Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines als Xylostasin bezeichneten neuen Aminoglykosidantibiotikums, das nach der wissenschaftlichen Nomenklatur die Bezeichnung C-I3-Xylofuranosyl-( 1 5 > C-[a-2,6-diamino- 2,6-didesoxy-D-glucopyranosylX 1 < 4)}2-desoxystreptamin und die folgende Formel hat:
EMI1.1
Die Erfindung umfasst ferner die Herstellung von pharmazeutisch unbedenklichen Salzen von Xylostasin mit Säuren, durch Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus.
Gemäss der Erfindung erfolgt die Herstellung der neuen Antibiotika nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der das Antibiotikum zu bilden vermag, in einem Kulturmedium, das die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendigen Nährstoffquellen enthält, züchtet, bis das Antibiotikum sich angereichert hat, und das Antibiotikum vom Kulturmedium isoliert.
Das Kulturmedium wird im allgemeinen Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und von verwertbarem Stickstoff nebst anderen für das Wachstum des Mikroorganismus notwendigen Nährstoffquellen enthalten.
Als Xylostasin bildende Stämme eignen sich für die Zwecke der Erfindung alle Stämme der Gattung Bacillus, die das gewünschte Antibiotikum zu bilden vermögen, und durch spontane und induzierte Mutation dieser Mikroorganismen erhaltene Mutanten. Um festzustellen, ob ein Mikroorganismus Xylostasin zu bilden vermag, kann beispielsweise die nachstehend beschriebene Auswahlmethode angewandt werden.
Ein Glucose-Bouillon-Medium wird mit Bacillus-Stämmen, die von den natürlichen Quellen dieser Stämme isoliert oder von Vorratskulturen dieser Stämme entnommen wurden, geimpft. Die Kultivierung wird 3 bis 4 Tage unter Schütteln bei 28 "C durchgeführt. Nachdem bestätigt worden ist, dass das erhaltene Kulturmedium antibakterielle Wirkung gegen einen geeigneten Testmikroorganismus, z. B. Bacillus subtilis, Escherichia coli oder Staphylococcus aureus, zeigt, werden etwa 20 ml des Kulturfiltrats mit Alkali auf pH 9 bis 10 eingestellt und dann durch eine Aktivkohlesäure (0,2 g) geleitet. Die Säule wird mit etwa 10 ml Wasser gewaschen und dann mit 10 ml 0,1 N HCI eluiert. Das Eluat wird neutralisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird durch Papierelektrophorese auf Filterpapier Whatman Nr. 1 (W. & R.
Balston Co., USA) in einem Boratpuffer (pH 9,5, 0,025-molar) bei einem Spannungsgradienten von 2 kV/36 cm für 90 Minuten analysiert. Der Flecken von Xylostasin kann durch Bioautographie gegen einen geeigneten Mikroorganismus, z. B. Bacillus subtilis, sowie auch durch eine Farbreaktion unter Verwendung von Peptidreagens nachgewiesen werden. Das Xylostasin wird 5 bis 6 cm zur Kathode festgestellt.
Als Mikroorganismen eignen sich für das Verfahren gemäss der Erfindung beispielsweise Bacillus sp. Y-399 und Bacillus sp. V-7, die unter den folgenden Zugangsnummern hinterlegt sind:
Tabelle 1
ATCC IFO Bacillus sp. Y-399 21 932 13 321 Bacillus sp. V-7 21 933 13 320 ATCC: American Type Culture Collection , Maryland, USA IFO: Institute for Fermentation, Osaka , Osaka, Japan Bacillus sp. Y-399 wurde vom Boden in Kyoto, Japan, und Bacillus sp. V-7 vom Boden in Tokyo, Japan, isoliert. Diese Mikroorganismen haben die nachstehend in Tabelle 2 genannten mikrobiologischen Eigenschaften.
Tabellle 2 Eigenschaft Bacillus sp. Baccilus sp.
