vorstehenden chromatographischen Trennung anfallenden Fraktionengruppe HUV 1,9 bis 2,8 an 1800 g Cellulosepulver (Marke Whatman, nicht mit Säure gewaschen, fein), das sich in einer Säule mit 7,5 cm Durchmesser und 150 cm Höhe befindet, wobei man das folgende einphasige Lösungsmittelgemisch verwendet: Aceton......................... 1 Teil Petroläther(Siedebereich30bis60°C) 25 Teile Benzol ........................ 50 Teile Man löst die zu chromatographierende Substanz in 68 ml des Lösungsmittelsgemisches, fügt 50 g Cellulose bei und bringt das Gemisch oben auf die Säule auf Dann eluiert man mit einer Durchfiußgeschwindigkeit von 50 ml je Minute, wobei man kontinuierlich Fraktionen zu 100 ml entnimmt. Das HUV dieser Säule beträgt etwa 6000 ml. Die Eluate werden gruppenweise vereinigt, wie in Tabelle VIII gezeigt. Wie ersichtlich, wird die Komponente R-451 B in der Fraktionengruppe HUV 17,7 bis 27,7, die Komponente R-451 Cl in der Fraktionengruppe HUV 1,7 bis 17,6 angereichert.
C. Reinigung von R-451 B Man löst 200 mg des aus der Fraktionengruppe HUV 17,7 bis 27,7 (Tabelle VIII) erhaltenen Rückstandes in 5 ml Aceton und gießt die Acetonlösung unter heftigem Schütteln in 50 ml Hexan. Der ausfallende Niederschlag wird abfiltriert, mit Hexan gewaschen und bei Zimmertemperatur im Vakuum über Phospb o pentoxyd getrocknet, wobei man zu 120 mg eines nahezu weißen Pulvers gelangt. Das so erhaltene R-451 B kann mit Spuren anderer Komponenten verunreinigt sein; wenn man es jedoch nach der Methode von Stahl an einer dünnen Silikagelschicht unter Verwendung von Aceton-Benzol (1: 1) als Elutionsmittel chromatographiert und die entwickelte, getrocknete Platte anschließend mit Schwefelsäure behandelt, so ist nur eine einzige Substanz nachweisbar, so daß also eine weitere Reinigung nicht nötig ist.
D. Reinigung von R-451 C, Man löst 100 mg des aus der Fraktionengruppe HUV 1,7 bis 17,6 (Tabelle VIII) erhaltenen Rückstands in 5 ml Aceton und gießt die Lösung unter heftigem Schütteln in 50 ml Isopropyläther. Der ausfallende Niederschlag wird abfiltriert, mit Isopropyläther gewaschen und bei Zimmertemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Man gelangt so zu etwa 70 mg eines nahezu weißen, aus R-451 C,, bestehenden Pulvers. Das so erhaltene Produkt ist, wie aus quantitativer Testung gegen Staphylococcus aureus folgt, im wesentlichen biologisch homogen.
E. Reinigung von R-451 A Man schlämmt 100 mg des von der Fraktionengruppe HUV 4,0 bis 5,0 aus der Diatomeenerdesäule (Tabelle VII) erhaltenen Rückstandes in 10 ml Dichlormethan auf, filtriert, wäscht den festen Rückstand mit Dichlormethan und trocknet ihn bei Zimmertemperatur im Vakuum über Phosphorpentoxyd. So erhält man 70 mg eines weißlichen, aus R-451 A bestehenden Pulvers.
Beispiel 9 Isolierung der Komponente R-451 B Statt nach dem im Beispiel 8 (Teile A bis C) beschriebenen Verfahren kann R-451 B auch wie folgt isoliert werden: Man bereitet eine 64 cm hohe Chromatographiesäule mit einem Durchmesser von etwa 50 mm, indem man eine Aufschlämmung in Methylenchlorid von 500 g Florisil ®r (60 bis 100 Mesh), das 18 Stunden bei 105°C aktiviert wurde, in eine Glassäule gießt - das Hold-up-Volumen der so bereiteten Säule ist 1100 ml. Man löst 50 g des amorphen rohen Antibioticums, wie man es aus Beispiel 2 (Teil E) erhält, in 300 ml Methylenchlorid und gibt die erhaltene klare Lösung auf die Florisilsäule auf. Zur Elution schickt man erst 4 HUV Methylenehlorid, dann 8 HUV Methylenchlorid-Aceton (95: 5), hierauf 8 HUV Methylenchlorid-Aceton (90:10), weiter 8 HUV Methylenchlorid-Aceton (80:20), 8 HUV Methylenehlorid-Aceton (50: 50) und schließlich 16 HUV reines Aceton durch die Säule. Tabelle IX zeigt das Ergebnis dieser Auftrennung, wobei die eingeklammerten Buchstaben in der rechten Tabellenspalte die in der betreffenden Fraktion vorliegenden R-451-Komponenten bezeichnen.
Das nach dem vorstehenden Absatz oder nach Beispiel 8 (Teile A bis C) erhaltene Produkt kann weitergereinigt werden, wie folgt: Man löst das amorphe Pulver in heißem Isopropanol, fügt Aktivkohle (etwa 10°/o des Gewichtes der zu reinigenden Substanz) zu, rührt 10 Minuten, filtriert und kühlt das Filtrat auf 5'C. Der sich abscheidende Niederschlag wird auf einem Filter gesammelt, mit kaltem Isopropanol gewaschen und 24 Stunden bei Zimmertemperatur im Hochvakuum getrocknet. Das Produkt hat einen Prüfwert von 760 Einheiten je Milligramm. Beispiel 10 Herstellung des Methyläthers von R-451 D Man löst 500 mg R-451 D in l1 ml Äthylacetat und 11 ml Äthyläther, fügt einen Überschuß einer ätherischen Diazomethanlösung zu und läßt die gelbe Lösung 72 Stunden bei 5°C stehen. Dann wird in einem Stickstoffstrom zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 5 ml Isopropanol gelöst, gekühlt und der gebildete Niederschlag abfiltriert. Man wäscht mit kaltem Isopropanol und trocknet das erhaltene Produkt, das aus 260 mg des gewünschten Methyläther in Form farbloser Prismen mit den folgenden physikalischen Daten besteht: Fp. = 161 bis 162°C; (1°/o in Pyridin); Am" = 228 m(i (E'°' = 13,7).
Physikalische und chemische Eigenschaften der nach den Beispielen gewonnenen Antibiotica Rohes R 451, hergestellt nach Beispiel 1, D, ist eine farblose amorphe Substanz mit den folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften: I. Schmelzpunkt 200 bis 204°C.
II. Analysenwerte (qualitative Gruppenbestimmung) 1. Ninhydrintest .................. negativ 2. Ferrichlorid ..... ............ .. . negativ III. Optische Drehung [x]2D5 = -16° (0,5°/o in Chloroform). IV. Löslichkeit Löslich in Wasser; unlöslich in Petroläther; löslich in den meisten organischen Lösungsmitteln; in einem Methanol-Methanol-System durch eine Cellophanmembrane dialysierbar. V. Ultraviolettspektrum F i g. 1 der Zeichnungen zeigt das Absorptionsspektrum für eine Konzentration in Methanol von 5 g/100 ml (."l bedeutet die Wellenlänge in m#t, D die optische Dichte): Am"" bei 288 m#t (El# = 50).

