DE2326943B2 - Xylostatin, Verfahren zu dessen Herstellung und Xylostatin enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Xylostatin, Verfahren zu dessen Herstellung und Xylostatin enthaltende Arzneimittel

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DE2326943B2 DE19732326943 DE2326943A DE2326943B2 DE 2326943 B2 DE2326943 B2 DE 2326943B2 DE 19732326943 DE19732326943 DE 19732326943 DE 2326943 A DE2326943 A DE 2326943A DE 2326943 B2 DE2326943 B2 DE 2326943B2
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Description

Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium unter io Hilfss(offen und Trägern.
aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 15 bis 35°C bzw. 15 bis 45°C und in einem pH-Bereich von 6 bis 9 kultiviert und das Xylostatin aus dem Kulturmedium isoliert
3. Arzneimittel, enthaltend Xylostatin oder dessen Salze zusammen mit pharmazeutisch üblichen
Die Erfindung betrifft ein als »Xylostasin« bezeichnetes neues Aminoglykosid-Antibiotikum, das nach der wissenschaftlichen Nomenklatur die Bezeichnung O-0-D-Xylofuranosyl-(l— 5)-O-(«-2,6-diamino-2,6-didesoxy-D-glucopyranosyl-(l-*4))-2-desoxystreptamin und die folgende Formel hat:
NH2
HO
HOH2C
NH2
OH
OH
Die Erfindung umfaßt ferner die pharmazeutisch unbedenklichen Salze von Xylostasin mit Säuren sowie ein Verfahren zur Herstellung von Xylostasin und Xylostasin oder dessen Salze enthaltende Arzneimittel.
Gemäß der Erfindung erfolgt die Herstellung von Xylostatin nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Bacillus Sp. Y-399 (ATCC-21932) oder Bacillus Sp. V-7 (ATCC-21933) oder daraus durch bekannte Techniken erhältliche Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 15 bis 350C bzw. 15 bis 45°C und in einem pH-Bereich von 6 bis 9 kultiviert und das Xylostatin aus dem Kulturmedium isoliert
Die Mutanten können durch spontane und induzierte Mutation dieser Mikroorganismen erhalten werden. Um festzustellen, ob ein Mikroorganismus Xylostatin zu bilden vermag, kann beispielsweise die nachstehend beschriebene Auswahlmethode angewandt werden.
Ein Glucose-Bouillon-Medium wird mit Bacillus-Stämmen, die von den natürlichen Quellen dieser Stämme isoliert oder von Vorratskulturen dieser Stämme entnommen wurden, geimpft Die Kultivierung wird 3 bis 4 Tage unter Schütteln bei 28° C durchgeführt. Nachdem bestätigt worden ist daß das erhaltene Kulturmedium antibakterielle Wirkung gegen einen geeigneten Testmikroorganismus, z. B. Bacillus subtilis, Escherichia coli oder Staphylococcus aureus, zeigt, werden etwa 20 ml des Kulturfiltrats mit Alkali auf pH 9 bis 10 eingestellt und dann durch eine Aktivkohlesäule (0,2 g) geleitet. Die Säule wird mit etwa 10 ml Wasser eewaschen und dann mit 10 ml 0.1 N HCl eluiert. Das Eluat wird neutralisiert und unter vermindertem Druck eingeengt Das Konzentrat wird durch Papierelektro phorese auf Filterpapier »Whatman« Nr. 1 in einem Boratpuffer (pH 9,5,0,025molar) bei einem Spannungsgradienten von 2 kV/36 cm für 90 Minuten analysiert. Der Flecken von Xylostasin kann durch Bioautographie gegen einen geeigneten Mikroorganismus, z. B. Bacillus subtilis, sowie auch durch eine Farbreaktion unter
Verwendung von Peptidreagens nachgewiesen werden. Das Xylostasin wird 5 bis 6 cm zur Kathode festgestellt. Als Mikroorganismen eignen sich für das Verfahren
gemäß der Erfindung beispielsweise Bacillus sp. Y-399
so und Bacillus sp. V-7, die unter den folgenden Zugangsnummern hinterlegt sind:
Tabelle 1
ATCC
IFO
Bacillus sp. Y-399 21932 13321 Bacillus sp. V-7 21933 13320 ATCC: »American Type Culture Collection«, Maryland,
USA. IFO: »Institute for Fermentation, Osaka«, Osaka, Japan.
