Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines als Xylostasin bezeichneten neuen Aminoglykosidantibiotikums, das nach der wissenschaftlichen Nomenklatur die Bezeichnung C-I3-Xylofuranosyl-( 1 5 > C-[a-2,6-diamino- 2,6-didesoxy-D-glucopyranosylX 1 < 4)}2-desoxystreptamin und die folgende Formel hat:
EMI1.1
Die Erfindung umfasst ferner die Herstellung von pharmazeutisch unbedenklichen Salzen von Xylostasin mit Säuren, durch Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus.
Gemäss der Erfindung erfolgt die Herstellung der neuen Antibiotika nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der das Antibiotikum zu bilden vermag, in einem Kulturmedium, das die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendigen Nährstoffquellen enthält, züchtet, bis das Antibiotikum sich angereichert hat, und das Antibiotikum vom Kulturmedium isoliert.
Das Kulturmedium wird im allgemeinen Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und von verwertbarem Stickstoff nebst anderen für das Wachstum des Mikroorganismus notwendigen Nährstoffquellen enthalten.
Als Xylostasin bildende Stämme eignen sich für die Zwecke der Erfindung alle Stämme der Gattung Bacillus, die das gewünschte Antibiotikum zu bilden vermögen, und durch spontane und induzierte Mutation dieser Mikroorganismen erhaltene Mutanten. Um festzustellen, ob ein Mikroorganismus Xylostasin zu bilden vermag, kann beispielsweise die nachstehend beschriebene Auswahlmethode angewandt werden.
Ein Glucose-Bouillon-Medium wird mit Bacillus-Stämmen, die von den natürlichen Quellen dieser Stämme isoliert oder von Vorratskulturen dieser Stämme entnommen wurden, geimpft. Die Kultivierung wird 3 bis 4 Tage unter Schütteln bei 28 "C durchgeführt. Nachdem bestätigt worden ist, dass das erhaltene Kulturmedium antibakterielle Wirkung gegen einen geeigneten Testmikroorganismus, z. B. Bacillus subtilis, Escherichia coli oder Staphylococcus aureus, zeigt, werden etwa 20 ml des Kulturfiltrats mit Alkali auf pH 9 bis 10 eingestellt und dann durch eine Aktivkohlesäure (0,2 g) geleitet. Die Säule wird mit etwa 10 ml Wasser gewaschen und dann mit 10 ml 0,1 N HCI eluiert. Das Eluat wird neutralisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird durch Papierelektrophorese auf Filterpapier Whatman Nr. 1 (W. & R.
Balston Co., USA) in einem Boratpuffer (pH 9,5, 0,025-molar) bei einem Spannungsgradienten von 2 kV/36 cm für 90 Minuten analysiert. Der Flecken von Xylostasin kann durch Bioautographie gegen einen geeigneten Mikroorganismus, z. B. Bacillus subtilis, sowie auch durch eine Farbreaktion unter Verwendung von Peptidreagens nachgewiesen werden. Das Xylostasin wird 5 bis 6 cm zur Kathode festgestellt.
Als Mikroorganismen eignen sich für das Verfahren gemäss der Erfindung beispielsweise Bacillus sp. Y-399 und Bacillus sp. V-7, die unter den folgenden Zugangsnummern hinterlegt sind:
Tabelle 1
ATCC IFO Bacillus sp. Y-399 21 932 13 321 Bacillus sp. V-7 21 933 13 320 ATCC: American Type Culture Collection , Maryland, USA IFO: Institute for Fermentation, Osaka , Osaka, Japan Bacillus sp. Y-399 wurde vom Boden in Kyoto, Japan, und Bacillus sp. V-7 vom Boden in Tokyo, Japan, isoliert. Diese Mikroorganismen haben die nachstehend in Tabelle 2 genannten mikrobiologischen Eigenschaften.
Tabellle 2 Eigenschaft Bacillus sp. Baccilus sp.
Y-399 V-7 a) Aussehen 1. Form und Grösse Stäbchen, 0,8 x 2,4 Stäbchen 0,8 x 2,4 bis 3,4 y mit abge- bis 3,4 u, mit rundeten Enden abgerundeten
Enden 2. Pleomorphismus tritt einzeln auf tritt einzeln und paarweise auf und gelegentlich paarweise auf.
3. Beweglichkeit beweglich, mit beweglich, mit und Flagellum Peritricha Peritricha 4. Sporogenese Sporen eliptisch Sporen eliptisch oder zylindrisch, oder zylindrisch, zentral bis sub- zentral bis sub terminal, Sporan- terminal, Sporan gium gequollen und geium gequollen und keulenförmig keulenförmig 5. Gram-Färbung unterschiedlich unterschiedlich
Eigenschaft Bacillus sp. Baccilus sp.
Y-399 V-7
6. Säurefestig- nicht säurefest nicht säurefest keit b) Wachstumsmerk male
1. Bouillonagar- sich ausbreitend, sich ausbreitend, platte glatte flache Ober- glatte flache Ober fläche, geschlossen, fläche, glänzend, durchscheinend, geschlossen, durch gelb und schleimig; scheinend, gräulich
Mikrokolonien sind weiss und schleimig; beweglich. beweglich.
2. Bouillon- mässiges Wachstum, mässiges Wachstum,
Schrägagar rhizoid, flach, rhizoid, flach, glänzend, durch- glänzend, gräulich scheinend und sehr weiss und sehr schleimig schleimig 3. Bouillon mässiges Wachstum, mässiges Wachstum, kein Oberflächen- kein Oberflächen wachstum, trübe; wachstum, trübe;
Zellen sind gelb. Zellen sind gräu lich-weiss.