VI. Infrarotspektrum F i g. 2 der Zeichnungen stellt das Spektrum im Handelsprodukt Nujol ® dar, wobei A, die Wellenlänge in #t, v die Frequenz in cm-' und A die Absorption bedeutet. Die Absorptionsmaxima (schw = schwach, m = mittel, m-st = mittel bis stark, st = stark, sst = sehr stark, Sch = Schulter) befinden sich bei den folgenden Wellenlängen

.; (Ex) Intensität

2,92 ........................... st

5,84 ........................... m

........................ m (breit)

6,12

6,45 ........................... m-st

8,00 ........................... Sch

8,07 ........................... st

8,33 ........................... m-st

8,55 ........................... Sch

9,10 ........................... st (breit)

9,60 ........................... st (breit)

10,26 ........................... m-st

10,55 ........................... m-st

11,02 ........................... schw

VII. Stabilität Bei pH < 7 schon bei 20°C instabil. Bei pH >7 bleibt die Aktivität noch nach 30 Minuten langem Erhitzen auf 100°C erhalten.

VIII. Papierchromatographische Daten Bei papierchromatographischer Untersuchung, wie unten ausgeführt, und biautographischer Exmittlung der Fleckenverteilung (gegen Staphylococcus aureus, wie oben beschrieben) gelangt man zu den folgenden RF-Werten für R-4.51:

Angewandtes Lösungsmittelsystem RF-Werte

A 80 °/oiges wäßriges Methanol + 30/,

Natriumchlorid; aufsteigend; Papiervor-

her mit Sulfat-Bisulfat auf pH = 2,3

gepuffert........................... 0,80

B n-Propanol-Pyridin-Wasser-Essig-

säure (15: 10: 3 : 12); aufsteigend ..... 1,0

C n-Propanol-Wasser-Essigsäure

(50: 40: 5); aufsteigend . .. . .. . .. . . . . . 0,93

D 80°/jges wäßriges Phenol; aufsteigend 0,95

E Benzol-Methanol (9: 1); aufsteigend 1,0

F Benzol-Chloroform (95: 5); ab-

steigend; Papier zuerst mit Formamid-

Methanol (1 : 1) gesättigt und vor Ver-

wendung (zur Entfernung des Methanols)

an der Luft getrocknet . . . . . . . . . . . . . . 0,0

G Benzol-Petroläther (Siedebereich 30 bis

60°C) -Aceton (10: 2, 5 : 5);

absteigend .................... 0,0; 0,14;

0,28; 0,64

Von den Einzelkomponenten von R-451 ist die Komponente R-451 A, erhalten nach den Verfahren von Beispiel 8, E, eine farblose amorphe Substanz mit den folgenden Eigenschaften: I. Ultraviolettspektrum Transparent im Bereiche von 220 bis 360 m#t. IL Infrarotspektrum (Spektrum in Nujol, s. F i g. 3 der Zeichnungen) Absorptionsmaxima (alle breit und stark ausgeprägt) befinden sich bei folgenden Wellenlängen: 2,90, 6,25, 8,25 bis 10,00 R-451 B, hergestellt nach Beispiel 8, C, ist eine farblose amorphe Substanz mit den folgenden Eigenschaften I. Ultraviolettspektrum Transparent im Bereich von 220 bis 360 rn#t. IL Infrarotspektrum (Spektrum in Nujol, s. F i g. 4 der Zeichnungen) Absorptionsmaxima (mit Intensitäten wie angegeben) befinden sich bei den folgenden Wellenlängen: A (#t) Intensität 2,94 ......................... m-st 5,72 ......................... st 5,80 ......................... m-st 7,92 ......................... m-st 8,60 ......................... m-st 9,10 ......................... st (breit) 9,64 ......................... st (breit) 12,50 ......................... m-st (breit) 13,90 ......................... m-st (breit) Für das gemäß Beispiel 9, Absatz 2, gereinigte Produkt wurden die folgenden Kennwerte ermittelt:

I. Schmelzpunkt (Kofler-Block)

154 bis 157'C.

IL Optische Drehung

[a]@5 = -25,5° (10/, in Pyridin).

III. Ultraviolettabsorption

@max = 228 m#t (E'% = 12 in Methanol).

-Zmax = 296 m#t (E'% = 72 in O,lnormaler metha-

nolischer NaOH).

IV. Analysenwerte

a) Elementaranalyse

C 51,92 0/0, H 6,68 %, N 1,23 0/0, 0 34,72 0/0,

Cl 3,97 %.

b) Quantitative Gruppenbestimmung

Methoxygruppen = 12,800/" C-Methylgruppen

= 7,150/0, N-Methylgruppen = 2,330/0.

V. Infrarotspektrum (in Nujol)

Absorptionsmaxima (mit Intensitäten wie ange-

geben) befinden sich bei den folgenden Wellenlängen:

Intensität

2,88 . st

3,35 bis 3,48 . . . . . . . . . . . . . . . . . . st (breit)

3,65 .......................... schor

4,54 .......................... schor

4,65 .......................... schor

5,74 .......................... st

5,82 .......................... Sch

6,02 .......................... Sch

6,10 . . m

6,35 bis 6,39 . . . . . . . . . . . . . . . . . . m (Dublett)

6,45 .......................... st

6,78 bis 6,87 .................. st (breit)

7,24 .......................... st

7,30 .......................... Sch

7,40 .......................... Sch

7,67 bis 7,80 . . . . . . . . . . . . . . . . .. Sch

7,92 .......................... Sch

7,98 .............. , .......... st

8,12 .......................... Sch

8,30 bis 8,35 . . . . . . .. . .. . . . . . . . st (breit)

8,55 .......................... Sch

8,75 bis 9,80 .. .... ... . . . . . . . . . st (breit)

10,20 bis 10,26 ................. st breit)

10,30 .......................... Sch

10,33 .......................... Sch

10,61 .......................... st

10,85 .......................... Sch

11,03 .......................... m

11,52 .......................... m

11,70 .......................... Sch

11,85 bis 12,00 . . .... . . . . . . . . . . . Sch

12,75 bis 12,81 . ..... .. . . . . . . . . . schor (breit)

12,98 .......................... schor

13,54 bis 13,60 . . .. . . . . . . . . .. . . . m (breit)

13,85 bis 13,90 . . . . . . . . . . . . . . . . . m (breit)

VI. Löslichkeit Löslich in Chlorkohlenwasserstoffen (Methylenchlorid, Chloroform), Alkohol, Aceton, Pyridin und verdünntem Alkali; wenig löslich in Benzol; unlöslich in Äther, Hexan und Wasser.