Bacillus Sp. Y-399 wurde von der Anmelderin vom Boden in Kyoto, Japan, und Bacillus Sp. V-7 vom Boden in Tokyo, Japan, isoliert. Diese Mikroorganismen haben die nachstehend in Tabelle 2 genannten mikrobiologischen Eigenschaften.
3 Tabelle 2 h 23 26 943 4
Eigenschaft ?■■ 18) Wachstumstemperatur
a) Aussehen Ä Bacillus sp. V-7
1) Form und Größe Bacillus sp. Y-399
I 19) Oj-Relation Stäbchen, 0,8 X 2,4 bis 3,4 μ, mil
2) Pleomorphismus r Stäbchen, 0,8 x 2,4 bis 3,4 μ, mit abgerundeten Enden
1 abgerundeten Enden tritt einzeln und gelegentlich paar
3) Beweglichkeit und tritt einzeln und paarweise auf weise auf
Flagellum beweglich, mit Peritricha
4) Sporogenese beweglich, mit Peritricha
Sporen eliptisch oder zylindrisch,
Sporen eliptisch oder zylindrisch, zentral bis subterminal, Sporangium
5) Gram-Färbung zentral bis subterminal, Sporangium gequollen und keulenförmig
6) Säurefestigkeit gequollen und keulenförmig unterschiedlich
b) Wachstumsmerkmale unterschiedlich nicht säurefest
1) Bouillonagarplatte nicht säurefest
sich ausbreitend, glatte flache Ober
sich ausbreitend, glatte flache Ober fläche, glänzend, geschlossen,
fläche, geschlossen, durchscheinend, durchscheinend, gräulich-weiß und
2) Bouillon-Schrägagar gelb und schleimig; Mikrokolonien schleimig; beweglich
sind beweglich mäßiges Wachstum, rhizoid, flach,
mäßiges Wachstum, rhizoid, flach, glänzend, gräulich-weiß und sehr
3) Bouillon glänzend, durchscheinend und sehr schleimig
schleimig mäßiges Wachstum, kein Ober
mäßiges Wachstum, kein Ober flächenwachstum, trübe; Zellen
4) Kartoffel flächenwachstum, trübe; Zellen sind gräulich-weiß
sind gelb gutes Wachstum, sich aus
5) Lackmusmilch mäßiges Wachstum, sich aus breitend, gräulich-weiß
c) Physiologische Merkmale breitend, hellgelb reduziert
1) Reduktion von Nitraten neutral, peptonisiert und reduziert
2) Denitrierung nicht reduziert
3) MR-Test nicht reduziert
4) VP-Test negativ negativ
5) indolbildung negativ negativ
6) Bildung von Schwefel negativ nein
wasserstoff nein ja
7) Hydrolyse von Stärke ja
8) Verwertung von Citrat schwach hydrolysiert
9) Verwertung von Nitraten schwach hydrolysiert keine Verwertung
10) Verwertung von Ammoniak keine Verwertung keine Verwertung
il) Pigmentbildung keine Verwertung Verwertung
keine Verwertung keine Pigmentbildung
ein in unlösliches gelbes Pigment
12) Urease-Aktivität (carotinoid) wird intrazellulär
13) Cytochromoxydase gebildet negativ
14) Reduktion von negativ vorhanden
Methylenblau fehlt im wesentlichen reduziert
15) Casein-Hydrolyse reduziert
16) Verflüssigung von Gelatine negativ
17) PH-Wert für das Wachstum positiv verflüssigt
verflüssigt Wachstum bei pM 6 bis 9, optimales
I Wachstum bei pM 6 bis 9, optimales Wachstum bei pM 8
Wachstum bei pM 8 Wachstum bei 15 bis 45°C,
Wachstum bei 15 bis 35°C, optimales Wachstum bei 30 bis
optimales Wachstum bei 300C 37°C
aerob, kein anaerobes Wachstum in
aerob, kein anaerobes Wachstum in Glucosebouillon
Glucosebouillon
Fortsetzung Eigenschaft Bacillus sp. Y-399 Bacillus sp. V-7
Säure
c) Physiologische Merkmale
