KR100549057B1 - 초임계 유체 추출기법을 이용한 오기단 (동충하초, 가시오갈피, 영지버섯, 녹용 및 인삼)의 혼합추출물을 함유한 화장료 조성물 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자연성 한방 5가지 천연물, 즉, 동충하초(Paceilomyces japonica), 가시오갈피(Acanthopanax senticosus), 영지버섯(Ganoderma lucidum Karst.), 녹용(Cervus elaphus L.) 및 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)을 초임계 유체 추출 기법을 통해 얻은 혼합 추출물을 함유함으로써 항염효과, 주름 완화, 탄력 증강 및 보습능 회복에 복합적으로 작용하여 피부 노화 방지 효능 등을 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.

초임계 유체 추출기법 * 오기단 추출물 * 동충하초 * 가시오갈피 * 영지버섯 * 녹용 * 인삼 * 화장료 조성물

Description

초임계 유체 추출기법을 이용한 오기단(동충하초, 가시오갈피, 영지버섯, 녹용 및 인삼)의 혼합추출물을 함유한 화장료 조성물 및 그의 제조방법{Cosmetic composition containing mixture extract of OUGIDAN(Paecilomyces japonica, Acanthopanax senticosus, Ganoderam Lucidum, Deer antlers and Ginseng), and the method of manufacturing thereof with supercritical fluids extraction }

도 1은 본 발명의 오기단 추출물의 탄력성 증대 효과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 본 발명의 오기단 추출물의 보습력 증대효과를 나타내는 그래프이다.

도 3은 본 발명의 오기단 추출물의 항염 효과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 자연성 한방 5가지 천연물, 즉, 동충하초(Paceilomyces japonica), 가시오갈피(Acanthopanax senticosus), 영지버섯(Ganoderma lucidum Karst.), 녹용(Cervus elaphus L.) 및 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)을 초임계 유체 추출 기법을 통해 혼합 추출물을 얻고 이를 화장료에 적용함으로써 항염효과, 주름 완화, 탄력 증강 및 보습능 회복에 복합적으로 작용하여 피부 노화 방지 등의 효능을 갖는 화장료 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

동충하초는 곤충에서 자실체(버섯)가 형성되는 자낭균류의 일종이다. 동충하초의 성분을 분석해 보면 인체에 필요한 11종의 아미노산과 약효력이 있는 10종의 아미노산이 각각 총함량의 60% 이상을 차지하고 있으며, 퀸산(quinic acid)의 이성체(異性體)인 코디세핀(cordycepic acid)을 약 7% 함유하고 있다. 또한 세포 활성화에 필요한 항산화 지질인 리놀렌산(linolenic acid)과 핵산인 3'-데옥시아데노신이 상당량 포함되어 있다. 이 밖에 면역증강 등의 다양한 약리작용이 알려져 있다(Cunningham, K. G., W. Manson. F. S. Spring and S. A. Hutchinson. 1950. Cordycepin, a metabolic product fromcultures of(Linn.), Link. nature, 166, 949 참조).

가시 오갈피는 오갈피 나무과에 속하는 낙엽성 관목으로 껍질을 약재로 많이 쓰고 있다. 항노화, 면역기능증진, 만성피로회복, 피부미용, 염증소멸, 항스트레스, 세포의 산성화 방지 등에 뛰어난 약리효능을 지니고 있다(한국가시오갈피 재배협회 자료, 토종약초장수법, 태일출판사, 최진규).

영지는 혈액순환 촉진 작용으로 피부를 건강하게 해주며 항염작용 및 항암 작용으로 피부 세포 보호효과를 보이며 항알러지 효과를 가진다.

녹용은 신진대사 촉진으로 피부영양공급 및 피로회복으로 피부에 윤기를 부여하며, 단백질 공급으로 피부 건조 및 주름 예방으로 노화 억제 효과를 보인다. 또한 상처치료 및 세포 재생, 면역 증강 효과를 보이며 항암 및 해독작용을 통해 건강한 피부를 유지할 수 있게 해준다.

인삼은 피부세포 부활 작용으로 피부 상처 및 트러블 치료, 예방에 효과적이며, 혈행 촉진과 세정작용으로 피부 표면을 매끄럽게 도와주며, 항균, 항암, 항염 효과와 더불어 항산화 효과로 피부노화를 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다.

이러한 5가지 유효성분들을 추출하는 종래 기술은 다음과 같다.

부틸렌 글리콜이나 프로필렌 글리콜 등의 용매에 상기 혼합 추출물을 넣은 후 용매가 증발되는 것을 방지하도록 냉각 콘덴서가 장착된 증류장치에서 50∼95℃, 3∼20시간 가열하여 추출하거나, 또는 5∼37℃에서 1∼15일간 침적시켜 유효성분을 추출하였다.

또한, 상기 천연물 추출물 각각을 추출한 다음 이를 혼합한 경우에도 같은 효과를 나타내므로 이 방법도 동일하게 적용이 가능하다. 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 상기한 5가지 천연물 혼합 추출물을 완전히 감압 농축하여 추출물을 얻는다.

그러나 이러한 일반용매 추출법은 고온으로 가열하기 때문에 증발, 열분해, 산화로 인하여 자연 활성 성분이 파괴되는 문제점이 있었다.

