KR101856374B1

KR101856374B1 - 증숙 가시오가피 뿌리 추출물을 함유하는 피부 광손상 보호용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101856374B1
Application number: KR1020160140060A
Authority: KR
Inventors: 김영희; 이강혁; 김건용; 이수연; 김예향; 박소연
Original assignee: 에스케이바이오랜드 주식회사
Priority date: 2016-10-26
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2018-05-11
Also published as: KR20180045955A

Abstract

본 발명은 증숙 가시오가피 뿌리 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 증숙 가시오가피 뿌리 추출물은 증숙하지 않은 일반 가시오가피 뿌리를 추출하여 얻은 추출물에 비해 코니페린 화합물을 다량 함유하고 있어 UV 흡수 또는 차단 기능이 뛰어나기에 피부 광손상 보호용 화장료 또는 약학 조성물로서 용이하게 이용될 수 있다.

Description

증숙 가시오가피 뿌리 추출물을 함유하는 피부 광손상 보호용 화장료 조성물 {Cosmetic composition comprising steamed root extract of Acanthopanax senticosus for protecting photo-damaged skin}

본 발명은 증숙 가시오가피 뿌리 추출물을 함유하는 피부 광손상 보호용 화장료 조성물에 관한 것이다.

자외선(Ultraviolet, UV)은 파장에 따라 자외선 A(UVA, 320~400 nm), 자외선 B(UVB, 290~320 nm), 자외선 C(UVC, 200~290 nm)로 분류되며 파장에 따라 피부의 침투 정도가 달라지는데, 그 중 UVA와 UVB가 지구상까지 도달하여 피부에 다양한 영향을 준다. 특히 UVB의 일부는 표피를 투과하여 진피의 유두층까지 도달하며 이러한 자외선에 의해 세포 조직 내 과잉의 활성산소(Oxygen free radical)가 생성되고, 피부 내 DNA 손상이 발생되며 이로 인해 홍반 반응, 일광 화상, 색소침착, 국소 및 전신적 면역 억제, 발암 등 광노화(Photoagaing)에 대한 증상이 나타나게 된다(I. Kimber et al., 2000. Br. J. Dermatol., 142, 401).

이러한 자외선에 피부세포가 노출되게 되면, 먼저 표피층의 케라티노사이트(Keratinocyte)가 염증성 사이토카인(Cytokine)을 분비하고 세포내 산화적 스트레스가 유발된다. 이로 인해 세포내에서 다양한 단백질키나제 및 포스포리파아제가 활성화 되고 이들 효소는 아라키돈산을 분비를 촉진하기 위해 세포막 지질을 가수분해한다. 분비된 아라키돈산은 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2, PGE2)로 변화하고, 이들은 분비된 사이토카인과 합성되어 피부의 발적 및 여러 가지 염증반응을 일으켜 결국 피부의 노화를 촉진한다. 또한 진피층의 섬유아세포(Fibroblast) 역시 자외선에 노출될 경우, 상기 케라티노사이트의 기작과 유사한 활성화가 이루어지며 자외선 조사 양이 증가됨에 따라 세포 사멸(Apoptosis) 및 DNA 손상이 일어나 궁극적으로는 피부암을 발생시킬 수 있다.