R-451 D, hergestellt wie vorstehend beschrieben, ist ein weißes amorphes Pulver mit den folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften: I. Schmelzpunkt (im Kofler-Block) Produkt nach Beispiel 3 ...... 138 bis 140°C Produkt nach Beispiel 4 ...... 160 bis 161'C 1I. Analysenwerte a) Elementaranalyse des Produktes nach Beispie13 C 52,02 °/o, H 6,81 °/o, N 0,72 °/o, Cl 5,04 °/a.
b) Elementaranalyse des Produktes nach Beispiel 4 C 51,79 %, H 6,35 %, N 1,40 0/a, Cl 3,98 0/0, 036,350/,.
c) Quantitative Gruppenbestimmung des Produktes nach Beispiel 3 - OCH3 = 14,15 °/a. d) Quantitative Gruppenbestimmung des Produktes nach Beispiel 4 - OCH3 = 13,300/0, C-Methyl = 6,930/0, N-Methyl = 1,980/0.
e) Qualitative Gruppenbestimmung 1. Ninhydrintest . . . . . . . . . . . . . . . . . . negativ 2. Elson-Morgan-Test ............. positiv 3. Test mit alkalischem KMn04.... positiv 4. Anthrontest.................... graublau 5. 2,4-Dinitro-phenylhydrazintest.... positiv 6. Ehrlich-Test (Diphenylamin) .... negativ 7. Triphenyl-tetrazoliumtest . . . . . . .. negativ III. Optische Drehung Produkt nach Beispiel 3 [x]ö5 = +29,2- (1 °/o in Dioxan) Produkt nach Beispiel 4 [oc]ö = -25,3° (10/, in Methanol) -37,7- (10/, in Pyridin) IV. Löslichkeit Sehr gut löslich in Chloroform, Methylenchlorid, Aceton und Methanol sowie 0,1 n-Natriumhydroxyd; wenig löslich in Äther; unlöslich in Petroläther, Toluol, Benzol, Wasser und 10°/oiger wäßriger Natriumbiearbonat- oder -carbonatlösung. V. Ultraviolettspektrum F i g. 1 der Zeichnungen zeigt das Spektrum in Methanol des Produktes nach Beispiel 3 bei einer Konzentration von 2,97 mg/100 ml: ).mal bei 290 bis 295 m#L (EI' = 37); der entsprechende Wert für das Produkt nach Beispiel 4 beträgt amax = 289 m#z (E1`' = 22). In einer Lösung von 6 ml 1,0 normaler methanolischer Kaliumhydroxydlösung, mit Methanol auf 100 ml aufgefüllt, beträgt das E"° für beide Produkte 79; das Zmax des Produktes nach Beispiel 4 ist auf 295 m#t verschoben.

VI. Infrarotspektrum F i g. 5 der Zeichnungen zeigt das Spektrum in Nujol des Produktes nach Beispiel 3. Die Absorptionsmaxima befinden sich bei den folgenden Wellenlängen:

Intensität

2,88 ............................. st

5,73 ............................. st

6,13 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . in-st

6,33 ............................. m-st

6,45 ............................. st

7,98 ............................. st

8,32 ............................. st

8,50

10,00} ........................... st

10,22 ............................ st

10,55 ............................ st

11,00 ............................ in-st

11,55 ............................ in-st

12,30 ............................ schor

12,98 ............................ schor

13,55 ............................ in-st

13,87 ............................ m-st

Für das Produkt nach Beispiel 4 wurden die folgenden Werte gemessen:

.) Intensität

2,89 ............................ st

3,35 bis 3,48 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . st (breit)

5,73 ............................ st

6,12 ............................ schw

6,35 ............................ Sch

6,45 ............................ st

6,77 bis 6,82 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . st

7,10 ............................ Sch

7,24 ............................ st

7,30 ............................ Sch

7,42 ............................ st

7,68 bis 7,84 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . st (breit)

7,99 ............................ st

8,33 ............................ st

8,48 bis 8,70 .................... Sch

8,84 bis 9,17 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . st (breit)

9;57 .................. ......... st (breit)

10,00 ........................... Sch

10,22 bis 10,26 . . . . . . . . . . . . . . . . . . st (Dublett)

10,55 ........................... st

10,91 ........................... Sch

11,00 ........................... m

11,50 bis 11,60 . . . . . . . . . . . . . . . . . . m (breit)

11,66 ........................... Sch

11,90 bis 12,00 . . . . . . . . . . . . . . . . . . m (breit)

12,25 bis 12,35 . . . . . . . . . . . . . . . . . . schw (breit)

12,70 bis 12,85 . . . . . . . . . . . . . . . . . . schw (breit)

13,00 ........................... schw

13,52 bis 13,60 . . . . . . . . . . . . . . . . . . schw (breit)

13,85 bis 13,90 . . . . . . . . . . . . . . . . . . schw (breit)

14,42 bis 14,58 . . . . . . . . . . . . . . . . . . schw (breit)

VII. Bildung von Derivaten Acetat, hergestellt nach Beispiel 5 Fp. = 135 bis 136°C; nach Reinigung gemäß Beispiel 6 Fp. = 1, 51 bis 160 ° C. Ultxaviolettabsorptionsmaximum bei 285 bzw. 286 m#t (E'% = 9,2).

Elementaranalyse: C 53,08 °/o, H 7,08 °/o, N 0,77 °/o. Infrarotabsorptionsbanden (in Nujol) bei den folgenden Wellenlängen:

.x (E£) Intensität

2,85 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . schw (breit)

5,57 ............................ m-st

5,71 ............................ st

6,14 ............................ schw

6,45 ............................ m-st

8,02 ............................ st

8,38 ............................ m-st

8,88 ............................ st

9,17 ............................ st

9,55 ............................ st

VIII. Stabilität R-451D ist bei 0°C und in der Dunkelheit stabil. Bei Zimmertemperatur im direkten Sonnenlicht nimmt die Aktivität nach 24 Stunden langsam ab und ist nach etwa 3 Wochen vollständig verschwunden. Gelöst in Methanol, ist R-451 D mindestens 2 Wochen stabil. Bei einem pH unterhalb 5,5 geht die Aktivität rasch verloren, wogegen bei einem pH von mehr als 7 und bis zu 14 die Aktivität mehrere Tage lang erhalten bleibt. Bei Behandlung mit 0,1 normaler methanolischer Chlowasserstoffsäure bei Zimmertemperatur geht die antibiotische Aktivität innerhalb 16 Stunden verloren; behandelt man die saure Mischung mit einer stöchiometrischen Menge 2°/oiger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, dampft anschließend das Methanol im Vakuum ab und extrahiert mit Chloroform, so erhält man, wie sich durch Dünnschichtchromatographie an Silikagel mit Benzol-Aceton (75:25) als Lösungsmittel und anschließendes Besprühen mit Schwefelsäure feststellen läßt, eine Mischung von fünf Komponenten, die sämtlich weniger polar als R-451 D sind. Bei 16stündigem Behandeln mit 1,0 n-NaOH-Lösung bei Zimmertemperatur bleibt die Aktivität vollständig erhalten.