4. Kartoffel mässiges Wachstum, gutes Wachstum, sich ausbreitend, sich ausbreitend, hellgelb gräulich-weiss 5. Lackmusmilch neutral, peptoni- reduziert siert und reduziert c) Physiologische
Merkmale 1. Reduktion von nicht reduziert nicht reduziert
Nitraten 2. Denitrierung negativ 3. MR-Test negativ negativ 4. VP-Test negativ negativ 5. Indolbildung nein nein 6. Bildung von ja ja
Schwefelwasser stoff 7. Hydrolyse schwach hydro- schwach hydrolysiert von Stärke lysiert 8. Verwertung keine Verwertung keine Verwertung von Citrat 9. Verwertung keine Verwertung keine Verwertung von Nitraten 10. Verwertung keine Verwertung keine Verwertung von Ammoniak 11. Pigmentbildung Ein in Wasser un- keine Pigment lösliches gelbes bildung
Pigment (caroti noid) wird intra zellulär gebildet.
12. Urease-Aktivität negativ negativ 13. Cytochrom- fehlt im vorhanden oxydase wesentlichen 14. Reduktion von reduziert reduziert
Methylenblau 15. Casein-Hydro- positiv negativ lyse 16. Verflüssigung verflüssigt verflüssigt von Gelatine 17. pH-Wert für Wachstum bei pH 6 Wachstum bei pH 6 das Wachstum bis 9, optimales bis 9, optimales
Wachstum bei pH 8 Wachstum bei pH 8 Eigenschaft Bacillus sp. Baccilus sp.
Y-399 V-7 18. Wachstums- Wachstum bei 15 bis Wachstum bei 15 bis temperatur 35 "C, optimales 45 "C, optimales
Wachstum bei 30 "C Wachstum bei 30 bis 37 0C 19. O2-Relation aerob, kein anaero- aerob, kein anaero bes Wachstum in bes Wachstum in
Glucosebouillon Glucosebouillon 20. Beständigkeit kein Wachstum bei kein Wachstum bei gegen Natrium- einer Konzentration einer Konzentration chlorid von 5% von 5010 21. O-F-Test Weder Säure noch Weder Säure noch Gas
Gas wird aus D- wird aus D-Glucose
Glucose oder aus gebildet.
Maltose gebildet.
22. Katalase schwach schwach d) Fermentation Säure Gas Säure Gas von Kohlenhy draten
L-Arabinose - - -
D-Xylose - - - -
D-Glucose - - i
D-Mannose + - ++
D-Fructose - - +
D-Galactose - - - -
Maltose + - ++ Saceharose - +
Lactose - - - -
Trehalose + - +
D-Sorbit - - - -
D-Mannit - - - -
Inosit - - - -
Glycerin - - -
Stärke + - ++
Ein Vergleich der vorstehend genannten mikrobiologischen Merkmale mit den entsprechenden Angaben in Ber gey's Manual of Determinative Cateriology (7. Auflage) lässt darauf schliessen, dass Bacillus sp.
V-7 entweder zu Bacillus circulans gehört oder ein Stamm ist, der mit Bacillus circulans eng verwandt ist. Andererseits kann Bacillus sp. Y-399 mit keinem der in der vorstehend genannten Literaturstelle beschriebenen Mikroorganismen identifiziert werden, vielmehr hat dieser Stamm eine grosse Ähnlichkeit mit dem in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 98875/1971 beschriebenen Stamm IFO-13 296 und wird daher als zu Bacillus vitellinus gehörend angesehen.
Das Verfahren gemäss der Erfindung wird durchgeführt, indem der Xylostasin bildende Stamm in einem geeigneten Medium gezüchtet wird. Geeignet sind Medien, die routinemässig bei der Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Bacillus verwendet werden. So kann das Medium als Kohlenstoffquellen Kohlenhydrate wie Glucose, Stärke, Dextrin usw. und als Stickstoffquellen verschiedene organische und anorganische Stickstoffverbindungen, z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Aminosäuren, Proteinmaterialien usw., enthalten. Diese Bestandteile des Nährmediums können allein oder in geeigneter Kombination verwendet werden. Ausser diesen Bestandteilen kann das Medium ferner anorganische Stoffe wie Kalium, Natrium, Magnesium, Eisen, Phos phorsäure usw. und wachstumsfördernde Faktoren, z. B. Vitamine, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton und organische Säuren, enthalten.
Der Mikroorganismus kann unter stationären Bedingungen gezüchtet werden, jedoch erfolgt die Kultivierung vorzugsweise unter Schütteln oder unter Belüftung und unter Rühren. Die Bebrütungstemperatur liegt im allgemeinen zwischen 20 und 37 "C. Die Bebrütungsdauer kann etwa 24 bis 90 Stunden betragen. Es ist zu bemerken, dass die optimalen Bedingungen von den Merkmalen des jeweils zu verwendenden, Xylostasin bildenden Stamms abhängen und unter Berücksichtigung dieser Eigenschaften zu wählen sind.
Wenn ein Xylostasin bildender Bacillus-Stamm unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen gezüchtet wird, wird Xylostasin überwiegend im Kulturfiltrat gebildet. Wie die nachstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften zeigen, ist Xylostasin ein wasserlösliches basisches Antibiotikum und kann daher nach den allgemeinen Verfahren zur Isolierung von üblichen wasserlöslichen basischen Antibiotika einschliesslich Neomycin, Paromomycin, Kanamycin und dergleichen isoliert werden.
Beispielsweise kann die Isolierung des Xylostasins vorgenommen werden, indem das Kulturmedium über ein Adsorptionsmittel geleitet und die aktive Verbindung mit einem geeigneten Elutionsmittel desorbiert wird, oder das Antibiotikum kann mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert werden. Zweckmässigerweise ist das erstgenannte Verfahren. Insbesondere lässt sich das Xylostasin in Fällen, in denen das Kulturmedium gereinigt werden soll, leicht auf der alkalischen Seite adsorbieren. Als Elutionsmittel wird vor teilhaft eine wässrige Lösung, die auf einen pH-Wert von we niger als 5, vorzugsweise von nicht mehr als 4, eingestellt worden ist, oder ein Lösungsmittel wie wässriges Aceton oder wässriger Alkohol verwendet. Xylostasin kann auch unter Verwendung eines Ionenaustauschers als Adsorptionsmittel gereinigt werden. Als lonenaustauscher können Kationenaustauschharze, z. B.