광노화의 경우, 내인성 노화에 비해 피부결이 더 거칠고 건조하며 탄력이 현저하게 감소하는 경향을 보이며 이로 인해 깊은 피부 주름, 자반과 피지선 과형성과 같은 병변이 흔히 관찰된다. 광노화가 일어난 피부는 표피의 두께가 처음에는 증가되는 것 처럼 보이나 결국 내인성 노화 때보다 더 얇아지고 각질세포의 형태와 배열이 비정상적으로 변화한다. 랑게르한스세포의 수도 더욱 감소되어 국소적인 면역 기능의 저하가 심해진다. 멜라닌 세포의 경우 숫자는 감소되지만 세포의 활성은 불규칙하게 증가되어 피부에 저색소반과 과색소반이 얼룩으로 혼재하는 양상을 보이게 되고 악성 종양의 발생 가능성이 현저하게 높아진다. 또한 광노화가 일어난 피부는 내인성 노화 피부에 비하여 진피 기질의 아교질 양이 더욱 더 감소되어 있다. 진피의 3~4%를 차지하는 탄력소는 그 수와 직경이 감소하고 길이가 짧아지며 석회화가 일어난다. 광노화가 일어난 진피에서는 진피 상부에 변형된 탄력 섬유성 물질(elastotic material)이 광범위하게 침착되어 있으며 진피 기질의 점다당질(mucopolysaccharide) 중 히알루론산의 감소가 현저하여 피부의 긴장도가 떨어지게 된다. 진피 두께의 감소와 그 구성 성분의 변화는 피부 탄력의 감소를 초래하여 외관상 처지거나 굵게 주름진 피부로 보이게 한다(Kang, S. et al., 2005. Am. J. Pathol. 166, 1691; Matsumura, Y. et al., 2004. Toxicol. Appl. Pharmacol. 195, 298).

따라서 자외선으로부터 피부를 보호하기 위해서는 자외선에 의한 피부세포 손상을 저해하고 산화적 스트레스를 억제하는 것이 중요하다. 최근에는 각종 천연물을 이용하여 보다 안전하면서 자외선으로부터 피부 세포를 보호하는 연구가 활발히 진행 되고 있다.

본 발명자들이 연구한 천연물인 가시오가피(Acanthopanax senticosus)는 가시오갈피라고도 하며, 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 다년생 낙엽활목관목으로 한반도, 시베리아 및 중국의 고산지대에서 자생하는 식물이다. 높이는 4-5m이고 줄기전체에 아래로 향하는 가느다란 가시가 털처럼 나있는 목본으로 러시아에서는 "시베리아 인삼" 이라고도 불리며 강장제로서 인삼에 버금가는 신진대사 작용이 있다고 알려져 있다. 동의보감을 비롯한 신농경초본, 한약집성방 등의 고전한의서에는 약리효능이 탁월한 것으로 기록되어 있으며 과학적으로 항피로 효과(Huang, L. Z. et al., 2011. J Ethnopharmacol 133, 213-219), 항염증 효과(Jung, H. J. et al., 2003. Planta Med 69, 610-616), 항당뇨 효과(Kim, S. D. et al., 2005. J East Asian Soc Diet Life 15, 549-557), 항바이러스 효과(Lee, S. et al., 2003. Arch Pharm Res 26, 40-42), 자외선에 의한 피부주름 예방 및 완화 효과(Park, K. J. et al., 2010. J Korean Soc Food Sci Nutr 39, 42-46) 등이 보고되었다. 현재까지 밝혀진 가시오가피의 성분은 Lignan류의 Eleutheroside B, Eleutheroside E, Saponin류의 Eleutheroside A, Eleutheroside I, Triterpene류의 β-sitosterol, Coumarin류의 Isofraxidin, 미네랄, 비타민 등이 있다(Choi, Y. H. et al., 2002. Korean J Pharmacogn 33, 88-91).

한국공개특허 제10-2015-0106111호에는 섬오가피의 뿌리가 원료로 포함된 생약 추출물이 자외선에 의한 피부 손상의 예방 또는 치료용 조성물이나 화장료로서 이용될 수 있음이 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0115229호에는 가시오가피의 잎과 줄기가 원료로 포함된 생약 추출물이 항산화와 미백용 화장료 조성물로서 이용가능함이 개시되어 있다. 이외에도 신경보호작용, 가시오가피가 포함된 복합 추출 조성물에 관한 연구가 보고된 바 있다.