R-451 E, isoliert und gereinigt wie im Beispiel 7 beschrieben, ist ein nahezu farbloses amorphes Pulver mit den folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften I. Schmelzpunkt 89 bis 96°C, 1I. Analysenergebnisse a) Elementaranalyse C 65,17 %, H 7,54 0/a, N 1,310/" 0 24,23 0/0. b) Qualitative Gruppenbestimmungen 1. Ninhydrintest ................... negativ 2. Elson-Morgan-Test ...... * * ...... positiv 3. Test mit alkalischem KMn04 . . .... positiv 4. Anthrontest ..................... positiv 5. 2,4-Dinitro-phenylhydrazintest ..... positiv 6. Ehrlich -Test (mit Diphenylamin ... negativ 7. Triphenyl-tetrazoliumtest ......... positiv III. Optische Drehung [a]ö5 = 36,7° (10/, in Dioxan).
IV. Löslichkeit Löslich in Chloroform, Methylenehlorid, Aceton, Methanol und Äther; schlecht löslich in Benzol, Toluol und Hexan; unlösich in Wasser.
V. Ultraviolettspektrum F i g. 1 der Zeichnungen zeigt das Spektrum in Methanol bei einer Konzentration von 3,0 mg/100 ml Am" = 240 mit (E1% = 232).

VI. Infrarotspektrum (Spektrum in Nujol, s. F i g. 6 der Zeichnungen) Die Absorptionsmaxima (Intensitäten wie angegeben) befinden sich bei den folgenden Wellenlängen:

Intensität

2,94 ............................. m-st

5,68 ............................. st

5,76 ............................. st

5,83 ........................ . .... st

6,0 .............................. sst

6,16 ............................. m-st

6,22 ............................. m-st

7,87 ................... ... . ...... sst

A GC) Intensität

8,31 ............................. schw

8,55 ............................: schw

8,96 ............................. schw

9,33 .............................. schw

9,55 ............................. schw

9,77 ............................. m-st

10,50 ........ .................... schw

10,90 ............................. schw

11,26 ............................. m-st.

11,42 ............................. schw

12,22 ............................. schw

12,62 ............................. m-st

Biologische Eigenschaften der nach obigen Beispielen erhaltenen Antibiotica Die Antibiotica der R-541-Gruppe, besonders R-451 und R-4511), haben einen breiten Wirkungsbereich gegen grampositive Organismen. Sie sind von besonderem Wert für die Behandlung von Krankheiten, die durch penicillin-resistente Mikroorganismen hervorgerufen wurden (s. Tabellen X und XVI). Außerdem sind sie zur Behandlung von durch Staphylococcus aureus, Diplococcus pneumoniae und andere pathogene Mikroorganismen hervorgerufenen Krankheiten brauchbar.

Die Antibiotica cer R-451-Gruppe sind auch gegen gewisse durch Penicillin angreifbare Mikroorganismen wirksam; es hat sich jedoch gezeigt, daß sie nicht zu den Penicillinen gehören, was daraus hervorgeht, daß weder R-451 noch R-451 D durch Penicillinase inaktiviert werden. Sie können übrigens auch bei Patienten verwendet werden, die eine durch die Behandlung mit Penicillin oder synthetischen Penicillinderivaten hervorgerufene Empfindlichkeit zeigen -eine relativ häufige Erscheinung, tritt sie doch laut Statistik bei etwa 8 bis 10 °/o z. B. der Bevölkerung der Vereinigten Staaten von Amerika auf.

Das rohe R-451, hergestellt nach Beispiel 1, ist unter anderem als antiinfektiöses Mittel zur Verhinderung gewisser Krankheitserscheinungen brauchbar, die durch Staphyloccocus aureus, Streptococcus pyogenes, Diplococcus pneumoniae und andere pathogene Organismen hervorgerufen werden. - Seine In-vitro-Aktivität gegen verschiedene Mikroorganismen folgt aus Tabelle X. Die Anfälligkeit der Mikroorganismen gegen die Antibiotica wurde nach normierten Rohrverdünnungsverfahren ermittelt: Als Inoculum wurden durchweg Verdünnungen auf 10-5 von 24 Stunden alten Brühekulturen verwendet, wobei die Endpunkte nach 24stündiger Bebrütung bei 37°C aufgenommen wurden. Das Nährmedium war auf Basis Hefeextrakt-Rindfleischextrakt-Glucose hergestellt. - Seine Invivo-Aktivität gegen gewisse bakterielle Infektionen wurde ebenfalls, und zwar an 18 bis 20 g schweren Mäusen untersucht. Die Mäuse wurden mit einem Inoculum der betreffenden Bakterien durch intraperitoneale Injektion infiziert und wurden dann zweimal täglich mit subkutanen Injektionen von R-451, gelöst in Wasser, behandelt. Tabelle XI zeigt, welche Dosis jeweils erforderlich ist, um einen bestimmten Prozentsatz so behandelter Tiere zu schützen. Bei oraler Verabreichung von 400 #tg (20 mg je Kilogramm Maus) in zwei gleichen Gaben, die erste 1/Z Stunde vor der Infektion, wird ebenfalls 100 °/oiger Schutz gegen Streptococcus pyogenes erzielt. Die akute Toxizität von R-451 wurde an Mäusen mit einem Gewicht von 18 bis 20 g nach verschiedenen normierten Verfahren geprüft, mit den folgenden Ergebnissen:

LDbp (Milligramm

Verabreichungsweise je Kilogramm Maus)