20) Beständigkeit gegen Natriumchlorid
21) O-F-Test
22) Katalase
d) Fermentation von Kohlenhydraten L-Arabinose D-Xylose D-Glucose D-Mannose D-Fructose D-Galactose Maltose Saccharose Lactose Trehalose D-Sorbit D-Mannit Inosit Glycerin Stärke
Ein Vergleich der vorstehend genannten mikrobiologischen Merkmale mit den entsprechenden Angaben in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7. Auflage) läßt darauf schließen, daß Bacillus sp. V-7 entweder zu Bacillus circulans gehört oder ein Stamm ist, der mit Bacillus circulans eng verwandt ist. Andererseits kann Bacillus Sp. Y-399 mit keinem der in der vorstehend genannten Literatlirstelle beschriebenen Mikroorganismen identifiziert werden, vielmehr hat dieser Stamm eine große Ähnlichkeit mit dem in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 98875/1971 beschriebenen Stamm IFO-13296 und wird daher als zu Bacillus vitellinus gehörend angesehen.
Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durchgeführt, indem der Xylostasin bildende Stamm in einem geeigneten Medium gezüchtet wird. Geeignet sind Medien, die routinemäßig bei der Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Bacillus verwendet werden. So kann das Medium als Kohlenstoffquellen Kohlenhydrate wie Glucose, Stärke, Dextrin usw. und als Stickstoffquellen verschiedene organische und anorganische Stickstoffverbindungen, z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Aminosäuren, Proteinmaterialien enthalten. Diese Bestandteile des Nährmediums können allein oder in geeigneter Kombination verwendet werden. Außer diesen Bestandteilen kann das Medium ferner anorganische Stoffe wie Kalium, Natrium, Magnesiurr Eisen, Phosphorsäure und wachstumsfördernde Faktoren, z. B. Vitamine, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton und organische Säuren, enthalten. Der Mikroorganismus kann unter stationären Bedingungen gezüchtet werden, jedoch erfolgt die Kultivierung vorzugsweise unter Schütteln oder unter Belüftung
kein Wachstum bei einer Konzentration von 5%
weder Säure nosh Gas wird aus D-Glucose oder aus Maltose gebildet
schwach
kein Wachstum bei einer Konzentration von 5%
weder Säure noch Gas wird aus D-Glucose gebildet
schwach Säure
Gas
und unter Rühren. Die Bebrütungstemperatur liegt im allgemeinen zwischen 20° und 37°C Die Bebrütungsdauer kann etwa 24 bis 90 Stunden betragen. Es ist zu bemerken, daß die optimalen Bedingungen von den Merkmalen des jeweils zu verwendenden, Xylostasin bildenden Stamms abhängen und unter Berücksichtigung dieser Eigenschaften zu wählen sind.
Wenn ein Xylostasin bildender Bacillus-Stamm unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen gezüchtet
<T) wird, wird Xylostasin überwiegend im Kulturfiltrat gebildet. Wie die nachstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften zeigen, ist Xylostasin ein wasserlösliches basisches Antibiotikum und kann daher nach den allgemeinen Verfahren zur Isolierung von üblichen wasserlöslichen basischen Antibiotika einschließlich Neomycin, Paromomycin, Kanamycin u. dgl. isoliert werden.
