NL8200640A - Nieuwe, carcinostatische stoffen, preparaten die ze bevatten, en werkwijze voor de bereiding daarvan. - Google Patents
Nieuwe, carcinostatische stoffen, preparaten die ze bevatten, en werkwijze voor de bereiding daarvan. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8200640A NL8200640A NL8200640A NL8200640A NL8200640A NL 8200640 A NL8200640 A NL 8200640A NL 8200640 A NL8200640 A NL 8200640A NL 8200640 A NL8200640 A NL 8200640A NL 8200640 A NL8200640 A NL 8200640A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- carcinostatic
- water
- ethanol
- substance
- spectrum
- Prior art date
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 99
- 230000003327 cancerostatic effect Effects 0.000 title claims description 110
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 18
- 101000651310 Desulfitobacterium hafniense (strain Y51) Trigger factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 claims abstract description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 290
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 36
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 33
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 claims description 31
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 29
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 25
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 21
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 14
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 14
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 claims description 14
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 14
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 claims description 13
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 7
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 6
- 208000003468 Ehrlich Tumor Carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037839 Solid Ehrlich Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 239000010200 folin Substances 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims 5
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 claims 3
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 claims 1
- RJTZUHVCZIGJMB-UHFFFAOYSA-N hydron;1h-indole;chloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2NC=CC2=C1 RJTZUHVCZIGJMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims 1
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 8
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 87
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 84
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 70
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 41
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 25
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 23
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 23
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 17
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 17
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 15
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 11
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 11
- 241000605986 Fusobacterium nucleatum Species 0.000 description 10
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 10
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 6
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 6
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 208000006268 Sarcoma 180 Diseases 0.000 description 4
- -1 acetone Chemical class 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 0 C**CC(CCCCN*C*CCCCC*=C*CCC***)CCC*CC**(C**C******)*C Chemical compound C**CC(CCCCN*C*CCCCC*=C*CCC***)CCC*CC**(C**C******)*C 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 2
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 2
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 244000038022 Chenopodium capitatum Species 0.000 description 1
- 235000004391 Chenopodium capitatum Nutrition 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000222356 Coriolus Species 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Diphosphoinositol tetrakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101100518501 Mus musculus Spp1 gene Proteins 0.000 description 1
- MUBMVGCGOYJTSS-QQPOUJNHSA-N OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]1CO Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]1CO MUBMVGCGOYJTSS-QQPOUJNHSA-N 0.000 description 1
- 101001041669 Oryctolagus cuniculus Corticostatin 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000006229 carbon black Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N hexahydrofarnesyl acetone Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)=O WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Substances [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/05—Immunological preparations stimulating the reticulo-endothelial system, e.g. against cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Oncology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
✓ - 1 - t *
Nieuwe, carcinostatische stoffen, preparaten die ze bevatten, en werkwijze voor de bereiding daarvan.
Deze uitvinding betreft een werkwijze voor het bereiden van nieuwe stoffen met carcinostatische en immunostimulerende werking, waarbij men onder anaerobe omstandigheden TF-2 vormende bacteriën kweekt die tot het geslacht 5 Fusobacterium behoren, en men deze stof uit de kweekvloeistof of het kweekfiltraat isoleert. Deze uitvinding betreft verder de aldus verkregen, T,TF-2'r genoemde stoffen (waaronder ook TF-210, -220, -230, -240, -250, -300 (-310, -320, -330), -340 en -350) en eveneens de carcinostatische preparaten die 10 ze bevatten.
In de afgelopen jaren heeft, voor de behandeling van patiënten met diverse soorten kanker, een remedie veel toepassing gekregen waarbij men de immunologische werking van de patiënt versterkt en men met deze versterkte 15 immunologische werking een carcinostatisch effect bereikt. Als hulpstoffen tegen de kanker bij deze remedie zijn verbindingen gebruikt die verkregen waren uit diverse soorten bacteriën, uit kweekfiltraten van diverse bacteriën en ook de polysaccha-riden die uit de vruchtlichamen van gekweekte Basidiomyceten 20 (en in het bijzonder uit Coriolus) verkregen waren.
Bij farmacologisch onderzoek van een kweekfiltraat van bacteriën behorende tot het geslacht Fusobacterium werd nu gevonden dat een bepaalde stof in dat kweekfiltraat carcinostatische werking heeft, dat die carcino-25 statische werking indirect is doordat het de afweer van de patiënt tegen de tumoren oftewel immuniteit van de patiënt versterkt, en dat deze stof een veel lagere toxiciteit heeft en uit dat kweekfiltraat geïsoleerd kan worden.
Het is een doel van deze uitvinding een 30 werkwijze te verschaffen voor het verkrijgen van deze stof, waarbij men bacteriën behorende tot het geslacht Fusobacterium 8200640 f i - 2 - onder anaerobe omstandigheden kweekt en nieuwe stoffen TF-2 met carcinostatische en de immuniteit-stimulerende werking uit het kweekfiltraat isoleert. Verder betreft deze uitvinding ook genoemde stoffen TF-2, en carcinostatische preparaten die dat 5 TF-2 bevatten.
Voor het verkrijgen van dat TF-2 kunnen alle bacteriën van het geslacht Fusobacterium gebruikt worden die dat TF-2 maken, bijvoorbeeld Fusobacterium nucleatum. Met name werd ervaring opgedaan met de stam Fusobacterium 10 nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647); dit omvat natuurlijk ook de natuurlijke en kunstmatige mutanten daarvan.
De bacteriologische eigenschappen van Fusobacterium nucleatum TF-031 zijn als volgt: (I) Vorm 15 (1) de cellen zelf: spoelvormig (figuur 1) (2) Polymorfisme is afwezig (3) Ze zijn onbeweeglijk (4) Sporen: afwezig (5) Gram-kleuring: Gram-negatief 20 (6) Zuurvastheid: negatief (II) Groei op kweekmedia (1) TF- agar-platen en schuine buizen Uitwendige vorm: rond
Grootte: ca 1 mm 25 In doorsnede: half-bolvormig
Structuur: dauwdruppelachtig Bovenkant: glad Randen: glad
Kleur: melkachtig, gelig-wit 30 Niet doorzichtig (2) TF vloeibaar kweek-medium Groeit hierin zeer goed
Door coaguleren ontstaat er een troebeling Geen neerslag 35 Groei aan het oppervlak: geen, pas groei bij een diepte van 5 mm en meer Gas: geen 8200540 - 3 - ί 5 (III) Fysiologische eigenschappen (1) wordt gevormd (2) Nitraten worden niet gereduceerd (3) Boterzuur wordt gevormd 5 (4) Indool wordt gevormd (5) Urease: afwezig (6) Katalase: afwezig (7) Zetmeel wordt niet gehydrolyseerd (8) Ze zijn anaëroob 10 (9) Ammoniak wordt gevormd (10) Koolzuur wordt gevormd (11) Groei bij pH tussen 5,0-8,5 en bij temperaturen
tussen 30° en 45°C
(12) Geen gasvorming uit de volgende suikers: 15 L-arabinose, D-xylose, D-glucose, D-mannose, D-fructose, D-galactose, maltose, saccharose, trehalose, sorbitol, mannitol, inositol, glycerol, zetmeel.
20 De nieuwe stoffen volgens de uitvinding TF-2 worden bijvoorbeeld als volgt verkregen: 8200540 s t - 4 - I---1 0 sr
CO CS CS I
1 to to H H .
+ O
+ m iü cs es sl· I - e to
fi «t H
cd > > +j 4J V) 3 3 3 /a /a 0) 3 Ό 110 3
3 *H O
«h sr
Cd es * EC to I — to to •I-) Eh •τ-η ·ϊ-4 •Η /d CC /3 , (¾ , Β S-Ι Cd 3 cd cd 4J Ό cd ,π ,ϋ / w 3 cd e cn o cu cd cd O rH 4-1
0 > O O rH to - 4J
— CS to O / «H
<N McSesofiO O* O & 1 -η i i 3 o m co co ·η
Ccj ·*Η to to O CS CS- CO CU
H 1-4 E-1 H H I I I W
d <U μ 3 to Ett toC
CU cd rM+'hcdcdHE-1 !H O
•rt > 3 3 6 .
Ό μ cd sr \o g + CO (jCO -sr 35 g cd <4h 3 3 sa es a Ώ cd «d cd 3 •u öo > > e cd e 3 u 3 *0 cd > cd CU Cd ·Η β JJ 4-1 > > ,—I cd Ό *0 ·Η μ 3 4-1 o — μ--·η — cd - in 334-134-1 3« cUr-H 333333 3 to a /3 cn β /1/13 3 3 •η Λ U 3 /V ο 3 ,α 3 0 14-1 C/3 3 λ ·3 3 3 /d /) 3 3 -U 3 Ό 3 • Η Ιμ 3 Ο 3 Τ) 3 Ο Ο Ο
3 0 3 331¾.1¾ CS Ο /CS
3 γΗ 3 ·η -η 3 cs*co<co
4JDH 3 ^ « Β *Η 3 J - r1 V
ΟΟΌ ES EC ·3 -3 to to to 3+3¾ toft__.EC Η Η Eh / cn -μ EC ft Εΰ Ο *Η g ·Τ-1 *1-1 to to 0) 3 01 ·ιΗ ·Η ·1~) 3 0 0 / /3 ·ρ-ι ·ιΗ ·<η txj pH γΗ ·γ) /) Ή > ft ., 3 3 /d /) 3 rü ο V 3 3 3 33 3 3 3 3 μ >3/3 /1/)333 S3 cn cn cd /3 cd -id W 01 3 Μ 0 0/13/1 3 ·μ·μ 3 ρΗρΗμομ
3 3 4-1 4-1 totoOHO
13 3 3 3 Ο Ο ι—! to '—1 ί2 Ü0 3 tS 3 3 to Ο to μ μ ο ο ο ο ο C4H μ ο ο μ μ μ 3 μ <— >-·
γΗ3 3 3 3 4-13 CS CO
3 μ 4-4 μ 4-1 3 4-1 I 1 •Η 3 cd cd cd [3 cd to Si to ιμ /: & & £ & Η— 1|-ι 3 0 33333 ^ χ} τ—I ι*Η *Η ·Η ·Η ·Η j £ £ 1-1 82 0 0 6 4 0 ϊ ί - 5 -
Deze bereidingswijze wordt als volgt toegelicht: (1) Het kweken der bacteriën
Het kweken van bacteriën die tot het 5 geslacht Fusobacterium behoren gebeurt op voor anaerobe bacteriën gebruikelijke wijze. Dat wil zeggen dat een kweekmedium dat een stikstofbron zoals runderhart- of runderhersen-extract, diverse peptonen, e.d., een vitaminebron zoals gistextract e.d., een anorganisch zout zoals NaCl e.d., een koolstofbron zoals 10 glucose- lactose e.d. en een reductiemiddel zoals L-cysteïne, « natriumsulfiet, thiglycolaat e.d. bevat, wordt op pH tussen 6 en 8,5 (bij voorkeur tussen 6,5 en 7,5 ingesteld en met de bacteriën beënt waarna gedurende 1 tot 5 dagen (bij voorkeur 24 tot 96 uur) onder anaerobe omstandigheden bij 30° tot 42°G (bij 15 voorkeur 32° tot 37°C) tot constante bevolkingsdichtheid gekweekt wordt. In het bijzonder is het wenselijk daarbij het in tabel A beschreven kweekmedium te gebruiken (hierna aangeduid als "TF-kweekmedium"). Maar het hersen-hart-extract is niet beslist nodig en kan vervangen worden door een hart-extract, een 20 rundvlees- of vis-extract, maisweekwater of iets dergelijks.
Onder de diverse peptonen zijn proteose- en phyton-pepton niet altijd nodig en het trypticase-pepton kan door polypepton vervangen worden. Indien geen agar gebruikt wordt is het wenselijk de kweekvloeistof te roeren.
25 8200640 v - 6 “ S j
Tabel A
Bestanddelen (g/1) TF-a TF-b TF-c TF-d TF-e TF-f 5 Trypticase- 17 17 17 17 17 17 pepton
Phyton- 3 3 1,5- pepton
Proteose- 10 5 5 10 pepton
Hersen-hart- 35 17,5 extract
Hart- - - 25 20 10 15 extract 15 Gist- 3 3 3 3 3 3 extract
Natrium- 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 chloride
Glucose 6 6 6 12 12 12 20 Lactose 5 5 5 10 10 10 L-cysteïne 0,25 0,5 0,5 - - -
Natrium- 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 sulfiet
Thioglyco- 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 25 laat
Agar 0 of 0 of 0 of 0 of 0 of 0 of 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 (2) Het verkrijgen van het kweekfiltraat (verwijderen der 30 bacteriën).
Uit de kweekvloeistof worden de organismen verwijderd, zodat men het filtraat verkrijgt. Dat gebeurt op een gebruikelijke wijze, bijvoorbeeld door centrifugeren en/ of filtreren met behulp van een filtreerhulpstof zoals Hyflo-35 Super-Cel. De voorkeur gaat uit naar centrifugeren omdat dat gemakkelijker is en vollediger gaat.
(3) Het afscheiden van de carcinostatische stoffen TF-2.
(i)(a) Een hydrofiel organisch oplosmiddel wordt aan het verkregen kweekfiltraat toegevoegd en het 40 ontstaande neerslag wordt opgevangen. Nu wordt in de heldere 8200640 ί i -7-- oplossing de pH bij voorkeur tussen 1,5 en 7 ingesteld, het beste tussen 1,5 en 2,5. Het hydrofiele organische oplosmiddel is bijvoorbeeld een alkohol zoals ethanol, methanol e.d. of een keton, zoals aceton e.d., hoewel alkoholen (in het bijzon-5 der ethanol) de beste resultaten geven. Van het hydrofiele organische oplosmiddel geeft men het beste zoveel dat de eind-concentratie tussen 30 en 80 vol.%, het beste tussen 50 en 80 vol.%, ligt. Na toevoegen van het hydrofiele organische oplosmiddel laat men het mengsel enige uren tot enige dagen bij la-10 ge temperatuur staan, bij voorkeur beneden 5°C, waardoor het neerslag volledig wordt.
Het aldus verkregen neerslag wordt op gebruikelijke wijze zoals decanteren, centrifugeren en filtreren afgescheiden.
15 (b) Aan het aldus verkregen neerslag wordt water toegevoegd, in het algemeen tussen 5 en 20 maal de hoeveelheid neerslag, en dan begint men met de fractionering naar de pH. Met name werd de volgende procedure toegepast: (b-1) In dit mengsel van neerslag en 20 water wordt de pH tussen 7,5 en 8 ingesteld. Nadat een onoplosbare rest indien nodig verwijderd is wordt de pH nu op omstreeks 4 ingesteld (tussen 3,5 en 4,5). Het dan ontstaande neerslag wordt op gebruikelijke wijze van de oplossing gescheiden, bijvoorbeeld door centrifugeren, filtreren e.d. Het aldus 25 verkregen in water oplosbare deel (TF-210) heeft de in tabel B genoemde eigenschappen.
(b-2) Afzonderlijk wordt aan het in (a) verkregen neerslag water toegevoegd in een hoeveelheid tussen 5 en 20 maal het neerslag. De pH wordt tussen 7,5 en 8 inge-30 steld. Na zonodig verwijderen van een onoplosbare rest wordt de pH op omstreeks 6 ingesteld (tussen 5,5 en 6,5). Het daarbij ontstaande neerslag wordt op gebruikelijke wijze zoals centrifugeren, filtreren e.d. van de oplossing gescheiden.
Het aldus verkregen in water onoplosbare deel (TF-220) heeft 35 de in tabel B genoemde eigenschappen.