Y-399 V-7 a) Aussehen 1. Form und Grösse Stäbchen, 0,8 x 2,4 Stäbchen 0,8 x 2,4 bis 3,4 y mit abge- bis 3,4 u, mit rundeten Enden abgerundeten
Enden 2. Pleomorphismus tritt einzeln auf tritt einzeln und paarweise auf und gelegentlich paarweise auf.
3. Beweglichkeit beweglich, mit beweglich, mit und Flagellum Peritricha Peritricha 4. Sporogenese Sporen eliptisch Sporen eliptisch oder zylindrisch, oder zylindrisch, zentral bis sub- zentral bis sub terminal, Sporan- terminal, Sporan gium gequollen und geium gequollen und keulenförmig keulenförmig 5. Gram-Färbung unterschiedlich unterschiedlich
Eigenschaft Bacillus sp. Baccilus sp.
Y-399 V-7
6. Säurefestig- nicht säurefest nicht säurefest keit b) Wachstumsmerk male
1. Bouillonagar- sich ausbreitend, sich ausbreitend, platte glatte flache Ober- glatte flache Ober fläche, geschlossen, fläche, glänzend, durchscheinend, geschlossen, durch gelb und schleimig; scheinend, gräulich
Mikrokolonien sind weiss und schleimig; beweglich. beweglich.
2. Bouillon- mässiges Wachstum, mässiges Wachstum,
Schrägagar rhizoid, flach, rhizoid, flach, glänzend, durch- glänzend, gräulich scheinend und sehr weiss und sehr schleimig schleimig 3. Bouillon mässiges Wachstum, mässiges Wachstum, kein Oberflächen- kein Oberflächen wachstum, trübe; wachstum, trübe;
Zellen sind gelb. Zellen sind gräu lich-weiss.
4. Kartoffel mässiges Wachstum, gutes Wachstum, sich ausbreitend, sich ausbreitend, hellgelb gräulich-weiss 5. Lackmusmilch neutral, peptoni- reduziert siert und reduziert c) Physiologische
Merkmale 1. Reduktion von nicht reduziert nicht reduziert
Nitraten 2. Denitrierung negativ 3. MR-Test negativ negativ 4. VP-Test negativ negativ 5. Indolbildung nein nein 6. Bildung von ja ja
Schwefelwasser stoff 7. Hydrolyse schwach hydro- schwach hydrolysiert von Stärke lysiert 8. Verwertung keine Verwertung keine Verwertung von Citrat 9. Verwertung keine Verwertung keine Verwertung von Nitraten 10. Verwertung keine Verwertung keine Verwertung von Ammoniak 11. Pigmentbildung Ein in Wasser un- keine Pigment lösliches gelbes bildung
Pigment (caroti noid) wird intra zellulär gebildet.
12. Urease-Aktivität negativ negativ 13. Cytochrom- fehlt im vorhanden oxydase wesentlichen 14. Reduktion von reduziert reduziert
Methylenblau 15. Casein-Hydro- positiv negativ lyse 16. Verflüssigung verflüssigt verflüssigt von Gelatine 17. pH-Wert für Wachstum bei pH 6 Wachstum bei pH 6 das Wachstum bis 9, optimales bis 9, optimales
Wachstum bei pH 8 Wachstum bei pH 8 Eigenschaft Bacillus sp. Baccilus sp.
Y-399 V-7 18. Wachstums- Wachstum bei 15 bis Wachstum bei 15 bis temperatur 35 "C, optimales 45 "C, optimales
Wachstum bei 30 "C Wachstum bei 30 bis 37 0C 19. O2-Relation aerob, kein anaero- aerob, kein anaero bes Wachstum in bes Wachstum in
Glucosebouillon Glucosebouillon 20. Beständigkeit kein Wachstum bei kein Wachstum bei gegen Natrium- einer Konzentration einer Konzentration chlorid von 5% von 5010 21. O-F-Test Weder Säure noch Weder Säure noch Gas
Gas wird aus D- wird aus D-Glucose
Glucose oder aus gebildet.