이에 본 발명자들은 오랜 임상경험을 통해 입증되어온 5가지 한방 물질들을 초임계 유체 추출법을 통해 추출한 오기단 추출물이 일반 용매 추출물에 비해 세포 보호 및 증식 효과와 함께 항염, 보습 효과가 우수함을 확인하였으며, 이를 화장료에 도입시 주름 방지, 탄력 증강 및 보습능 회복등에 보다 효과적으로 기여할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 동충하초, 가시오갈피, 영지버섯, 녹용 및 인삼을 초임계 유체추출법으로 추출하여 제조한 오기단 추출물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 오기단 추출물을 함유함으로써, 상기 천연물들이 가지는 자외선으로부터의 세포 보호능, 세포 증식능 및 우수한 항염 및 보습능을 일반 용매 추출법에서 추출하였을 때 보다 항진시킬 수 있으며, 각 유효성분의 시너지효과를 통해 피부 주름 완화, 탄력 증강 및 보습능 회복에 효과적으로 기여하고, 안전성 및 안정성 면에서도 문제가 없는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 사람의 피부가 나이가 들면서 노화되고, 주름이 생기며, 탄력 및 보습 성분이 상실되어 가는 것을 극복하기 위하여, 자연성 한방 성분의 천연물 혼합 추출물과 관련하여 연구하게 되었다. 즉, 천(天), 지(地), 인(人), 산(山), 수(水)의 개념으로 형상화한 5가지의 자연성 한방물질인 오기단이 강장, 활력증강, 신진 대사 강화 효과가 있는 것으로 알려진 것을 표방하는 것이므로, 이를 피부노화와 연관지어 생각하게 된 것이다.

이에, 본 발명자들은 상기 5가지 한방 물질인 동충하초, 가시오갈피, 영지, 녹용 및 인삼을 "오기단"이라고 명명하였고, 이러한 오기단을 초임계 유체 추출법 으로 추출하여 얻은 추출물을 "오기단 추출물"이라고 명명하였다.

따라서, 본 발명은 동충하초, 가시오갈피, 영지버섯, 녹용 및 인삼을 초임계 유체 추출법으로 추출하여 제조한 오기단 추출물에 관한 것이다.

초임계 유체란 "임계온도와 압력 이상에서 있는 유체"로 정의되는 것으로서, 기존의 일반용매 추출법과 차별되는 독특한 특성을 가지고 있다. 초임계 상태에 처해있는 물질은 그 임계점 부근에서 압력을 변화시키면, 밀도, 점도, 확산계수 및 극성 등 많은 물성이 기체에 가까운 상태에서부터 액체에 가까운 상태로까지 연속적으로 매우 큰 변화를 가져온다. 액체의 이산화탄소를 밀폐된 용기에 넣고 가열하면 기-액의 계면이 온도, 압력이 증가하면서 점점 그 경계가 사라지는 것을 볼 수 있다. 초임계 유체는 기체처럼 밀폐된 공간을 가득 채우는 묵직한 유체라고 할 수 있다. 초임계 유체기술은 높은 용해력, 물질이동 및 열이동이 빠르고, 낮은 점도, 높은 확산계수 그리고 낮은 표면장력으로 인한 미세공으로의 빠른 침투성 등과 같은 초임계 유체의 장점을 이용하는 기술이다.

본 발명에서 따른 초임계 유체 추출법은 초임계 유체로서 이산화탄소를 사용하며 추출공정은 다음과 같다:

1) 동충하초, 가시오갈피, 영지버섯, 녹용 및 인삼을 혼합하고 분쇄한 후 용매와 혼합하여 교반하는 단계;

2) 상기 혼합물을 초임계 추출조에 넣고 초임계 유체를 공급하는 단계;

3) 추출조의 압력을 300기압으로 유지시키며 추출조 내부의 온도를 0.5℃/min 속도로 40℃까지 승온시키는 단계; 및

4) 추출조의 온도와 압력을 30∼50℃, 200∼350 기압으로 50분간 유지 한 후 상압으로 감압하여 오기단 추출물을 얻는 단계를 포함한다.

상기와 같은 초임계 조건에서의 추출을 통해서 유효성분의 효과적인 수득뿐만 아니라 각 유효성분들이 추출 후에 각각의 유효성이 잘 발현되고 서로가 시너지 효과를 얻을 수 있게 된다.

본 발명에 따른 동충하초, 가시오갈피, 영지버섯, 녹용 및 인삼의 혼합추출물인 오기단 추출물의 제조방법을 보다 상세히 살펴보면 다음과 같다.

먼저 동충하초, 가시오갈피, 영지버섯, 녹용 및 인삼을 혼합하고 분쇄하여 부틸렌 글리콜과 에탄올을 혼합하며, 각각의 함량은 분쇄한 천연물 62.7 중량%, 부틸렌 글리콜 33.9 중량% 및 에탄올 3.4 중량%로 혼합하여 교반한 다음 1시간 동안 방치한다.

상기의 혼합물을 초임계 추출조에 투입하고 고압용 기체펌프를 이용하여 추출조에 이산화탄소를 공급하여 압력을 높인다. 추출조의 압력이 300기압에 달하면 이산화탄소의 공급을 중단한다. 이때 추출조 내부의 온도는 상온과 유사하며, 그 이유는 가압 펌프와 추출조간에 긴 관(1m)으로 연결되어 있어서 가압 펌프에 근접한 곳은 가온되나 실제로 추출조 내부의 온도는 변화가 없게 된다.