Beispielsweise kann die Isolierung des Xylostasin^ vorgenommen werden, indem das Kulturmedium über ein Adsorptionsmittel geleitet und die aktive Verbindung mit einem geeigneten Elutionsmittel desorbiert wird, oder das Antibiotikum kann mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert werden. Zweckmäßiger ist das erstgenannte Verfahren. Insbesondere läßt sich das
bo Xylostasin in Fällen, in denen das Kulturmedium unter Verwendung von Aktivkohle als Adsorptionsmittel gereinigt werden soll, leicht auf der alkalischen Seite adsorbieren. Als Elutionsmittel wird vorteilhaft eine wäßrige Lösung, die auf einen pH-Wert von weniger als
bi 5, vorzugsweise von nicht mehr als 4, eingestellt worden ist, oder ein Lösungsmittel wie wäßriges Aceton oder wäßriger Alkohol verwendet. Xylostasin kann auch unter Verwendung eines Ionenaustauschers als Adsorp-
tionsmittel gereinigt werden. Als Ionenaustauscher können Kationenaustauschharze, z. B. Amberlite® IRC-50 verwendet werden. Als Elutionsmittel werden im allgemeinen wäßrige Lösungen einer Säure, eines Alkalis oder eines Salzes verwendet
Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe pulverförmige Xylostasin kann durch Ionenaustauschchromatographie beispielsweise am Harz Dowex® 1x2 (OH--Form), Amberlite® CG-50 (NH4 +- Form) und CM-Sephadex® (N H4+-Form), weiter gereinigt werden. Aus dem Eluat, das bei der Reinigung unter Verwendung eines solchen Adsorptionsmittels erhalten wird, wird Xylostasin beispielsweise durch Eindampfen des Eluats zur Trockene vorzugsweise bei niedriger Temperatur oder durch Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels zum Eiuai und Abtrennen der Fällung isoliert. Xylostasin wird in Form eines Salzes mit einer Säure isoliert, wenn das Eluat vor oder nach der Einengung mit einer Säure neutralisiert wird.
Xylostasin kann der biologischen Testung nach üblichen Methoden, beispielsweise nach der Papierscheibenmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testmikroorganismus, unterworfen werden.
Das Antibiotikum gemäß der Erfindung hat die folgenden physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften:
1. Xylostasin ist eine basische Substanz. Xylostasin, sein Hydrochlorid und Sulfat sind weiße kristalline Pulver. Xylostasin ist in neutraler oder alkalischer Lösung beständig, jedoch in saurer Lösung weniger beständig.
2. Xylostasin hat keinen scharfen Schmelzpunkt. Es zersetzt sich unter Schäumen im Bereich von etwa 150 bis 1800C.
3. Xylostasin ist in Wasser leicht löslich, in Methanol wenig löslich und in organischen Lösungsmitteln wie Aceton, Butanol, Äthylacetat, Benzol, Hexan, Äther usw. unlöslich.
4. Das UV-Spektrum von Xylostasin zeigt keine charakteristische Absorption mit Ausnehme der Endabsorption.
5. Das Infrarotspektrum von Xylostasin in Kaliumbromid zeigt für Aminoglucosid-Antibiotika charakteristische Absorptionsbanden in der Nähe von 3320, 2920, 1590, 1465, 1340, 1100 und 1020 cm-'. Da jedoch keine Absorption in der Nähe von 1652 cm -' vorhanden ist, enthält das Molekül von Xylostasin offensichtlich keine Säureamidbindung.
6. Das NMR-Spektrum (in D2O) von Xylostasin zeigt die folgenden charakteristischen Maxima:
d-Werte: 136 (q, IH, axiales Methylenproton), 2,13 (m, IH, äquatoriales Methylenproton), 5,44 (IH, J= <1, anomerisches Xyloseproton), 5,70 (d, IH, J=3—4, anomerisches Proton von Neosamin C).
7. Optische Drehung von Xylostasin, gemessen in wäßriger Lösung: [«] i? + 34°.
8. Farbreaktionen: Xylostasin ist positiv in der Ninhydrin-Reaktion, beim Molisch-, Anthron- und Greig-Leaback-Test und negativ beim Sakaguchi-Test, Maltol-Test, Eisen(III)-chloridtest, Biuret-Test und Ehriich-Test
9. Die Elementaranalyse einer Xylostasinprobe, die 20 Stunden unter vermindertem Druck bei 1100C getrocknet worden ist, ergibt 44,18% C, 738% H und 1138% N. Das Molekulargewicht (Neutralisationsäquivalent) beträgt 451.