Subkutan ........................ 1000

Intraperitoneal ................... 1000

Intravenös ....................... 850

Oral ............................ >2500

R-541 A und R-451 B, hergestellt nach Beispiel 8, E bzw. C, zeigen nach dem Scheibenprüfverfahren (Scheibendurchmesser 6,3 mm), wobei die Inhibitionszone gemessen wurde, nachdem eine mit dem Antibioticum imprägnierte Scheibe auf eine mit dem Testorganismus beimpfte Agarplatte aufgebracht und 24 Stunden bei 37°C bebrütet worden war, eine In-vitro-Aktivität gegen gewisse Mikroorganismen, wie in Tabellen XII bzw. XIII ausgeführt. Weitere Daten betreffen die In-vitro-Aktivität von R-541 B (ermittelt an nach Beispiel 9 gereinigtem Material) sind der Tabelle XIV zu entnehmen. (Das Verhalten der Testorganismen gegenüber dem Antibioticum wurde hierbei nach genormten Verdünnungsmethoden bestimmt. In jedem Falle wurden Verdünnungen auf 10-4 von 24 Stunden alten Kulturen als Inoculum verwendet, und die Endprodukte wurden nach 24stündiger Bebrütung bei 37°C in einem »Difco-Pen-assay«-Brühemedium aufgenommen. Die Tabelle zeigt die Aktivität des Antibioticums in Einheiten je Milliliter, wobei die Einheit wie oben definiert ist.) Die In-vivo-Aktivität von R-451 B, hergestellt nach Beispiel 8,C, wurde in der bei R-451 angegebenen Weise geprüft, mit den folgenden Ergebnissen: Gegen Staphylococcus aureus beträgt die PD5o = 500 #Lg je Maus (25 mg je Kilogramm Maus); gegen Streptococcus pyogenes beträgt sie 80 #tg je Maus (4 mg je Kilogramm Maus). - Weitere Daten betreffend die In-vivo-Aktivität von R-451B (ermittelt an nach Beispiel 9 gereinigtem Material) sind der Tabelle XV zu entnehmen. (Die Daten dieser Tabelle wurden pharmakologisch an 18 bis 20 g schweren Mäusen als Versuchstieren gegenüber gewissen pathogenen Mikroorganismen ermittelt, und zwar nach dem folgenden genormten Verfahren: Dreißig Mäuse wurden mit einem Inoculum des betreffenden Organismus durch intraperitoneale Injektionen infiziert. Dann wurden zwanzig Mäuse subkutan mit einer Lösung des Antibioticums in 2 Teilen Äthanol, 0,5 Teilen Tween 80 und 8,5 Teilen Erdnußöl behandelt, wobei die Injektionen in zwei gleichen täglichen Dosierungen verabreicht wurden; zehn Mäuse blieben als Kontrolltiere unbehandelt. Alle Kontrolltiere starben innerhalb 18 Stunden. Die Dosis, die erforderlich ist, damit 50 % der behandelten Tiere nach 48 Stunden noch leben (PDSo), ergab sich gemäß Tabelle XV).

Die akute Toxizität von R-451 B wurde bestimmt wie folgt:

LDSO (Milligramm

Verabreichungsweise je Kilogramm Maus)

Subkutan ........................ 2500

Intraperitoneal ................... 750

R-451 D, hergestellt nach Beispiel 3, zeigt eine Invitro=Aktivität gegen verschiedene grampositive Organismen, wie aus Tabelle XVI ersichtlich - bestimmt wie bei R-451 angegeben. -Ferner wurde die In-vivo-Aktivität des nach Beispiel 3 hergestellten R-451 D in der bei R-451 angegebenen Weise untersucht. Tabelle XVII zeigt die Ergebnisse. - Weitere Daten betreffend die In-vitro- und In-vivo-Aktivität von R-4.51 D (ermittelt an nach Beispiel 4 gereinigtem Material) sind den Tabellen XIV bzw. XV zu entnehmen; die Bestimmung dieser Daten ist im Zusammenhang mit R-451 B näher erläutert. - Die akute Toxizität von R-451 D wurde bestimmt wie folgt:

Verabreichungsweise 1-D5" (Milligramm

je Kilogramm Maus)

Subkutan ........................ 1000

Intraperitoneal ................... 500

Intravenös ....................... 150

Für R-451 E, hergestellt nach Beispiel 7, wurde in der für R-451 A und R-451 B angegebenen Weise die in Tabelle XVIII aufgeführte In-vitro-Aktivität ermittelt.

Tabelle I

Vergleichende Taxonomie von Micromonosporaarten

Teil A: Medium enthält 0,1 °/o NZ-Amin Typ A, 10/, Dextrose, 1,5°/o Agar

Verwendeter Beobachtete Eigenschaften

Mikro-

organismus Makroskopisch I Mikroskopisch

M. carbonacea Kein Luftmycel; Kolonie flach, feucht; Wachs- Mycel lang, verzweigt, regelmäßig, wandlos,

NRRL 2972 tum mittelmäßig; kein diffundierbares Pigment Durchmesser 0,6 #t; reichliche Bildung läng-

gebildet. licher bis ellipsoidaler Sporen, 1,0 zu 1,5 #t,

Farbe: getragen von büschelweise auftretenden Sporo-

Oberfläche: Peripherie hellorange-g4NA, leb- phoren, dunkel gefärbt.

haft orange-48, Zentrum: braunschwarz.

Rückseite: desgl.

M. chaleea Kßin Luftmycel; Kolonie schwach erhöht, ge- Mycel lang, verzweigt, regelmäßig, wandlos,

ATCC 12452 furcht, wachsartig; mittelmäßiges Wachstum; sehr fein, Durchmesser kleiner als 0,5 #t; reich-

kein diffundierbares Pigment gebildet. I liche Bildung kugelförmiger bis ellipsoidaler

Farbe: Sporen, braun, 1,0 #t im Durchmesser, größten-

Oberfläche: kaffeebraun-g3PN, dunkeloliv- teils frei, aber einige einzeln an langen Sporo-

braun-96. phoren.

Rückseite: desgl.

M. fusca Kein Luftmycel; Kolonie schwach erhöht, Mycel kurz, unregelmäßig, bildet viele poly-

NRRL B-943 feucht, körnig bis gefurcht; mittelmäßiges morphe Elemente, Durchmesser 0,8 bis 2,0 #t;

Wachstum; ganz schwach gelblichbraunes dif- Sporen 1,0 #t im Durchmesser, schwer auffind-

fundierbares Pigment gebildet. bar unter zahlreichen dunkelwandigen - (oliv-

Farbe: braunen) polymorphen Formen.

Oberfläche: braunrotorange-g4PC, tief-

orange-51.

Rückseite: kofferbraun-g4NE, intensiv-

braun-55.

M. sp. Kein Luftmycel; Kolonie schwach erhöht, Mycel lang, verzweigt, regelmäßig, wandlos,

ATCC 10026 trocken, körnig bis gefurcht; kein diffundier- 0,5 [. im Durchmesser; Sporen äußerst reich-

bares Pigment gebildet. lich, in Büscheln und einzeln, 1,0 p. im Durch-

Farbe: messer; einige polymorphe Formen vorliegend;

Oberfläche: Peripherie kaffeebraun-g3PN, sowohl Sporen als auch polymorphe Formen

dunkelolivbraun-96, Zentrum rotbraun- dunkelwandig.

orange-g4PC, tieforange-51.