온도 제어기를 이용하여 추출조 외부를 감싸고 있는 열선을 이용하여 추출조 내부의 온도를 0.5℃/min 속도로 40℃까지 승온시킨다. 승온으로 인한 추출조의 압력은 추출조의 출구에 부착된 압력조절기를 이용하여 이산화탄소를 일부 배출하며 압력을 300기압으로 유지한다.

추출조의 온도와 압력을 40℃, 300기압으로 50분간 유지한다. 고압용 기체펌프를 재가동하여 20L/min의 유량으로 이산화탄소를 추출조에 연속적으로 공급을 한다. 동시에 출구쪽에 부착된 압력조절기를 이용하여 추출물을 방출시키며 추출조의 온도와 압력을 일정하게 유지한다. 압력조절기를 통하여 방출된 방출물은 압력 및 온도강하로 인하여 이산화탄소가 고체 드라이아이스로 전이된다. 이로 인하여 최종 출구쪽의 튜브가 막히는 현상이 발생할 수 있다. 이를 방지하기 위하여 압력조절기의 온도를 70℃가 되도록 유지한다.

방출된 추출물을 상압으로 감압하여 이산화탄소를 대기로 방출시키고, 오기단의 유효성분 추출물과 부틸렌 글리콜을 함께 포집기 내로 회수한다. 위의 과정을 12시간 동안 수행하여 추출물을 얻어낸 후 추출조업을 종료한다.

상기 오기단 추출물에 대한 5가지 추출물 각각의 바람직한 건조중량비는 동충하초 5∼10 중량%, 가시오갈피 10∼20 중량%, 영지버섯 5∼10 중량%, 녹용 2∼5 중량% 및 인삼 20∼30 중량%가 되게 하는 것이 좋다.

또한 본 발명은 상기 초임계 유체 추출법에 의한 오기단 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 상기 오기단 추출물을 피부에 도입시킴으로써, 이들이 자외선으로부터 세포 보호 작용, 세포 증식 작용과 함께 항염 및 보습 작용이 일반 용매추출법을 통해 얻어진 추출물 보다 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 의한 화장료 조성물은 상기 오기단 추출물을 전체 조성물에 대하여 0.1~ 10 건조중량%, 바람직하게는 0.5∼7 건조중량%의 양으로 함유되는 것이 좋 다(건조조건: 시료 1g, 105℃, 2시간).

상기 화장료 조성물에서 오기단 추출물의 함유량이 0.1 건조중량% 미만인 경우, 유효성을 나타내는데 바람직하지 못하고, 10 건조중량% 이상인 경우 제형화하는데 문제가 생기며, 효능과 안정성을 고려한 최적농도는 0.5∼7 건조중량%이다.

이하, 실시예 및 시험예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

[실시예 1] 오기단 추출물 제조

동충하초 50g, 가시오갈피 100g, 영지버섯 50g, 녹용 20g, 인삼 150g을 혼합하여 분쇄한 혼합물 370g을 부틸렌 글리콜 200g 및 에탄올 20g에 혼합하여 교반한 후 1시간 동안 방치하였다.

상기의 혼합물을 초임계 추출조에 투입한 다음 고압용 기체펌프를 이용하여 추출조에 이산화탄소를 공급하여 압력이 300기압에 달하면 이산화탄소의 공급을 중단하였다. 온도 제어기를 이용하여 추출조 외부를 감싸고 있는 열선을 통해 추출조 내부의 온도를 0.5℃/min 속도로 40℃까지 승온하였다. 추출조의 출구에 부착된 압력조절기를 이용하여 이산화탄소를 일부 배출하면서 추출조의 온도와 압력을 40℃, 300기압으로 50분간 유지하였다. 그런 다음 고압용 기체펌프를 재가동하여 20L/min 의 유량으로 이산화탄소를 추출조에 연속적으로 공급을 하였다. 동시에 출구쪽에 부착된 압력조절기를 이용하여 추출물을 방출시키며 추출조의 온도와 압력을 40℃ 300기압으로 일정하게 유지하였다. 압력조절기의 온도를 70℃로 유지하면서 압력조절기를 통하여 방출된 방출물은 압력 및 온도강하로 인하여 이산화탄소가 고체 드라이아이스로 전이되었다. 방출된 추출물은 상압으로 감압되어 이산화탄소는 대기로 방출되었고, 오기단의 유효성분 추출물과 부틸렌 글리콜은 함께 포집기 내로 회수하였다. 위의 과정을 12시간 동안 수행하여 추출물을 얻어낸 후 추출조업을 종료하여 천연 추출물 29.5g(건조중량)을 얻었다.

[실시예 2] 오기단 추출물 제조

상기 실시예 1에서 용매로 부틸렌 글리콜과 에탄올을 함께 사용하지 않고 부틸렌 글리콜만을 단독으로 사용하는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여, 천연물 추출물 26g(건조중량)을 얻었다.

[실시예 3] 오기단 추출물 제조

상기 실시예 1에서 용매로 부틸렌 글리콜과 에탄올 대신에 부틸렌 글리콜과 물을 사용하는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여, 천연물 추출물 27g(건조중량)을 얻었다.

[실시예 4] 오기단 추출물 제조

상기 실시예 1에서 용매로 부틸렌 글리콜과 에탄올 대신에 에탄올과 물을 사용하는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여, 천연물 추출물 25g(건조중량)을 얻었다.

[실시예 5] 오기단 추출물 제조

상기 실시예 1에서 용매로 사용한 부틸렌 글리콜과 에탄올 대신 에탄올을 단독으로 사용하는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여, 천연물 추출물 23g(건조중량)을 얻었다.