Amberlite IRC-50 (Rohm and Haas Co.) verwendet werden. Als Elutionsmittel werden- im allgemeinen wässrige Lösungen einer Säure, eines Alkalis oder eines Salzes verwendet.
Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe pulverförmige Xylostasin kann durch Ionenaustauschchromatographie beispielsweise am Harz Dowex 1 x 2 (OH--Form) (Dow Chemical Co.), Amerlite CG-50 (NH4+-Form, Hersteller Rohm and Haas Co.) und CM-Sephadex (NH4+-Form, Hersteller Pharmacia Fine Chemicals, Schweden), weiter gereinigt werden. Aus dem Eluat, das bei der Reinigung unter Verwendung eines solchen Adsorptionsmittels erhalten wird, wird Xylostasin beispielsweise durch Eindampfen des Eluats zur Trockene vorzugsweise bei niedriger Temperatur oder durch Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels zum Eluat und Abtrennen der Fällung isoliert.
Xylostasin wird in Form eines Salzes mit einer Säure isoliert, wenn das Eluat vor oder nach der Einengung mit einer Säure neutralisiert wird.
Xylastasin kann der biologischen Testung nach üblichen Methoden, beispielsweise nach der Papierscheibenmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testmikroorganismus, unterworfen werden.
Das erfindungsgemäss hergestellte Antibiotikum hat die folgenden physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften:
1. Xylostasin ist eine basische Substanz. Xylostasin, sein Hydrochlorid und Sulfat sind weisse kristalline Pulver. Xylostasin ist in neutraler oder alkalischer Lösung beständig, jedoch in saurer Lösung weniger beständig.
2. Xylostasin hat keinen scharfen Schmelzpunkt. Es zersetzt sich unter Schäumen im Bereich von etwa 150 bis 180 C.
3. Xylostasin ist in Wasser leicht löslich, in Methanol wenig löslich und in organischen Lösungsmitteln wie Aceton, Butanol, Äthylacetat, Benzol, Hexan, Äther usw. unlöslich.
4. Das UV-Spektrum von Xylostasin zeigt keine charakteristische Absorption mit Ausnahme der Endabsorption.
5. Das Infrarotspektrum von Xylostasin in Kaliumbromid zeigt für Aminoglucosid-Antibiotika charakteristische Absorptionsbanden in der Nähe von 3320, 2920, 1590, 1465, 1340, 110 und 1020 cm-1. Da jedoch keine Absorption in der Nähe von 1652 cm-1 vorhanden ist, enthält das Molekül von Xylostasin offensichtlich keine Säureamidbindung.
6. Das NMR-Spektrum (in D2O) von Xylostasin zeigt die folgenden charakteristischen Maxima: o-Werte: 1,36 (q, 1H, axiales Methylenproton), 2,13 (m, 1H, äquitoriales Methylenproton), 5,44 (1H, J = < 1, anomerisches Xyloseproton), 5,70 (d, 1 H, J = 3 bis 4, anomerisches Proton von Neosamin C).
7. Optische Drehung von Xylostasin, gemessen in wässriger Lösung: [a23 + 34 .
8. Farbreaktionen: Xylostasin ist positiv in der Ninhydrin Reaktion, beim Molisch-, Anthron- und Greig-Leaback-Test und negativ beim Sakaguchi-Test, Maltol-Test, Eisen(lllfchlo- ridtest, Biuret-Test und Ehrlich-Test.
9. Die Elementaranalyse einer Xylostasinprobe, die 20 Stunden unter vermindertem Druck bei 110 "C getrocknet worden ist, ergibt 44,18% C, 7,58% H und 11,98% N. Das Molekulargewicht (Neutralisationsäquivalent) beträgt 451.
Strukturuntersuchungen ergeben die Bruttoformel C17H34N4O10 (berechnet: 44,930in C, 7,540/0 H, 12,33% N, Molekulargewicht 454,49).
10. Xylostasin wandert bei der Papierelektrophorese etwa 5 bis 6 cm zur Kathode (Boratpuffer (pH 9,5, 0,025-molar) auf Filterpapier Whatman Nr. 1 bei 2 kV/36 cm für 90 Minuten).
11. Wenn Xylostasin 6 Tage der Methanolyse mit 0,4 N HCI in Methanol bei 22 "C unterworfen wird, werden Methyl D-Xylosid und Neamin gebildet. Wenn Xylostasin 6 Stunden mit 0,5 N Schwefelsäure bei 90 C hydrolysiert wird, werden D-Xylose und Neamin im Hydrolysat nachgewiesen.
12. Das antibiotische Spektrum von Xylostasin ist nachstehend in Tabelle 3 genannt.
Tabelle 3 Hemmende Mindestkonzentrationen nach der Agar-Verdün nungsmethode Testmikroorganismus hemmende Mindest konzentration, Ag/ml Escherichia coli IFO 3044 6,25 Shigella flexneri EW-10 12,5 Proteus vulgaris IFO 3045 50 Pseudomonas aeruginosa IFO 3080 > 50 Staphylococcus aureus FDA 209P 6,25 Bacillus subtilis Pol 219 3,125 Bacillus cereus IFO 3466 50 Bacillus brevis IFO 3331 25 Sarcina lutea IFO 3232 25 Mycobacterium avium IFO 3153 1,6 Mycobacterium avium 3,125 (Streptomycin-resistent) Mycobacterium avium > 50 (Neomycin-resistent) Mycobacterium phlei IFO 3158 1,6 Mycobacterium smegmatis IFO 3083 1,6 FDA: Food and Drug Administration , Washington, D. C., USA PCI: Penicillin Control and Immunology Section, Food and Drug Administration , Washington, D.
C., USA
Als Medien für den Test werden Bouillonagar für die gewöhnliche Bakterien und Glycerin-Bouillonagar für säurefeste Bakterien verwendet.