Maltose gebildet.
22. Katalase schwach schwach d) Fermentation Säure Gas Säure Gas von Kohlenhy draten
L-Arabinose - - -
D-Xylose - - - -
D-Glucose - - i
D-Mannose + - ++
D-Fructose - - +
D-Galactose - - - -
Maltose + - ++ Saceharose - +
Lactose - - - -
Trehalose + - +
D-Sorbit - - - -
D-Mannit - - - -
Inosit - - - -
Glycerin - - -
Stärke + - ++
Ein Vergleich der vorstehend genannten mikrobiologischen Merkmale mit den entsprechenden Angaben in Ber gey's Manual of Determinative Cateriology (7. Auflage) lässt darauf schliessen, dass Bacillus sp.
V-7 entweder zu Bacillus circulans gehört oder ein Stamm ist, der mit Bacillus circulans eng verwandt ist. Andererseits kann Bacillus sp. Y-399 mit keinem der in der vorstehend genannten Literaturstelle beschriebenen Mikroorganismen identifiziert werden, vielmehr hat dieser Stamm eine grosse Ähnlichkeit mit dem in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 98875/1971 beschriebenen Stamm IFO-13 296 und wird daher als zu Bacillus vitellinus gehörend angesehen.
Das Verfahren gemäss der Erfindung wird durchgeführt, indem der Xylostasin bildende Stamm in einem geeigneten Medium gezüchtet wird. Geeignet sind Medien, die routinemässig bei der Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Bacillus verwendet werden. So kann das Medium als Kohlenstoffquellen Kohlenhydrate wie Glucose, Stärke, Dextrin usw. und als Stickstoffquellen verschiedene organische und anorganische Stickstoffverbindungen, z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Aminosäuren, Proteinmaterialien usw., enthalten. Diese Bestandteile des Nährmediums können allein oder in geeigneter Kombination verwendet werden. Ausser diesen Bestandteilen kann das Medium ferner anorganische Stoffe wie Kalium, Natrium, Magnesium, Eisen, Phos phorsäure usw. und wachstumsfördernde Faktoren, z. B. Vitamine, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton und organische Säuren, enthalten.
Der Mikroorganismus kann unter stationären Bedingungen gezüchtet werden, jedoch erfolgt die Kultivierung vorzugsweise unter Schütteln oder unter Belüftung und unter Rühren. Die Bebrütungstemperatur liegt im allgemeinen zwischen 20 und 37 "C. Die Bebrütungsdauer kann etwa 24 bis 90 Stunden betragen. Es ist zu bemerken, dass die optimalen Bedingungen von den Merkmalen des jeweils zu verwendenden, Xylostasin bildenden Stamms abhängen und unter Berücksichtigung dieser Eigenschaften zu wählen sind.
Wenn ein Xylostasin bildender Bacillus-Stamm unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen gezüchtet wird, wird Xylostasin überwiegend im Kulturfiltrat gebildet. Wie die nachstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften zeigen, ist Xylostasin ein wasserlösliches basisches Antibiotikum und kann daher nach den allgemeinen Verfahren zur Isolierung von üblichen wasserlöslichen basischen Antibiotika einschliesslich Neomycin, Paromomycin, Kanamycin und dergleichen isoliert werden.
Beispielsweise kann die Isolierung des Xylostasins vorgenommen werden, indem das Kulturmedium über ein Adsorptionsmittel geleitet und die aktive Verbindung mit einem geeigneten Elutionsmittel desorbiert wird, oder das Antibiotikum kann mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert werden. Zweckmässigerweise ist das erstgenannte Verfahren. Insbesondere lässt sich das Xylostasin in Fällen, in denen das Kulturmedium gereinigt werden soll, leicht auf der alkalischen Seite adsorbieren. Als Elutionsmittel wird vor teilhaft eine wässrige Lösung, die auf einen pH-Wert von we niger als 5, vorzugsweise von nicht mehr als 4, eingestellt worden ist, oder ein Lösungsmittel wie wässriges Aceton oder wässriger Alkohol verwendet. Xylostasin kann auch unter Verwendung eines Ionenaustauschers als Adsorptionsmittel gereinigt werden. Als lonenaustauscher können Kationenaustauschharze, z. B.