Rückseite: desgl.

Teil B: Medium enthält 3 °/o NZ-Amin Typ A, 10/, Dextrose, 1,5 °/o Agar

M. carbonacea Kein Luftmycel; Kolonie erhöht, gefurcht; Mycel lang, verzweigt, regelmäßig, wandlos,

NRRL 2972 Wachstum gut; kein diffundierbares Pigment 0,6 V, im Durchmesser; Sporen einzeln, an

gebildet. einzelnen Sporophoren getragen, länglich bis

Farbe: ellipsoid, 1,0 zu 1,5 #t, dunkel gefärbt.

Oberfläche: terracottafarben-g5PE, intensiv-

braun-55.

Rückseite: desgl.

M. chalcea Kein Lufmycel; Kolonie erhöht, faltig, wachs- Mycel lang, verzweigt, regelmäßig, wandlos,

ATCC 12452 artig; mittelmäßiges Wachstum; kein diffun- 0,5 im Durchmesser; Sporen reichlich, einzeln

dierbares Pigment gebildet. und büschelweise getragen, kugelförmig bis

Farbe: ellipsoidal, 1,0 #t im Durchmesser.

Oberfläche: kupferbraun-g5PI, intensiv-

braun-55.

Rückseite: rotbraun bis braun-g4PI, intensiv-

braun-55.

Tabelle I (Fortsetzung)

Verwendeter Beobachtete Eigenschaften

Mikro-

organismus Makroskopisch Mikroskopisch

M. fusca Kein Luftmycel; Kolonie erhöht, grobkörnig, Mycel unregelmäßig, viele polymorphe Ele-

NRRL B-943 matt (»dull«); gutes Wachstum; ganz schwach mente vorliegend, 0,5 bis 2,0 #t im Durchmesser,

gelblich-braunes diffundierbares Pigment ge- ohvbraun gefärbt; echte Sporen, 1,0 #t im

bildet. Durchmesser, stufenweiser Übergang in poly-

Farbe: morphe Formen mit Durchmesser 0,5 bib 2,0 @,.

Oberfläche: terracottafarben-g5PE, intensiv-

braun-55.

Rückseite: rotbraun-g5PG, intensivbraun-55.

M. sp. Kein Luftmycel; Kolonie erhöht, dichtkörnig, Zwei Arten Mycel: lang und regelmäßig einer-

ATCC 10026 trocken; gutes Wachstum. seits, kurz und unregelmäßig anderseits, bildet

Farbe: viele polymorphe Elemente, 0,8 bis 2,0 #t im

Oberfläche:Peripherierotbraunorange-g4PC, Durchmesser; reichlich echte Sporen, büschel-

intensivorange-50, Zentrumschokoladebraun_ weise getragen, 1,0 a, im Durchmesser, kugel-

g4PN, dunkelbraungrau-62. förmig bis ellipsoidal.

Rückseite: dunkelzimtbraun (»dark spiee

brown«)-g4PL, dunkelbraun-59.

Tabelle II

Verwendetes M. carbonacea M. chalcea M. fusca M. parva M. globosa M. coerulea

Medium

NRRL 2972

Glucose- Wachstum: Kein Luftmycel. Wachstum: Wachstum: Wachstum: Wachstum:

Asparagin- schlecht Wachstum: äußerst gut. schlecht schlecht schlecht

Agar äußerst gut. Bildet lösliches

Bildet kein lös- braunes Pigment.

liches Pigment. Farbe: wechselt

Farbe: blaßrosa bis von orange bis tief-

tieforange mit braun, mit grau-

bräunlich- bis schwarzer bis

grünlichschwarzer braunschwarzer

Sporenschicht Sporenschicht

Gelatine Verflüssigung Verflüssigung Schwache Verflüssi- Verflüssigung Verflüssigung Rasche Verflüssi-

gung gung

Milch Wird langsam Peptonbildung, Wird langsam Bleibt unver- Koagulation und Kann koaguliert

verdaut gelegentlich verdaut, nicht ändert Peptonbildung werden, Ver-

Koagulation koaguliert dauung ganz

schwach

Saccharose Wird verbraucht Wird invertiert Wird invertiert Wird nicht Wird invertiert Wird invertiert

invertiert

Stärke Wird hydroly- Wird hydrolysiert Wird hydrolysiert Wird hydroly- Wird hydroly- Wird hydroly-

siert siert siert siert

Cellulose - Wird rasch zersetzt Wird schwach ange- Wird nicht Wird nicht Wird nicht zer-

griffen zersetzt zersetzt setzt

Nitrat- Aus Nitraten ent- Aus Nitraten ent- Wechselhaft Keine Reduk- Aus Nitraten Keine Reduktion

reduktion stehen Nitrite stehen Nitrite tion entstehen

Nitrite

Temperatur Gutes Wachstum Optimales Wachs- - - - -

bei 16 bis 37°C, turn zwischen 30

kein Wachstum und 35°C

bei 50°C

Wachstum Aerob Aerob Aerob Aerob Aerob Aerob

(aerob oder

anaerob)

5095181424

Tabelle IH

Chromatographische Studien an den durch Bebrütung von M. carbonacea gebildeten antibiotischen Substanzen

Verwendete Lösungsmittelsysteme RI:-Werte für

R-451 A I R-451 B I R-451 C I R-451 D I R-451 E

I. Benzol .................... 10 V. T.*

Petroläther (Siedebereich 30 bis

60°C) ..................... 2,5 V. T. 0 0,14 0,28 0,64 0,74

Aceton ...................... 5 V. T.

Entwicklungsdauer . . . . . . . . . . . . 11/z Stunden

II. Toluol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 V. T.

n-Butanol ................... 1,5 V. T.

Destilliertes Wasser . . .. . . . .. . . 7 V. T. 0 0,19 0,42 0,61 0,71

Petroläther (Siedebereich 30 bis

60°C) ..................... 1,5 V. T.

Entwicklungsdauer . . . . . . . . . . . . 41/8 Stunden

III. Petroläther (Siedebereich

60 bis 90°C) . . . . . . . . . . . . . . . 5 V. T.

Methanol.................... 8 V. T.

0 0,08 0,26 0,60 0,82

Äthylacetat .................. 5 V. T.

Destilliertes Wasser . . . . . . . . . . . 2 V. T.

Entwicklungsdauer . . . . . . . . . . . . 2 Stunden

*) V. T. = Volumteile; im Originalversuch: 1 V. T. =1 pint.