Strukturuntersuchungen ergeben die Bruttoformel Ci7H34N4O10 (berechnet: 44,93% C, 7,54% H, 12,33% N, Molekulargewicht 454,49).
10. Xylostasin wandert bei der Papierelektrophorese etwa 5 bis 6 cm zur Kathode (Boratpuffer (pH 9,5, 0,025molar) auf Filterpapier Whatman Nr. 1 bei 2 kV/36 cm für 90 Minuten).
Wenn Xylostasin 6 Tage der Methanolyse mit 0,4 N HCI in Methanol bei 220C unterworfen wird, werden Methyl-D-Xylosid und Neamin gebildet. Wenn Xylostasin 6 Stunden mit 0,5 N Schwefelsäure bei 9O0C hydrolysiert wird, werden D-Xylose und Neamin im Hydrolysat nachgewiesen.
Das antibiotische Spektrum von Xylostasin ist nachstehend in Tabelle 3 genannt.
Tabelle 3
Hemmende Mindestkonzentnitionen nach der Agar- hemmende Min
Verdünnungsmethode destkonzentration
Testmikroorganismus 6,25
12,5
Escherichia coli IFO 3044 50
Shigella flexneri EW-IO >50
Proteus vulgaris IFO 3045
Pseudomonas aeruginosa 6,25
IFO 3080
Staphylococcus aureus 3,125
FDA 209 P 50
Bacillus subtilis PCI 219 25
Bacillus cereus IFO 3466 25
Bacillus brevis IFO 3331 1,6
Sarcina lutea IFO 3232
Mycobacterium avium 3,125
IFO 3153
Mycobacterium avium >50
(Streptomycin-resistent)
Mycobacterium avium 1,6
(Neomycin-resistent) 1,6
Mvcobacterium phlei IFO 3158
Mycobacterium smegmatis
IFO 3083
FDA: »Food and Drug Administration«, Washington,
D.C., USA.
PCI: »Penicillin Control and Immunology Section,
Food and Drug Administration«, Washington, D.C., USA.
Als Medien für den Test werden Bouillonagar für die gewöhnlichen Bakterien und Glycerin-Bouillonagar für säurefeste Bakterien verwendet
13. Akute Toxizität: Die akute Toxizität von Xylostasin wurde an Mäusen bei intravenöser Injektion untersucht Der LDso-Wert für die freie Base beträgt etwa 100 mg/kg.
14. Anti-Infektionstest mit Mäusen: Wenn eine wäßrige Lösung von Xylostasin Mäusen unmittelbar nach einer Infektion mit Escherichia coli O-111 in einer Einzeldosis von 10 mg/kg subkutan verabreicht wurde, wurde der Tod der Mäuse vollständig verhindert
Xylostasin und seine pharmazeutisch unbedenklichen Salze mit Säuren sind wirksam gegen Infektionen durch Bakterien. Ihre Toxizität bei Warmblütern (z. B. Mensch, Maus und Ratte) ist äußerst gering. Die Verbindungen können daher unbedenklich und wirksam zur Behandlung von Infektionen durch Bakterien, z. B. Harnweginfektionen, Bronchopneumie, Pyelitis und Mandelentzündung verwendet werden. Die Antibiotika gemäß der Erfindung können im allgemeinen parenteral verabreicht werden, jedoch ist auch eine andere Verabreichung möglich. Die Dosierung wird zweckmäßig in Abhängigkeit von den Symptomen der zu behandelnden Krankheit bestimmt und liegt beispielsweise im Bereich von etwa 10 bis 40 mg/kg Körpergewicht bei jeder Gabe. Die erfindungsgemäßen Antibioti- ka können in Form von üblichen Arzneimittelzubereitungen, z. B. Injektionslösungen, Tabletten und Salben, verabreicht werden.
