CN115197972A - 一种抗衰老砖红链霉菌提取物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗衰老砖红链霉菌提取物及其制备方法。将活化的砖红链霉菌A001发酵培养后，分别用乙酸乙酯和丙酮对上清液和菌丝进行浸提、旋转蒸发浓缩，将乙酸乙酯提取物和丙酮提取物合并，对得到萃取物进行分离旋转蒸发浓缩；采用衰老细胞系WI38进行抗衰老活性筛选，发现展开物质具有抗衰老活性。本发明在抗衰老药物或功能保健食品等方面具有积极作用，可用于辅助制备抗衰老的产品，从而应用于缓解衰老、延长寿命，具备良好的实际应用价值。

Description

一种抗衰老砖红链霉菌提取物及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物发酵提取技术领域，具体涉及一种具有抗衰老功效的砖红链霉菌A001提取物及其制备方法。
背景技术
衰老是生命活动的基本现象和规律，是指随着年龄的增长，组织器官发生功能退化的过程，与机体元件的老化及衰老相关疾病等均有密切关系。衰老相关性疾病包括心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病等。衰老分子机制的深入研究、延缓衰老新型物质的筛选与发现等，为人类主动延缓衰老、防治衰老相关疾病、改善老年人的生活质量提供重要的理论基础和科学依据。
砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001 为从土壤中分离得到的菌株,保藏编号为CGMCC No.21851，已于CN113215066A中保藏。放线菌是重要的活性成分产生源，而链霉菌属是其中主要的先导化合物产生类群。已有研究表明，砖红链霉菌的次级代谢产物丰富，在抗肿瘤、抗衰老等方面具有积极作用，是一种重要的菌种资源。我们前期发现该菌株发酵上清液和菌体的萃取物对秀丽隐杆线虫具有延缓衰老的作用，进一步挖掘砖红链霉菌抗衰老活性物质，对砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001作为抗衰老成分产生菌进行应用具有重大的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种链霉菌提取物，进一步从砖红链霉菌（Streptomyceslateritius）A001提取物中具有抗衰老活性的组分及其制备方法。
本发明是通过以下技术方案得到的：
一种具有抗衰老功效的砖红链霉菌A001提取物，其制备方法如下：
（1）将活化的保藏编号为CGMCC No.21851的砖红链霉菌（Streptomyceslateritius）A001接种于YIM3
发酵培养基中，制作种子液，随后将种子液转接于豆粕发酵培养基中培养；
（2）收集菌株液体发酵产物，加入有机溶剂超声提取，将上清和菌丝提取物合并，浓缩物复溶于二氯甲烷。
（3）将浓缩物采用薄层层析板对得到上清乙酸乙酯萃取物和菌体丙酮萃取物在展开系统为三氯甲烷:丙酮:甲醇，9:0.8:0.6中进行分离，得到4个组分（F1-F4）。
（4）将F1-F4组分分别用衰老细胞系WI38进行活性筛选，即确定活性组分为F3。
其中步骤（1）中，所述的液体培养基选自：包括但不限于豆粕或豆粕为主要成分的液体培养基。
其中，步骤（2）中的有机溶剂选自：氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇或以上溶剂的混合溶液。上清优选油酸乙酯，菌丝优选丙酮。
其中，步骤（3）中，组分F1-F4为展开系统为三氯甲烷:丙酮:甲醇的展开剂中分离得到，展开系统中三氯甲烷:丙酮:甲醇的比例为（1-15）:（0.1-2）:（0.1-1.5）；优选的，展开系统中三氯甲烷:丙酮:甲醇的比例为（5-12）:（0.2-1.4）:（0.2-1）；更优选的，展开系统中三氯甲烷:丙酮:甲醇的比例为（8-11）:（0.5-1.0）:（0.3-0.8），更优选的比例为（8-10）:（0.6-1.0）:（0.4-0.6）。
其中，步骤（3）中，薄层层析板吸附剂选自：氧化铝和硅胶。
优选为：硅胶GF254，20*20cm，厚度为1-2cm。
另一方面，本发明提供一种抗衰老砖红链霉菌提取物的制备方法，制备方法包括下述步骤：
（1）将活化后的砖红链霉菌接种于培养基中培养；
（2） 发酵菌液离心，收集上清液和菌体，分别进行萃取，旋蒸、浓缩，合并得粗提物；
（3）将粗提物复溶，用薄层层析板分离，分离物质即为抗衰老砖红链霉菌提取物。
优选的，砖红链霉菌为砖红链霉菌A001，保藏编号为CGMCC No.21851。
优选的，培养基为YIM38液体培养基或豆粕液体培养基。