Tabelle IV

Chromatographie von Antibiotica der R-451-Gruppe an Aluminiumoxyd

Inhibitionszone in Milli-

meter bei 6,35 mm im

Getestete Durchmesser messenden Papierbioautographische

Fraktionen Behandlungsweise und Ausbeute Filterpapierscheiben und Verteilung

(Gruppen) Konzentrationen in #tg/ml

von

1000 100 1 10 I 1 RF-Werte*

Ausgangs- - 20 j 14 8 0 0,0; 0,15; 0,29; 0,60;

material 0,74

1 Inaktiv 0 0 0 0 -

2 Rückstand in Chloroform gelöst, mit zehn- 23 17 10 0 0,0; 0,12 (Spur); 0,62;

fachem Volumen Petroläther gefällt; 0,74

Ausbeute: 102 mg

3 bis 4 Behandelt wie Fraktion 2; Ausbeute: 725 mg 15 I 0 0 0 0,0

5 bis 8 Behandelt wie Fraktion 2; Ausbeute: 541 mg 18 11 0 0 0,0; 0,18 (Spur);

0,62 (Spur)

9 bis 12 Inaktiv 0 0 0 0 -

13 bis 30 Behandelt wie Fraktion 2; Ausbeute: 1,73 g 26 22 16 8 0,0; 0,14; 0,28; 0,64

31 bis 34 Behandelt wie Fraktion 2; Ausbeute: 32,5 mg 25 i 22 16 8 0,0; 0,15; 0,29; 0,60

35 bis 42 In Wasser gelöst, lyophilisiert; Ausbeute: 111 mg 22 17 11 0 0,0; 0,13 (schwach);

0,24 (schwach); 0,59

43 bis 49 Behandelt wie Fraktionen 35 bis 42; 22 16 9 8 0,0; 0,13; 0,25; 0,58

I

Ausbeute: 67,5 mg' I

* Angewandtes System: Benzol-Petroläther-Aceton (10: 2,5: 5), absteigend; chromatographisches Papier der Sorte Whatman

Nr. 1;

Entwicklungsdauer.

Tabelle V

Chromatographie von Antibiotica

der R-451-Gruppe an Diatomeenerde

Eluierungs- Gewicht Bioautographisch

HUV mittel des Rück- ermittelte

standes RF-Werte

ml mg

1 3500 - -

2 3500 3400 0,77

2,1 bis 2,9 2800 190 0,79

3 bis 10 24500 2200 0,3; 0,65; 0,75

11 bis 13 7000 100 0,14; 0,28; 0,64

14 bis 16 7000 100 0

Tabelle VI

Chromatographische Auftrennung von HUV 3 bis 10

aus den Antibiotica der R-451-Gruppe

Eluierungs- Gewicht Papierchromato-

HUV mittel des Rück- graphisch-bioauto-

standes graphisch ermittelte

ml mg RF-Werte

1 900 - -

1 bis 1,5 450 320 0,78

1,5 bis 14 11000 680 0,64; 0,74

Tabelle VII

Vortrennung der Antibiotica der R-451-Gruppe

durch Cromatographie an Diatomeenerde

Eluierungs Bioautographisch

HUV mittel - Gewicht des Rück- ermittelte

standes RT-Werte

ml mg

0,9 7000 - -

1,0 bis 1,1 800 186 0,8; 0,55

1,2 bis 1,8 5000 900 0,56; 0,43

1,9 bis 2,8 7200 5700 0,16; 0,23;

0,43; 0,55

2,9 bis 3,9 8000* 100 0; 0,16; 0,23;

0,55 (Spur)

4,0 bis 5,0 8000** 120 0

* Eluierung mit Aceton.

** Eluierung mit Aceton-Methanol (1 : 1).

Tabelle VIII

Chromatographische Auftrennung

der Fraktionengruppe HUV 1,9 bis 2,8 von Tabelle XI

Verwendetes Gewicht Bioautographisch

HUV Eluierungs- des Rück-

mittel standes ermittelte

ml mg RT-Werte

0,7 4200 - -

0,8 bis 1,6 4800 1100 0,55

1,7 bis 17,6 96000 300 0,43

17,7 bis 27,7 60000 200 0,16; 0,23

27,7 bis 28,1 2400 70 0; 0,15

Tabelle IX

Chromatographie von Antibiotica

der R-451-Gruppe an Florisil®

Gewicht Bioautographisch

Elutionsmittel Eluat des Rück- ermittelte

standes RF-Werte

ml g

CH,Cl2 4400 10,2 0,43(D); 0,56(E)

CH,C12

5 °/o Aceton 8800 8,1 0,45(D)

CH,C12

-I- 10 % Aceton 8800 13,2 0,43(D)

CH,C12

-t- 20°/o Aceton 8800 2,3 0,45(D); 0,24(B)

CH1Cl2

-f- 50010 Aceton 8800 6,3 0,23(B)

100% Aceton 8800 5,4 0,150); 0,23(B)

Tabelle X

In-vitro-Aktivität von R-451

Minimale

Systematischer Name Stammbezeich- Inbi-

nung bitions-

Konzen-

der verwendeten Mikroorganismen tration

&,g/ml

Bacillus cereus ATCC 7064 0,75

Bacillus cereus

var. mycoides DA 39 0,25

Bacillus megatherium DA 31 0,75

Bacillus subtilis ATCC 6633 0,25

Staphylococcus albus ! DA 2100 0,10

Staphylococcus aureus ATCC 6538P 0,075

Staphylococcus aureus ATCC 1163 0,25

Staphylococcus aureus ATCC 12715 0,75

Staphylococcus aureus Gray 0,50

Staphylococcus aureus DA 201 * 0,10

Staphylococcus aureus DA 202** 0,25

Staphylococcus aureus DA 203*** 0,30

Staphylococcus aureus DA 204*** 0,15

Staphylococcus aureus DA 205*** 0,40

Streptococcus fäcalis DA 20 0,75

Streptococcus pyogenes ATCC 12348 0,175

Streptococcus pyogenes , DA 21 0,375

* Ein gegen Novobiocin resistenter Stamm.

** Ein gegen Oleandomycin und Erythromycin resistenter

Stamm.