Beispiel 1
20
Ein flüssiges Medium (pH 7,2), das 3% Polypepton, 1% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt, wurde mit Bacillus sp. Y-399, der auf Glycerin-Bouillon-Agar gezüchtet worden war, geimpft. Die Bebrütung wurde 40 Stunden unter Schütteln bei 28°C durchgeführt Diese Impfkultur wurde dann in ein Fermentationsmedium (301, pH 7,5), das 1% Glucose, 1% Polypepton, 0,7% Fleischextrakt und 0,5% Magnesiumchlorid enthielt, in einem 50-1-Tank bei einer Größe des Inoculums von 10% geimpft Die Fermentation wurde 66 Stunden bei 880C, 100% Belüftung und 200 UpM durchgeführt
Das erhaltene Kulturmedium wurde mit einer gesättigten wäßrigen Oxalsäurelösung auf pH 1 bis 2 eingestellt und dann mit einem Filterhilfsmittel (300 g Hyflo-Super-Cel·, Hersteller Johns-Manville Products Co.) filtriert Das Filtrat wurde auf pH 7 eingestellt und durch eine Säule von 21 des Kationenaustauscherharzes Amberlite® IRC-50 (NH4+-Form) geleitet, wobei das aktive Produkt am Ionenaustauscherharz adsorbiert wurde. Das Harz wurde zuerst mit Wasser gewaschen und dann mit 5%igem wäßrigem Ammoniak eluiert Die aktiven Fraktionen (2,51) wurden zusammengegossen und durch eine Säule von 600 ml Aktivkohle für Chromatographiezwecke geleitet, wobei die aktive Verbindung adsorbiert wurde. Die Aktivkohlesäure wurde mit Wasser gewaschen und dann mit einer wäßrigen 0,3N HCl-Lösung eluiert Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, mit dem Anionenaustauscherharz Amberlite® IR 45 (OH--Form) neutralisiert und unter vermindertem Druck eingeengt Abschließend wurde das Konzentrat gefriergetrocknet, wobei 5,6 g eines rohen Pulvers, das etwa 30% Xylostasin enthielt, erhalten wurden.
Reinigung
Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe Produkt (9,6 g) wurde in Wasser gelöst und an einer Säule von 150 ml des Kationenaustauscherharzes Amberlite® CG-50 (NH4 +-Form) adsorbiert Nach einer Wäsche mit Wasser wurde die Säule mit 0,2N Ammoniakwasser eluiert Die aktiven Fraktionen wurden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt Dem Konzentrat wurde Aceton zugesetzt Die gebildete Fällung wurde abfiltriert Hierbei wurden 3,0 g eines hellbraunen Pulvers mit einejn Xylostasingehalt von etwa 90% erhalten. Dieses Pulver wurde in Wasser gelöst und an einer Säule (3 cm χ 90 cm) des Kationenaustauscherharzes CM-Sephadex® C-25, NH4+-Form, adsorbiert. Die Säule wurde dann mit wäßrigem Ammoniak unter Anwendung der Gradienten-Elution (von 0 bis 1,7N) eluiert. Die aktiven Fraktionen, die Xylostasin allein enthielten, wurden zusammengegossen und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2,4 g weißes pulverförmiges Xylostasin erhalten wurden.
Herstellung des Sulfats
Eine wäßrige Lösung des in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Xylostasins (freie Base) wurde mit 2 N Schwefelsäure auf pH 4 bis 5 eingestellt und durch eine Aktivkohlesäule geleitet. Die Säule wurde mit 0,03 N Schwefelsäure eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, mit dem Anionenaustauscherharz Amberlite® IR-45 (OH--Form) auf pH 6,0 eingestellt und unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Konzentrat wurde Aceton zugesetzt. Die gebildete Fällung wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Hierbei wurde Xylostasinsulfat als weißes Pulver erhalten.