(b—3) In het bij (b-2) verkregen fil- 8200640
y F
- 8 - traat wordt de pH op omstreeks 4 ingesteld (tussen 3,5 en 4,5). Het daarbij ontstaande neerslag wordt op gebruikelijke wijze door centrifugeren, filtreren e.d. van de oplossing gescheiden. Het daarbij verkregen neerslag (TF-230) heeft de in tabel 5 B genoemde eigenschappen.
(b-4) In het bij (b-1) of (b-3) verkregen filtraat wordt de pH omstreeks 2 ingesteld (tussen 1,5 en 2,5), waarbij een neerslag ontstaat. Dit neerslag wordt op gebruikelijke wijze, zoals centrifugeren, filtreren, e.d. van 10 de oplossing gescheiden. Het aldus verkregen neerslag (TF-240) heeft de in tabel B genoemde eigenschappen.
(b-5) Aan het bij (a) verkregen neerslag wordt water toegevoegd, in het algemeen in een hoeveelheid tussen 5 en 20 maal het neerslag, en de pH van het mengsel ligt 15 nu bijvoorbeeld tussen 7,5 en 8. Dan wordt de pH op omstreeks 2 ingesteld (tussen 1,5 en 2,5). Aan de daarbij verkregen oplossing of aan de bij (b-4) overgehouden oplossing wordt, zonodig na concentreren van de oplossing tot 1/3-1/7 van de oorspronkelijke hoeveelheid, een hydrofiel organisch oplosmiddel toe-20 gevoegd, bij voorkeur een alkohol, zodanig dat de eindconcen-tratie daarvan tussen 20 en 80 %, het beste tussen 20 en 60 % ligt. Het daarbij verkregen neerslag noemen wij TF-250. De eigenschappen daarvan staan ook in tabel B.
De carcinogene stoffen TF-210, TF-220, 25 TF-230, TF-240 en TF-250 kunnen voor een verdere zuivering ieder voor zich meerdere malen aan dezelfde fractionering naar de pH onderworpen worden. De aldus verkregen carcinostatische stoffen kunnen met gebruikelijke werkwijzen in farmaceutisch aanvaardbare zouten zoals dê alkalimetaal-zouten omgezet wor-30 den, bijvoorbeeld het natrium- of kalium-zout, of anders in een aardalkalimetaal-zout zoals magnesium- of calcium-zout.
(ii) De volgens (i) verkregen fracties met carcinostatische werking, TF-210, TF-220, TF-230, TF-240 en TF-250, worden elk op gebruikelijke wijze onteiwit, hetgeen 35 de fracties van de TF-300-serie geeft (TF-310, TF-320 en TF-330), TF-340 en TF-350. Voor het onteiwitten kunnen de in de 8200640 I Γ - 9 - techniek bekende methoden gebruikt worden; de voorkeur daaronder geniet de ontleding door proteolytische enzymen. Indien het wenselijk is dat het onteiwitten met behulp van een proteo-lytisch enzym gebeurt is het voldoende dat elke bij (i) verkre-5 gen fractie in water of een buffer-oplossing opgenomen wordt, een eiwit-ontledend enzym toegevoegd wordt en men de enzym-inwerking op gebruikelijke wijze laat voortgaan.
Als proteolytische enzymen kunnen pro-nase, papaïne, trypsine en chymotrypsine e.d. genoemd worden; 10 bijzondere voorkeur genieten pronase en trypsine. Bij voorkeur wordt voor of tijdens de enzym-behandeling de pH van de waterige oplossing tussen 7 en 8 ingesteld. Hiertoe kunnen NaOH, KOH, Na^CO^, NaHCO^ e.d. gebruikt worden. Om bederf van het reactiemengsel tijdens de enzym-inwerking te voorkomen is het 15 wenselijk een kleine hoeveelheid organisch oplosmiddel zoals chloroform, tolueen of iets dergelijks toe te voegen. Het enzym wordt gewoonlijk gebruikt in een hoeveelheid tussen 1 en 2 % van het gewicht aan poeder dat de enzym-behandeling moet ondergaan.
20 Deze ênzym-inwerking gebeurt gewoonlijk gedurende 1 tot 72 uur (bij voorkeur 24 tot 48 uur) bij 30° tot 40°C. Het kan gebeuren door bijvoorbeeld eerst 1 gew.% enzym aan de oplossing van het te behandelen materiaal toe te voegen, en na 1 tot 24 uur nogeens 1 gew.% enzym, om de inwerking te 25 voltooien.
Na deze enzymatische behandeling wordt zonodig onoplosbaar materiaal verwijderd door centrifugeren, filtreren e.d., waarna de oplossing gescheiden wordt van de respectievelijke onoplosbare fracties der carcinostatische 30 stoffen TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 en TF-350. Op die wijze kan TF-310 uit TF-210 verkregen worden, TF-320 uit TF-220, TF-330 uit TF-230, TF-340 uit TF-240 en TF-350 uit TF-250. Het isoleren van de fracties van deze YF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 en TF-350, afhankelijk van de fractio-35 nering naar de pH, het neerslaan met een hydrofiel organisch 8200640 j 'r - ίο - oplosmiddel, fractionering met een ionenuitwisselaar, ultrafiltratie e.d. Ook kan een of meer van deze bewerking meerdere malen uitgevoerd worden. Met name worden de carcinostatische stoffen TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 en TF-350 ver-5 kregen door de pH van de water-oplosbare fracties op niet hoger dan 2,5 in te stellen (zonodig wordt trichloorazijnzuur toegevoegd), het dan ontstaande neerslag te verwijderen en aan het oplosbare deel een hydrofiel organisch oplosmiddel tot een eind-concentratie tussen 30 en 80 % (bijvoorkeur tussen 60 en 80 %) 10 toe te voegen, het dan ontstaande neerslag op te vangen, deze fractie (die de gewenste stof bevat) desgewenst met een sterke anionenwisselaar zoals Dowex 1 of Amberliet IRA-400 te behandelen (eventueel meerdere malen), de niet geadsorbeerde fracties op te vangen en zonodig aan ultrafiltratie te onderwerpen 15 (bijvoorbeeld door een Toyo Ultrafilter UK-50 of UK-200, die nominaal op molecuulgewichten 50.000 resp. 200.000 scheiden) , en de oplossing dan te concentreren, te ontzouten of te drogen of de stof er met een hydrofiel organisch oplosmiddel uit neer te slaan. De eigenschappen van de aldus te verkrijgen 20 carcinostatische stoffen TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 en TF-350 hebben de in tabel B genoemde eigenschappen.
De carcinostatische stoffen TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 en TF-350 kunnen op gebruikelijke wijze in farmaceutisch aanvaardbare zouten omgezet wor-25 den. Met name kunnen dat de zouten van alkalimetalen zoals natrium, kalium e.d. en van aardalkalimetalen zoals magnesium, calcium e.d. zijn.
8200640 t Jt - 11 -
Tabel B
Fractie Voorkomen Farmacologische Oplosbaarheid __werking_ TF-210 Grijzig-wit, Remt de voortwoekering A . , i · τη. i · t. Onoplosbaar xn lichtbruin van Ehrlich ascites methanol poeder tumor, vast Ehrlich- ethanol ace- tumor, Sacomen 180 en toI1} he^zeeÏli B-16 en Melanoom van de chioro£ormj muis en had een ethylacetaat immunostimulerende en ^iethyl- _werkin§_ether_ TF-220 " " " _____ _ _ ' T, _____ _ _ _ TF-250 " " Oplosbaar in water en onoplosbaar in methanol, ethanol, ace-ton, benzeen, chloroform, ethylacetaat en diethyl- __ether_ TF-300 " Remt de voortwoekering " van Ehrlich ascites tumor, vast Ehrlich tumor, Sarcomen 180 en B-16, Melanoom van de muis en had een immuno- _stimulerende werking _ TF-310_”__"_ TF-320 " Remt de voortwoekering " van Ehrlich ascites tumor en Sarcoom 180 van de muis en had een immuno- _stimulerende werking_ TF-330 " Remt de voortwoekering " van Ehrlich ascites tumor van de muis en had een immunostimulerende _werking_ TF-340 "_» _;_"_ TF-350_”_”_"_ 8200640 • r - 12 -
Vervolg van tabel B
Fractie Deze fracties Infrarood-absorp- Element-analy- hadden geen tiespectrum (in se_ echte smelt- KBr) punten. Ontleden absorptiebanden C(%) H(%) N(%) _trad opt_bij_ TF-210 tussen 160° en 3600-3200, 2950- 40-43 5-7 9-10 235°C 2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 en _1120-1020 cm-1_ TF-220 tussen 160° en " 40-42 5-7 7-9 _240°C_ TF-230 tussen 185° en " 42-45 5-7 10-11 _225°C_ TF-240 tussen 200° en 3600-3200, 2950- 35-38 4-5 12- 215°C 2920, 1680-1620, 14 1550-1520, 1410-1360, 1280-1210, 1060, 960 en '__820 cm~l_______ TF-250 tussen 165° en 3600-3200, 2950- 30-33 3-5 3-5 210°C 2920, 1680-1620, 1550-1510, 1410-1380, 1240-1210, 1150-1120, 1080-1020, 980 en _810 cm~*_______ TF-300 vanaf 180° 3500-3300, 2920, 38-47 5-7 1-4 sterk boven 195° 2850, 1660-1620, 1580,1540, 1460-1400, 1380-1360, 1120, 1080-1020, 970 en 820-800 _cm~l_ TF-310_"_^_38-47 5-7 1-4 TF-320_^_"_38-47 5-7 1-4 TF-330_^_"_38-47 5-7 1-4 TF-340 vanaf 140°C 3500-3300, 2920, 32-34 4-6 3-5 sterk boven 200°C 2850, 1660-1640, 1580-1520, 1460-1440, 1410-1340, 1250-1220, 1120-1030, 970 en _835 cm~l_ TF-350 vanaf 110°C 3500-3300, 2920- 34-37 5-6 1-2 sterk boven 180°C 2900, 1660-1630, 1580-1520, 1460-1340, 1140-1100, 1080-1020, 970 en _820-800 cm-1_ 8200640 i Λ' - 13 -
Vervolg van tabel B
Fractie _Kleurreacties met_
Nin- Reagens v. Fenol- Anthron- Indool- Reagens hydrine Molisch E^SO^ EL^SO^ HC1 van
Lowry- _Folin TF-210 + + + + + IF-220 + + + + + TF-230 + + + + + TF-240 + + + + + TF-250 + + + + + TF-300 - + + + + ' + TF-310 + + + + + TF-320 - + + + + + TF-330 + + + + + TF-340 - + + + + + TF-350 + + + + + 8200640 J i - 14 -
Vervolg van tabel B
Fractie Ultraviolet- Saccharide-gehalte Eiwit-gehalte (be- absorptie- (berekend als glu- rekend als runder- spectra (opl. cose) bepaald met serum-albumine) in water met de fenol-i^SO,- bepaald met de pH = 7,0) methode (in Z) methode van Lowry X (nm) en Folin (in %) _max___ TF-210 Bij de absorp- 5-25 20-50 tiegrens en in de buurt van _248-265 nm s_ TF-220 Bij de absorp- 5-20 < 10 tiegrens en in de buurt van _248-266 nm s_ TF-230 Bij de absorp- 5-25 30-60 tiegrens en in de buurt van _249-264 nm_ TF-240 Bij de absorp- 15-35 20-30 tiegrens en in de buurt van _250-265 nm_ TF-250 Bij de absorptie- 60-80 5-20 grens en in de buurt van _ 248-269 nm_' _ TF-300 Bij de absorptie- 16-60 < 10 grens en in de buurt van _ 246-280 nm _' _ TF-310 _" __"_ TF-320_" H ' _"_ TF-330 "_ "__"_ TF-340 Bij de absorptie- 20-50 " grens en in de buurt van 250-265 ma...........................
TF-350 Bij de absorptie- 80-95 " grens en in de buurt van 246-280 nm s Meting uitgevoerd aan het in water oplosbare deel.
8200640 ϋ * - 15 -
De farmacologische eigenschappen van de carcinogene stoffen TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 en TF-350 zijn zoals hierna beschreven wordt. Bij deze proeven werd voor TF-210 het 5 produkt van voorbeeld I gebruikt, voor TF- 220 het produkt van voorbeeld III, voor TF-230 van voorbeeld V, voor TF-240 van voorbeeld VII, voor TF-250 van voorbeeld IX, voor TF-310-1 van voorbeeld XI(1), voor TF-310-2 van voorbeeld XVIII, voor TF-320 van voorbeeld XII, voor TF-330 van voorbeeld XIII, 10 voor TF-340 van voorbeeld XIX, voor TF-350 van voorbeeld XXIV en voor TF-300 de produkten van voorbeelden XI en XVIII.
(1) Immunostimulerende werking.
Voor elke groep werden drie vrouwelijke, zes weken oude ratten van de stam ICR gebruikt. Elke proefstof 15 werd in fysiologische zout-oplossing opgelost en 0,2 ml van elke oplossing werd intraperitoneaal toegediend. 24 uur na de toediening werd in elke muizenstaart 0,2 ml roet-suspensie ge-injicieerd, welke verkregen was door 1 ml Oostindische inkt (Pelikan no. 17 van de firma Günther-Wagner Co.) te mengen met 20 2 ml fysiologische zout-oplossing die 3 gew.% gelatine bevatte; en 1, 5, 10 en 15 minuten na de injectie werd 0,02 ml bloed met behulp van een met heparine beklede hematocriet-capillair afgetapt, direct verdund en gehemoliseerd met 1,6 ml 0,1 % NaHCO^-oplossing. Van deze oplossing werd de absorptie bij 675 nm 25 gemeten, en de phagocyten-index (K-waarde) werd met de formule van Halpern et al berekend: ..log Cn - log C K = --- fc0 30 waarin = koolstof-gehalte in het bloed op tijd t^ en C = koolstof-gehalte in het bloed op tijd t.
De muizen van de blanco groepen hadden alleen 0,2 ml fysiologische zout-oplossing toegediend gekregen.
35 De uitkomsten staan in tabel C.
8200640 λ r - 16 -
Tabel C
Stof Dosering Gemiddelde K-waarde _(mg/kg)________ TF-210 3 0,1155+0,0273 6 0,1198+0,0231 TF-220 1,5 0,1087+0,0346 3 0,1292+0,0289 TF-230 5 0,1028+0,0175 .10 0,1194 + 0,0334 TF-240 5 0,1109+0,0250 10 0,1127+0,0496 TF-250 5 0,0865 + 0,0131 10 0,1120+0,0329
Blanco - 0,0348 + 0,0037 STF-310-1 0,1 0,0580+0,0088 1 0,0776 + 0,0168 TF-320 0,1 0,0468+0,0123 1 0,0715 + 0,0040 TF-330 0,1 0,0601+0,0098 1 0,0965 + 0,0102
Blanco - 0,0295+0,0007 xTF-340 5 0,1292+0,0229 10 0,1001 +0,0295 TF-350 5 0,0817 + 0,0002 10 0,1453 +0,0229
Blanco - 0,0408 +0,0016 x Deze proef werd uitgevoerd op een groep van 4 muizen.
(2) Carcinostatische werking.
(i) Tegen Ehrlich ascites gezwellen. Vrouwelijke ratten van de ICR-stam van 6 weken oud kregen elk intraperitoneaal 1 x 10^ Ehrlich ascites tumorcellen, en vervolgens gedurende 7 dagen elke dag 0,2 ml oplossing van de te beproeven stof in fysiologische zout-oplos-sing. De blanco groepen kregen alleen 0,2 ml fysiologisch zout- 8200640 -17- i Jr oplossing.
De resultaten hiervan staan in tabel D, waarin T/C staat voor de gemiddelde overlevingsduur in dagen van de behandelde muizen gedeeld door de gemiddelde 5 overlevingsduur van de blanco muizen x 100 (dus in %).