13. Akute Toxizität: Die akute Toxizität von Xylostasin wurde an Mäusen bei intravenöser Injektion untersucht. Der LD50-Wert für die freie Base beträgt etwa 1000 mg/kg.
14. Anti-Infektionstest mit Mäusen: Wenn eine wässrige Lösung von Xylostasin Mäusen unmittelbar nach einer Infektion mit Escherichia coli 0-111 in einer Einzeldosis von 10 mg/kg subkutan verabreicht wurde, wurde der Tod der Mäuse vollständig verhindert.
Xylostasin und seine pharmazeutisch unbedenklichen Salze mit Säuren sind wirksam gegen Infektionen durch Bakterien. Ihre Toxizität bei Warmblütern (z. B. Mensch, Maus und Ratte) ist äusserst gering. Die Verbindungen können daher unbedenklich und wirksam zur Behandlung von Infektionen durch Bakterien, z. B. Harnweginfektionen, Bronchopneumie, Pyelitis und Mandelentzündung verwendet werden.
Die erfindungsgemäss hergestellten Antibiotika können im allgemeinen parenteral verabreicht werden, jedoch ist auch eine andere Verabreichung möglich. Die Dosierung wird zweckmässig in Abhängigkeit von den Symptomen der zu behandelnden Krankheit bestimmt und liegt beispielsweise im Bereich von etwa 10 bis 40 mg/kg Körpergewicht bei jeder Gabe. Die erfindungsgemäss erhaltenen Antibiotika können in Form von üblichen Arzneimittelzubereitungen, z. B. Injektionslösungen, Tabletten und Salben, verabreicht werden.
Beispiel 1
Ein flüssiges Medium (pH 7,2), das 3% Polypepton, 1% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt, wurde mit Bacilllus sp. Y-399, der auf Glycerin-Bouillon-Agar gezüchtet worden war, geimpft. Die Bebrütung wurde 40 Stunden unter Schütteln bei 28 "C durchgeführt. Diese Impfkultur wurde dann in ein Fermentationsmedium (30 1, pH 7,5), das 1% Glucose, 1% Polypepton, 0,70/0 Fleischextrakt und 0,50/0 Magnesiumchlorid enthielt, in einem 50-1-Tank bei einer Grösse des Inoculums von 10% geimpft. Die Fermentation wurde 66 Stunden bei 88 "C, 100% Belüftung und 200 UpM durchgeführt.
Das erhaltene Kulturmedium wurde mit einer gesättigten wässrigen Oxalsäurelösung auf pH 1 bis 2 eingestellt und dann mit einem Filterhilfsmittel (300 g Hyflo-Super-Cel, Hersteller Johns-Manville Products Co.) filtriert. Das Filtrat wurde auf pH 7 eingestellt und durch eine Säule von 2 1 des Kationenaustauschharzes Amberlite IRC-50 (NH4+-Form) geleitet, wobei das aktive Produkt am Ionenaustauscherharz adsorbiert wurde. Das Harz wurde zuerst mit Wasser gewaschen und dann mit 50/obigem wässrigem Ammoniak eluiert.
Die aktiven Fraktionen (2,5 1) wurden zusammengegossen und durch eine Säule von 600 ml Aktivkohle für Chromatographiezwecke geleitet, wobei die aktive Verbindung adsorbiert wurde. Die Aktivkohlesäule wurde mit Wasser gewaschen und dann mit einer wässrigen 0,3 N HC1-Lösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, mit dem Anionaustauscherharz Amberlite IR 45 (Hersteller Rohm and Haas Co., OH--Form) neutralisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Abschliessend wurde das Konzentrat gefriergetrocknet, wobei 5,6 g eines rohen Pulvers, das etwa 30 /0 Xylostasin enthielt, erhalten wurden.
Reinigung
Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe Produkt (9,6 g) wurde in Wasser gelöst und an einer Säule von
150 ml des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50 (Hersteller Rohm and Haas Co., NH4+-Form) adsorbiert.
Nach einer Wäsche mit Wasser wurde die Säule mit 0,2 N Ammoniakwasser eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Konzentrat wurde Aceton zugesetzt. Die gebildete Fällung wurde abfiltriert. Hierbei wurden 3,0 g eines hellbraunen Pulvers mit einem Xylostasingehalt von etwa 900/0 erhalten. Dieses Pulver wurde in Wasser gelöst und an einer Säule (3 cm x 90 cm) des Kationenaustauscherharzes CM-Sephadex C-25, NH4+-Form, adsorbiert. Die Säule wurde dann mit wäss rigem Ammoniak unter Anwendung der Gradienten-Elution (von 0 bis 1,7 N) eluiert. Die aktiven Fraktionen, die Xylosta sin allein enthielten, wurden zusammengegossen und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2,4 g weisses pulverförmiges Xylostasin erhalten wurden.
Herstellung des Sulfats
Eine wässrige Lösung des in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Xylostasins (freie Base) wurde mit 2 N
Schwefelsäure auf pH 4 bis 5 eingestellt und durch eine Ak tivkohlensäule geleitet. Die Säule wurde mit 0,03 N Schwefel säure eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammenge gossen, mit dem Anionenaustauscherharz Amberlite IR45 (OH--Form) auf pH 6,0 eingestellt und unter vermindertem
Druck eingeengt. Dem Konzentrat wurde Aceton zugesetzt.
Die gebildete Fällung wurde abfiltriert und unter verminder tem Druck getrocknet. Hierbei wurde Xylostasinsulfat als weisses Pulver erhalten.
Beispiel 2
Ein flüssiges Medium (pH 7,2), das 3 /0 Polypepton, 1% Fleischextrakt und 0,50/c Natriumchlorid enthielt, wurde mit Bacillus sp. V-7 geimpft, der auf Glycerin-Bouillon-Schrägagar gezüchtet worden war, worauf 40 Minuten unter Schütteln bei 28 "C bebrütet wurde. Die erhaltene Impfkultur wurde dann in einen 50-1-Behälter geimpft, der 30 1 eines Fermentationsmediums (pH 8) enthielt, das 1% 0/o Glucose, 0,7% Polypepton, 0,50/0 Fleischextrakt und 0,3% Natriumchlorid bei einer Inoculumgrösse von 10% enthielt. Die Fermentation wurde 66 Stunden bei 28 "C mit 100% Belüftung bei 200 UpM durchgeführt.