Beispiel 2
Ein flüssiges Medium (pH 7,2), das 3% Polypepton, 1% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt, wurde mit Bacillus sp. V-7 geimpft, der auf Glycerin-Bouillon-Schrägagar gezüchtet worden war, worauf 40 Minuten unter Schütteln bei 28° C bebrütet wurde. Die erhaltene Impfkultur wurde dann in einen 50-1-Behälter geimpft der 301 eines Fermentationsmediums (pH 8) enthielt, das 1% Glucose, 0,7% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt und 0,3% Natriumchlorid bei einer Inoculumgröße von 10% enthielt Die Fermentation wurde 66 Stunden bei 28° C mit 100% Belüftung bei 200 UpM durchgeführt
Der erhaltenen Fermentationsbrühe wurden 150 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung eines Agglutinationsmittels (Primafloc® C-7, Hersteller Rohm and Haas Co.) und 300 g Filterhilfsmittel (Hyflo-Super-Cel®) zugesetzt Das Gemisch wurde mit einer gesättigten wäßrigen Oxalsäurelösung auf pH 1 bis 2 eingestellt und nitriert Das Filtrat (24 1) wurde auf pH 8,5 bis 9,5 eingestellt und 30 Minuten mit etwa 1% Aktivkohle gerührt wodurch die aktive Substanz im Filtrat fast ausschließlich an der Kohle adsorbiert wurde. Die Aktivkohle wurde abgetrennt mit Wasser gewaschen und in 31 70%igem wäßrigem Methanol suspendiert Die Suspension wurde zur Extraktion der aktiven Substanz mit 4 N Salzsäure auf pH 2 eingestellt Die Aktivkohle wurde abfiltriert Das Methanol wurde vom Filtrat unter vermindertem Druck abdestilliert worauf das Filtrat mit dem Anionenaustauscherharz Amberlite® IR-45 (OH--Form) neutralisiert wurde. Die Lösung wurde auf pH 7 eingestellt und dann durch eine Kationenaustauschersäule (Amberlite® CG-50, NH4 +-FOnTi) geleitet wobei die aktive Substanz adsorbiert wurde. Die Säule wurde mit wäßrigem Ammoniak unter Anwendung der Gradienten-Elution (Konzentration von 0 bis 10%) eluiert Die aktiven Fraktionen wurden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt worauf Aceton zugesetzt wurde. Hierbei wurden etwa 5,7 g rohes Xylostasin (Xylostasingehalt etwa 30%) erhalten.
Reinigung
Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe Produkt (9,6 g) wurde der in Beispiel 1 beschriebenen
Behandlung unterworfen, wobei 2,5 g Xylostasin als weißes Pulver erhalten wurden.
Beispiel 3
Ein flüssiges Kulturmedium (pH 7,2), das 3% Polypepton, 1% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt, wurde mit Bacillus sp. Y-3199 geimpft, der auf Glucose-Bouillon-Schrägagar gezüchtet worden war, und 40 Stunden bei 28°C unter Schütteln bebrütet.
Mit der Impfkultur wurden 301 eines Fermentationsmediums (pH 7,5) geimpft, das 2% Dextrin, 0,5% lösliche Stärke, 1,2% Polypepton, 0,7% Fleischextrakt und 0,5% Magnesiumsulfat in einem 50-1-Fermenter bei einer Inoculumgröße von 10% enthielt. Die Kultivierung wurde bei 280C, 100% Belüftung und 200UpM durchgeführt. Das erhaltene Kulturmedium wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 22,1 g eines rohen Pulvers, das etwa 70% Xylostasin enthielt, erhalten wurden.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Xylostatin und dessen pharmakologisch unbedenkliche Salze mit Säuren.
2. Verfahren zur Hersteilung von Xylostatin, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus sp. Y-399 (ATCC-21932) oder Bacillus Sp. V-7 (ATCC-21933) oder daraus durch bekannte Techniken erhältliche
DE19732326943 1972-05-31 1973-05-26 Xylostatsin Verfahren zu dessen Herstellung und Xylostatsin enthaltende Arzneimittel Expired DE2326943C3 (de)

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