[실시예 6] 오기단 추출물 제조

상기 실시예 1에서 용매로 부틸렌 글리콜과 에탄올 대신에 물만을 단독으로 사용하는 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여, 천연물 추출물 24g(건조중량)을 얻었다.

[비교예 1]

동충하초 50g, 가시오갈피 100g, 영지버섯 50g, 녹용 20g, 인삼 150g을 혼합하여 분쇄한 혼합물 370g을 부틸렌 글리콜 3.7kg 및 에탄올 300g에 혼합하여 10시간 동안 교반한 후 냉각 콘덴서가 장착된 증류장치에서 95℃에서 5 시간 동안 가열하여 추출물 6.3g(건조중량)을 얻었다.

[비교예 2]

상기 비교예 1에서 용매로 부틸렌 글리콜과 에탄올을 함께 사용하지 않고 부틸렌 글리콜만을 단독으로 사용하는 것을 제외하고 비교예 1과 동일한 방법을 사용하여, 천연물 추출물 7.4g(건조중량)을 얻었다.

[비교예 3]

상기 비교예 1에서 용매로 부틸렌 글리콜과 에탄올 대신에 부틸렌 글리콜과 물을 사용하는 것을 제외하고 비교예 1과 동일한 방법을 사용하여, 천연물 추출물 7.0g(건조중량)을 얻었다.

[비교예 4]

상기 비교예 1에서 용매로 부틸렌 글리콜과 에탄올 대신에 에탄올과 물을 사용하는 것을 제외하고 비교예 1과 동일한 방법을 사용하여, 천연물 추출물 5.5g(건조중량)을 얻었다.

[비교예 5]

상기 비교예 1에서 용매로 사용한 부틸렌 글리콜과 에탄올 대신 에탄올을 단독으로 사용하며 가열조건의 온도를 60℃로 하는 것을 제외하고 비교예 1과 동일한 방법을 사용하여, 천연물 추출물 4.0g(건조중량)을 얻었다.

[비교예 6]

상기 비교예 1에서 용매로 부틸렌 글리콜과 에탄올 대신에 물만을 단독으로 사용하는 것을 제외하고 비교예 1과 동일한 방법을 사용하여, 천연물 추출물 6.0g(건조중량)을 얻었다.

[시험예 1] 자외선으로부터의 세포 보호 효과 시험

1)시험 방법

사람 섬유아세포를 2×10⁵세포/웰로 하여 웰 플레이트에 놓고 10% FBS를 함유하는 DMEM배지를 0.2㎖ 공급한 후, 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 여기에 DMSO에 녹인 실시예 1∼6의 오기단 추출물 및 비교예 1∼6의 추출물을 각각 처리한 다음, 2MED의 자외선을 5분간 조사하고, 이를 24시간 동안 배양하였다. 세포의 생존력을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. MTT assay는 배양한 세포에 MTT 용액 0.1㎖를 가하여 4시간 동안 배양한 다음, 배지를 제거하고 DMSO 0.5㎖를 넣어 형성된 포르마잔(formazan)을 ELISA 판독기(reader)를 사용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 각각의 실시예의 고형분을 녹인 용매인 DMSO로 시험을 시행한 것을 대조군으로 하여 흡광도를 측정하였고, 대조군과의 상대적인 흡광도의 차이로부터 세포 보호 효과를 판정하였다.

2)시험결과

상기 방법에 따라, 실시예 1∼6 및 비교예 1∼6에서 추출한 추출물의 자외선 으로부터의 세포 보호 효과를 측정하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 상기 결과로부터 본 발명에 의한 실시예 1∼6의 오기단 추출물은 종래 추출방법으로 제조한 비교예 1∼6의 추출물과 비교하여 세포 보호 효과가 현저히 우수함을 알 수 있었다.

	반응액 중에 함유시킨 시료의 농도(㎍/㎖)	세포 보호 효과(%)
		실시예	비교예
1	100	92(0.95999)	86(0.9003)
2	100	87(0.91038)	79(0.82531)
3	100	87(0.9053)	77(0.80121)
4	100	80(0.83739)	68(0.70612)
5	100	49(0.51261)	46(0.47865)
6	100	79(0.81983)	62(0.64894)
세포보호효과(%)=시험군의 흡광도/대조군의 흡광도 ×100 괄호안의 수치는 흡광도(㎚)임. 참고로 대조군의 흡광도는 1.0449㎚

[시험예 2] 수퍼옥사이드 라디칼(Superoxide radical)로부터의 세포 보호 효과 시험

1)시험 방법

사람 섬유아세포를 2×10⁵세포/웰로 하여 웰 플레이트에 놓고 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지를 0.2㎖ 공급한 후, 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 여기에 DMSO에 녹인 실시예 1∼6의 오기단 추출물 및 비교예 1∼6의 추출물을 각각 처리하고 30분 동안 배양하였다. 이 배양된 세포에 1.5mM 크산틴(xanthine) 10㎕와 0.25U 크산틴 산화 효소(Xanthin oxidase) 10㎕를 가하여 수퍼옥사이드 라디칼을 발생시킨 후, 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포의 생존력을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. MTT assay는 배양한 세포에 MTT 용액 0.1㎖을 가하여 4시간 동안 배양한 다음, 배지를 제거하고 DMSO 0.5㎖를 넣어 형성된 포르마잔을 ELISA 판독기를 사용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 각각의 실시예의 고형분을 녹인 용매인 DMSO로 시험을 시행한 것을 대조군으로 하여 흡광도를 측정하였고, 대조군과의 상대적인 흡광도의 차이로부터 세포 보호 효과를 판정하였다.