Amberlite IRC-50 (Rohm and Haas Co.) verwendet werden. Als Elutionsmittel werden- im allgemeinen wässrige Lösungen einer Säure, eines Alkalis oder eines Salzes verwendet.
Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe pulverförmige Xylostasin kann durch Ionenaustauschchromatographie beispielsweise am Harz Dowex 1 x 2 (OH--Form) (Dow Chemical Co.), Amerlite CG-50 (NH4+-Form, Hersteller Rohm and Haas Co.) und CM-Sephadex (NH4+-Form, Hersteller Pharmacia Fine Chemicals, Schweden), weiter gereinigt werden. Aus dem Eluat, das bei der Reinigung unter Verwendung eines solchen Adsorptionsmittels erhalten wird, wird Xylostasin beispielsweise durch Eindampfen des Eluats zur Trockene vorzugsweise bei niedriger Temperatur oder durch Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels zum Eluat und Abtrennen der Fällung isoliert.
Xylostasin wird in Form eines Salzes mit einer Säure isoliert, wenn das Eluat vor oder nach der Einengung mit einer Säure neutralisiert wird.
Xylastasin kann der biologischen Testung nach üblichen Methoden, beispielsweise nach der Papierscheibenmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testmikroorganismus, unterworfen werden.
Das erfindungsgemäss hergestellte Antibiotikum hat die folgenden physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften:
1. Xylostasin ist eine basische Substanz. Xylostasin, sein Hydrochlorid und Sulfat sind weisse kristalline Pulver. Xylostasin ist in neutraler oder alkalischer Lösung beständig, jedoch in saurer Lösung weniger beständig.
2. Xylostasin hat keinen scharfen Schmelzpunkt. Es zersetzt sich unter Schäumen im Bereich von etwa 150 bis 180 C.
3. Xylostasin ist in Wasser leicht löslich, in Methanol wenig löslich und in organischen Lösungsmitteln wie Aceton, Butanol, Äthylacetat, Benzol, Hexan, Äther usw. unlöslich.
4. Das UV-Spektrum von Xylostasin zeigt keine charakteristische Absorption mit Ausnahme der Endabsorption.
5. Das Infrarotspektrum von Xylostasin in Kaliumbromid zeigt für Aminoglucosid-Antibiotika charakteristische Absorptionsbanden in der Nähe von 3320, 2920, 1590, 1465, 1340, 110 und 1020 cm-1. Da jedoch keine Absorption in der Nähe von 1652 cm-1 vorhanden ist, enthält das Molekül von Xylostasin offensichtlich keine Säureamidbindung.
6. Das NMR-Spektrum (in D2O) von Xylostasin zeigt die folgenden charakteristischen Maxima: o-Werte: 1,36 (q, 1H, axiales Methylenproton), 2,13 (m, 1H, äquitoriales Methylenproton), 5,44 (1H, J = < 1, anomerisches Xyloseproton), 5,70 (d, 1 H, J = 3 bis 4, anomerisches Proton von Neosamin C).
7. Optische Drehung von Xylostasin, gemessen in wässriger Lösung: [a23 + 34 .
8. Farbreaktionen: Xylostasin ist positiv in der Ninhydrin Reaktion, beim Molisch-, Anthron- und Greig-Leaback-Test und negativ beim Sakaguchi-Test, Maltol-Test, Eisen(lllfchlo- ridtest, Biuret-Test und Ehrlich-Test.