8200640 j i - 18 - •1-1 o ff ÖO 60 •rl ff O O „ „ ffj ..M — _ CO 00 CO 00 00 CO CO 00 00 ff N ~N ·% V -N ^ ’-'.-'r "» i—i o) r'.O —in p* in m cm o o T-t ff O ff
> öO
ff _ ff ff ff) <u ff Ö0 ff ff !> ff) O O „ <ü — — 00 00 00 00 00 00 CO 00 00
!-) O X 'N "V X
μ co cor>s cm p·. p- p* co o cm o o ff > ff O ff — σι ui en p» oo co o —co o 0/-n om π n r·^ o co <f N ui o g>S i—I i—< i—ii—i i—Ir—I —' — — — <—· H ' Λ Λ ΛΛ ΛΛ ΛΛ ΛΛ Γ“ί ff ff « ff ff > ff ff ffr-f ρ·* σ\ —oo coo om -vfio o
AA AA AA AA AA A
ffiff LO-ff· ff ff O <P iff r» OIO CM
ffo +1+1 +1 + 1 +1+1 +1 + 1 +1 + 1 +1 l"H ff) ffff)Ö CM 00 00— Ol ff N ff ff O 00
O ar{ (y AA AA AA AA AA A
ff d öo p·» o ei οι o co co<t· oo o Ê-lffff CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM — OO Λ Λ ΛΑ ΛΛ ΛΛ ΛΛ
γ—I
ff U <—.
ff Ö ff ff ff ÖO ff ÖO f“<! ·—1 ff ffp'P' p- p- p~ r~ r- p- p- γ·» •H öO ff
μ,ϋ.Η*!* XX * * XX a * ff ff) I
caöOff r^-in com — o — o —o O |3 O Λ Λ Λ Λ pvu ο co ο- σο ο o ο ο — CM CO ST ο υ IH CM CM CM CM CM ff O I I I I I ff
+J 1¾ pE4 Ρκ Pn ΗI
on Η Η Η Η H ffl 8200640 19 I „lï *1-1 •Η ja
<U
00 00
T3*H 00 00 CO 00 CO co co CO OO CO
rH u) <}· vO r-. p~ p. ΙΛΙΛ O 00 O
f-l Ö O <0
> M
ö ^ 0) Ö Π3 0) CM ai cd >O 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 S v ^ —·ρ. 's ^ ^ ^ ^ "p- r-1 o < vo i·» ps p>p« r^tn o co o μ co cu
> cd O C
VOO CM p» p» vO 00 PO P* C\ o
cj ^ vo p r>vo r~- r- vö »3· >-< p~ O
Q '*·»* IN? »—**- *-*«-· φ~ rm *—·»>· **»“· i~* Λ Λ ΛΛ ΛΛ ΛΛ Λ ϊ-Μ ω
•S
μ
C
Cd τΗ > cd c μα) _ _ MC> in co νο σν νοσν ui μι· —ο co ,—] «5 0) *« « « ·» *> » « «·> «
OCdr-4 ·<· CM CM Mf ΟΟ <1·σν -Cf Ο CM
u -β ffl +1 + 1 +1+1 +1 + 1 +1+1 +1+1 +1 <u r-Η >
><DO σννΟ Ο— 00 vO COO vOO CO
n a η ft ft ft λ « λλ λ A β p- co σ\οο <τ> σι οο<τ σν ο νο •μ 01 CM CM CM CM CM CM CM CM i— CO — g Μ Λ Λ ΛΛ ΛΛ ΛΛ Λ <u cd Ο Ό) τμ cd μ ,-s ö ö cd <u cd Μ β Μ X ·μ Ρ» Ρ» Ρ* Ρ·- Ρ» Ρ» Γ'.Γ·'· Ρ>· ρ~
2 Μ α) X X XX XX «X XX I
μ Μ ·μ ju
V) —< ui — <— >Λ tO
03 Ö0 <1) * Λ 9\ Ο e ο Ο ο ο
ρ w W
ό Ο ο ο ο ο cm co <r tn o ιμ co co co co co β o I I I I I Λ μ Cu 1¾ Pm pq pq r-4
CO Η η Η Η H PQ
8200640 '» > - 20 - (ii) Werking tegen Sarcoom 180-cellen.
(a) Vrouwelijke muizen van de ICR-stam van 6 weken oud kregen elk intraperitoneaal 1x10 Sarcoom- 180-cellen, en vervolgens gedurende 7 dagen elke dag 0,2 5 ml van een oplossing van de te beproeven stof in fysiologische zout-oplossing. De blanco muizen kregen alleen 0,2 ml zoutoplossing. De uitkomsten hiervan staan in tabel E-l.
10 8200640 r i - 21 -
•«“I
m
X
a
ÖO ÖO
•r4 om min tnm mm mm mm m <u n "«.·>*» ^ ^ \ ^ ">>· > r-IQ) <· m n m <- es —m -i CS o
μ C o <U
> ÖO
0 _ (U ö ♦ T3 <D 0 00 <0 te i> Ό <U mm mm mm mm mm m
Tam <r ïn es m st en m m st sr o <u > ed o ö Οζ-s en en en r^oo men vo cm o co o o σ\ vo <r o cv er» o E_iv—' — es —es — — — es — — —·
AA AA AA AA AA
] r*H
ja te ö +J o μ ö> voo oo o exi en o O es en
<U <ÖO Λ Λ Λ Λ ΛΑ ΑΛ AA A
,α «Μ mo voo — σν i^O esen es Η +I+! +1 + 1 +1+1 +1+1 + i +1 +1 rS £> __ al o eso eno esco o O <r oo 1¾ A η ΛΛ Λ Λ Λ Λ ΛΛ Λ Όΐΰ !**. Ο νΟΟ ΟΊ <f — Ο σ> οο Ο" •ΗΦ es en es en es es es en es es — g ÖO Λ Λ Λ Λ ΛΛ Λ Λ ΛΑ <0 ed Ο Ί3 ι-Ι ed
4J
13 0 ed <U cd eö pj r- ι·*» r-~ Is- 1"» r··»
Ö * 'β * * XX X* XX K* I
H öO <U
n ,Μ ·η m r·» enm — m —m — m οι \ t3 « » ·» m öo <u en o — o g o
O w +J
0 0 0 0-0 o —< cs en vf m u o-ι es es es es es β o I I I I I J3 •u ia ia ta ia a m
co E-t Η Η Η Η M
8200640 j t - 22 - (b) Vrouwelijke muizen van de ICR-stam van 6 weken oud kregen elk subcutaan 1 x Sarcoom-180-cellen, en vervolgens gedurende 7 dagen elke dag 0,2 ml van een oplossing van de te beproeven stof in fysiologische zout-oplos-5 sing of in 5 % waterige glucose-oplossing. De blanco muizen kregen 0,2 ml porties vloeistof zonder proefstof. De uitkomsten hiervan staan in tabel E-2, 10 8200640 5 / - 23 -
/-N
w ooo — <r oo o — vo<tmoo 5 0 CJ CM \Q O CO i"· OH <J* O CH <f 'd* CM CM O CO 0 Ψ~Γ '
H
00 4J in O — I"- ΙΛ CO - CM CM O MO OT VO ·-* Ο O £ r> _ cO r-~ -if CO -Φ "d· CMITICM CM CM <f (O IT) U Λ Λ Λ *«»-»« *"»»**** •Η ΟΟΟ Ο Ο Ο · Ο CM ΟΟΟΟΟΟ ΟΟ % +1+1 +1 +1 +1 + |· +·| +| +| +! +1 +1 +1 +1 +1+1 t? (TvvOtn «d'Or'-CO'CT Γ'· ΟΊ 01 — JO -Φ coot O CM 00 -Φ ιΛΙΛνΟ ΓΟΟ vO 00 CO CO O CM νΟνθ β η η η ·»·»«-·>«* „*»«.#.«>·» **
§ Ο Ο —•fO'-' CM'd" CM CM CM -> >—1 «Π —“ST
H
jjj 7 dagen na 14 dagen na 14 dagen <u Ό U . ......._—--———----------- O cd ° ff .
<Ü * ca <u · -- - co - o
CM ' H
I ö 4J Ά' ' W Μ β ij,
Pi O ÖO
H Cl) H O) 60 . ' ' <s u ai & e S> ^3 |3 CO Ü *i-l co · cd CU WW ’Γ1 „n
E-t cw o *h m y SP
O ω O ® "3 4JCH O H -w *h · _______ - - CO O r-)ft= = = = S '?- - - - - - .
•rl U OO S 5
(D ffl *fl ·Η W O
o i-c CO 3 ij i—I CU ® >> O ‘ft J> Ί0 ^ Pm M m o· r-l cd ff ff cd cu
Cd 00 · [N. Pv p? *ff r-- ΓΧ r* r*. r*. · r·* * * ^ ^
•rl ÖO (U KfH
8*3 * * ***:*, S S . «n * 1 * 1 CO ÖQ CU <-* r-, „ „ —t OOOO— O β O Λ Λ*·*-·* Λ Λ Λ Λ Λ ο «5 3 ο ο οοο.ο οοοοο ο cu s > a ι > § > β ι > .g ο ·Η ·Ι-Ι ·ι-1 ·<-* - Γ-!· "
Pi______ 1____. ------------
— CM
, I
ΟΟ Ο Ο CM ΟΟΟ +1 28 Ν Ο I Ο - ϋ· ο COÖ co ö ο 3 Ö.
τ> ι cd I cd ι *· cd 1 cd m es e s is" ses· 8200640 j i - 24 - (iii) Werking tegen vaste Ehrlich-tumorcellen.
Vrouwe lijke ratten van de ICR-stam van 6 weken oud kregen elk subcutaan in een oksel een transplantaat g van 4 x 10 tumorcellen, en vervolgens of gedurende 7 dagen 5 elke dag of gedurende 10 dagen om de andere dag 0,2 ml van een oplossing van de te beproeven stof in fysiologische zoutoplossing of in een 5 %’s waterige glucose-oplossing. De blanco muizen kregen dezelfde oplossingen volgens hetzelfde tijdschema, alleen zat er geen proefstof in. Na afloop van de proef werd 10 van elk gezwel het gewicht bepaald, hetgeen gebeurde door met behulp van een meetpasser de grootste diameter (a mm) en de kleinere diameter (b mm) te meten en de gevonden waarden in de volgende vergelijking in te vullen: ......*2 15 Gewicht van de tumor = —^- (mg)
De uitkomsten hiervan staan in tabel F.
20 8200640 t * - 25 -
—< /'"N /-N
« 5 £ v_/
ooococMCMcoo,\ooo\'»or''OcfiO
*««» CM en Ό en CM ΙΟ m «if <t O m O ^ H .g ö <u cw m • o
/-\ t—\ U
00¾ * * “ f ~ “ - i
4J CMvOUtcO’-'VO'tf’-^cn <U
o,fir*cr\'-cMcM'©r,»co©eM- — oo o
-30 »«««*«·««·»"* U
— CM — — OO — '-*'- — CMCM O.
~ § +[ +| +| +1 +1 +1 +1 +1 +Ί +1 +1 +1 +i g> ¢) ¢)0 "*
>T3J-lO(NOCrvCn<fr^CNO^CMCOO *H
ocovocncovoooo—> — ooi^r- u Q.Ö λλλλλλλλλλλλ λ O)
Os — K
H ^ ——-————————___— ^ 'd n
ÖO
Ö •r-l co co fa ° ^ 7, _J Λ P< « ft e 2 ? Λ O <U Λ Λ1 cd Λ Ό Ö) η -g « ό o" " o
CU Ö " « ^ 5 H
•H CU CM UO 03 * 3
ΟΛ - CO Mf U ÖO
^ O K
Η -ΰ δ in +J C öo ------- --------1.. ........ ......... " "1'" - ·Η ·Η Pi 3 ·Η
T3 W
öo ö en
CO (U O
M V -rt %
cö *O O
2 _ <D <D I
ü 'ü Ό ÖO U
§S . 2 g g
10 pP U N
oox*Hr^r^r-r^r^.r^r'r^r^r^ en -¾¾¾ .hmSmxkkkxkk**i «I - ft £ J, ,_J PU <U w (U'^'ami^envDo ooooo — o&w U Hllll · —CM — CM — <N „„ ΤΟ S o en e 7 o
.5 i H
r—C — O
Cj CO ·Η
fa I W
— CD fa ï>* o O I « Η «Η
— CM O O O O O O
«H CM CM <n -et ^^”90 o I I CM CM CM S CO Ö Mi
Ufa fa I 1 I i3 r1 .2 w COH H fa fa
Η Η H pq H PQ
8200640 J 4 - 26 - (iv) Werking tegen B-l 6-melanoom.
(a) Mannelijke cellen van de stam BD1\
6 J
van 7 weken oud kregen elk subcutaan in een oksel 1 -x 10 B—16— melanoom-cellen, en vervolgens gedurende 7 dagen elke dag 0,2 5 ml van een oplossing van de te beproeven stof in fysiologische zout-oplossing. De blanco muizen kregen dezelfde oplossing maar dê stiê ·* zonder iets erin. Op de 17 of de 23 dag na de beenting werden de tumorgewichtên bepaald, hetgeen op dezelfde wijze gebeurde als bij (iii). De resultaten hiervan staan in 10 tabel G-l.
8200640 r * - 27 - V Λ <t cm σ\ <* cn co o co o
(j \θ co f-» Γ^. Ρ^ΟΟ νΟίΠ O vO O
Ό
1-I
ftf
cO
P, <u M3
ÖO
CÖ na "ω <u C7 Ί-Ι m 4J co X on — -vfoo 'vovocop^oo — m cm
O CM CO M3 O CM CO l-»0 M3 M3 CO
* ΛΛ Λ Λ Λ Λ ΛΛ Λ ft * Ο) ιΗ|5 Ο cm Ο Ο— — <— Ο Ο Ο 1— Ο Ό
Sm +1 +|+| +1+1 +1+1 +1+1 +1 +1+1 g* <¥
frt W WTO
•HO I"* CM ON — —' 00 O ps m M3 CO O , Ό Ëd O on \o cm r-> r» o on r- m O y
<J}»3 Λ Λ ft ft ft Λ ft ΛΛ Λ Λ Λ pC W
04J m CO CH fOCO CO Μ M <1* <N <f 0¾ •j-l Γ-* § Ö0 <u i-i Ό
-. O
I ë ft O 3 ° « +> ® ’S « *= *g E-H *J 2 Ü C Ό +j c3 <D ft m «β M S -.
pj J5 O
δΟΜΉΓ^Γ^Γ'.Ι'^Γ'-Γ^Γ^Γ^Γ' •Η &0 § M MM MM MM MM 1 Μ I Tm Η A! ·Η _ ° 2
<u ·— ό i'' m co m o m o mo co ITS
w w> <i> - ^- —· ** coo ° 1¾ «} M Η Ό •m ·!-)
•H *H
PQ ,D
oo o o o ooo ,-cm co st m o ·— o m CM CM CM CM CM C CO p Ο I I I I I CÖ 1 cd +J pi* pi* pi* pi* pi* >-* 1¾ r-l
03 Η H EH EH EH M Eh PP
8200640 > λ - 28 - (b) Mannelijke muizen van de BDF.-stam g 1 van 6 weken kregen elk subcutaan in een oksel 1 x 10 B-16-mel- anoom-cellen, en op dagen 13, 15, 17, 19, 21 en 23 na de beën-ting tegelijkertijd intraperitoneaal en in de tumor 0,2 ml 5 van een oplossing van TF-310-2 in 5 % glucose-oplossing.
De blanco muizen kregen volgens hetzelfde tijdschema dezelfde oplossing, maar zonder proefstof erin. Op de 23 dag werden de tumorgewichten bepaald; de uitkomsten hiervan staan in tabel G-2.