본 발명자들은 증숙 가시오가피 뿌리 추출물이 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 상기 증숙 가시오가피 뿌리 추출물이 피부 광손상을 보호하는 효과가 있어 이와 관련된 화장료 조성물 또는 약학 조성물로서 이용가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2015-0106111호 (발명의 명칭 : 자외선에 의한 피부 손상의 예방 또는 치료용 조성물, 출원인 : 코웨이 주식회사 외, 공개일 : 2015.09.21) 한국공개특허 제10-2014-0115229호 (발명의 명칭 : 생약재의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 미백용 조성물, 출원인 : 이장수, 공개일 : 2014.09.30)

Bednarek, P. et al., Planta Vol 138, 1058-1070, 2005. Berlin, J. et al., 1986. J Nat Prod. 49, 435-439. Choi, Y. H. et al., 2002. Korean J Pharmacogn 33, 88-91. Della Creca. M. et al., 1998. Phytochemistry. 49, 1299-1304. Huang, L. Z. et al., 2011. J Ethnopharmacol 133, 213-219. I. Kimber et al., 2000. Br. J. Dermatol., 142, 401. Jung, H. J. et al., 2003. Planta Med 69, 610-616. Kang, S. et al., 2005. Am. J. Pathol. 166, 1691. Kim, S. D. et al., 2005. J East Asian Soc Diet Life 15, 549-557. Kim. J. S. et al., 2009. Kor. J. Pharmacogn. 40, 326-333. Kim. Y. H. et al., 1988. Arch. Pharm. Res. 11, 159-162. Lee, S. et al., 2003. Arch Pharm Res 26, 40-42. Matsumura, Y. et al., 2004. Toxicol. Appl. Pharmacol. 195, 298. Moseman T., 1983. J. Immuno. Methods, 65, 55. Park, K. J. et al., 2010. J Korean Soc Food Sci Nutr 39, 42-46. Skaper S.D., et al., 1990, Cell Culture, 2, 17-33. Sugiyama. M. et al., 1993. Phytochemistry. 33, 1215-1219.

본 발명의 목적은 증숙 가시오가피 뿌리 추출물을 함유하는 피부 광손상 보호용 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 증숙 가시오가피 뿌리는 90~120℃에서 1~3시간 동안 증숙한 뒤, 40~80℃에서 1~30시간 동안 건조하여 얻는 것을 특징으로 한다.

상기 증숙 가시오가피 뿌리 추출물은 증숙 가시오가피 뿌리를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있다.

상기 증숙 가시오가피 뿌리 추출물에는, 건조물 기준으로 하기 화학식 1의 코니페린(coniferin) 화합물이 0.3 ~ 0.6 중량% 함유될 수 있다.

[화학식 1]

이에 본 발명은 상기 조성물을 함유하는 화장료를 제공한다. 상기 화장료는 피부외용연고, 에센스, 미백크림, 로션, 에멀젼, 팩, 일반화장수, 스킨밀크, 스킨, 크림, 세럼, 미용비누, 유연화장수, 약용화장수, 전신세정제, 클렌징 오일, 클렌징 크림, 클렌징 티슈 및 클렌징 워터에서 선택되는 제형일 수 있다.

또한, 본 발명은 증숙 가시오가피 뿌리 추출물을 함유하는 피부 광손상 보호용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 증숙 가시오가피 뿌리 추출물을 함유하는 피부 광손상 보호용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 상기 피부 광손상 보호용 화장료 조성물은 UV 차단 또는 흡수용 화장료 조성물이다. 상기 UV는 바람직하게는 UVB 일 수 있다.

상기 증숙 가시오가피 뿌리는 90~120℃에서 1~3시간 동안 증숙한 뒤, 40~80℃에서 1~30시간 동안 건조하여 얻는 것을 특징으로 한다. 상기 증숙 및 건조 조건을 벗어날 경우, 증숙 가시오가피 뿌리 추출물 내의 코니페린 함량의 증가가 잘 되지 않을 수 있다.

상기 증숙 가시오가피 뿌리 추출물은 증숙 가시오가피 뿌리를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있으며, 상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 이 때 바람직하게는 상기 용매로는 20~50%(w/w) 에탄올 수용액인 것이 좋으며, 가장 바람직하게는 30%(w/w) 에탄올 수용액인 것이 좋다.

상기 증숙 가시오가피 뿌리 추출물의 제조시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 증숙 가시오가피 뿌리 사용 중량 기준 1~40배 부피 또는 중량(1kg 기준 1~40ℓ 또는 1~40kg)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피 또는 중량을 사용할 수 있다. 상기 증숙 가시오가피 뿌리 추출물의 추출조건은 20~120℃에서 1분~72시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수 있다.