9. Die Elementaranalyse einer Xylostasinprobe, die 20 Stunden unter vermindertem Druck bei 110 "C getrocknet worden ist, ergibt 44,18% C, 7,58% H und 11,98% N. Das Molekulargewicht (Neutralisationsäquivalent) beträgt 451.
Strukturuntersuchungen ergeben die Bruttoformel C17H34N4O10 (berechnet: 44,930in C, 7,540/0 H, 12,33% N, Molekulargewicht 454,49).
10. Xylostasin wandert bei der Papierelektrophorese etwa 5 bis 6 cm zur Kathode (Boratpuffer (pH 9,5, 0,025-molar) auf Filterpapier Whatman Nr. 1 bei 2 kV/36 cm für 90 Minuten).
11. Wenn Xylostasin 6 Tage der Methanolyse mit 0,4 N HCI in Methanol bei 22 "C unterworfen wird, werden Methyl D-Xylosid und Neamin gebildet. Wenn Xylostasin 6 Stunden mit 0,5 N Schwefelsäure bei 90 C hydrolysiert wird, werden D-Xylose und Neamin im Hydrolysat nachgewiesen.
12. Das antibiotische Spektrum von Xylostasin ist nachstehend in Tabelle 3 genannt.
Tabelle 3 Hemmende Mindestkonzentrationen nach der Agar-Verdün nungsmethode Testmikroorganismus hemmende Mindest konzentration, Ag/ml Escherichia coli IFO 3044 6,25 Shigella flexneri EW-10 12,5 Proteus vulgaris IFO 3045 50 Pseudomonas aeruginosa IFO 3080 > 50 Staphylococcus aureus FDA 209P 6,25 Bacillus subtilis Pol 219 3,125 Bacillus cereus IFO 3466 50 Bacillus brevis IFO 3331 25 Sarcina lutea IFO 3232 25 Mycobacterium avium IFO 3153 1,6 Mycobacterium avium 3,125 (Streptomycin-resistent) Mycobacterium avium > 50 (Neomycin-resistent) Mycobacterium phlei IFO 3158 1,6 Mycobacterium smegmatis IFO 3083 1,6 FDA: Food and Drug Administration , Washington, D. C., USA PCI: Penicillin Control and Immunology Section, Food and Drug Administration , Washington, D.
C., USA
Als Medien für den Test werden Bouillonagar für die gewöhnliche Bakterien und Glycerin-Bouillonagar für säurefeste Bakterien verwendet.
13. Akute Toxizität: Die akute Toxizität von Xylostasin wurde an Mäusen bei intravenöser Injektion untersucht. Der LD50-Wert für die freie Base beträgt etwa 1000 mg/kg.
14. Anti-Infektionstest mit Mäusen: Wenn eine wässrige Lösung von Xylostasin Mäusen unmittelbar nach einer Infektion mit Escherichia coli 0-111 in einer Einzeldosis von 10 mg/kg subkutan verabreicht wurde, wurde der Tod der Mäuse vollständig verhindert.
Xylostasin und seine pharmazeutisch unbedenklichen Salze mit Säuren sind wirksam gegen Infektionen durch Bakterien. Ihre Toxizität bei Warmblütern (z. B. Mensch, Maus und Ratte) ist äusserst gering. Die Verbindungen können daher unbedenklich und wirksam zur Behandlung von Infektionen durch Bakterien, z. B. Harnweginfektionen, Bronchopneumie, Pyelitis und Mandelentzündung verwendet werden.
Die erfindungsgemäss hergestellten Antibiotika können im allgemeinen parenteral verabreicht werden, jedoch ist auch eine andere Verabreichung möglich. Die Dosierung wird zweckmässig in Abhängigkeit von den Symptomen der zu behandelnden Krankheit bestimmt und liegt beispielsweise im Bereich von etwa 10 bis 40 mg/kg Körpergewicht bei jeder Gabe. Die erfindungsgemäss erhaltenen Antibiotika können in Form von üblichen Arzneimittelzubereitungen, z. B. Injektionslösungen, Tabletten und Salben, verabreicht werden.