*** Gegen Penicillin resistente Stämme.

Tabelle XI

In-vivo-Aktivität von R-541

Infizierender Prozentsatz

Mikro- Verabreichte Dosis überlebender

Organismus R-451 in #Lg je Maus und Tag Mäuse nach

24 Stunden

0 (Kontrollsalzlösung) 0

40 (2 mg je Kilogramm 50

Strepto- Maus)

coccus 40 (2 mg je Kilogramm 100

pyogenes Maus) eine einzige In-

jektion 1 Stunde nach

der Injektion

Tabelle XI (Fortzsetzung)

Infizierender Prozentsatz

Mikro- Verabreichte Dosis überlebender

organismus R-451 in #Lg je Maus und Tag Mäuse nach

24 Stunden

Staphylo- 40 (2 mg je Kilogramm 50

coccus Maus)

aureus

Diplococcus 50 (2,5 mg je Kilogramm 100

pneumoniae Maus) (nach

2 Tagen)

Tabelle XII
In-vitro-Aktivität von R-451 A
Durchmesser in Millimeter der Inhibitions-
Konzentration zone gegen
in F.g R-451/ml Staphylococcusl Streptococcus Bacillus
aureus fäcalis subtilis
1000 18 23 13
100 9 15 10
10 0 20 0
1 0 7 0

Tabelle XIII

In-vitro-Aktivität von R-451 B

Durchmesser in Millimeter der Inhibitions-

Konzentration zone gegen

in leg R-451B/nII Staphylococcus Streptococcus ( Bacillus

aureus fäcalis subtilis

1000 23 30 17

100 20 26 8

10 15 22 0

1 8 15 0

Tabelle XIV

Antibiotisches Spektrum (In-vitro-Aktivität)

von R-4.51 B und R-451 D

Minimale

Testorganismen Inhibitions-

Stamm- konzentration

Bezeichnung in Einheiten

Systematischer je Milliliter

Name R-451B I R-451D

Bacillus cereus ..... QMCC B 964 0,3 0,025

Bacillusmegatherium ATCC 5773 1,2 0,15

Bacillus subtilis .... ATCC 6633 1,2 0,15

Sarcina lutea ...... ATCC 9341 1,2 0,3

Staphylocossus

aureus ... ... . .. . ATCC 6538 0,15 0,025

Staphylococcus

aureus . . ... ... . . ATCC 6538P 0,15 0,025

Staphylococcus

aureus .......... ATCC 12715 0,6 0,15

Staphylococcus

aureus . . . . . . . . . . ATCC 9996 0,15 0,075

Staphylococcus

aureus .......... ATCC 1163 0,6 0,3

Tabelle XIV (Fortsetzung)

Minimale

Testorganismen Inhibitions-

Stamm- konzentration

Bezeichnung in Einheiten

Systematischer je Milliliter

Name R-451B R-451D

Staphylococcus

aureus ......... Gray 0,3 0,025

Staphylococcus

aureus ......... Smith 0,6 ( 0,3

Staphylococcus

aureus . . . . . . . . . DA 2027 bis - I je 0,25

2036

(zehn klinische Iso-

late, die gegen Peni- .

cillin, Streptomycin,

Tetracyclin und

Erythromycin

resistent sind)

Diplococcus

pneumoniae*) ... DA 150 - 0,25

Streptococcus

pyogenes*) ...... DA 21 0,15 0,0075

Streptococcus

haemolyticus . . . 0,1 ( 0,1

Streptococcus

fäcalis .. .. . . . ... ATCC 10541 0,3

0,025

* Hirn-Herz-Infusionsbrühe -I- 0,5 % menschliches Serum.

Tabelle XV

In-vivo-Aktivität von R-451 B und R-451 D

PD/50 (in mg/kg)

Infizierende Mikroorganismen

R-451 B 1 R-451 D

Streptococcus pyogenes ....... 1,3 3,75

Staphylococcus aureus......... 2,5 12,5

Diplococcus pneumoniae ...... - 3,75

Tabelle XVI

In-vitro-Aktivität von R-451 D

Systematischer Name der Minimale

untersuchten Stamm- Inhibitions-

Mikroorganismen Bezeichnung konzentration

p.g/ml

Bacillus cereus . . . . . . . . ATCC 7064 0,25

Bacillus cereus var.

mycoides .......... DA 39 0,075

Bacillus megatherium. . DA 31 0,25

Bacillus megatherium . . QMCC 3773 0,025

Bacillus megatherium. . DA 38 0,25

Bacillus sphaericus .... DA 32 0,75

Bacillus sphaericus .... DA 33 0,25

Bacillus subtilis ...... ATCC 6633 0,25

Diplococcus

pneumoniae*) ...... DA 150 0,25

* Him-Herz-Infusionsbrühe + 0,5 °/o menschliches Serum.

33

Tabelle XVI (Fortsetzung)

Systematischer Name der Minimale

untersuchten Stamm- Inhibitions-

Mikroorganismen Bezeichnung konzentration

gg/nil

Sarcina lutea . . . . . . . . . ATCC 9431 0,0075

Staphylococcus albus .. DA 2100 0,25

Staphylococcus aureus DA 2027 bis je 0,25

(zehn klinische Isolate, 2036

die gegen Penicillin,

Streptomycin, Tetra-

cyclin und Erychro-

mycin resistent sind)

Staphylococcus aureus Gray 0,25

Streptococcus fäcalis . . DA 20 0,025

Streptococcus

pyogenes*) ........ DA 21 0,25

*) Hirn-Herz-Infusionsbrühe -i- 0,5% menschliches Serum.

Tabelle XVII

In-vivo-Aktivität von R-451 D

Prozentsatz

Infizierender überlebender

Dosierung in "g R-451D

Mikro- Mäuse

organismus je Maus und Tag

nach

24 Stunden

0 (Kontrollsalzlösung) 0

Strepto- 75 (3,75 mg je Kilogramm 50

coccus Maus)

pyogenes 100 (5,0 mg je Kilogramm 100

Maus)

Staphylo- 250 (12,5 mg je Kilogramm 50

Maus)

coccus ,400 (20 mg je Kilogramm 100

aureus Maus)

34

Tabelle XVII (Fortsetzung)

Prozentsatz

Infizierender

Dosierung in @.g R-451 D überlebender

orgari smus Je Maus und Tag Mäuse

24 Stunden

75 (3,75 mg je Kilogramm 50

Maus) (nach

Diplococcus 2 Tagen)

pneumoniae 100 (5,0 mg je Kilogramm 100

Maus) (nach

2 Tagen)

Tabelle XVIII
In-vitro-Aktivität von R-451 E
Konzentration Inhibitionszone in Millimeter gegen
m @tg Staphylococcus Streptococcus Bacillus
R-451E/ml aureus ( fäcalis subtilis
1000 20 19 24
100 15 13 19
10 8 9 15
1 0 0 8

Claims

Patentansprüche: 1. Die Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Micromonospora, insbesondere der Art M. carbonacea (NRRL 2972) zur Herstellung von neuen Antibiotica (R-451) durch Züchtung, Isolierung aus der Kultur, gegebenenfalls Zerlegung in seine Komponenten R-451 A, R-451 B, R-451 C, R-451 D und R-4.51 E und Aufarbeitung in üblicher Weise.
2. Die Verwendung von M. carbonacea var. aurantiaca (NRRL 2997) als Mikroorganismen nach Anspruch 1.