10 8200640 £ Γ· - 29 - ✓—\ ο οονο ο ^ m ν in r- co ο Η — οο •ρ Λ χ; η ν νο 'ί οο Ο Ο Ν Ν Μ Ν (Ο 00 ·ρ{ Λ Λ Λ Λ *\ Μ |3 Ο Ο Ο Ο Ο Ο οο +1+1+1 +Ι+Ι +Ι Μ Ο Μ 00 νΟ - Ν (Λ g οι ο w η σι οο [j A A η Λ Λ Λ Η cm -cf co -er -> m α> 4J U +j ft jj «r4 *r4 ·ι-4 a A t /—Λ—v /—λ-\ r-ί CÖ
4J
ϋ e{ rt co nj oo
Ö \D vO vD vO vO
CM 00 >4 *H
I ü Ü X X X XX
O *rl 00 <U
μ,Μ-Ηοαο m o i d) Λ Λ Λ Λ *» Μ 60 (U — ΙΓ) Ο Ο — rH Ο è Ο — 0) Ο νμ
S
Η
CM
ό ο — ο m co ö ο ι «5 4-11¾ rj co 6-1 Μ 8200640 > 1 5 -soes) Acute toxiciteit.
Deze werd bepaald aan vrouwelijke muizen van de ICR-stam van 6 weken oud, bij intraveneuze toediening.
De LD-50 waarden zijn de volgende:
Tabel H
Stof................. LD5q (mg/kg) TF-210 >100 TF-220 >200 10 TF-230 >100 TF-240 >200 TF-250 >200 TF-300 >10 TF-340 >200 15 TF-350 >200 /
Zoals uit de bovenstaande farmacologische proeven blijkt zijn de stoffen TF-2 volgens deze uitvinding als carcinostatische middelen, en men mag verwachten dat 20 ze tegen diverse soorten kanker werkzaam zijn, en dat men vooral tegen vaste kankers een opmerkelijke activiteit mag verwachten. Alle stoffen TF-2 volgens de uitvinding hebben uitstekende effecten.
De stoffen TF-2 kunnen in diverse farma-25 ceutische vormen toegediend worden, voor orale toediening, als zetpillen of als injecties, maar bij voorkeur als injectie-preparaten. Indien ze oraal toegediend worden kunnen de farmaceutische preparaten diverse hulpstoffen bevatten en kunnen ze de vorm van capsules, tabletten, poeders en korrels hebben. 30 Indien ze door injectie toegediend worden kan dat subcutaan, intramusculair en intraveneus zijn, en zowel in de vorm van suspensies als van oplossingen, hetzij in fysiologische zoutoplossing hetzij in glucose-oplossing, welke eventueel ook een 8200640 r * - 31 - plaatselijk verdovingsmiddel bevat.
De dosering der stoffen TF-2 volgens de uitvinding wordt bepaald door de toestand van de patiënt, maar in het algemeen is het wenselijk een volwassen patiënt ëën of 5 meerdere malen per dag ker kg lichaamsgewicht 0,005 tot 50 mg toe te dienen, en wel in het aangetaste lichaamsdeel.
De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de nu komende voorbeelden en hierbij behorende tekeningen, waarvan 10 figuur 1 een microscopische fotografie « van de stam TF-031 van Fusobacterium nucleatum geeft die bij de eerder beschreven proeven gebruikt werd, en waarvan figuren 2 t/m 31 infrarood-spectra, ultraviolet-spectra en zogenaamde "high performance" vloeistof-15 chromatogrammen van de produkten van sommige der hierna te geven voorbeelden weergeven, en wel als volgt:
Nummers der figuren TF-fractie Verkregen IR- UV- HP- in voorb. spectrum spectrum chrom.
20 210 1 2 3 220 III 4 5 230 V 6 7 240 VII 8 9 250 IX 10 11 25 310 XI 12 13 14 320 XII 15 16 17 330 XIII 18 19 20 330-Z XIII 21 22 310-Z XVIII 23 24 25 30 340 XIX 26 27 28 350 XXIV 29 30 31 (de toevoeging -Z duidt op gezuiverde fracties) 35 8200640
1 X
- 32 -
Voorbeeld I
(1) In een 10 liter fermentatievat (van de firma Marubishi Rika Kenkyusho) werd 8 liter kweekmedium "TF-e" gebracht (voor de samenstelling zie tabel A) en door 30 minu- 5 ten verhitten op 120°C gesteriliseerd. Na afkoelen werd een uur lang 100 ml/min. stikstof doorgeleid. Deze vloeistof werd beent met 1 liter voorcultuur van Fusobacterium nucleatum TF-031 (FEKM-5077, ATCC 31647), die ook gekweekt was in het medium TF-e. Na 3 dagen incuberen bij 37°C onder roeren 10 (30 rpm) en doorleiden van 65 ml/min. werden er 160 g Celiet en 80 g cellulose-poeder in geroerd en werd de kwe'ekvloeistof onder afzuigen gefiltreerd, wat 7,0 liter bacteriënvrij fil-traat gaf.
(2) Aan deze 7,8 liter filtraat werd 117 ml 15 geconcentreerd zoutzuur toegevoegd waardoor de pH op 2,0 kwam, waarna 11,7 liter ethanol toegevoegd werd, wat een mengsel met 60 % ethanol gaf dat men 24 uur op 4°C liet staan. De bovenstaande vloeistof werd voorzichtig afgeschonken en de rest werd 5 minuten op 6000 rpm bij 4°C gecentrifugeerd. Het sedi-20 ment werd achtereenvolgens uitgewassen met 400 ml 60 % ethanol met pH a 2,0, 400 ml ethanol, 200 ml aceton, en 200 ml diëthyl-ether, en daarna onder verlaagde druk gedroogd, wat 3,9 g poeder gaf.
(3) Het bij (2) verkregen poeder werd in 25 25 ml water gesuspendeerd. De pH van deze suspensie werd met 1 N
NaOH op 7,5-8,0 ingesteld, en na 30 minuten roeren op kamertemperatuur werd 1 N HC1 toegevoegd tot een pH van 4,0. Na 2 uur roeren onder ijskoeling werd het mengsel 10 minuten bij 10.000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd met 10 ml water 30 met pH = 4,0 uitgewassen, waarbij opnieuw 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd. De wasvloeistof werd bij de moederloog gedaan en het opwerken daarvan is in voorbeeld IX beschreven. Het sediment werd verder uitgewassen met 10 ml ethanol en onder verlaagde druk gedroogd, wat 1,5 g carcino-35 statische stof TF-210 gaf.
De eigenschappen van deze carcinosta- 8200640 1' *· - 33 -
tische stof TF-210 staan in tabel B. Het infrarood- en het ultraviolet-absorptiespectrum daarvan staan in figuren 2 en 3. Voorbeeld II
(1) In een 10 liter fermentatievat werd 5 8 liter kweekmedium TF-d geplaatst, (voor de samenstelling zie tabel A) en gesteriliseerd door 30 minuten verhitten op 120°C.
Na afkoelen werd er 1 uur lang 100 ml/min. stikstof doorgeblazen, en daarna werd beent met 1 liter voorkweek van Fusobacterium nucleatum TF-03I (FERM-5077, ATCC-33647) eerder gekweekt in het 10 medium van dezelfde samenstelling. Na 3 dagen incubatie op 37°C onder roeren op 30 rpm en doorleiden van 65 ml’/min. stikstof werden 160 g Celiet en 80 g cellulose-poeder aan de kweek toegevoegd, het geheel nog eens goed geroerd en onder afzuigen gefiltreerd, wat 7,8 liter bacteriënvrij filtraat gaf.
15 (2) In deze 7,8 liter filtraat werd de pH
met 117 ml geconcentreerd zoutzuur op*2,0 ingesteld, en daarna werd 11,7 liter ethanol toegevoegd, wat een suspensie in 60 % ethanol gaf, die men 24 uur bij 4°C liet staan. Vervolgens werd de bovenstaande vloeistof voorzichtig afgeschonken en de rest 20 5 minuten op 6000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd achter eenvolgens met 400 ml 60 % ethanol met pH = 2,0, 400 ml ethanol, 200 ml aceton en 200 ml diëthylether uitgewassen.
(3) Dit poeder onderging dezelfde behande ling als in voorbeeld 1(3), wat 1,6 g carcinostatische stof 25 TF-210 gaf.
De eigenschappen van deze stof TF-210 staan in tabel B, Het infrarood- en het ultraviolet-spectrum daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld I.
Voorbeeld III
30 (1) In een 10 liter fermentatievat werd 8 liter kweekmedium TF-e geplaatst (zie voor de samenstelling tabel A) en gesteriliseerd door 30 minuten verhitten op 120°C.
Na afkoelen werd er een uur lang 100 ml/min. stikstof doorgeleid en werd de vloeistof beent met 1 liter voorcultuur van 35 Fusobacterium nucleatum TF-031 (FEEM-5077, ATCC-31647) die eer der in een medium met dezelfde samenstelling gekweekt was. Na 8200640 i x - 34 - 5 dagen incuberen bij 37°C onder roeren op 30 rpm en doorleiden van 65 ml/min. stikstof werden 160 g Celiet en 80 g cellulose-poeder toegevoegd, werd het geheel nog eens goed geroerd en dan onder afzuigen gefiltreerd, wat 7,8 liter bacterievrij filtraat 5 gaf.
(2) In deze 7,8 liter filtraat werd de pH
met 117 ml geconcentreerd zoutzuur op 2,0 ingesteld, waarna 11,7 liter ethanol toegevoegd werd, wat een suspensie in 60 % ethanol gaf, die men 24 uur bij 4°C liet staan. De bovenstaande 10 vloeistof werd voorzichtig afgeschonken en de rest 5 minuten bij 4°C op 6000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd achtereenvolgens met 400 ml 60 % ethanol met pH = 2,0, 400 ml ethanol, 200 ml aceton en 200 ml diëthylether uitgewassen en onder verlaagde druk gedroogd, wat 4,9 g poeder gaf.
15 (3) Het in (2) verkregen poeder werd in 49 ml water gesuspendeerd, en de pH daarvan werd met 1 N NaOH op 7,5-8,0 ingesteld. Na 30 minuten roeren op kamertemperatuur werd de pH met 1 N HC1 op 6,0 ingesteld. Na 2 uur roeren onder koeling met ijs werd het mengsel 10 minuten op 10.000 rpm ge-20 centrifugeerd. Het sediment werd met 5 ml water met pH = 6,0 uitgewassen, waarbij opnieuw 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd. Daarna werd het neerslag met 10 ml ethanol uitgewassen en onder verlaagde druk gedroogd, wat 1,8 g carcinostatische stof TF-220 gaf.
25 De eigenschappen hiervan staan in tabel B. Het infrarood- en het ultraviolet-absorptiespectrum daarvan staan in figuren 4 en 5.
•Voorbeeld IV
(1) In een 10 liter fermentatievat werd 30 8 liter kweekmedium TF-d geplaatst (voor de samenstelling zie tabel A) en door 30 minuten verhitten op 120°C gesteriliseerd.
Na afkoelen werd er een uur 100 ml/min. stikstof doorgeleid, waarna beent werd met 1 liter voorkweek van Fusobacterium nucleatum TF-031 (FEBM-5077, ATCC-31647) die eerder in een me-35 dium met dezelfde samenstelling gekweekt was. Na 5 dagen incuberen bij 37°C onder roeren op 30 rpm en doorleiden van 65 ml/ 8200640 i * - 35 - min. stikstof werden 160 g Celiet en 80 g cellulose-poeder toegevoegd, hetgeen nog eens goed omgeroerd en dan onder afzuigen gefiltreerd, wat 7,8 liter bacterievrij filtraat gaf.
(2) In deze 7,8 liter filtraat werd de pH 5 met geconcentreerd zoutzuur op 2,0 ingesteld, en daarna werd 11,7 liter ethanol toegevoegd, wat een suspensie in 60 % ethanol gaf, die men 24 uur op 4°C liet staan. Nu werd de bovenstaande vloeistof voorzichtig afgeschonken en de rest werd 5 minuten bij 4°C op 6000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment 10 werd achtereenvolgens uitgewassen met 400 ml 60 % ethanol met pH = 2,0, 400 ml ethanol, 200 ml aceton en 200 ml diethylether en onder verlaagde druk gedroogd, wat 5,07 g poeder gaf.
(3) Het aldus verkregen poeder werd precies als in voorbeeld 111(3) behandeld, wat 1,9 g carcinostatische 15 TF-220 gaf.
De eigenschappen hiervan staan in tabel B. Het infrarood- en het ultraviolet-absorptiespectrum daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld III. Voorbeeld V
20 (1) In een 10 liter fermentatievat werd 8 liter kweekmedium TF-e geplaatst (voor de samenstelling zie tabel A) en door 30 minuten verhitten op 120°C gesteriliseerd.
Na afkoelen werd er een uur 300 ml/min. doorgeleid, waarna beent werd met 1 liter voorkweek van Fusobacterium nucleatum 25 TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) die eerder in hetzelfde medium gekweekt was. Na 2 dagen incuberen bij 37°C onder roeren bij 30 rpm en doorleiden van 65 ml/min. stikstof werden 160 g Celiet en 80 g cellulose-poeder toegevoegd, werd het geheel nog eens goed omgeroerd en dan onder afzuigen gefiltreerd, 30 wat 7,8 g bacterievrij filtraat gaf.
(2) In deze 7,8 liter filtraat werd de pH
met 117 ml geconcentreerd zoutzuur op 2,0 ingesteld, waarna 11,7 liter ethanol toegevoegd werd, wat een suspensie in 60 % ethanol gaf. Na 24 uur staan op 4°C was het neerslag volledig 35 bezonken. De bovenstaande vloeistof werd voorzichtig afgeschonken en de rest werd 5 minuten op 6000 rpm bij 4°C gecen- 8200640 * X - - 36 - trifugeerd. Dit neerslag werd achtereenvolgens met 400 ml 60 % ethanol met pH = 2,0, 400 ml ethanol, 200 ml aceton en 200 ml diëthylether uitgewassen en onder verlaagde druk gedroogd, wat 2,73 g poeder gaf.
5 (3) Het in (2) verkregen poeder werd in 25 ml water gesuspendeerd, en de pH daarvan werd met 1 N NaOH op 7,5-8,0 ingesteld. Na 30 minuten roeren op kamertemperatuur werd de pH met 1 N HC1 op'ö,0 ingesteld. Vervolgens werd de suspensie onder ijskoeling 2 uur geroerd en dan 10 minuten op 10 10.000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd met 5 ml water met pH 6,0 uitgewassen, waarbij opnieuw 10 minuten'op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd.
Wasvloeistof werd met de eerder verkregen vloeistof gecombineerd en nadat daarin de pH met 1 N HC1 15 op 4,0 ingesteld was liet men 12 uur op een temperatuur van niet meer dan 5°C staan, waarna opnieuw 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd. Het sediment werd met 15 ml water met pH = 4,0 uitgewassen, waarbij opnieuw 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd, en vervolgens met 10 ml ethanl en ten-20 slotte onder verlaagde druk gedroogd, wat 0,58 g carcinostati-sche stof TF-230 gaf.
De eigenschappen van deze stof TF-230 staan in tabel B, en het infrarood- en ultraviolet-absorptie-spectrum staan in figuren 6 en 7.
25 Voorbeeld VI
(1) In een 10 liter fermentatievat werd 8 liter kweekmedium TF-d geplaatst (voor de samenstelling zie tabel A) en door 30 minuten verhitten op 120°C gesteriliseerd.