Der erhaltenen Fermentationsbrühe wurden 150 ml einer 40/obigen wässrigen Lösung eines Agglutinationsmittels (Primafloc C-7, Hersteller Rohm and Haas Co.) und 300 g Filterhilfsmittel (Hyflo-Super-Cel, Hersteller Johns-Manville Products Co.) zugesetzt. Das Gemisch wurde mit einer gesättigten wässrigen Oxalsäurelösung auf pH 1 bis 2 eingestellt und filtriert. Das Filtrat (24 1) wurde auf pH 8,5 bis 9,5 eingestellt und 30 Minuten mit etwa 1% Aktivkohle gerührt, wodurch die aktive Substanz im Filtrat fast ausschliesslich an der Kohle adsorbiert wurde. Die Aktivkohle wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen und ind 3 1 700/obigem wässrigem Methanol suspendiert. Die Suspension wurde zur Extraktion der aktiven Substanz mit 4 N Salzsäure auf pH 2 eingestellt. Die Aktivkohle wurde abfiltriert.
Das Methanol wurde vom Filtrat unter vermindertem Druck abdestilliert, worauf das Filtrat mit dem Anionenaustauscherharz Amberlite IR45 (OH--Form) neutralisiert wurde. Die Lösung wurde auf pH 7 eingestellt und dann durch eine Kationenaustauschersäule (Amberlite CG-50, NH4+-Form) geleitet, wobei die aktive Substanz adsorbiert wurde. Die Säule wurde mit wässrigem Ammoniak unter Anwendung der Gradienten-Elution (Konzentration von 0 bis 10%) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Aceton zugesetzt wurde. Hierbei wurden etwa 5,7 g rohes Xylostasin (Xylostasingehalt etwa 300/0) erhalten.
Reinigung
Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe Produkt (9,6 g) wurde der in Beispiel 1 beschriebenen Behandlung unterworfen, wobei 2,5 g Xylostasin als weisses Pulver erhalten wurden.
Beispiel 3
Ein flüssiges Kulturmedium (pH 7,2), das 3 /0 Polypepton,
1% Fleischextrakt und 0,50/0 Natriumchlorid enthielt, wurde mit Bacillus sp. Y-399 geimpft, der auf Glucose-Bouillon Schrägagar gezüchtet worden war, und 40 Stunden bei 28 "C unter Schütteln bebrütet.
Mit der Impfkultur wurden 30 1 eines Fermentationsmediums (pH 7,5) geimpft, das 2% Dextrin, 0,50/0 lösliche Stärke,
1,2% Polypepton, 0,70/0 Fleischextrakt und 0,5% Magnesium sulfat in einem 501-Fermenter bei einer Inoculumgrösse von
10% enthielt. Die Kultivierung wurde bei 28 "C, 100% Belüf tung und 200 UpM durchgeführt. Das erhaltene Kulturme dium wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgear beitet, wobei 22,1 g eines rohen Pulvers, das etwa 70% Xylo stasin enthielt, erhalten wurden.
The invention relates to a process for the production of a new aminoglycoside antibiotic called xylostasin, which according to scientific nomenclature is called C-13-xylofuranosyl- (1 5> C- [a-2,6-diamino-2,6-dideoxy-D- glucopyranosylX 1 <4)} 2-deoxystreptamine and has the following formula:
EMI1.1
The invention further comprises the preparation of pharmaceutically acceptable salts of xylostasin with acids by culturing a microorganism of the genus Bacillus.
According to the invention, the new antibiotics are produced by a process which is characterized in that a microorganism of the genus Bacillus, which is capable of producing the antibiotic, is cultivated in a culture medium which contains the nutrient sources necessary for the growth of the microorganism, until the antibiotic has accumulated and the antibiotic is isolated from the culture medium.
The culture medium will generally contain sources of assimilable carbon and utilizable nitrogen, along with other sources of nutrients necessary for the growth of the microorganism.
All strains of the genus Bacillus which are able to produce the desired antibiotic and mutants obtained by spontaneous and induced mutation of these microorganisms are suitable as xylostasin-producing strains for the purposes of the invention. In order to determine whether a microorganism is able to produce xylostasin, the selection method described below can be used, for example.
A glucose broth medium is inoculated with Bacillus strains isolated from the natural sources of these strains or taken from stock cultures of these strains. The cultivation is carried out for 3 to 4 days with shaking at 28 ° C. After it has been confirmed that the culture medium obtained shows antibacterial activity against a suitable test microorganism, for example Bacillus subtilis, Escherichia coli or Staphylococcus aureus, about 20 ml of the culture filtrate is adjusted to pH 9 to 10 with alkali and then passed through activated carbonic acid (0.2 g). The column is washed with about 10 ml of water and then eluted with 10 ml of 0.1 N HCl. The eluate is neutralized and under The concentrate is purified by paper electrophoresis on Whatman No. 1 filter paper (W. & R.
Balston Co., USA) in a borate buffer (pH 9.5, 0.025 molar) with a voltage gradient of 2 kV / 36 cm for 90 minutes. The stain of xylostasin can be bioautographed against a suitable microorganism, e.g. B. Bacillus subtilis, as well as by a color reaction using peptide reagent. The xylostasin is found 5 to 6 cm from the cathode.
Suitable microorganisms for the method according to the invention are, for example, Bacillus sp. Y-399 and Bacillus sp. V-7, which are deposited under the following access numbers:
Table 1
ATCC IFO Bacillus sp. Y-399 21 932 13 321 Bacillus sp. V-7 21 933 13 320 ATCC: American Type Culture Collection, Maryland, USA IFO: Institute for Fermentation, Osaka, Osaka, Japan Bacillus sp. Y-399 was obtained from the soil in Kyoto, Japan and Bacillus sp. V-7 isolated from the ground in Tokyo, Japan. These microorganisms have the microbiological properties shown in Table 2 below.