2)시험결과

상기 방법에 따라, 실시예 1∼6 및 비교예 1∼6에서 추출한 추출물의 수퍼옥사이드 라디칼로부터의 세포 보호 효과를 측정하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 상기 결과로부터 본 발명에 의한 실시예 1∼6의 오기단 추출물은 종래 추출방법으로 제조한 비교예 1∼6의 추출물과 비교하여 수퍼옥사이드 라디칼로부터의 세포 보호 효과가 현저히 우수함을 알 수 있었다.

	반응액 중에 함유시킨 시료의 농도(㎍/㎖)	세포 보호 효과(%)
		실시예	비교예
1	100	92(0.95989)	82(0.85875)
2	100	72(0.75268)	68(0.70725)
3	100	85(0.88816)	78(0.81457)
4	100	82(0.85437)	76(0.79412)
5	100	63(0.65829)	60(0.62794)
6	100	79(0.82547)	66(0.68963)
세포보호효과(%)=시험군의 흡광도/대조군의 흡광도 ×100 괄호안의 수치는 흡광도(㎚)임. 참고로 대조군의 흡광도는 1.0449㎚

[시험예 3] 세포 증식 효과 시험

1)시험 방법

96μ-웰 플레이트에 5% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 용액을 100㎕씩 넣은 다음, 2% FBS가 함유된 DMEM 배지에 실시예 1∼6의 오기단 추출물 및 비교예 1∼6의 추출물을 각각 일정농도로 분산시켜 묽히고 100㎕씩 다시 첨가하였다. 헤모사이토메타(Hemocytometer)를 이용하여 신생아의 포피(foreskin)조직에서 얻은 섬유아세포를 웰당 4,000개씩 100㎕ 배지에 분산시켜 가한 후, 7일간 배양하였다. 배양이 끝난 후, 상등액을 제거하고 다시 5% 인산 완충 용액(PBS, phosphate buffered saline)을 200㎕씩 가하여 세척한 다음, DMSO를 웰당 150㎕씩 가하고 10분간 흔들어 녹여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 각각의 실시예의 고형분을 녹인 용매인 DMSO로 시험을 시행한 것을 대조군으로 하여 흡광도를 측정하였고, 대조군과의 상대적인 흡광도의 차이로부터 세포 증식 효과를 판정하였다.

2)시험결과

상기 방법에 따라, 실시예 1∼6 및 비교예 1∼6에서 추출한 추출물의 세포 증식 효과를 측정하였고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 상기 결과로부터 본 발명에 의한 실시예 1∼6의 오기단 추출물은 종래 추출방법으로 제조한 비교예 1∼6의 추출물과 비교하여 세포 증식 효과가 우수함을 알 수 있었다.

	반응액 중에 함유시킨 시료의 농도(㎍/㎖)	세포 증식 효과(%)
		실시예	비교예
1	100	130(1.59880)	113(1.62345)
2	100	127(1.55119)	116(1.41321)
3	100	110(1.34112)	106(1.29875)
4	100	104(1.26811)	99(1.21002)
5	100	97(1.18735)	90(1.09815)
6	100	113(1.38127)	104(1.27026)
세포증식효과(%)=시험군의 흡광도/대조군의 흡광도 ×100 괄호안의 수치는 흡광도(㎚)임. 참고로 대조군의 흡광도는 1.2214㎚

[시험예 4] 보습 효과 시험

1)시험 방법

디쉬(Dish)에 실시예 1∼6의 오기단 추출물 및 비교예 1의 추출물을 5g씩 넣고, 이를 CaCl₂가 들어있는 데시케이터 중의 상대습도 41%, 온도 25℃의 조건하에 방치한 다음, 일정시간 경과 후의 중량 변화를 경시적으로 측정하였다.

2)시험결과

상기 방법에 따라, 실시예 1∼6 및 비교예 1에서 추출한 추출물의 보습 효과를 측정하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 상기 결과로부터 본 발명에 의한 실시예 1∼6의 오기단 추출물은 종래 추출방법으로 제조한 비교예 1의 추출물과 비교하여 보습 효과가 우수함을 알 수 있었다

	측정 시간(hr)	수분 함유량 (%)
실시예 1	120	53.6
실시예 2	120	47.1
실시예 3	120	51.3
실시예 4	120	47.7
실시예 5	120	45.8
실시예 6	120	49.4
비교예 1	120	43.3
수분 함유량(%) = 잔류 시료량(g)/ 초기 시료의 양(g) ×100

[시험예 5] 오기단 추출물의 안전성 시험

오기단 추출물의 안전성을 시험하기 위하여, 실시예 1의 오기단 추출물을 사용하여 실험용 쥐를 대상으로 1차 피부 자극성 시험, 1차 안점막 자극성 시험 및 피부 감작성 시험을 실시하여 그 결과를 하기 표 5∼7에 나타내었다(시험 기간: 2003년 4월 4일 ∼ 2003년 5월 20일). 하기 표 5는 1차 피부 자극성 시험 결과를 나타낸다.

시 간	홍 반	부 종
30-60분	0	0
24시간	0	0
48시간	0	0
72시간	0	0
*실험동물종: 뉴질랜드산 Albino Rabbit, 투여개시시 주령 및 체중범위: 10주, 2.5㎏±20g

상기 결과로부터, 본 발명의 오기단 추출물은 피부 홍반이나 부종 등의 자극성이 없는 안전한 물질임을 확인하였다.