Na afkoelen werd er 1 uur lang 100 ml/min. stikstof doorgeleid, 30 waarna beent werd met 1 liter voorkweek van Fusobacterium nucleatum TF-0,31 (FEBM-5077, ATCC-31647) die eerder in hetzelfde medium gekweekt was. Na 2 dagen incuberen bij 37°C onder roeren op 30 rpm en doorleiden van 65 ml/min. stikstof werden 160 g Celiet en 80 g cellulose-poeder toegevoegd, het geheel 35 nog eens goed omgeroerd, en dan onder afzuigen gefiltreerd, wat 8200640 4 * - 37 - 7,8 liter bacterevrij filtraat gaf.
(2) In deze 7,8 liter filtraat werd de pH met 117 ml geconcentreerd zoutzuur op 2,0 ingesteld, waarna 11,7 liter ethanol toegevoegd werd, wat een suspensie in 60 % 5 ethanol gaf. Na 24 uur staan op 4°C werd de bovenstaande vloeistof voorzichtig afgeschoriken en de rest 5 minuten bij 4°C op 6000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd achtereenvolgens uitgewassen met 400 ml 60 % ethanol met pH = 2,0, 400 ml ethanol, 200 ml aceton en 200 ml diethylethér, waarna onder 10 verlaagde druk gedroogd werd, wat 3,15 g poeder gaf.
(3) Het in (2) verkregen poeder'werd op dezelfde wijze als in voorbeeld V(3) behandeld, wat 0,8 g carcino-statische stof TF-230 gaf. De eigenschappen hiervan staan in tabel B. Het infrarood- en het ultraviolet-absorptie-spectrum 15 hiervan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld V.
Voorbeeld VII
(1) In 25 ml water werd 3,9 g poeder gesuspendeerd dat op dezelfde wijze verkregen was als in voorbeeld 1(1) en (2). De pH werd met 1 N NaOH op 7,5-8,0 ingesteld, en 20 na 30 minuten roeren op kamertemperatuur werd de pH weer met 1 N HC1 op 6,0 ingesteld. Na 2 uur roeren onder ijskoeling werd de suspensie 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd uitgewassen met 5 ml water met pH = 6,0, waarbij opnieuw 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd. De was-25 vloeistof werd met de eerder verkregen afgeschonken vloeistof gecomcbineerd en de opwerking daarvan staat in onderdeel (2) hierna. Het sediment werd nogeens met 10 ml ethanol uitgewassen en onder verlaagde druk gedroogd, wat 1,06 g carcinosta-tische stof TF-220 gaf.
30 De eigenschappen daarvan staan in tabel B* Het infrarood- en het ultraviolet-absorptiespectrum daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld III.
(2) In de bij (1) verkregen combinatie van oplossing en wasvloeistof werd de pH met 1 N HC1 op 4,0 inge- 35 steld, waarna men de suspense 12 uur bij niet hoger dan 5°C liet staan. Vervolgens werd hij 10 minuten op 10.000 rpm ge- 8200640 * r - 38 - centrifugeerd, en het sediment werd met 5 ml water met pH *> 4,0 uitgewassen, waarna opnieuw 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd. Oplossing en waswater werden opnieuw gecombineerd en het opwerken daarvan wordt hierna in (3) beschre-5 ven. Het sediment werd met 5 ml ethanol uitgewassen en onder verlaagde druk gedroogd, wat 0,48 g carcinostatische stof TF-230 gaf. De eigenschappen hiervan staan in tabel B, en het infrarood- en het ultraviolet-absorptiespectrum hiervan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld V.
10 (3) In de bij (2) verkregen combinatie van oplossing en wasvloeistof werd de pH met 1 N zoutzuur op 2,0 ingesteld, waarna men de suspensie 2 uur onder ijskoeling liet staan. Nu werd deze 10 minuten op 6000 rpm gecentrifugeerd, en het sediment werd met 3 ml water met pH = 2,0 uitgewassen, 15 waarbij opnieuw 10 minuten op 6000 rpm gecentrifugeerd werd.
Afgeschonken vloeistof en waswater werden gecombineerd en het opwerken daarvan wordt hierna in (4) beschreven. Het sediment werd nog eens met 5 ml ethanol gewassen en onder verlaagde druk gedroogd, wat 0,10 g carcinostatische stof TF-240 gaf. De 20 eigenschappen daarvan staan in tabel B, en het infrarood- en het ultraviolet-spectrum daarvan staan in figuren 8 en 9.
(4) Aan de bij (3) verkregen combinatie van afgeschonken vloeistof en wasvloeistof werd zoveel ethanol toegevoegd dat het mengsel 80 % ethanol bevatte, en dit mengsel 25 liet men 12 uur bij niet hoger dan 5°C staan. Het ontstane neerslag werd afgescheiden door 10 minuten centrifugeren op 6000 rpm, waarna het achtereenvolgens met 10 ml 80 % ethanol en 10 ml ethanol uitgewassen werd en onder verlaagde druk gedroogd, hetgeen 2,08 g carcinostatische stof TF-250 gaf. De 30 eigenschappen daarvan staan in tabel B, en het infrarood- en het ultraviolet-absorptiespectrum daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van het nog komende voorbeeld IX.
Voorbeeld VIII
In 45 ml water werd 4,5 g poeder ge-35 suspendeerd dat op eenzelfde wijze verkregen was als beschreven in onderdelen (1) en (2) van voorbeeld II. Met IN NaOH
8200640 1 ;· - 39 - werd de pH van deze suspensie op 7,5-8,0 ingesteld, en na 30 minuten roeren op kamertemperatuur werd de pH met 1 N HC1 op 4.0 ingesteld, waarna 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd. Het sediment werd met 5 ml water met pH = 4,0 uitgewassen, 5 waarbij opnieuw 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd.
De wasvloeistof werd met de eerder verkregen afgeschonken vloeistof gecombineerd, en daarin werd de pH met 1 N HC1 op 2.0 ingesteld, waarna men die vloeistof 2 uur onder ijskoeling liet staan en nog eens 10 minuten op 6000 rpm centrifugeerde.
10 Het daarbij verkregen sediment werd uitgewassen met 3 ml water met pH = 2,0, waarbij opnieuw 10 minuten op 6000 rpm gecentrifugeerd werd, en het sediment werd daarna met 5 ml ethanol uitgewassen en onder verlaagde druk gedroogd, wat 0,12 g carci-nostatische stof TF-240 gaf.
15 De eigenschappen daarvan staan in tabel B en het infrarood- en het ultraviolet-absorptie-spectrum daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld VII. Voorbeeld ΙΣ
(1) In de bij voorbeeld 1(3) verkregen com-20 binatie van afgeschonken vloeistof en wasvloeistof werd de pH
met 1 N HCl op 2,0 ingesteld, en na 2 uur staan onder ijskoeling werd het 10 minuten op 6000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd uitgewassen met 3 ml water met pH = 2,0, waarbij opnieuw 10 minuten op 6000 rpm gecentrifugeerd werd. De wasvloeistof 25 werd met de eerder afgeschonken vloeistof gecombineerd, en de opwerking daarvan wordt hierna onder (2) beschreven. Het sediment werd nog eens met 5 ml ethanol uitgewassen en onder verlaagde druk gedroogd, wat 0,11 g carcinostatische stof TF-240 gaf.
30 De eigenschappen hiervan staan in tabel B. Het infrarood- en het ultraviolet-absorptiespectrum daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld VII.
(2) Aan de bij (1.) verkregen combinatie van afgeschonken vloeistof en wasvloeistof werd zoveel ethanol toe- 35 gevoegd dat een mengsel met 80 % ethanol verkregen werd, en na 12 uur staan bij niet hoger dan 5°C werd het ontstane neer- 8200640 ' ji - 40 - slag afgecentrifugeerd en met achtereenvolgens 10 ml 80 % ethanol en 10 ml ethanol uitgewassen en onder verlaagde druk gedroogd, wat 2,1 g carcinostatische stof TF-250 gaf.
De eigenschappen daarvan staan in tabel 5 B, en het infrarood- en het ultraviolet-absorptiespectrum daarvan staan respectievelijk in figuren 10 en 11.
Voorbeeld X
In 45 ml water werd 4,5 g poeder gesuspendeerd dat op een zelfde wijze verkregen was als in voorbeeld 10 1181) en (2). Met IN NaOH werd de pH op 7,5-8,0 ingesteld, en na 30 minuten onder roeren staan bij kamertemperatuur werd de pH met IN zoutzuur weer op 2,0 gebracht, waarna 10 minuten op 6000 rpm gecentrifugeerd werd. Het sediment werd uitgewassen met 10 ml water met pH = 2,0, waarbij opnieuw 10 minuten op 6000 15 rpm gecentrifugeerd werd, en de wasvloeistof werd met de eerder verkregen vloeistof gecombineerd. Hieraan werd zoveel ethanol toegevoegd dat het mengsel 80 % ethanol bevatte. Na 12 uur staan bij niet hoger dan 5°C werd dit mengsel 10 minuten op 6000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd achtereenvolgens met 10 ml 20 80 % ethanol en met 10 ml ethanol uitgewassen en onder verlaag de druk gedroogd, wat 2,68 g carcinostatische stof TF-250 gaf.
De eigenschappen daarvan staan in tabel B, en het infrarood- en het ultraviolet-absorptiespectrum daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld IX.
25 'Voorbeeld XI
(1) In 15 ml water werd 1,5 g van de in voorbeeld I verkregen carcinostatische stof TF-210 gesuspendeerd, en in deze suspensie werd de pH met 1 N NaOH op 7,8 gebracht. Na opwarmen tot 37°C werd hieraan 15 mg Pronase E 30 (produkt van de firma Kaken Kagaku, 1.000.000 tyrosine-eenheden per gram) toegevoegd, alsmede enkele druppels tolueen. Onder schudden liet men het enzym 24 uur bij pH - 7,8-8,0 en bij 37-40°C inwerken, en daarna werd 10 minuten op 4000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd uitgewassen met 3 ml water met 35 pH is 8,0, waarbij opnieuw 10 minuten op 4000 rpm gecentrifugeerd werd. De wasvloeistof werd met de eerder afgeschonken 8200640 4 - 4α - vloeistof gecombineerd, en hierin werd de pH met 1 N HCl op 2,0 ingesteld, waarbij opnieuw een neerslag ontstond. Na 12 uur staan op 5°C werd deze suspensie 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd, en het sediment werd uitgewassen met 3 ml water 5 met pH = 2,0, waarbij opnieuw 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd. De wasvloeistof werd met de eerder afgeschonken vloeistof gecombineerd, en hieraan werd zoveel ethanol toegevoegd dat het mengsel 80 % ethanol bevatte. Na 2 uur roeren onder ijskoeling werd 10 minuten op 4000 rpm gecentrifugeerd, en 10 het sediment werd achtereenvolgens met 5 ml 80 % ethanol en met 5 ml ethanol uitgewassen en onder verlaagde druk ge’droogd, wat 327 mg carcinostatische stof TF-330 gaf.
In 5 ml water werd deze 327 mg poeder opgelost, en na instellen van de pïï op 7,0 (met IN NaOH) werd 15 deze oplossing op een kolom van 45 ml Amberlite IRA 400 (produkt van de firma Rohm & Haas) gebracht die van te voren met IN NaOH in de 0H-vorm gebracht was. Vervolgens werd 200 ml water door de kolom geleid. Alle eluaten werden gecombineerd en de pH werd met 1 N zoutzuur op 7,0 bijgesteld. Deze oplossing werd 20 onder verlaagde druk geconcentreerd en dan door een Millipore-filter met porie-diameter van 0,3 jm. geleid (dit is een produkt van de Japan Millipore Ltd.) en tenslotte gevriesdroogd, wat 210 mg carcinostatische stof TF-330 gaf.
De eigenschappen daarvan staan in tabel 25 B, en het saccharide-gehalte daarvan lag in het algemeen tussen 20 en 60 %. Het infrarood- en het ultraviolet-spectrum en een representatief "high performance" vloeistofchromatogram daarvan staan respectievelijk in figuren 32, 33 en 14, (2) In 50 ml water werd 140 mg van het hier- 30 boven verkregen produkt TF-310 opgelost, en deze oplossing werd 300-voudig geconcentreerd door middel van een Ultrafilter UK-50 (produkt van de firma Toyo Roshi K.K., dat nominaal op een mole-cuulgewicht van 50.000 scheidt). Dit concentraat werd gefiltreerd' door een Millipore-filter met porie-doorsnede van 0,2 ^im en 35 daarna gevriesdroogd, wat 88 mg TF-310-Z gezuiverd en gevriesdroogd TF-310) gaf. De eigenschappen hiervan staan in tabel B, 8200640 - 42 -
en het saccharide-gehalte lag in het algemeen tussen 16 en 30 %. Voorbeeld XII
(1) In 10 ml water werd 1 g van de in voor beeld VII(l) verkregen carcinostatische stof TF-220 gesus-5 pendeerd, en in deze suspensie werd de pH met 1 N NaOH op 7,8 ingesteld. Na opwarmen tot 37°C werden er van 15 mg Pronase E en enkele druppels tolueen aan toegevoegd. Onder schudden liet men het enzym bij 37° tot 40°C en bij pH tussen 7,8 en 8,0 inwerken, en daarna werd 10 minuten op 4000 rpm gecentrifugeerd.
10 Het sediment werd uitgewassen met 3 ml water met pH = 8,0, waarbij opnieuw 10 minuten op 4000 rpm gecentrifugeerd werd.
De wasvloeistof werd met de eerder afgeschonken vloeistof gecombineerd en hierin werd de pH met IN HC1 op 2,0 ingesteld, waarbij opnieuw een neerslag ontstond. Na 12 uur staan op 5°C 15 werd dit 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd uitgewassen met 3 ml water met pH = 2,0, waarbij opnieuw 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd wérd. De wasvloeistof daarvan werd met de eerder afgeschonken vloeistof gecombineerd, en daaraan werd zoveel ethanol toegevoegd dat een 20 mengsel met 80 % ethanol ontstond. Na 2 uur roeren onder ijs-koeling werd 10 minuten op 4000 rpm gecentrifugeerd, en het daarbij verkregen sediment werd uitgewassen met 5 ml 80 % ethanol en met 5 ml ethanol, en onder verlaagde druk gedroogd, wat 163 mg carcinostatische stof TF-320 gaf.
25 In 5 ml water werd 150 mg van het zo juist verkregen poeder opgelost, en na bijstellen van de pH met IN NaOH op 7,0 werd de oplossing gebracht op een kolom van 25 ml Amberlite IRA 400 die van te voren met 1 N NaOH in de OH-vorm gebracht was. Daarna werd 100 ml water door de kolom 30 geleid. Alle eluaten werden gecombineerd, en hierin werd met IN zoutzuur de pH op 7,0 bijgeregeld. Deze oplossing werd onder verlaagde druk geconcentreerd en door een Millipore-filter met porie-diameter van 0,3 yim gefiltreerd, en tenslotte gevriesdroogd, wat 110 mg TF-320-Z gaf.
35 He eigenschappen van de carcinostatische stof TF-320 staan in tabel B, en het saccharide-gehalte daarvan 8200640 - 43 - lag in het algemeen tussen 20 en 60 %. Het infrarood- en het ultraviolet-absorptiespectrum en een representatief "high performance" vloeistofchromatogram staan in respectievelijk figuren 15, 16 en 17.
5 (2) In 50 ml water werd 100 mg van het aldus verkregen produkt TF-32Q opgelost, en deze oplossing werd 100-voudig geconcentreerd met behulp van het Ultrafilter UK-50.
Dit concentraat werd gefiltreerd door een Millipore filter met porie-diameter van 0,2^im, en daarna gevriesdroogd, hetgeen 10 72 mg TF-320-Z (gezuiverd en gevriesdroogd TF-320) gaf. De eigenschappen van deze gezuiverde fractie staan in tabel B, en het saccharide-gehalte daarvan lag in het algemeen tussen 16 en 30 %.