优选的，步骤（2）中，上清液用乙酸乙酯进行萃取，菌体用丙酮浸泡24 h后进行萃取；优选的，菌体萃取剂为丙酮。
优选的，步骤（3）中，薄层层析板的展开系统为三氯甲烷:丙酮:甲醇。
优选的，展开系统中三氯甲烷:丙酮:甲醇的比例为（1-15）:（0.1-2）:（0.1-1.5）；优选的，展开系统中三氯甲烷:丙酮:甲醇的比例为（5-12）:（0.2-1.4）:（0.2-1）；更优选的，展开系统中三氯甲烷:丙酮:甲醇的比例为（8-11）:（0.5-1.0）:（0.3-0.8），更优选的比例为（8-10）:（0.6-1.0）:（0.4-0.6）。
优选的，上述制备方法中薄层层析板展开后刮下条带，用丙酮浸提、减压旋蒸，展开第3条带为抗衰老提取物。以展开方向排序为准，展开条带层析速度最快者为第1条带，依次排序。
本发明的另一方面，提供一种具有抗衰老功效的砖红链霉菌提取物，由上述制备方法制备获得。
本发明的另一方面，提供上述砖红链霉菌提取物在制备抗衰老产品中的应用。
本发明的另一方面，提供上述砖红链霉菌提取物在制备延长细胞衰老产品中的应用。
有益效果：
1、本发明验证了砖红链霉菌A001提取物中具有抗衰老的活性组分。
2、通过衰老细胞系WI38筛选得到，并通过秀丽隐杆线虫模型进行抗衰老活性验证，试验表明砖红链霉菌A001提取物中的F3组分具有明显的抗衰老作用。
3、抗衰老的活性组分可用于辅助制备抗衰老的产品，从而应用于缓解衰老、延长寿命，具备良好的实际应用价值，为抗衰老产品的进一步研制和开发提供依据。
附图说明
图1实施例1中砖红链霉菌CGMCC No.21851发酵提取物在波长为254 nm 紫外灯照射下的TLC图。
图2 F1组分对衰老细胞系WI38细胞增殖的影响。
图3 F2组分对衰老细胞系WI38细胞增殖的影响。
图4 F3组分对衰老细胞系WI38细胞增殖的影响。
图5 F4组分对衰老细胞系WI38细胞增殖的影响。
图6 F3对秀丽隐杆线虫的毒理实验结果。
图7 F3秀丽隐杆线虫的寿命实验结果。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，其仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。
本发明实施例中涉及的培养基配方：
豆粕培养基：每100ml水中，可溶性淀粉3克，豆粕粉2g，NaCl0.1g，pH7.2。
YIM38培养基:每1升培养基中，酵母提取物4g，葡萄糖4g，麦芽浸提物5g，维生素B1g，NaCl 1g，pH7.2。
实施例1 砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001的发酵培养
将-80℃冻存的砖红链霉菌A001，保藏编号为 CGMCC No.21851取出，将其置于37℃恒温水浴中融化后，平皿涂布于YIM38琼脂培养基中，将其置于28℃培养箱培养一周至长出菌落；
挑取单个菌落，将其接种至50ml的YIM38液体培养基中，在29℃、200rpm摇床培养24h，再按照5%的接种量接种到豆粕液体培养基中，在29℃、200rpm条件下培养60h。
实施例2 发酵产物的提取
将发酵菌液离心（4000rpm*10min），收集上清液和菌体，室温下上清液用等体积的乙酸乙酯进行萃取，菌体用等体积的丙酮萃取浸泡24 h。在 35-40℃条件下对萃取物分别进行旋转蒸发浓缩，减压回收溶剂，合并上清和菌体浓缩物，得粗提物。
实施例3提取物的分离
将粗体物复溶于二氯甲烷，用薄层层析板进行分离，展开系统为三氯甲烷:丙酮:甲醇，9:0.8:0.6，在波长为254 nm 紫外灯照射下显色（图1），出现4个条带，分别刮下条带用丙酮浸提，减压旋蒸得到4份组分，命名为F1-F4，真空干燥后，称量各组分重量。
实施例4 提取物F1-F4抗衰老活性筛选
1、实验材料
细胞株：人衰老细胞系WI-38（人胚胎肺成纤维细胞）
所需试剂：胎牛血清，青霉素，链霉素，DMEM培养基。
2、实验方法
取对数生长期的WI-38细胞用胰酶消化后，WI38细胞以每孔3.5×103/100μl的密度接种于96孔板，向每个孔内加入F1-F4组分，采用的浓度为6.125ug/ml，25ug/ml和100ug/ml，每组设5个复孔。之后置于二氧化碳培养箱中培养，培养条件为37℃，5%CO2，95%O2。孵育24h后，吸除细胞培养液，每孔加入10%CCK8试剂后，37℃孵育1h，酶标仪490nm下测定吸光度，以进行细胞活力测定实验，检测F1-F4对老年WI38细胞活力的影响（图2-图5）。
结果如图2、3、5所示，F1、F2和F4组分在6.125 ug/ml添加量下，细胞生长存活率无明显变化，影响效果不显著，100ug/ml添加量下下，对细胞生长有一定抑制作用；F1、F2和F4组分在25 ug/ml添加量下能够略微提升细胞存活率。