또한, 하기 표 6은 1차 안점막 자극성 시험 결과를 나타낸다.

소 견	1시간	24시간	48시간	72시간
각막혼탁	0	0	0	0
홍채 이상	0	0	0	0
각막 발적 부종	0	0	0	0
*실험동물종: 뉴질랜드산 Albino Rabbit, 투여개시시 주령 및 체중범위: 10주, 2.5㎏±20g

상기 결과로부터, 본 발명의 오기단 추출물은 각막 혼탁, 홍채 이상 또는 각막 발적 부종 등의 안점막 자극성이 없는 안전한 물질임을 확인하였다.

또한, 하기 표 7은 1차 피부 감작성 시험 결과를 나타낸다.

시 간	감작율(%)	등 급	감작성 정도
24시간	6	Ⅰ	아주 약함
48시간	3	Ⅰ	아주 약함
*실험동물종: Hartly 계 수컷 Guinea-Pig, *투여개시시 주령 및 체중범위: 10주, 300 ∼ 500g

상기 결과에 있어서, 감작율은 상기 시험에 대하여 양성 반응을 나타낸 동물의 수 및 이들의 피부 반응을 점수화한 것으로부터 통상적인 방법으로 환산한 것이며, 감작율이 0∼8% 일 때, 등급 Ⅰ로 하고, 감작성 정도를 아주 약함으로 정하는 것임이 통상적임을 밝혀둔다. 따라서, 본 발명의 오기단 추출물은 피부 감작성에 있어서 안전한 물질임을 확인하였다.

또한, 사람 피부 패취 테스트에서도 시료제거 후 30분, 24시간까지의 반응에 있어서 모두 음성으로 나타났으며, 시료제거 후 7일째에도 이상은 확인되지 않았다.

즉, 이상의 안전성 시험 결과로부터 오기단 추출물은 매우 안전한 물질임이 증명되었다.

[시험예 6] 오기단 추출물의 물성 안정도 측정시험

실시예 1의 오기단 추출물을 화장료에 도입시, 그 물성이 어느 정도의 안정성을 갖고 사용될 수 있는지를 평가하기 위하여, 상온, 40℃ 및 일광에 대해 화장료 성분의 물성 측정에 일반적으로 사용되는 변색 측정을 시행하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

날짜 조건	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
상온	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
40℃	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
일광	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
날짜 조건	16	17	18	19	20	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30
상온	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
40℃	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
일광	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+
-; 색상 변화 없음, +; 변색 시작, ++; 많이 변함, +++; 완전 변색

상기 결과로부터 본 발명의 오기단 추출물은 상온과 40℃에서 매우 안정하며, 일광에서는 거의 무시될 정도의 변색이 관찰되기는 하나, 더 이상의 변색 진행은 없는 매우 안정한 물질임이 판명되었다.

[시험예 7] 사람 피부에 대한 탄력성 증가 시험

실시예 1의 오기단 추출물을 함유하여 제형화한 하기 제형예 1의 영양크림 및 일반용매 추출물을 함유한 비교예 7의 영양크림을 제조하여, 피부 도포시 피부의 탄력성에 미치는 효과를 측정하였다. 시험은 20세∼55세의 여성 중, 정상, 지성, 건성, 복합성 피부를 지닌 20명에 대해 안면 왼쪽 부위에는 실시예 1의 영양 크림을, 안면 오른쪽 부위에는 비교예 7의 영양크림을 아침, 저녁으로 1일 2회 도포하여 사용하게 한 후, 1주, 2주, 3주 및 4주 후에 피부 탄력 측정기기(Ballisto meter)를 이용하여 피부의 탄력성을 측정하는 방법으로 수행하였다. 결과는 하기 표 9 및 도 1에 나타내었다.

[제형예 1 및 비교예 7] 영양크림

원 료	제형예 1	비교예 7
실시예 1의 오기단 추출물	7.0	-
비교예 2의 추출물	-	7.0
β시토스테롤	3.5	3.5
씨12-20애씨드 피이지-8에스텔	3.0	3.0
세라마이드	0.7	0.7
세테스-4	2.0	2.0
콜레스테롤	3.5	3.5
디이에이세틸포스페이트	0.4	0.4
글리세린	5.0	5.0
선플라워씨드오일	22.0	22.0
밀납	1.0	1.0
카보머	0.5	0.5
트리에탄올아민	0.5	0.5
방부제	미량	미량
향료	미량	미량
정제수	잔량	잔량

			제형예 1					비교예 7
			T0	T1	T2	T3	T4	T0	T1	T2	T3	T4
탄 력 성	튀어오름 수		0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0
	진 폭	첫번째	1.7	4.1	5.2	6.4	7.2	1.6	3.6	4.4	4.6	5.4
		두번째	1.2	3.4	3.8	5.2	6.0	1.3	1.9	2.3	3.0	3.4
		세번째	0.0	2.2	2.8	3.7	4.5	0.0	0.0	2.0	2.3	2.4
		네번째	0.0	0.0	1.3	2.9	3.3	0.0	0.0	0.2	0.3	0.9
평 균			0.725	2.425	3.275	4.55	5.25	0.725	1.375	2.225	2.55	3.025
(주) T0;사용전, T1;1주 사용후, T2;2주 사용후, T3;3주 사용후, T4;4주 사용후

이상의 결과에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 오기단 추출물을 함유한 제형예 1의 영양크림은 비교예 7의 영양크림에 비해 피부상태 개선에 의한 피 부 탄력 효과가 우수한 것으로 나타났다.