추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 증숙 가시오가피 뿌리 추출물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 또한, 상기 증숙 가시오가피 뿌리 추출물은 상법에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 칼럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 증숙 가시오가피 뿌리 추출물에는, 건조물 기준으로 코니페린 화합물이 0.3 ~ 0.6 중량% 함유될 수 있는데, 이는 증숙하지 않는 가시오가피 뿌리로 제조한 추출물 대비 2~3배 이상 코니페린 화합물의 함량이 증가된 것이다.

본 발명은 상기 화장료 조성물을 원료 또는 유효성분으로 함유하는 화장료를 제공할 수 있다. 상기 화장료로는 피부외용연고, 에센스, 미백크림, 로션, 에멀젼, 팩, 일반화장수, 스킨밀크, 스킨, 크림, 세럼, 미용비누, 유연화장수, 약용화장수, 전신세정제, 클렌징 오일, 클렌징 크림, 클렌징 티슈 및 클렌징 워터에서 선택되는 것을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 증숙 가시오가피 뿌리 추출물을 함유하는 피부 광손상 보호용 약학 조성물을 제공한다. 상기 피부 광손상 보호용 약학 조성물은 UV 차단 또는 흡수용 약학 조성물을 말한다. 또한 상기 약학 조성물은 바람직하게는 피부 외용제일수 있다. 상기 증숙 가시오가피 뿌리 추출물은 본 발명의 약학 조성물에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다.

상기 약학 조성물은 바람직하게는 피부에 뿌리거나 바르거나 붙이는 스프레이제, 액상제제, 로션, 수포제, 테이프제, 연무제, 외용산제, 겔, 크림, 졸, 연고제, 패치제, 마스크팩 등으로 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물에 수용성 프로폴리스는 0.001~99.9%가 함유될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 활성성분 이외의 다른 성분들은 일반적으로 피부에 적용되는 외용제에 사용되는 어떠한 성분이 사용될 수 있다. 예를 들어, 백색와셀린(와셀린), 황색와셀린, 라놀린, 정제 밀랍, 세타놀, 스테아릴 알콜, 스테아르산, 수소첨가유, 탄화수소겔, 폴리에틸렌글리콜, 액체 파라핀 및 스쿠알란과 같은 기제; 올레산, 이소프로필 미리스테이트, 글리세롤 트리이소옥타노에이트, 크로타미톤, 디에틸 세바케이트, 디이소프로필 세바케이트, 디이소프로필아디페이트, 헥실라울레이트, 지방산, 지방산 에스테르, 식물성유, 지방산 알콜 및 알콜과 같은 용매 또는 안정화제; 토코페롤 유도체, L-아스코르브산, 디부틸히드록시톨루엔 및 부틸히드록시아니졸과 같은 항산화제; p-히드록시벤조에 이트와 같은 방부제; 글리세린, 플로필렌 글리콜 및 소듐히라우로네이트와 같은 연석제; 폴리옥시에틸렌 유도체, 글리세롤 지방산 에스테르, 슈크로스 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르 및 레시틴과 같은 계면 활성제; 카르복시비닐 폴리머, 크산검, 카르복시메틸 셀룰로스 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스 및 히드록시프로필메틸 셀룰로스와 같은 증점제; 안정화제; 보존제; 흡착 촉진제; 및 기타 적당한 충진제들이 첨가될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 또는 피부외용제는 외용제를 제조하는데 잘 알려진 방법에 따라, 필요에 따라 적당한 기제와 함께, 각 성분을 잘 혼합하여 제조될 수 있으며 이와 같이 제조된 제제는 필요에 따라 병변에 적용된다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 제한되지 않으나 바람직하게는 피부에 접촉되는 방법들이 가장 바람직하다.

본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명은 증숙 가시오가피 뿌리 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 증숙 가시오가피 뿌리 추출물은 코니페린 화합물을 다량 함유하고 있어 피부 광손상 보호용 화장료 또는 약학 조성물로서 용이하게 이용될 수 있다.