Table 2 property Bacillus sp. Baccilus sp.
Y-399 V-7 a) Appearance 1. Shape and size of rods, 0.8 x 2.4 rods 0.8 x 2.4 to 3.4 y with rounded to 3.4 u, with rounded ends rounded
Ends 2. Pleomorphism occurs singly, occurs singly and in pairs, and occasionally in pairs.
3. Mobility mobile, with mobile, with and flagellum peritricha peritricha 4. sporogenesis spores elliptical spores elliptical or cylindrical, or cylindrical, central to sub-central to sub-terminal, sporan-terminal, sporangium swollen and generally swollen and club-shaped club-shaped 5. Gram staining differently different
Property Bacillus sp. Baccilus sp.
Y-399 V-7
6. Acid resistance not acid resistance not acid resistance b) Growth characteristics
1. Broth agar- spreading, spreading, flat smooth flat surface- Smooth flat surface, closed, flat, shiny, translucent, closed, through yellow and slimy; seeming, grayish
Microcolonies are white and slimy; movable. movable.
2. Broth- moderate growth, moderate growth,
Slant agar rhizoid, flat, rhizoid, flat, shiny, translucent, shining grayish and very white and very slimy slimy 3. Broth moderate growth, moderate growth, no surface growth, no surface growth, cloudy; growth, cloudy;
Cells are yellow. Cells are grayish-white.
4. Potato moderate growth, good growth, spreading, spreading, light yellow greyish-white 5. Litmus milk neutral, peptonized and reduced c) Physiological
Features 1. Reduction from not reduced not reduced
Nitrates 2. Denitration negative 3. MR test negative negative 4. VP test negative negative 5. Indole formation no no 6. Formation of yes yes
Hydrogen sulphide 7. Hydrolysis weakly hydro- weakly hydrolysed of starch lysed 8. Utilization no utilization no utilization of citrate 9. utilization no utilization no utilization of nitrates 10. utilization no utilization no utilization of ammonia 11. pigment formation A pigment not used in water soluble yellow formation
Pigment (caroti noid) is formed intra-cellularly.
12. Urease activity negative negative 13. Cytochrome absent in the present oxidase essential 14. Reduction of reduced reduced
Methylene blue 15. Casein hydro- positive negative lysis 16. Liquefaction liquefied liquefied by gelatine 17. pH value for growth at pH 6 growth at pH 6 growth up to 9, optimal up to 9, optimal
Growth at pH 8 Growth at pH 8 Property Bacillus sp. Baccilus sp.
Y-399 V-7 18. Growth- growth at 15 to growth at 15 to temperature 35 "C, optimal 45" C, optimal
Growth at 30 "C Growth at 30 to 37 0C 19. O2 ratio aerobic, no anaero-aerobic, no anaerobic growth in bes growth in
Glucose broth Glucose broth 20. Stability no growth with no growth against sodium- a concentration of 5% chloride of 5010 21. O-F-Test Neither acid nor acid nor gas
Gas becomes D- becomes D-glucose
Glucose or formed from.
Maltose formed.
22. Catalase weak weak d) Fermentation acid gas acid gas from carbohydrates
L-arabinose - - -
D-xylose - - - -
D-glucose - - i
D-mannose + - ++
D-fructose - - +
D-galactose - - - -
Maltose + - ++ Saceharose - +
Lactose - - - -
Trehalose + - +
D-sorbitol - - - -
D-mannitol - - - -
Inositol - - - -
Glycerine - - -
Strength + - ++
A comparison of the above-mentioned microbiological characteristics with the corresponding information in Bergey's Manual of Determinative Cateriology (7th edition) suggests that Bacillus sp.
V-7 either belongs to Bacillus circulans or is a strain closely related to Bacillus circulans. On the other hand, Bacillus sp. Y-399 cannot be identified with any of the microorganisms described in the above-mentioned reference, rather this strain has a great similarity with the strain IFO-13 296 described in Japanese Patent Publication No. 98875/1971 and is therefore considered to belong to Bacillus vitellinus.
The method according to the invention is carried out in that the xylostasin-producing strain is grown in a suitable medium. Media that are routinely used in the cultivation of microorganisms of the genus Bacillus are suitable. Thus, the medium can contain, as carbon sources, carbohydrates such as glucose, starch, dextrin, etc. B. ammonium sulfate, ammonium chloride, amino acids, protein materials, etc. contain. These components of the nutrient medium can be used alone or in a suitable combination. In addition to these components, the medium can also contain inorganic substances such as potassium, sodium, magnesium, iron, phosphoric acid, etc. and growth-promoting factors such. B. vitamins, meat extract, yeast extract, peptone and organic acids.
The microorganism can be cultivated under stationary conditions, but cultivation is preferably carried out with shaking or with aeration and stirring. The incubation temperature is generally between 20 and 37 "C. The incubation time can be around 24 to 90 hours. It should be noted that the optimum conditions depend on the characteristics of the xylostasin-producing strain to be used and are selected taking these properties into account are.
When a xylostasin-producing Bacillus strain is grown under the conditions described above, xylostasin is mainly produced in the culture filtrate. As shown by the physicochemical properties described below, xylostasin is a water-soluble basic antibiotic and therefore can be isolated by the general methods for isolating common water-soluble basic antibiotics including neomycin, paromomycin, kanamycin and the like.
For example, the isolation of the xylostasin can be done by passing the culture medium over an adsorbent and desorbing the active compound with a suitable eluant, or the antibiotic can be extracted with a suitable solvent. The first-mentioned procedure is expedient. In particular, in cases where the culture medium is to be purified, the xylostasin can be easily adsorbed on the alkaline side. The eluent used is advantageously an aqueous solution which has been adjusted to a pH of less than 5, preferably not more than 4, or a solvent such as aqueous acetone or aqueous alcohol. Xylostasin can also be purified using an ion exchanger as an adsorbent. Cation exchange resins such. B.