[시험예 8] 항염증 시험

마우스 좌측 귀를 대조부위, 우측 귀를 시험부위로 하여 추출 혼합물을 적용 전 에탄올로 귀를 깨끗하게 세척한 후, 시료 20㎕를 1일 1회 4일간 지속적으로 도포한 다음, 마지막 도포 1시간 후에 좌측 귀에 에탄올을 우측 귀에는 아라키돈산(Arachidonic acid)을 2㎎/ear을 도포하여 1시간 후 귀의부종(ear edema) 정도를 마이크로미터로 양쪽 귀를 3회씩 반복 측정하였다.

상기 과정에서 사용한 시료로는 비스테로이드성 소염 진통제인 인도메타신(Indomethacin), 아라키돈산 및 실시예 1∼6의 오기단 추출물을 사용하였다.

항염효과는 아라키돈산(Arachidonic acid) 처리군을 기준으로 하여 아래의 수학식 1을 통해 부종억제 정도를 계산하여 판정하였으며, 그 결과를 표 10에 나타내었다.

억제율(%) = (A―B) / A × 100

A : 대조군귀의 평균두께(아라키돈산 처리귀의 두께-비처리 귀의두께)

B : 추출 혼합물 도포군 귀의두께(시료처리귀의 두께-비처리귀의 두께)

도 3은 실시예 1의 오기단 추출물의 항염 효과를 측정하여 그래프로 도시한 것이다.

항염 효과

시료	반응액중에 함유시킨 최종농도(㎍/ml)	용매	귀두께(㎛)		억제율(%)
			시료처리전	시료처리후
Indomethacin	1.0	에탄올	321	466	43.4
아라키돈산	2㎎/ear	에탄올	298	554	-
실시예 1	1.0	에탄올	321	516	23.8
실시예 2	1.0	에탄올	241	446	19.9
실시예 3	1.0	에탄올	286	490	20.3
실시예 4	1.0	에탄올	284	496	17.2
실시예 5	1.0	에탄올	259	467	18.8
실시예 6	1.0	에탄올	284	503	14.5

상기 표 10에서 알 수 있듯이, 본 발명에 의한 실시예 1∼6의 오기단 추출물이 항염 효능을 가짐을 확인할 수 있었다.

[시험예 9] 주름 개선 효과 시험

실시예 1의 오기단 추출물을 함유하여 제형화한 하기 제형예 2의 영양에센스 및 일반용매 추출물을 함유한 비교예 8의 영양에센스에 대하여, 피부 탄력성 증진에 따른 주름 개선 효과를 측정하기 위해 20명의 왼쪽 눈 가장자리에 하루에 두번 제형예 2를 적용하고, 오른쪽 눈 가장자리에는 비교예 8을 적용하였다. 각각의 처리 후 45일이 경과한 다음, 피부 표면의 탄력성을 Cutometer SEM 474에 의해 측정하였다. Cutometer SEM 474에 의한 피부 탄력도 측정은 주름의 깊이를 측정하는 것으로서, 값이 적을수록 탄력성이 좋고 주름이 완화된 것이다. 탄력도 값은 처리전의 측정값에 비해 감소한 값을 %로 나타내었으며, 피검자 20명의 평균값을 구하여 표 11에 나타내었다.

[제형예 2 및 비교예 8] 영양 에센스

원 료	제형예 2	비교예 8
실시예 1의 오기단 추출물	7.0	-
비교예 2의 추출물	-	7.0
β시토 스테롤	1.50	1.50
씨12-20애씨드피이지-8에스텔	2.00	2.00
세라마이드	0.7	0.7
세테스-4	1.2	1.2
콜레스테롤	1.5	1.5
디이에이세틸포스페이트	0.4	0.4
글리세린	5.0	5.0
선플라워씨드오일	5.0	5.0
사이클로메치콘	2.0	2.0
카르보머	0.2	0.2
산탄검	0.2	0.2
방부제	미량	미량
향료	미량	미량
정제수	잔량	잔량

시 료	피부 탄력도(주름깊이 감소) 효과(%)
	30일	45일
제형예 2	18.1	29.5
비교예 8	11.2	21.4

상기 표 11에서 알 수 있듯이, 본 발명에 의한 오기단 추출물을 함유하는 화장료인 제형예 2가 비교예 8에 비해 피부탄력을 증가시킴으로써 주름 개선 효과가 있음을 알 수 있었다.

[시험예 10] 보습 효과 시험

실시예 1의 오기단 추출물을 함유하여 제형화한 하기 제형예 3의 영양로션 및 일반용매 추출물을 함유한 비교예 9의 영양로션에 대하여, 피부 보습 효과를 시험하기 위해 20명의 왼쪽 팔 안쪽에 제형예 3과 비교예 9를 적용하였다. 각각을 적 용한 후, Corneometer CM 825에 의해 시간에 따른 피부 표면의 보습력을 측정하였다. Corneometer CM 825에 의한 피부 보습 측정은 피부의 수분 함유량를 측정하는 것으로서, 값이 높을수록 보습력이 좋은 것이다. 피검자 20명의 평균값을 구하여 하기 표 12 및 도 2에 나타내었다. 시험은 온도 20℃, 상대습도 20% 하에서 이루어졌다.