Voorbeeld XIII
15 (1) In 5 ml water werd 0,48 g van het in voorbeeld VII(2) verkregen produkt TF-320 gesuspendeerd. Na bijregelen van de pH met IN NaOH op 7,8 en opwarmen tot 37°C werden er 5,0 mg Pronase E en enkele druppels tolueen aan toegevoegd. Onder roeren liet men het enzym 24 uur bij 37° tot 40°C 20 en bij pH = 7,8-8,0 inwerken, waarna 10 minuten op 4000 rpm gecentrifugeerd werd. Het sediment werd uitgewassen met 3 ml water met pH = 8,0, waarbij opnieuw 10 minuten op 4000 rpm gecentrifugeerd werd. De wasvloeistof werd met de eerder verkregen afgeschonken vloeistof gecombineerd, en hierin werd met IN HC1 de 25 pH op 2,0 ingesteld, waardoor een neerslag ontstond. Na 12 uur staan op 5°C/werd dit mengsel 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd. Het neerslag werd uitgewassen met 3 ml water met pH = 2,0, waarbij opnieuw 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd. De wasvloeistof daarvan werd met de eerder afgeschonken 30 vloeistof gecombineerd, en hieraan werd zoveel ethanol toegevoegd dat een mengsel met 80 % ethanol ontstond. Na 2 uur roeren onder ijskoeling werd 10 minuten op 4000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd achtereenvolgens met 5 ml 80 % ethanol en met 5 ml ethanol uitgewassen en onder verlaagde druk ge-35 droogd, wat 100 mg carcinostatische stof TF-330 gaf.
Deze 100 mg werd in 5 ml water opgelost, 8200640 ' i - 44 - en na bijstellen van de pH met 1 N NaOH op 7,0 werd deze oplossing op een kolom van 15 ml Amberlite IRA 400 gebracht, die vooraf met IN NaOH in de OH-vorm gebracht was. Vervolgens werd 60 ml water door de kolom geleid. Alle eluaten werden 5 gecombineerd, en hierin werd met IN HC1 de pH op 7,0 ingesteld. Nu werd de oplossing onder verlaagde druk geconcentreerd en door een Millipore-filter met porie-diameter van 0,3 jm gefiltreerd en tenslotte gevriesdroogd, hetgeen 70 mg TF-330 gaf.
De eigenschappen van de carcinostati-10 sche stof TF-330 staan in tabel B, en het infrarood- en het ultraviolet-absorptiespectrum daarvan en een representatief "high performance" vloeistofchromatogram staan in respectievelijk figuren 18, 19 en 20.
(2) In 50 ml water werd 70 mg van de aldus 15 verkregen stof TF-330 opgelost, en deze oplossing werd 100-voudig geconcentreerd met behulp van het Ultra-filter UK-50.
Het concentraat werd door een Millipore-filter met porie-door-snede 0,2 jm. gefiltreerd en daarna gevriesdroogd, wat 49 mg TF-330-Z (gezuiverd en gevriesdroogd TF-330) gaf. De eigen-20 schappen daarvan staan in tabel B en het saccharide-gehalte daarvan lag in het algemeen tussen 16 en 30 %. Het infrarood-en het ultraviolet-absorptie-spectrum daarvan staan in figuren 21 en 22.
Voorbeeld XIV
25 (1) Overeenkomstig voorbeelden 11(3), VII(l) en VII(2) werd 4,5 g van de in voorbeeld 11(1) en (2) verkregen stof behandeld, wat respectievelijk de fracties TF-210, TF-220 en TF-230 gaf.
(2) Deze drie fracties werden op dezelfde 30 wijze behandeld als in voorbeeld XI(1), voorbeeld XII(1) en voorbeeld XIII(1), wat respectievelijk 220 mg, 120 mg en 75 mg van de gevriesdroogde carcinostatische stoffen TF-310, TF-320 en TF-330 gaf.
De eigenschappen van deze drie fracties 35 staan in tabel B, en de infrarood- en ultraviolet-absorptie- spectra en de vloeistofchromatogrammen daarvan waren in hoofd 8200640 i - 45 - zaak identiek met die van voorbeelden XI, XII en XIII,
Voorbeeld XV
Op eenzelfde wijze als in voorbeeld XI werd 1,5 g van de in voorbeeld I verkregen carcinostatische 5 stof TF-210 behandeld, behalve dat nu in plaats van het Pronase E 15 mg trypsine gebruikt werd, en (b) dat in plaats van een 80 % ethanol-mengsel een 60 %ethanol-mengsel werd aangemaakt. Aldus werd 200 mg gevriesdroogde, carcinostatische stof TF-310 verkregen. Op een zelfde wijze werden ook de volgende twee 10 gevriesdroogde carcinostatische stoffen TF-320 en TF-330 verkregen:
Carcinostatische Trypsine Gevriesdroogde stof 'Stof............. ’ .......... ..
15 TF-220 1,0 g_15 mg_TF-320 100 mg_ TF-230 0,48 g 5 mg TF-330 65 mg
De eigenschappen van deze carcinostatische stoffen TF-310, TF-320 en TF-330 staan in tabel B, en 20 de infrarood- en ultraviolet-absorptiespectra daarvan en de vloeistofchromatogrammen daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeelden XI, XII en XIII(l).
Voorbeeld XVI
De in voorbeeld I, voorbeeld VII(l) en 25 voorbeeld VII(2) verkregen carcinostatische stoffen TF-210, TF-220 en TF-230 werden op een zelfde wijze behandeld als in voorbeeld XI(1), voorbeeld XII(l) en voorbeeld XIII(l) behalve dat na de behandeling met enzym de waterige oplossing met een pH = 2,0 in een 60 % ethanol-oplossing in plaats van in 30 een 80 % ethanol-oplossing omgezet werd. Aldus werden de gevriesdroogde carcinostatische stoffen TF-310, TF-320 en TF-330 verkregen in hoeveelheden van respectievelijk 190 mg, 98 mg en 66 mg.
De eigenschappen van deze carcinosta-35 tische stoffen TF-310, TF-320 en TF-330 staan in tabel B, en de infrarood- en ultraviolet-absorptiespectra en de vloeistof- 8200640 - 46 - chromatogrammen daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeelden XI, XII en XIII(l).
Voorbeeld XVII
De in voorbeeld I, voorbeeld VII(l) en 5 voorbeeld VII(2) verkregen carcinostatische stoffen TF-210, TF-220 en TF-230 werden op dezelfde wijze behandeld als in voorbeeld XI(1), voorbeeld XII(1) en voorbeeld XIII(l), behalve dat na de behandeling met enzym de waterige oplossing met pH = 2,0 in een 60 % ethanol-oplossing omgezet werd in plaats van 10 in een 80 % ethanol-oplossing. Aldus werden de carcinostatische stoffen TF-310, TF-320 en TF-330 verkregen in opbrengsten van respectievelijk 192 mg, 102 mg en 65 mg.
De eigenschappen van deze carcinostatische stoffen TF-310, TF-320 en TF-330 staan in tabel B, en 15 de infrarood- en ultraviolet-absorptiespectra en de vloeistof-chromatogrammen daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeelden XI, XII en XIII(l).
Voorbeeld XVIII
(j} In een 90 liter fermentatievat (type 20 MSJ-l^ van de firma Marubishi Rika Kenkyusho) werd 70 liter kweekmedium TF-f geplaatst (voor de samenstelling zie tabel A) en gesteriliseerd door 15 minuten verhitten op 118°C. Na afkoelen werd er een uur lang 250 ml/min. stikstof doorgeleid.
Dit kweekmedium werd beent met 900 ml 25 voorkweek van Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) die vooraf in een medium met dezelfde samenstelling gekweekt was. Na 4 dagen incuberen op ongeveer 33°C onder roeren op 90 rpm en doorleiden van 250 ml/min. stikstof werd aan de vloeistof per liter 10 g Celiet en 5 g cellulose-poeder 30 toegevoegd, het geheel goed omgeroerd en vervolgens onder afzuigen gefiltreerd, wat 65 liter bacterievrij filtraat gaf.
(2). In 7,5 liter van dit filtraat werd de pH met 13 ml geconcentreerd zoutzuur op 2,0 ingesteld. Daarna werd 11,4 liter ethanol toegevoegd, hetgeen een mengsel met 60 35 % ethanol gaf, dat men 24 uur bij 4°G liet staan. Vervolgens werd de heldere bovenstaande vloeistof afgeschonken en de 8200640 •i * - 47 - rest werd 10 minuten bij 4°C op 4000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd met 2 x 100 ml 60 % ethanol met pH = 2,0 uitgewassen, vervolgens met 150 ml ethanol, 150 ml methanol en tenslotte met 150 ml aceton, waarna het aan de lucht gedroogd 5 werd tot 3,0 g poeder.
(3) Het in (2) verkregen poeder werd in 30 ml water gesuspendeerd, en na instellen van de pH met 4N NaOH op 7,5-8,0 liet men 15 minuten onder roeren op kamertemperatuur staan en werd de pH met 4N zoutzuur weer op 4,0 10 gebracht. Na 2 uur staan onder ijskoeling werd dit mengsel 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd in 6 ml water opgeroerd, hierin werd de pH met 4N NaOH op 7,5-8,0 ingesteld, en na 15 minuten roeren op kamertemperatuur werd de pH met 4N HC1 weer op 4,0 gebracht; na nog eens 2 uur staan 15 onder ijskoeling werd deze wassuspensie 10 minuten op 10.000 gecentrifugeerd, en het daarbij verkregen sediment werd met 4 ml water met pH = 4,0 uitgewassen, waarbij weer 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd, wat 6,2 g vaste stof gaf (TE-210).
20 De eigenschappen van deze carcinosta- tische stof TF-210 staan in tabel B en het infrarood- en het ultraviolet-absorptiespectrum daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld I.
(4) De in (3) verkregen 6,2 g sediment werd 25 in 6 ml water gesuspendeerd, en de pH van deze suspensie werd met een verzadigde oplossing van ammoniumcarbonaat in water op 7,8 bij gesteld. Na opwarmen tot 37°C werden er 21 mg Pronase E en enkele druppels tolueen aan toegevoegd. Men liet het enzym 24 uur bij 37° tot 40°C en pH van 7,8-8,0 inwerken. Daarna 30 werd de pH van het reactiemengsel met 4 N zoutzuur op 1,0 ingesteld, waardoor een.neerslag ontstond. Deze suspensie liet men 2 uur onder ijskoeling staan waarna 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd. Aan de afgeschonken vloeistof werd 29 ml ethanol toegevoegd, waardoor een suspensie van een neerslag in 35 60 % ethanol ontstond. Na 2 uur staan onder ijskoeling werd dit 10 minuten op 6000 rpm gecentrifugeerd, en het sediment 8200640 J l - 48 - werd achtereenvolgens met 5 ml 60 % ethanol, 10 ml ethanol en 10 ml aceton uitgewassen en aan de lucht gedroogd, wat 315 mg ruwe kristallen van de carcinostatische stof TF-310 gaf.
5 Deze 315 mg ruwe kristallen werden in 30 ml water opgelost en na bijregelen van de pH met 4N NaOH op 8,0 werd de oplossing op een kolom van 30 ml Dowex 1x4 (produkt van de firma Dow Chemical) in de Cl-vorm gebracht. Daarna werd 100 ml water door de kolom geleid en alle eluaten 10 werden gecombineerd. Hierin werd de pH op 6,5-7,0 ingesteld, waarna door een Ultrafilter UK-50 gefiltreerd werd, en het filtraat werd 100-voudig geconcentreerd. Dit concentraat werd door een Millipore-filter met een porie-doorsnede van 0,3 jm gefiltreerd.en vervolgens gevriesdroogd, wat 230 mg gevries-15 droogde, gezuiverde, carcinostatische stof TF-310 gaf.
De eigenschappen van deze carcinostatische stof TF-310 staan in tabel B, en het saccharide-ge-halte daarvan lag in het algemeen tussen 16 en 30 gew.%. Het infrarood- en het ultraviolet-spectrum en een Mhigh performance" 20 vloeistofchromatogram daarvan staan respectievelijk in figuren 23, 24 en 25.
Voorbeeld XIX
In 10 ml water werd 0,9 g carcinostatische stof TF-240 gesuspendeerd, die overeenkomstig voorbeeld 25 VII(3) verkregen was, en met IN NaOH werd de pH op 7,8 inge steld. Na opwarmen tot 37°C werden 9 mg Pronase E en enkele druppels tolueen toegevoegd. Men liet het enzym 24 uur bij 37° tot 40°C en bij pH van 7,8 tot 8,0 inwerken, waarna 10 minuten op 4000 rpm gecentrifugeerd werd. Het sediment werd uit-30 gewassen met 3 ml water met pH is 8,0, waarbij opnieuw 10 minuten op 4000 rpm gecentrifugeerd werd. De wasvloeistof werd met de eerder afgeschonken vloeistof gecombineerd, en hierin werd met 1 N HCl de pH op 2,0 ingesteld, waardoor een neerslag ontstond. Na 12 uur staan op 5°C werd deze suspensie 10 minuten 35 op 10.000 rpm gecentrifugeerd. Het sediment werd met 5 ml water met pH = 2,0 uitgewassen, waarbij opnieuw 10 minuten op 8200640 i t- - 49 - 10.000 rpm gecentrifugeerd werd. De wasvloeistof werd nu met de eerder afgeschonken vloeistof gecombineerd, en hieraan werd zoveel ethanol toegevoegd dat een suspensie in 80 % ethanol ontstond. Na 2 uur roeren onder ijskoeling werd 10 minuten op 5 10.000 rpm gecentrifugeerd. Dit laatste neerslag werd achter eenvolgens met 5 ml 80 % ethanol en met 5 ml ethanol uitgewassen en onder verlaagde druk gedroogd, wat 170 mg carcinosta-tische stof TF-340 gaf.
In 5 ml water werd 150 mg van dat poeder 10 opgelost, en de pH werd met IN NaOH op 7,0 ingesteld. Deze oplossing werd op een kolom van 25 ml Amberlite IRA 400 gebracht, die van te voren met 1 N NaOH in de OH-vorm gebracht was. Daarna werd 100 ml water door de kolom geleid en alle eluaten werden gecombineerd en hierin werd de pH met IN zout-15 zuur op 7,0 ingesteld. De verkregen oplossing werd onder verlaagde druk geconcentreerd en door een Millipore-filter met porie-doorsnede van 0,3 jam gefiltreerd en daarna gevriesdroogd, wat 310 mg gevriesdroogde careinostatische stof TF-340 gaf.
De eigenschappen van deze carcino-20 statische stof TF-340 staan in tabel B, en het infrarood- en het ultraviolet-absorptie-spectrum daarvan en een "high performance" vloeistofchromatogram daarvan staan respectievelijk in figuren 26, 27 en 28.
Voorbeeld XX
25 Overeenkomstig voorbeeld XIX werd 0,9 g careinostatische stof TF-240, verkregen zoals beschreven in voorbeeld VIII, behandeld waardoor 115 mg gevriesdroogde careinostatische stof TF-340 verkregen werd.
De eigenschappen van deze carcinosta-30 tische stof TF-340 staan in tabel B, en het infrarood- en het ultraviolet-spectrum en een "high performance" vloeistofchromatogram daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld XIX.
Voorbeeld XXI
35 Overeenkomstig voorbeeld XIX werd 0,9 g careinostatische stof TF-240, verkregen zoals beschreven in 8200640
-*· J
- 50 - voorbeeld VII(3) behandeld, behalve dat nu (a) de enzym-behan-deling met 9 mg trypsine in plaats van met Pronase E gebeurde, en dat (b) na de enzym-behandeling de waterige oplossing met pH * 2,0 tot een vloeistof met 80 % ethanol in plaats van met 5 60 % ethanol verdund werd. Aldus werd 105 mg gevriesdroogde carcinostatische stof TF-340 verkregen.