Amberlite IRC-50 (Rohm and Haas Co.) can be used. In general, aqueous solutions of an acid, an alkali or a salt are used as eluents.
The crude powdery xylostasin obtained in the manner described above can be obtained by ion exchange chromatography, for example, on the resin Dowex 1 x 2 (OH - form) (Dow Chemical Co.), Amerlite CG-50 (NH4 + form, manufacturer Rohm and Haas Co.) and CM-Sephadex (NH4 + form, manufacturer Pharmacia Fine Chemicals, Sweden), can be further purified. Xylostasin is isolated from the eluate obtained during purification using such an adsorbent, for example by evaporating the eluate to dryness, preferably at low temperature, or by adding a water-miscible organic solvent to the eluate and separating the precipitate.
Xylostasin is isolated in the form of a salt with an acid if the eluate is neutralized with an acid before or after the concentration.
Xylastasin can be subjected to biological testing by customary methods, for example by the paper disk method using Bacillus subtilis PCI 219 as the test microorganism.
The antibiotic produced according to the invention has the following physical, chemical and biological properties:
1. Xylostasin is a basic substance. Xylostasin, its hydrochloride and sulfate are white crystalline powders. Xylostasin is stable in neutral or alkaline solution, but less stable in acidic solution.
2. Xylostasin does not have a sharp melting point. It decomposes with foaming in the range of about 150 to 180 C.
3. Xylostasin is easily soluble in water, sparingly soluble in methanol and insoluble in organic solvents such as acetone, butanol, ethyl acetate, benzene, hexane, ether, etc.
4. The UV spectrum of xylostasin shows no characteristic absorption except for the final absorption.
5. The infrared spectrum of xylostasin in potassium bromide shows absorption bands characteristic of aminoglucoside antibiotics in the vicinity of 3320, 2920, 1590, 1465, 1340, 110 and 1020 cm-1. However, since there is no absorption near 1652 cm-1, the molecule of xylostasin does not appear to contain an acid amide bond.
6. The NMR spectrum (in D2O) of xylostasin shows the following characteristic maxima: o-values: 1.36 (q, 1H, axial methylene proton), 2.13 (m, 1H, equitorial methylene proton), 5.44 ( 1H, J = <1, anomeric xylose proton), 5.70 (d, 1H, J = 3 to 4, anomeric proton of neosamine C).
7. Optical rotation of xylostasin, measured in aqueous solution: [a23 + 34.
8. Color reactions: xylostasin is positive in the ninhydrin reaction, in the Molisch, Anthron and Greig Leaback tests and negative in the Sakaguchi test, maltol test, iron (Illfchloride test, biuret test and Ehrlich test.
9. The elemental analysis of a xylostasin sample which has been dried under reduced pressure at 110 "C for 20 hours gives 44.18% C, 7.58% H and 11.98% N. The molecular weight (neutralization equivalent) is 451.
Structural investigations give the gross formula C17H34N4O10 (calculated: 44.930in C, 7.540 / 0 H, 12.33% N, molecular weight 454.49).
10. Xylostasin migrates about 5 to 6 cm to the cathode during paper electrophoresis (borate buffer (pH 9.5, 0.025 molar) on Whatman No. 1 filter paper at 2 kV / 36 cm for 90 minutes).
11. If xylostasin is subjected to methanolysis with 0.4 N HCl in methanol at 22 "C for 6 days, methyl D-xyloside and neamine are formed. If xylostasin is hydrolyzed for 6 hours with 0.5 N sulfuric acid at 90 C, D -Xylose and neamine detected in the hydrolyzate.
12. The antibiotic spectrum of xylostasin is given in Table 3 below.
Table 3 Minimum inhibitory concentrations according to the agar dilution method Test microorganism minimum inhibitory concentration, Ag / ml Escherichia coli IFO 3044 6.25 Shigella flexneri EW-10 12.5 Proteus vulgaris IFO 3045 50 Pseudomonas aeruginosa IFO 3080> 50 Staphylococcus aure 6us FDA 209, 25 Bacillus subtilis Pol 219 3.125 Bacillus cereus IFO 3466 50 Bacillus brevis IFO 3331 25 Sarcina lutea IFO 3232 25 Mycobacterium avium IFO 3153 1.6 Mycobacterium avium 3.125 (Streptomycin-resistant) Mycobacterium avium> 50 (Neomycin-resistant) Mycobacterium phlei IFO 3158 , 6 Mycobacterium smegmatis IFO 3083 1.6 FDA: Food and Drug Administration, Washington, DC, USA PCI: Penicillin Control and Immunology Section, Food and Drug Administration, Washington, D.
C., USA
The media used for the test are bouillon agar for common bacteria and glycerin bouillon agar for acid-fast bacteria.
13. Acute toxicity: The acute toxicity of xylostasin was investigated in mice after intravenous injection. The LD50 value for the free base is around 1000 mg / kg.
14. Anti-infection test with mice: When an aqueous solution of xylostasin was subcutaneously administered to mice immediately after infection with Escherichia coli 0-111 in a single dose of 10 mg / kg, the death of the mice was completely prevented.
Xylostasin and its pharmaceutically safe salts with acids are effective against infections caused by bacteria. Their toxicity in warm-blooded animals (e.g. humans, mice and rats) is extremely low. The compounds can therefore be used safely and effectively for the treatment of infections caused by bacteria, e.g. Urinary tract infections, bronchopneumonia, pyelitis and tonsillitis can be used.