Beispiel 1
Ein flüssiges Medium (pH 7,2), das 3% Polypepton, 1% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt, wurde mit Bacilllus sp. Y-399, der auf Glycerin-Bouillon-Agar gezüchtet worden war, geimpft. Die Bebrütung wurde 40 Stunden unter Schütteln bei 28 "C durchgeführt. Diese Impfkultur wurde dann in ein Fermentationsmedium (30 1, pH 7,5), das 1% Glucose, 1% Polypepton, 0,70/0 Fleischextrakt und 0,50/0 Magnesiumchlorid enthielt, in einem 50-1-Tank bei einer Grösse des Inoculums von 10% geimpft. Die Fermentation wurde 66 Stunden bei 88 "C, 100% Belüftung und 200 UpM durchgeführt.
Das erhaltene Kulturmedium wurde mit einer gesättigten wässrigen Oxalsäurelösung auf pH 1 bis 2 eingestellt und dann mit einem Filterhilfsmittel (300 g Hyflo-Super-Cel, Hersteller Johns-Manville Products Co.) filtriert. Das Filtrat wurde auf pH 7 eingestellt und durch eine Säule von 2 1 des Kationenaustauschharzes Amberlite IRC-50 (NH4+-Form) geleitet, wobei das aktive Produkt am Ionenaustauscherharz adsorbiert wurde. Das Harz wurde zuerst mit Wasser gewaschen und dann mit 50/obigem wässrigem Ammoniak eluiert.
Die aktiven Fraktionen (2,5 1) wurden zusammengegossen und durch eine Säule von 600 ml Aktivkohle für Chromatographiezwecke geleitet, wobei die aktive Verbindung adsorbiert wurde. Die Aktivkohlesäule wurde mit Wasser gewaschen und dann mit einer wässrigen 0,3 N HC1-Lösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, mit dem Anionaustauscherharz Amberlite IR 45 (Hersteller Rohm and Haas Co., OH--Form) neutralisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Abschliessend wurde das Konzentrat gefriergetrocknet, wobei 5,6 g eines rohen Pulvers, das etwa 30 /0 Xylostasin enthielt, erhalten wurden.
Reinigung
Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe Produkt (9,6 g) wurde in Wasser gelöst und an einer Säule von
150 ml des Kationenaustauscherharzes Amberlite CG-50 (Hersteller Rohm and Haas Co., NH4+-Form) adsorbiert.
Nach einer Wäsche mit Wasser wurde die Säule mit 0,2 N Ammoniakwasser eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Konzentrat wurde Aceton zugesetzt. Die gebildete Fällung wurde abfiltriert. Hierbei wurden 3,0 g eines hellbraunen Pulvers mit einem Xylostasingehalt von etwa 900/0 erhalten. Dieses Pulver wurde in Wasser gelöst und an einer Säule (3 cm x 90 cm) des Kationenaustauscherharzes CM-Sephadex C-25, NH4+-Form, adsorbiert. Die Säule wurde dann mit wäss rigem Ammoniak unter Anwendung der Gradienten-Elution (von 0 bis 1,7 N) eluiert. Die aktiven Fraktionen, die Xylosta sin allein enthielten, wurden zusammengegossen und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2,4 g weisses pulverförmiges Xylostasin erhalten wurden.
Herstellung des Sulfats
Eine wässrige Lösung des in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Xylostasins (freie Base) wurde mit 2 N
Schwefelsäure auf pH 4 bis 5 eingestellt und durch eine Ak tivkohlensäule geleitet. Die Säule wurde mit 0,03 N Schwefel säure eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammenge gossen, mit dem Anionenaustauscherharz Amberlite IR45 (OH--Form) auf pH 6,0 eingestellt und unter vermindertem
Druck eingeengt. Dem Konzentrat wurde Aceton zugesetzt.
Die gebildete Fällung wurde abfiltriert und unter verminder tem Druck getrocknet. Hierbei wurde Xylostasinsulfat als weisses Pulver erhalten.