如图4所示，F3在6.125 ug/ml、25 ug/ml的浓度范围内对WI38细胞无明显的细胞毒作用，且细胞存活率明显高于对照组；而在100 ug/ml的浓度下与对照相比，细胞存活率没有较大的抑制作用，由此可见，F3组分相比其他组分，含有更多的延缓细胞衰老的有效成分，实验结果显示F3具有延缓细胞衰老的活性。
实施例5 砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001提取物线虫毒理实验
在20℃条件下，将线虫野生型N2同步化（方法是将20条成虫转移到包含大肠杆菌op50的6cm NGM培养板上，产卵2小时后，将成虫移走，留下同步化的卵）后培养3天，发育为成虫后，挑入每孔包含200µL S medium液体培养基（培养基配比：NaCl 2.4g，KH2PO4 2.4g，K2HPO4 0.44g，ddH2O 400ml，甘油 172ml）的48孔板中，培养基中含有0, 6.125 ug/ml，25ug/ml，100ug/ml浓度的F3 ，6天后统计线虫存活率。培养基中加入氟尿苷FUDR（400uM）, 用于抑制线虫产生后代。将同步化线虫挑入含有不同浓度样品中，培养6天后，统计存活率，如图6和表1所示。砖红链霉菌抗衰老提取物细胞存活程度与对照相比没有差异。
Figure 39357DEST_PATH_IMAGE001
由图6可知，在F3组分浓度为6.125，25ug/ml的添加量下，线虫存活率略高于对照组，而F3组分添加量为100ug/ml时，线虫存活率显著降低。证明在适当浓度下提取物E3不会对线虫存活造成影响或生存压力，且可能能够适当提高线虫存活率。
实施例6 砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）A001提取物线虫寿命实验
在20℃条件下，将线虫野生型N2同步化后培养3天，发育为成虫后，挑入每孔含80µL S medium 液体培养基的96孔板中，培养基中含有6.125μg/ml和25μg/ml浓度的F3组分，每孔2-3条虫，每1-2天统计线虫存活率。培养基中加入氟尿苷FUDR（400uM）, 用于抑制线虫产生后代。
50µM 雷帕霉素阳性对照。结果如图7和表2所示，将线虫在浓度为6.125μg/ml和25μg/ml的砖红链霉菌抗衰老提取物液体培养基中培养时，浓度为6.125μg/ml和25μg/ml能显著延长线虫寿命。
Figure 152676DEST_PATH_IMAGE002
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种抗衰老砖红链霉菌提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：
（1）将活化后的砖红链霉菌接种于培养基中培养；
（2） 发酵菌液离心，收集上清液和菌体，分别进行萃取，旋蒸、浓缩，合并得粗提物；
（3）将粗提物复溶，用薄层层析板分离，分离物质即为抗衰老砖红链霉菌提取物。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，砖红链霉菌为砖红链霉菌A001，保藏编号为CGMCC No.21851。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述培养基为YIM38液体培养基或豆粕液体培养基。
4.如权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，上清液用乙酸乙酯进行萃取，菌体用丙酮萃取浸泡24 h。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，薄层层析板的展开系统为三氯甲烷:丙酮:甲醇。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，展开系统中三氯甲烷:丙酮:甲醇的比例为（8-10）:（0.6-1.0）:（0.4-0.6）。
7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，薄层层析板展开后刮下条带，用丙酮浸提、减压旋蒸，展开第3条带为抗衰老提取物。
8.一种具有抗衰老功效的砖红链霉菌提取物，由权利要求1-7任一所述的制备方法制备获得。
9.如权利要求8的砖红链霉菌提取物在制备抗衰老产品中的应用。
10.如权利要求8的砖红链霉菌提取物在制备延长细胞衰老产品中的应用。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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