한국공개특허 제10-2015-0106111호에는 섬오가피의 뿌리가 원료로 포함된 생약 추출물이 자외선에 의한 피부 손상의 예방 또는 치료용 조성물이나 화장료로서 이용될 수 있음이 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2014-0115229호에는 가시오가피의 잎과 줄기가 원료로 포함된 생약 추출물이 항산화와 미백용 화장료 조성물로서 이용가능함이 개시되어 있지만, 본 발명의 증숙 가시오가피 추출물의 피부 광손상 보호 화장료 조성물에 대해서는 기재하고 있지 않다.

코니페린은 섬가시오가피(Kim. Y. H. et al., 1988. Arch. Pharm. Res. 11, 159-162), 목서(Sugiyama. M. et al., 1993. Phytochemistry. 33, 1215-1219), 인동(Kim. J. S. et al., 2009. Kor. J. Pharmacogn. 40, 326-333), 칼라(Della Creca. M. et al., 1998. Phytochemistry. 49, 1299-1304) 등으로부터 분리 정제되는 단일화합물이며, [Berlin, J. et al., 1986. J Nat Prod. 49, 435-439]에 Linum flavum의 뿌리 추출물에 포함된 상기 코니페린 화합물이 UV 흡수 효과가 있음이 개시되어 있다.

그러나 본 발명은 가시오가피 뿌리를 증숙하는 것만으로도 상기 코니페린 화합물의 함량이 현저하게 증가되는 것을 확인함으로써 피부 광손상 보호용 조성물을 용이하게 제조할 수 있음을 최초로 확인하였다는 데에 의의가 있다. 또한 피부 광손상 보호용 조성물을 원료 시료로 사용하는 각종 제품에 제조비용이 상대적으로 높은 코니페린 화합물을 사용하는 것 대신 상기 가시오가피 뿌리 추출물을 사용하는 것만으로도 충분한 피부 광손상 보호 효과를 유도할 수 있어 제조자로 하여금 원료절감효과를 가져올 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 증숙 가시오가피 뿌리 추출물(실시예 1-1)을 HPLC로 분석한 크로마토그램 결과를 나타낸다.
도 2는 증숙하지 않은 일반 가시오가피 뿌리 추출물(비교예 1-1)을 HPLC로 분석한 크로마토그램 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 1-1의 추출물과 코니페린 화합물의 광보호 효과를 확인한 JC-1 Staining 결과를 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 증숙 가시오가피 뿌리 추출물의 제조>

실시예 1-1

가시오가피 뿌리 3kg을 100℃에서 2시간 동안 증숙한 뒤, 70℃에서 20시간 동안 건조하였다. 건조된 증숙 가시오가피 뿌리 3kg에 30%(w/w) 에탄올 수용액 30kg을 가하여 60℃에서 48시간 중탕 추출한 후 250 메쉬 여과포로 여과하고 0.45㎛ 필터로 여과하였다. 이후 여과액을 감압농축기(EYELA사, N-1000, 일본)로 감압 용매를 완전히 제거시켜 증숙 가시오가피 뿌리 추출물을 분말 상태로 128.2g을 수득하였다.

실시예 1-2 내지 1-4

실시예 1-1과 동일하게 실시예 1-1 내지 1-4의 증숙 가시오가피 뿌리 추출물을 제조하되, 가시오가피 뿌리의 증숙 조건은 하기 표 1의 조건을 참고하였다.

조건	증숙온도	증숙시간	건조온도	건조시간
실시예 1-1	100℃	2시간	70℃	20시간
실시예 1-2	90℃	3시간	40℃	12시간
실시예 1-3	120℃	1시간	65℃	30시간
실시예 1-4	110℃	2시간	80℃	24시간

< 비교예 1. 일반 가시오가피 뿌리 추출물 및 비교 증숙 가시오가피 뿌리 추출물의 제조>

비교예 1-1.

건조된 가시오가피 뿌리 3kg을 30%(w/w) 에탄올 수용액 30kg에 넣고 환류 냉각장치를 연결하여 60℃에서 48시간 중탕 추출한 후, 250 메쉬 여과포로 여과하고 0.45㎛ 필터로 여과하였다. 이후 여과액을 감압농축기(EYELA사, N-1000, 일본)로 용매를 완전히 제거시켜 일반 가시오가피 뿌리 추출물을 분말 상태로 수득하였다.