Beispiel 2
Ein flüssiges Medium (pH 7,2), das 3 /0 Polypepton, 1% Fleischextrakt und 0,50/c Natriumchlorid enthielt, wurde mit Bacillus sp. V-7 geimpft, der auf Glycerin-Bouillon-Schrägagar gezüchtet worden war, worauf 40 Minuten unter Schütteln bei 28 "C bebrütet wurde. Die erhaltene Impfkultur wurde dann in einen 50-1-Behälter geimpft, der 30 1 eines Fermentationsmediums (pH 8) enthielt, das 1% 0/o Glucose, 0,7% Polypepton, 0,50/0 Fleischextrakt und 0,3% Natriumchlorid bei einer Inoculumgrösse von 10% enthielt. Die Fermentation wurde 66 Stunden bei 28 "C mit 100% Belüftung bei 200 UpM durchgeführt.
Der erhaltenen Fermentationsbrühe wurden 150 ml einer 40/obigen wässrigen Lösung eines Agglutinationsmittels (Primafloc C-7, Hersteller Rohm and Haas Co.) und 300 g Filterhilfsmittel (Hyflo-Super-Cel, Hersteller Johns-Manville Products Co.) zugesetzt. Das Gemisch wurde mit einer gesättigten wässrigen Oxalsäurelösung auf pH 1 bis 2 eingestellt und filtriert. Das Filtrat (24 1) wurde auf pH 8,5 bis 9,5 eingestellt und 30 Minuten mit etwa 1% Aktivkohle gerührt, wodurch die aktive Substanz im Filtrat fast ausschliesslich an der Kohle adsorbiert wurde. Die Aktivkohle wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen und ind 3 1 700/obigem wässrigem Methanol suspendiert. Die Suspension wurde zur Extraktion der aktiven Substanz mit 4 N Salzsäure auf pH 2 eingestellt. Die Aktivkohle wurde abfiltriert.
Das Methanol wurde vom Filtrat unter vermindertem Druck abdestilliert, worauf das Filtrat mit dem Anionenaustauscherharz Amberlite IR45 (OH--Form) neutralisiert wurde. Die Lösung wurde auf pH 7 eingestellt und dann durch eine Kationenaustauschersäule (Amberlite CG-50, NH4+-Form) geleitet, wobei die aktive Substanz adsorbiert wurde. Die Säule wurde mit wässrigem Ammoniak unter Anwendung der Gradienten-Elution (Konzentration von 0 bis 10%) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Aceton zugesetzt wurde. Hierbei wurden etwa 5,7 g rohes Xylostasin (Xylostasingehalt etwa 300/0) erhalten.
Reinigung
Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe Produkt (9,6 g) wurde der in Beispiel 1 beschriebenen Behandlung unterworfen, wobei 2,5 g Xylostasin als weisses Pulver erhalten wurden.
Beispiel 3
Ein flüssiges Kulturmedium (pH 7,2), das 3 /0 Polypepton,
1% Fleischextrakt und 0,50/0 Natriumchlorid enthielt, wurde mit Bacillus sp. Y-399 geimpft, der auf Glucose-Bouillon Schrägagar gezüchtet worden war, und 40 Stunden bei 28 "C unter Schütteln bebrütet.
Mit der Impfkultur wurden 30 1 eines Fermentationsmediums (pH 7,5) geimpft, das 2% Dextrin, 0,50/0 lösliche Stärke,
1,2% Polypepton, 0,70/0 Fleischextrakt und 0,5% Magnesium sulfat in einem 501-Fermenter bei einer Inoculumgrösse von
10% enthielt. Die Kultivierung wurde bei 28 "C, 100% Belüf tung und 200 UpM durchgeführt. Das erhaltene Kulturme dium wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgear beitet, wobei 22,1 g eines rohen Pulvers, das etwa 70% Xylo stasin enthielt, erhalten wurden.