De eigenschappen van deze carcinostatische stof TF-340 staan in tabel B, en het infrarood- en het ultraviolet-absorptie-spectrum daarvan waren in hoofdzaak iden-10 tiek met die van voorbeeld XIX.
Voorbeeld XXII
De in voorbeeld VII(3) verkregen carcinostatische stof TF-240 werd overeenkomstig voorbeeld XIX verder behandeld, behalve dat na de enzymatische inwerking de waterige 15 oplossing met een pH 2,0 verdund werd tot een vloeistof met 60 % ethanol in plaats van met 80 % ethanol. Aldus werd 101 mg gevriesdroogde carcinostatische stof TF-340 verkregen.
De eigenschappen van deze carcinostatische stof TF-340 staan in tabel B, en het infrarood- en het ultraviolet-20 absorptiespectrum daarvan en een "high performance" vloeistof-chromatogram daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld 19.
Voorbeeld XXIII
De in voorbeeld VII(3) verkregen carcino-25 statische stof TF-240 onderging dezelfde enzym-behandeling als in voorbeeld XIX, waarna niet met ethanol neergeslagen werd maar 40 % trichloorazijnzuur toegevoegd werd tot een trichloorazijn-zuur-concentratie van 10 %. Na verwijdering van een neerslag werd de oplossing met ethanol verdund tot een vloeistof met 30 80 % ethanol, waarna overeenkomstig voorbeeld XIX verder opge werkt werd, hetgeen 99 mg gevriesdroogde carcinostatische stof TF-340 gaf.
De eigenschappen van deze carcinostatische stof TF-340 staan in tabel B en het infrarood- en het 35 nltraviolet-absorptiespectrum en een "high performance" vloei- stofchromatogram daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van 8200640 I * - 51 - voorbeeld XIX.
Voorbeeld XXIV
In 10 ml water werd 0,82 g van de carcinostatische stof TF-250 gesuspendeerd, die verkregen was zoals 5 beschreven in voorbeeld VII(4), en na bijregelen van de pH met IN NaOH op 7,8 en opwarmen tot 37°C werden 8 mg Pronase E en enkele druppels tolueen toegevoegd. Men liet het enzym 24 uur bij 37° tot 40°C en pH tussen 7,8 en 8,0 inwerken, waarna 10 minuten op 4000 rpm gecentrifugeerd werd. Het bezinksel werd 10 in 3 ml water met pH = 8,0 opgeroerd en ook deze suspensie werd 10 minuten op 4000 rpm gecentrifugeerd. Deze wasvloeistof werd gecombineerd met de eerder verkregen afgeschonken vloeistof, en hierin werd met 1 N HC1 de pH op 2,0 ingesteld, waardoor een neerslag ontstond. Na 12 uurstaan op 5°C werd deze suspensie 15 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd, en het sediment werd met 5 ml water met pH 2,0 uitgewassen, waarbij opnieuw 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd werd. Wasvloeistof en de eerder verkregen afgeschonken vloeistof werden gecombineerd, en hieraan werd zoveel ethanol toegevoegd dat een suspensie in 20 80 % ethanol ontstond. Na 2 uur roeren onder ijskoeling werd de ze 10 minuten op 10.000 rpm gecentrifugeerd, en het sediment werd achtereenvolgens met 5 ml 80 % ethanol en met 5 ml ethanol uitgewassen en onder verlaagde druk gedroogd, wat 430 mg carcino-statische stof TF-350 gaf.
25 Van dit poeder werd 300 mg in 5 ml water opgelost, en na bijstellen van de pH met NaOH op 7,0 werd deze oplossing op een kolom van 45 ml Amberlite IRA 400 in de 0H-vorm gegoten. Daarna werd 200 ml water door de kolom geleid en alle eluaten werden gecombineerd. Na bijstellen van de pH met 30 IN zoutzuur op 7,0 werd de oplossing onder verlaagde druk geconcentreerd en door een Millipore-filter met een porie-doorsne-de van 0,3 jm gefiltreerd en gevriesdroogd, wat 260 mg gevriesdroogde carcinostatische stof TF-350 gaf.
De eigenschappen van de aldus verkregen 35 carcinostatische stof TF-350 staan in tabel B en het infrarood-en het ultraviolet-absorptiespectrum en een "high performance" 8200640 » 1 - 52 - vloeistofchromatogram daarvan staan in figuren 29, 30 en 31.
Voorbeeld XXV
Op eenzelfde wijze als in voorbeeld XXIV werd 0,85 g van de in voorbeeld IX verkregen carcinosta-5 tische stof TF-250 met 8 mg Pronase E behandeld, wat 265 mg gevriesdroogde carcinostatische stof TF-350 gaf.
De eigenschappen van deze carcinostatische stof TF-350 staan in tabel B, en het infrarood- en het ultraviolet-absorptE-spectrum daarvan en een "high performance" 10 vloeistofchromatogram daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld XXIV.
Voorbeeld XXVI
Overeenkomstig voorbeeld XXIV liet men op 0,80 g van de in voorbeeld X verkregen carcinostatische stof 15 TF-250 8 mg Pronase E inwerken, wat 253 mg gevriesdroogde carci nostatische stof TF-350 gaf.
De eigenschappen van de aldus verkregen carcinostatische stof TF-350 staan in tabel B, en het infrarood-en het ultraviolet-absorptiespectrum en een "high performance" 20 vloeistofchromatogram daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld XXIV.
Voorbeeld XXVII
Overeenkomstig voorbeeld XXIV werd 0,85 g van de in voorbeeld VII(4) verkregen carcinostatische stof 25 TF-250 behandeld, behalve (a) dat men nu in plaats van het
Pronase 8 mg trypsine (produkt van de firma Difco) liet inwerken, en (b) dat na de enzym-inwerking de waterige oplossing met een pH = 2,0 niet tot een mengsel met 80 % ethanol maar met 60 % ethanol werd verdund; aldus verkreeg men 247 mg ge-30 vriesdroogde carcinostatische stof TF-350.
De eigenschappen van de aldus verkregen carcinostatische stof TF-350 staan in tabel B, en het infrarood-en het ultraviolet-absorptiespectrum en een "high performance" vloeistofchromatogram daarvan waren in hoofdzaak identiek met 35 die van voorbeeld XXIV.
8200640
r 'T
- 53 -
Voorbeeld XXVIII
Van. de in voorbeeld VII(4) verkregen carcinostatische stof TF-350 werd 0,85 g overeenkomstig voorbeeld XXIV behandeld, behalve dat na de enzym-inwerking de 5 waterige oplossing met een pH van 2,0 met ethanol verdund werd tot een mengsel met 60 % ethanol in plaats van met 80 % ethanol; aldus verkreeg men 242 mg gevriesdroogde carcinostatische stof TF-350.
De eigenschappen van het aldus ver-10 kregen TF-350 staan in tabel B, en het infrarood- en het ultra-violet-absorptiespectrum en een "high performance"'vloeistof-chromatogram daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld XXIV.
Voorbeeld XXIX
15 Van de in voorbeeld VII(4) verkregen carcinostatische stof TF-250 werd 0,8 g overeenkomstig voorbeeld XXIV met enzym behandeld, maar aan de waterige oplossing met een pH = 2,0 werd nu 40 % trichloorazijnzuur toegevoegd tot een trichloorazijnzuur-concentratie van 10 % en het in 20 water oplosbare deel daarvan werd met ethanol verdund tot een vloeistof met 80 % ethanol. Verder ging het opwerken zoals in voorbeeld XXIV, en dit gaf 238 mg gevriesdroogde carcinostatische stof TF-350.
De eigenschappen van de aldus verkregen 25 carcinostatische stof TF-350 staan in tabel B, en het infrarood-en het ultraviolet-absorptiespectrum en een "high performance" vloeistofchromatogram daarvan waren in hoofdzaak identiek met die van voorbeeld XXIV.
Voorbeeld XXX
30 Aan 3 tot 4 mg carcinostatische stof TF-250 werd verdunde Na0H-oplossing toegevoegd, hetgeen een oplossing met een pH van 7,0-7,5 gaf. Het in water oplosbare deel daarvan werd in een ampul gebracht en gevriesdroogd. Dit wordt, wanneer het nodig is opgelost in een steriele fysiolo-35 gische zout-opbssing, een 0,5 % lidocaïne-oplossing, een 5 % glucose-oplossing of iets dergelijks, en dat wordt dan voor 8200640 - 54 - injectie gebruikt.
Voorbeeld XXXI
Aan 2 tot 3 mg carcinostatische stof TF-220 wordt verdunde NaOH-oplossing toegevoegd zodat een op-5 lossing met een pH van 7,0-7,5 ontstaat. Het in water oplosbare deel daarvan wordt in een ampul gebracht en gevriesdroogd. Dit wordt, wanneer het nodig is, opgelost in een steriele fysiologische zout-oplossing, een 0,5 % lidocaïne-oplossing, een 5 % glucose-oplossing of iets dergelijks, en dat wordt dan 10 voor injectie gebruikt.
Voorbeeld XXXII
Aan J mg carcinostatische stof TF-230 wordt verdunde NaOH-oplossing toegevoegd zodat een oplossing met een pH van 7,0-7,5 ontstaat. Deze wordt in een ampul 15 gebracht en gevriesdroogd. Dit wordt, wanneer het nodig is, opgelost in steriele fysiologische zout-oplossing, een 0,5 % lidocaïne-oplossing, een 5 % glucose-oplossing of iets dergelijks, en dat wordt dan voor injectie gebruikt.
Voorbeeld XXXIII
20 Aan 1 mg carcinostatische stof TF-240 wordt verdunde NaOH-oplossing toegevoegd zodat een oplossing met een pH van 7,0-7,5 ontstaat, en die wordt in een ampul gebracht en gevriesdroogd. Dit wordt, wanneer het nodig is, opgelost in een steriele fysiologische zout-oplossing, een 0,5 Z 25 lidocaïne-oplossing, een 5 % glucose-oplossing of iets dergelijks, en dat wordt dan voor injectie gebruikt.
Voorbeeld XXXIV
Aan 1 mg carcinostatisch poeder TF-250 wordt verdunde NaOH-oplossing toegevoegd, zodat een oplossing met 30 een pH van 7,0-7,5 ontstaat, en die wordt in een ampul gebracht en gevriesdroogd. Dit wordt, wanneer het nodig is, opgelost in een steriele fysiologische zout-oplossing, een 0,5 % lidocaïne-oplossing, een 5 % glucose-oplossing of iets dergelijks, en dat wordt dan voor injectie gebruikt.
35 Voorbeeld XXXV
Een waterige oplossing van de carcino- 8200640 t ± - 55 - statische stof TF-310-1, met een pH van 7,0-7,5, werd in een ampul gebracht en gevriesdroogd, hetgeen een gevriesdroogd carcinostatisch preparaat TF-310 met een eenheidsdosis van 0,5 of 1 mg geeft. Dit wordt, wanneer het nodig is, opgelost 5 in een steriele fysiologische zout-oplossing, een 0,5 % lidocaïne-oplossing of een 5 % glucose-oplossing of iets dergelijks, en dat wordt dan voor injectie gebruikt.
Voorbeeld XXXVI
Een waterige oplossing van de carcino-10 statische stof TF-310-2 met een pH van 7,0-7,5 wordt in een ampul gebracht en gevriesdroogd, wat een gevriesdroogd carcinostatisch preparaat TF-310 geeft net een eenheidsdosis van 0,5 tot 1 mg. Dit wordt, wanneer het nodig is, opgelost in een steriele fysiologische zout-oplossing, een 0,5 % lidocaïne-15 oplossing, een 5 % glucose-oplossing of iets dergelijks, en dat wordt dan voor injectie gebruikt.
Voorbeeld XXXVII
Een waterige oplossing van de carcino-statische stof TF-320 met een pH van 7,0-7,5 wordt in een ampul 20 gebracht en gevriesdroogd, wat een gevriesdroogd carcinostatisch preparaat TF-320 geeft met een eenheidsdosis van 0,5 of 1 mg. Dat wordt, wanneer het nodig is, opgelost in een steriele fysiologische zout-oplossing, een 0,5 % lidocaïne-oplossing, een 5 % glucose-oplossing of iets dergelijks, en dat wordt dan 25 voor injectie gebruikt.
Voorbeeld 1ΧΧ7ΙΙΙ
Een waterige oplossing van de carcino-statische stof TF-330 met een pH. van 7,0-7,5 wordt in een ampul gebracht en gevriesdroogd, wat een gevriesdroogd carcino-30 statisch preparaat TF-330 geeft met een eenheidsdosis van 0,5 tot 1 mg. Dit wordt, wanneer het nodig is, opgelost in een steriele fysiologische zout-oplossing, een 0,5 % lidocaïne-oplossing, een 5 % glucose-oplossing of iets dergelijks, en dat wordt dan voor injectie gebruikt.
35 Voorbeeld XXXIX
Een waterige oplossing van de carcinosta- 820064Ü
» A
- 56 - tische stof TF-340 met een pH van 7,0-7,5 wordt in een ampul gebracht en gevriesdroogd, wat een gevriesdroogd carcinosta-tisch preparaat TF-340 geeft met een eenheidsdosis van 0,5 of 1 mg. Dit wordt, wanneer het nodig is, opgelost in een ste-5 riele fysiologische zout-oplossing, een 0,5 % lidocaïne-oplos- sing, een 5 % glucose-oplossing of iets dergelijks, en dat wordt dan voor injectie gebruikt.
Voorbeeld XL
Een waterige oplossing van de carcino-10 statische stof TF-350 met een pH van 7,0-7,5 wordt in een ampul gebracht en gevriesdroogd, wat een gevriesdroogd carcinostatisch preparaat TF-350 geeft met een eenheidsdosis van 0,5 of 1 mg.
Dit wordt, wanneer het nodig is, opgelost in een steriele fysiologische zout-oplossing, een 0,5 % lidocaïne-oplossing, een 15 5 % glucose-oplossing of iets dergelijks, en dat wordt dan voor injectie gebruikt.
8200640
Claims (30)
1. Werkwijze voor de bereiding van een carcinostatische stof, waarbij men bacteriën kweekt en uit 5 het kweekfiltraat een macromoleculaire stof isoleert, met het kenmerk, dat men bacteriën van het geslacht Fusobacterium kweekt en uit het kweekfiltraat stoffen van de TF-2 reeks isoleert.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, 10 met het kenmerk, dat men aan het kweekfiltraat een hydrofiel organisch oplosmiddel toevoegt en men een stof uit 'de TF-2 reeks uit het neerslag isoleert.
3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het met het organische oplosmiddel ver- 15 kregen neerslag naar de oplosbaarheid bij verschillende pH isoleert.
4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat een bij pH tussen 3,5 en 4,5 in water onoplosbare fractie geïsoleerd wordt.
5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat een bij pH tussen 5,5 en 6,5 in water onoplosbare fractie geïsoleerd wordt.
6. Werkwijze volgens conclusie 3, met hét kenmerk, dat een fractie geïsoleerd wordt die bij pH 25 tussen 5,5 in water oplosbaar maar bij pH tussen 3,5 en 4,5 in water onoplosbaar is.
7. Werkwijze volgens conclusie 3, mét het kenmerk, dat een fractie geïsoleerd wordt die bij pH tussen 3,5 en 4,5 in water oplosbaar maar bij pH tussen 1,5 en 30 2,5 in water onoplosbaar is.
8. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat een bij pH tussen 1,5 en 2,5 in water oplosbare fractie geïsoleerd wordt.
9. Werkwijze volgens een der voorafgaande 35 conclusies, met het kenmerk, dat uit het verkregen produkt eiwit verwijderd wordt. 8200640 - 58 -
10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het verwijderen van eiwit gebeurt door een proteolytisch enzym op het produkt te laten inwerken.