비교예 1-2 내지 1-4.

본 발명의 실시예 1의 증숙 조건을 벗어난 하기 표 2의 조건으로 증숙 가시오가피 뿌리를 제조한 후, 이 뿌리 3kg을 30%(w/w) 에탄올 수용액 30kg에 넣고 환류 냉각장치를 연결하여 60℃에서 48시간 중탕 추출한 후, 250 메쉬 여과포로 여과하고 0.45㎛ 필터로 여과하였다. 이후 여과액을 감압농축기(EYELA사, N-1000, 일본)로 용매를 완전히 제거시켜 일반 가시오가피 뿌리 추출물을 분말 상태로 수득하였다.

조건	증숙온도	증숙시간	건조온도	건조시간
비교예 1-2	80℃	1시간	25℃	20시간
비교예 1-3	100℃	10시간	60℃	0.5시간
비교예 1-4	100℃	0.5시간	25℃	20시간

<화장료 제조예 1. 마스크팩 제조>

실시예 1-1에서 제조한 증숙 가시오가피 추출물 1g을 멸균정제수 1000㎖에 희석하였다. 마스크팩 전용 부직포를 멸균하고, 상기 부직포를 추출물 희석액에 함침시킨 후 멸균비닐팩에 진공포장하였다.

<화장료 제조예 2. 보습제 제조>

실시예 1-1에서 제조한 증숙 가시오가피 추출물 1g을 멸균정제수 500㎖에 희석하고, 히알루론산 농도가 1%(w/v)가 되도록 첨가한 후 멸균 용기에 담아 보습제를 제조하였다.

<화장료 제조예 3. 데이크림 제조>

실시예 1-1에서 제조한 증숙 가시오가피 추출물 8.0중량%, 세토스테아릴알코올 3.0중량%, 자기유화형 모노스테아린산 0.5중량%, 친유형 모노스테아린산 1.5중량%, 밀납 0.5중량%, 유동파라핀 8.0중량%, 스쿠알란 7.0중량%, 이소세틸옥타노에이트 4.0중량%, 정제호호바유 4.0중량%, 디메틸실록산 0.3중량%, 모노스테아린산소르비탄 1.0중량%, 모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 1.2중량%, 글리세린 6.0 중량%, 프로필렌글리콜 4.0중량%, 베타인 4.0중량%, 잔탄검 0.06중량%, 트리에탄올아민 0.10중량%, 방부제 0.25중량%, 적량의 향료와 색소, 및 잔량의 정제수를 총 100중량%가 되도록 혼합하여 자외선 조사량이 많은 낮에 사용하는 데이크림을 제조하였다.

<화장료 비교제조예 1. 비교 데이크림 제조>

화장료 제조예 3과 동일한 조건으로 데이크림을 제조하되, 실시예 1-1에서 제조한 증숙 가시오가피 추출물 대신 비교예 1-1에서 제조한 가시오가피 추출물을 포함시켰다.

<화장료 비교제조예 2. 비교 데이크림 제조>

화장료 제조예 3과 동일한 조건으로 데이크림을 제조하되, 실시예 1-1에서 제조한 증숙 가시오가피 추출물 대신 비교예 1-4에서 제조한 가시오가피 추출물을 포함시켰다.

<화장료 비교제조예 3. 비교 데이크림 제조>

화장료 제조예 3과 동일한 조건으로 데이크림을 제조하되, 실시예 1-1에서 제조한 증숙 가시오가피 추출물 대신 정제수를 포함시켰다.

<약학조성물 제조예 1. 피부연고>

백색 바셀린에 실시예 1-1에서 제조한 증숙 가시오가피 추출물을 1중량%로 첨가하고 골고루 혼합하고 튜브에 주입하여 피부 보호용 외용제 조성물(연고)을 제조하였다.