The antibiotics prepared according to the invention can generally be administered parenterally, but other administration is also possible. The dosage is expediently determined as a function of the symptoms of the disease to be treated and is, for example, in the range from about 10 to 40 mg / kg body weight for each dose. The antibiotics obtained according to the invention can be in the form of conventional pharmaceutical preparations, e.g. B. injection solutions, tablets and ointments are administered.
example 1
A liquid medium (pH 7.2) containing 3% polypeptone, 1% meat extract and 0.5% sodium chloride was mixed with Bacilllus sp. Y-399 grown on glycerin broth agar was inoculated. Incubation was carried out for 40 hours with shaking at 28 "C. This inoculum was then transferred to a fermentation medium (30 1, pH 7.5) containing 1% glucose, 1% polypeptone, 0.70 / 0 meat extract and 0.50 / 0 magnesium chloride, inoculated in a 50-1 tank with an inoculum size of 10%. The fermentation was carried out for 66 hours at 88 ° C., 100% aeration and 200 rpm.
The obtained culture medium was adjusted to pH 1 to 2 with a saturated aqueous oxalic acid solution and then filtered with a filter aid (300 g of Hyflo-Super-Cel, manufactured by Johns-Manville Products Co.). The filtrate was adjusted to pH 7 and passed through a column of 2 l of the cation exchange resin Amberlite IRC-50 (NH4 + form), the active product being adsorbed on the ion exchange resin. The resin was washed first with water and then eluted with 50% aqueous ammonia.
The active fractions (2.5 l) were pooled and passed through a column of 600 ml of activated carbon for chromatographic purposes, whereby the active compound was adsorbed. The activated charcoal column was washed with water and then eluted with an aqueous 0.3 N HCl solution. The active fractions were pooled, neutralized with the anion exchange resin Amberlite IR 45 (manufactured by Rohm and Haas Co., OH - Form) and concentrated under reduced pressure. The concentrate was then freeze-dried, 5.6 g of a crude powder containing about 30/0 xylostasin being obtained.
cleaning
The crude product obtained in the manner described above (9.6 g) was dissolved in water and passed on a column of
150 ml of the cation exchange resin Amberlite CG-50 (manufacturer Rohm and Haas Co., NH4 + form) was adsorbed.
After washing with water, the column was eluted with 0.2N ammonia water. The active fractions were collected and concentrated under reduced pressure. Acetone was added to the concentrate. The precipitate formed was filtered off. This gave 3.0 g of a light brown powder with a xylostase content of about 900/0. This powder was dissolved in water and adsorbed on a column (3 cm × 90 cm) of the cation exchange resin CM-Sephadex C-25, NH4 + form. The column was then eluted with aqueous ammonia using gradient elution (from 0 to 1.7 N). The active fractions containing xylostasin alone were pooled and evaporated to dryness under reduced pressure to give 2.4 g of white powdery xylostasin.
Manufacture of the sulfate
An aqueous solution of the xylostasin (free base) obtained in the manner described above was treated with 2N
Sulfuric acid adjusted to pH 4 to 5 and passed through an Ak tivkohlensäule. The column was eluted with 0.03 N sulfuric acid. The active fractions were poured together, adjusted to pH 6.0 with the anion exchange resin Amberlite IR45 (OH form) and reduced
Pressure restricted. Acetone was added to the concentrate.
The precipitate formed was filtered off and dried under reduced pressure. Here, xylostasin sulfate was obtained as a white powder.
Example 2
A liquid medium (pH 7.2) containing 3/0 polypeptone, 1% meat extract and 0.50 / c sodium chloride was treated with Bacillus sp. V-7, which had been grown on glycerine broth agar slants, was then incubated for 40 minutes with shaking at 28 ° C. The resulting inoculum was then inoculated into a 50 l container containing 30 l of a fermentation medium (pH 8 ), which contained 1% 0 / o glucose, 0.7% polypeptone, 0.50 / 0 meat extract and 0.3% sodium chloride with an inoculum size of 10%. The fermentation was carried out for 66 hours at 28 "C with 100% aeration carried out at 200 rpm.
To the fermentation broth obtained, 150 ml of a 40% above aqueous solution of an agglutinating agent (Primafloc C-7, manufactured by Rohm and Haas Co.) and 300 g of filter aid (Hyflo-Super-Cel, manufactured by Johns-Manville Products Co.) were added. The mixture was adjusted to pH 1 to 2 with a saturated aqueous oxalic acid solution and filtered. The filtrate (24 l) was adjusted to pH 8.5 to 9.5 and stirred for 30 minutes with about 1% activated charcoal, as a result of which the active substance in the filtrate was almost exclusively adsorbed on the charcoal. The activated charcoal was separated off, washed with water and suspended in 3 1,700 / above aqueous methanol. The suspension was adjusted to pH 2 with 4N hydrochloric acid to extract the active substance. The activated carbon was filtered off.
The methanol was distilled off from the filtrate under reduced pressure, whereupon the filtrate was neutralized with the anion exchange resin Amberlite IR45 (OH form). The solution was adjusted to pH 7 and then passed through a cation exchange column (Amberlite CG-50, NH4 + form), whereby the active substance was adsorbed. The column was eluted with aqueous ammonia using gradient elution (concentration from 0 to 10%). The active fractions were collected and concentrated under reduced pressure, after which acetone was added. About 5.7 g of crude xylostasin (xylostasin content about 300/0) were obtained.
cleaning
The crude product (9.6 g) obtained in the manner described above was subjected to the treatment described in Example 1, whereby 2.5 g of xylostasin were obtained as a white powder.
Example 3
A liquid culture medium (pH 7.2), the 3/0 polypepton,
1% meat extract and 0.50 / 0 sodium chloride contained, was with Bacillus sp. Y-399, which had been grown on glucose broth agar slant, and incubated for 40 hours at 28 ° C. with shaking.
30 l of a fermentation medium (pH 7.5) containing 2% dextrin, 0.50 / 0 soluble starch,
1.2% polypeptone, 0.70 / 0 meat extract and 0.5% magnesium sulfate in a 501 fermenter with an inoculum size of
Contained 10%. The cultivation was carried out at 28 ° C., 100% aeration and 200 rpm. The culture medium obtained was worked up in the manner described in Example 1, giving 22.1 g of a crude powder containing about 70% xylostasin were.