11. Werkwijze volgens conclusie 10, 5 met het kenmerk, dat het proteolytische enzym Pronase of trypsine is.
12. Werkwijze volgens conclusie 10 of 11, met het kenmerk, dat het produkt na de inwerking van een proteolytisch enzym een verdere -zuivering door neerslaan met een 10 hydrofiel organisch oplosmiddel, door ultrafiltratie en/of door het passeren van een ionenwisselaar ondergaat*
13. Werkwijze volgens een der conclusies 2 t/m 12, met het kenmerk, dat het hydrofiele organische oplosmiddel aan het kweekfiltraat toegevoegd wordt nadat de pH daar- 15 van tussen 1,5 en 2,5 ingesteld is.
14. Werkwijze volgens een der conclusies 2 t/m 13,'mét hét kenmerk, dat het hydrofiele organische oplosmiddel een alkohol is.
15. Werkwijze volgens een der conclu-20 sies 2 t/m 14, mét 'hét kénmérk, dat zoveel hydrofiel organisch oplosmiddel toegevoegd wordt dat het mengsel daarvan 30 tot 80 vol.% bevat.
16. Werkwijze volgens een der voorafgaande conclusies, 'met het kenmerk, dat de bacteriën van het ge- 25 slacht Fusobacterium tot de soort Fusobaeterium nucleatum behoren.
17. Werkwijze in hoofdzaak volgens be-. schrijving en/of voorbeelden.
18. Carcinostatische stof uit de TF-2 30 reeks, of een zout daarvan, met de volgende eigenschappen: a) het is een grijzig-wit, lichtbruin poeder, b) het remt de voortwoekering van Ehrlich ascites tumor, vast Ehrlich tumor , Sarcomen 180 en B-116 en Melanoom van de muis, en het heeft een immunostamulerende werking, 35 c) het is onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethylacetaat en diethylether, 8200640 - 59 - d) het heeft geen echt smeltpunt maar ontleedt bij temperaturen boven 100°C, e) het heeft een infrarood-absorptiespectrum met absorptie-banden in de buurt van 3600-3200, 2950-2920, 1440 en 1060 5 cm"1, f) het heeft een ultraviolet-absorptiespectrum met een sterke absorptie nabij de absorptiegrens en een piek. binnen het traject van 246 - 269 nm, 10 g) het geeft positieve kleurreacties met het reagens van Molisch, met fenol-zwavelzuur, met anthron-zwavëlzuur, met indool-HCl en met het reagens van Lowry-Folin.
19. Carcinostatische stof volgens conclusie 18, aangedüid als TF-210, die 15 d) tussen 160° en 235°C ontleedt, e) een IR-spectrum met absorptiebanden bij 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 en 1120-1020 cm ^ heeft, h) bij element-analyse 40-43 % C, 5-7 % H en 9—10 % N bevat, 20 en i) een saccharide-gehalte (bepaald met fenol-zwavelzuur) van 5-25 gew.% en een eiwit-gehalte (bepaald met de methode van Lowry-Folin) van 20-50 gew.% vertoont.
20. Carcinostatische stof volgens 25 conclusie 18, aangeduid als TF-220, die d) tussen 160° en 240°C ontleedt, e) een IR-spectrum met absorptiebanden bij 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550, 1510, 1440, 1380, 1240-1220 en 1120-1020 cm * vertoont, 30 h) bij element-analyse 40-42 % C, 5-7 % H en 7-9 % N bevat, en i) een saccharide-gehalte van 5-20 gew.% en een eiwit-gehalte van 10 gew.% of minder vertoont.
21. Carcinostatische stof volgens conclusie 18, aangeduid als TF-230, die 35 d) tussen 185° en 225°C ontleedt, e) een IR-spectrum met absorptiebanden bij 3600-3200, 2950- 8200640 - 60 - 2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 en 1120, 1020 cm * vertoont, h) bij element-analyse 42-45 % C, 5-7 % H en 10-11 % N bevat, en i) een saccharidegehalte van 5-25 gew.% en een eiwit-gehalte 5 van 30-60 gew.% vertoont.
22. Carcinostatische stof volgens conclusie 18, aangeduid als TF-240, die d) tussen 200° en 215°C ontleedt, e) een IR-spectrum met absorptiebanden bij 3600-3200, 2950- 10 2920, 1680-1620, 1550-1520, 1410-1360, 1280-1210, 1060, 960 en 820 cm * vertoont, h) bij element-analyse 35-38 % C, 4-5 % H en 12-14 % N bevat, en i) een saccharide-gehalte van 15-35 gew.% en een eiwit-gehalte van 20-30 gew.% vertoont.
23. Carcinostatische stof volgens con clusie 18, aangeduid als TF-250, die d) tussen 165° en 210°C ontleedt, e) een IR-spectrum met absorptiebanden bij 36-3200, 2950- 2920, 1680-1620, 1550-1510, 1410-1380, 1240-1210, 1150- . 20 1120, 1080-1020, 980 en 810 cm * vertoont, h) bij element-analyse 30-35 % C, 3-5 % H en 3-5 % N bevat, en i) een saccharide-gehalte van 60-80 gew.% en een eiwit-gehalte van 5-20 gew.% vertoont.
24. Carcinostatische stof volgens con-25 conclusie 18, aangeduid als TF-300 (TF-310, TF-320 en TF-330), die d) boven 180°C begint te ontleden en pas boven 195°C duidelijk ontleedt, e) een IR-spectrum met absorptiebanden bij 3500-3300, 2920, 30 2850, 1660-1620, 1580-1540, 1460-1400, 1380-1360, 1120, 1080-1020, 970 en 820-800 cm * vertoont, h) bij element-analyse 38-47 % C, 5-7 % H en 1-4 % N bevat, en i) een saccharide-gehalte van 16-60 gew.% en een eiwitgehalte van 10 gew.% of minder vertoont.
25. Een carcinostatische stof volgens conclusie 24 aangeduid als TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330) die 8200640 - 61 - een saccharide-gehalte tussen 16 en 30 gew.% vertoont.
26. Een carcinostatische stof volgens conclusie 24, aangeduid als TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330) die een saccharide-gehalte tussen 20 en 60 gew.% vertoont.
27. Carcinostatische stof volgens con clusie 18, aangeduid als TF-340, die d) hoven 140°C begint te ontleden en pas boven 200°C duidelijk ontleedt, e) een IR-spectrum met absorptiebanden bij 3500-3300, 2920, 10 2850, 1660-1640, 1580-1520, 1460-1440, 1410-1340, 1250-1220, 1120-1030, 970 en 835 cm ^ vertoont, h) bij element-analyse 32-34 % C, 4-6 % H en 3-5 % N bevat, en i) een saccharide-gehalte van 20-50 gew.% en een eiwit-gehalte van 10 gew.% of minder vertoont.
28. Carcinostatische stof volgens con clusie 18, aangeduid als TF-350, die d) boven 110°C begint te ontleden en boven 180°C duidelijk ontleedt, e) een IR-spectrum met absorptiebanden bij 3500-3300, 2920- 20 2900, 1660-1630, 1580-1520, 1460-1340, 1140-1100, 1080-1020, 970 en 820-800 cm ^ vertoont, h) bij element-analyse 34-37 % C, 5-6 % H en 1-2 % N bevat, en i) een saccharide-gehalte tussen 80 en 95 gew.% en een eiwitgehalte van 10 gew.% of minder vertoont.
29. Carcinostatisch preparaat dat een of meer der stoffen volgens conclusies 18 t/m 28 bevat.
30. Carcinostatisch preparaat volgens conclusie 29, dat de carcinostatische stof TF-300 (TF-310, TF-320 of TF-330) bevat. 30 8200640
Applications Claiming Priority (18)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56022275A JPS57136598A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-300, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022273A JPS57136596A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-240, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP2227581 | 1981-02-19 | ||
| JP2227481 | 1981-02-19 | ||
| JP56022274A JPS57136597A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-250, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP2227781 | 1981-02-19 | ||
| JP2227081 | 1981-02-19 | ||
| JP56022271A JPS57136594A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-220, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022276A JPS57139088A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-340, its preparation and carcinostatic agent containing the same |
| JP2227681 | 1981-02-19 | ||
| JP2227281 | 1981-02-19 | ||
| JP56022272A JPS57136595A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-230, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022270A JPS57136593A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-210, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP2227181 | 1981-02-19 | ||
| JP56022277A JPS57139089A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-350, its preparation and carcinostatic agent containing the same |
| JP2227381 | 1981-02-19 | ||
| JP57011744A JPS58129977A (ja) | 1982-01-29 | 1982-01-29 | 制癌性物質ｔｆ−３００−２及びその製造法並びにこれを含有する制癌剤 |
| JP1174482 | 1982-01-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8200640A true NL8200640A (nl) | 1982-09-16 |
Family
ID=27576620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8200640A NL8200640A (nl) | 1981-02-19 | 1982-02-18 | Nieuwe, carcinostatische stoffen, preparaten die ze bevatten, en werkwijze voor de bereiding daarvan. |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4591558A (nl) |
| AT (1) | AT381722B (nl) |
| BE (1) | BE892204A (nl) |
| CA (1) | CA1184864A (nl) |
| CH (1) | CH651052A5 (nl) |
| DE (1) | DE3205074A1 (nl) |
| DK (1) | DK151640C (nl) |
| FI (1) | FI69096C (nl) |
| FR (1) | FR2499855B1 (nl) |
| GB (1) | GB2093347B (nl) |
| IT (1) | IT1189224B (nl) |
| NL (1) | NL8200640A (nl) |
| NO (1) | NO157426C (nl) |
| NZ (1) | NZ199771A (nl) |
| PT (1) | PT74455B (nl) |
| SE (1) | SE457000B (nl) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5931715A (ja) * | 1982-08-17 | 1984-02-20 | Toyama Chem Co Ltd | 制癌性物質ｔｆ−５００の製造法 |
| US8522671B2 (en) * | 2009-02-20 | 2013-09-03 | Frymaster L.L.C. | Racking system for deep fryer |
| CA2753301A1 (en) | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Frymaster L.L.C. | Automated rack/basket lifting system for deep open vat frying system |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5461112A (en) * | 1977-10-24 | 1979-05-17 | Ono Pharmaceut Co Ltd | Oncostatic polysaccharide* its preparation* and oncostatic drugs containing it as an effective component |
| JPS5943929B2 (ja) * | 1979-08-13 | 1984-10-25 | サッポロビール株式会社 | 多糖体ｒｂｓ物質，その製法およびそれを有効成分とする抗腫瘍性剤 |
| DE3031152A1 (de) * | 1979-08-24 | 1981-03-19 | Toyama Chemical Co. Ltd., Tokyo | Carcinostatische substanzen, verfahren zur herstellung derselben und mittel mit einem gehalt derselben |
| US4477437A (en) * | 1981-02-19 | 1984-10-16 | Toyama Chemical Co., Ltd. | Substances having carcinostatic and immunostimulating activity |
-
1982
- 1982-02-12 GB GB8204093A patent/GB2093347B/en not_active Expired
- 1982-02-12 DE DE19823205074 patent/DE3205074A1/de active Granted
- 1982-02-17 FR FR8202601A patent/FR2499855B1/fr not_active Expired
- 1982-02-17 CH CH979/82A patent/CH651052A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-02-17 IT IT47817/82A patent/IT1189224B/it active
- 1982-02-17 CA CA000396425A patent/CA1184864A/en not_active Expired
- 1982-02-17 DK DK069282A patent/DK151640C/da not_active IP Right Cessation
- 1982-02-17 FI FI820527A patent/FI69096C/fi not_active IP Right Cessation
- 1982-02-18 NL NL8200640A patent/NL8200640A/nl not_active Application Discontinuation
- 1982-02-18 NO NO820509A patent/NO157426C/no unknown
- 1982-02-18 NZ NZ199771A patent/NZ199771A/en unknown
- 1982-02-18 SE SE8201016A patent/SE457000B/sv unknown
- 1982-02-18 PT PT74455A patent/PT74455B/pt not_active IP Right Cessation
- 1982-02-19 BE BE0/207355A patent/BE892204A/fr not_active IP Right Cessation
- 1982-02-19 AT AT0064682A patent/AT381722B/de not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-08-06 US US06/619,895 patent/US4591558A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2093347A (en) | 1982-09-02 |
| PT74455A (en) | 1982-03-01 |
| PT74455B (en) | 1984-12-04 |
| DK151640C (da) | 1988-06-20 |
| NZ199771A (en) | 1985-09-13 |
| NO157426B (no) | 1987-12-07 |
| IT8247817A0 (it) | 1982-02-17 |
| DK151640B (da) | 1987-12-21 |
| NO157426C (no) | 1988-03-16 |
| AT381722B (de) | 1986-11-25 |
| SE8201016L (sv) | 1982-08-20 |
| FI820527L (fi) | 1982-08-20 |
| CH651052A5 (de) | 1985-08-30 |
| NO820509L (no) | 1982-08-20 |
| SE457000B (sv) | 1988-11-21 |
| US4591558A (en) | 1986-05-27 |
| CA1184864A (en) | 1985-04-02 |
| ATA64682A (de) | 1986-04-15 |
| DE3205074C2 (nl) | 1987-09-24 |
| FR2499855A1 (fr) | 1982-08-20 |
| FR2499855B1 (fr) | 1985-07-12 |
| FI69096C (fi) | 1985-12-10 |
| FI69096B (fi) | 1985-08-30 |
| DE3205074A1 (de) | 1982-12-16 |
| IT1189224B (it) | 1988-01-28 |
| DK69282A (da) | 1982-08-20 |
| GB2093347B (en) | 1985-03-27 |
| BE892204A (fr) | 1982-08-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4289688A (en) | Protein-bound polysaccharides | |
| JP3444624B2 (ja) | 高分岐度β−グルカン、その製造法及び用途 | |
| NL8200640A (nl) | Nieuwe, carcinostatische stoffen, preparaten die ze bevatten, en werkwijze voor de bereiding daarvan. | |
| JPH021154B2 (nl) | ||
| US5667999A (en) | Process for preparing a fermentation product having SOD activity using a microorganism and a beverage containing the same | |
| KR900008247B1 (ko) | 새로운 생리활성물질 아르파메닌(Arphamenine)의 제조방법 | |
| EP0067000B1 (en) | Production of a nitrogen-containing polysaccharide having antitumour activity | |
| US4016260A (en) | Novel polypeptide produced by pseudomonas | |
| US4477437A (en) | Substances having carcinostatic and immunostimulating activity | |
| US4547462A (en) | Process for preparing substance having carcinostatic and immunostimulating activity | |
| JPH0372084B2 (nl) | ||
| Wishart | EXPERIMENTS ON CARBOHYDRATE METABOLISM AND DIABETES. III. THE PERMEABILITY OF BLOOD CORPUSCLES TO SUGAR. | |
| KR800001444B1 (ko) | 홍국균이 생산하는 색소의 제조방법 | |
| NO155697B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av fysiologisk aktive forbindelser ved fermentering. | |
| Dhaliwal et al. | Extracellular polysaccharides of Rhizobium | |
| JPS627918B2 (nl) | ||
| JPH0144721B2 (nl) | ||
| JPH039120B2 (nl) | ||
| JPH0710857A (ja) | 新規アルドース還元酵素阻害剤 | |
| JPH027631B2 (nl) | ||
| JPH021156B2 (nl) | ||
| CH637542A5 (fr) | Procede de preparation d'inhibiteurs d'amylase, produits ainsi obtenus et compositions pharmaceutiques les contenant. | |
| JPH0242478B2 (nl) | ||
| JPH021151B2 (nl) | ||
| JPH021152B2 (nl) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| BV | The patent application has lapsed |