[제형예 3 및 비교예 9] 영양로션

원 료	제형예 3	비교예 9
실시예 1의 오기단 추출물	7.0	-
비교예 2의 추출물	-	7.0
β시토스테롤	1.70	1.70
폴리소르베이트 60	1.00	1.00
세라마이드	0.7	0.7
세테스-4	1.2	1.2
콜레스테롤	1.5	1.5
디이에이세틸포스페이트	0.4	0.4
글리세린	5.0	5.0
선플라워씨드오일	8.0	8.0
사이클로메치콘	1.0	1.0
카르보머	0.2	0.2
산탄검	0.3	0.3
트리에탄올아민	0.2	0.2
방부제	미량	미량
향료	미량	미량
정제수	잔량	잔량

시간(min)	5	10	15	20	25	30
제형예 3	19.4	7.99	5.92	5.33	5.05	4.76
비교예 9	20.4	7.60	4.24	3.68	3.32	3.08

상기 표 12에서 알 수 있듯이, 본 발명에 의한 오기단 추출물을 함유하는 화장료인 제형예 3이 비교예 9와 비교하여 시간이 경과하여도 피부의 수분 함유량이 어느정도 유지됨을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 오기단 추출물은 상기 제형예 1∼3 이외에도 하기 제형예 4 및 제형예 5로 제형화될 수 있으며, 본 발명이 이들 제형으로만 한정되는 것은 아니다.

[제형예 4] 화장수(스킨로션)

원 료	함량(중량%)
실시예 1의 오기단 추출물	7.0
글리세린	2.0
부틸렌 글라이콜	1.0
프로필렌 글라이콜	2.0
피피지-26-부테스-26/피이지-40 히드로게네이티드 캐스터오일	1.0
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제	미량
색소	미량
향료	미량
정제수	잔량

[제형예 5] 마사지 크림

원 료	함량(중량%)
실시예 1의 오기단 추출물	7.0
밀납	5.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.8
친유형 글리세릴스테아레이트	0.8
유동파라핀	30.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
카르보머	0.3
글리세린	5.0
부틸렌글라이콜	3.0
프로필렌글라이콜	3.0
트리에탄올아민	0.3
방부제	미량
색소	미량
향료	미량
정제수	잔량

본 발명에 따른 초임계 유체 추출법은 자연활성 성분을 거의 파괴하지 않고 추출할 수 있다. 또한 자연활성 성분의 추출물 내 함량이 일반 용매추출물은 미량이나 초임계 유체 추출법은 3∼4배 이상의 수율을 얻을 수 있었다. 따라서 동량의 추출물을 적용할 때 일반용매 추출물 보다 많은 양의 자연성 활성 성분을 포함할 수 있으며, 적용되는 자연성 활성 성분이 파괴되지 않은 자연 그대로의 성분을 얻을 수 있었다. 뿐만 아니라 추출 소요 경비 역시 저렴하여 매우 경제적이다.

본 발명에서는 동충하초, 가시오갈피, 영지버섯, 녹용 및 인삼을 초임계 유체 추출법을 통해 추출하여 이를 화장료에 도입시킴으로써, 일반용매 추출물 보다 상기 추출물의 자외선으로부터의 세포 보호능, 세포 증식능 및 우수한 보습능을 통해, 피부 주름 완화, 탄력 증강 및 보습능 회복에 복합적으로 작용하는 피부 노화 방지 등의 효능을 효과적으로 제공할 수 있었다.

Claims (9)

1) 오기단 성분으로서 동충하초, 가시오갈피, 영지버섯, 녹용 및 인삼을 혼합하고 분쇄한 후 용매와 혼합하여 교반하는 단계;

2) 상기 혼합물을 초임계 추출조에 넣고 초임계 유체를 공급하는 단계;

3) 추출조의 압력을 300기압으로 유지시키며 추출조 내부의 온도를 0.5℃/min 속도로 40℃까지 승온시키는 단계; 및

4) 추출조의 온도와 압력을 30∼50℃, 200∼350기압으로 50분간 유지한 후 상압으로 감압하여 오기단 추출물을 얻는 단계;

를 포함하는 초임계 유체 추출법으로 추출됨을 특징으로 하는 오기단 추출방법.

제 1항에 있어서, 상기 천연물들은 동충하초 5∼10 중량%, 가시오갈피 10∼20 중량%, 영지버섯 5∼10 중량%, 녹용 2∼5 중량% 및 인삼 20∼30 중량%의 건조 중량비로 함유됨을 특징으로 하는 오기단 추출방법.

제 1항에 있어서, 상기 용매는 부틸렌 글리콜, 물 및 에탄올로 구성된 그룹으로부터 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 오기단 추출방법.

제 1항에 있어서, 상기 초임계 유체로서 이산화탄소가 사용됨을 특징으로 하 는 오기단 추출방법.

제 1항에 의한 추출 방법으로 제조된 오기단 추출물.

제 5항에 의한 오기단 추출물을 함유함을 특징으로 하는 화장료 조성물.

제 6항에 있어서, 화장료 조성물이 상기 오기단 추출물을 전체 조성물 총중량에 대하여 0.1∼10 건조중량%로 함유함을 특징으로 하는 화장료 조성물.

제 6항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 화장수, 스킨로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림 또는 영양에센스로 제형화 됨을 특징으로 하는 화장료 조성물.

제 6항에 있어서, 상기 추출물이 자외선으로부터 세포 보호용, 세포 증식용 또는 보습용으로 함유됨을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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