<실험예 1. 추출물에 함유된 코니페린 화합물의 함량 확인>

본 발명자들은 예비 실험을 통해 가시오가피 뿌리 추출물에 하기 화학식 1의 구조를 갖는 코니페린(Coniferin) 화합물이 존재하는 것을 확인한 바 있다.

[화학식 1]

상기 코니페린의 물성을 확인하기 위해 NMR 및 ESI-MS 분석을 확인하였는데, NMR 기기로 H¹-NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 400 MHz), C¹³-NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 100 MHz)로 분리된 화합물의 구조를 분석하였으며, DMSO-d₆₍Sigma-Aldrich 社)를 용매로 사용하였다. ESI-MS 분석기기로는 JMS-HX110(Japan)을 사용하였으며, NMR 및 MS 결과는 이미 발표된 자료와 일치한다(Bednarek, P. et al., Planta Vol 138, 1058-1070, 2005).

¹H-NMR(DMSO-d₆, 400MHz) :δ 7.05 (1H, d, J=1.6 Hz, H-2'), 7.01 (1H, d, J=8.3Hz, H-5'), 6.88 (1H, dd, J=8.3, 1.6Hz, H-6'), 6.47 (1H, d, J=15.9Hz, H-3), 6.27 (1H, dt, J=15.9Hz, H-2), 4.88 (1H, d, J=7.2Hz, H-1''), 4.09 (2H, t J=4.3, 4.7, H-1), 3.77 (3H, s, H₃CO-3'), 3.65(1H, d, H-6''a), 3.45(1H, d, H-6''b), 3.28(1H, m, H-3''), 3.25(2H, m, H-5'', H-2''), 3.16(1H, m, H-4'').

¹³C-NMR(DMSO-d₆, 100MHz) : δ 149.0 (C-3'), 145.9 (C-4'), 131.0 (C-1'), 128.9 (C-2), 128.4 (C-3), 119.0 (C-6'), 115.2 (C-5'), 109.9 (C-2'), 100.0 (C-1''), 77.0 (C-3''), 76.8 (C-5''), 73.2 (C-2''), 69.6 (C-4''), 61.5 (C-1), 60.6 (C-6''), 55.6 (H₃CO-3').

ESI-MS m/z 365 [M+Na]⁺, HR-ESI-MS m/z 365.1209 (C₁₆H₂₂O₈Na, calc 365.1209).

본 발명자들은 상기 코니페린 화합물의 함량을 실시예 1 및 비교예 2의 추출물에서 확인하였다. 이를 위해 제조된 각각의 추출물 중 750g을 2L 증류수로 현탁시킨 후 동량의 부탄올을 가하여 2회 반복 추출하고 분액깔때기에서 분획하여 부탄올을 회수한 뒤 부탄올 층을 감압농축하여 가시오가피 부탄올 가용 추출물을 수득하였다.

상기에서 수득된 가시오가피의 부탄올 가용 추출물을 메탄올과 디클로로메탄용액에 용해시킨 후 디클로로메탄:메탄올=50:1(v:v)인 혼합용액을 사용하여 칼럼(5×40cm)에 충진한 실리카겔(머크사, 상품명:9385)에 분획물을 흡착시키고 디클로로메탄 : 메탄올(50:1→5:1)의 조건으로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 시행하여 용출물을 크게 6개의 분획으로 나누었고 4번 용출물에서 하기 표 3에 기재된 조건의 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 코니페린을 수득하였고 각 추출물의 코니페린 함량은 하기 표 4에 기재하였다.

컬럼(Column)	캅셀팍 C₁₈4.6 × 250㎜ 시세이도사
컬럼온도(Column temperature)	30℃
유속(Flow rate)	1.0mL/min
측정기(Detector)	UV 254nm
주입부피(Injection Volume)	20㎕
이동상(Mobile phase)	5~100% 아세토나이트릴

조건	코니페린 함량(mg/g)
실시예 1-1	5.3549
실시예 1-2	5.9345
실시예 1-3	5.2123
실시예 1-4	5.0234
비교예 1-1	2.2557
비교예 1-2	2.8423
비교예 1-3	2.0345
비교예 1-4	1.9234

상기 표 4를 참고하면, 실시예 1 추출물이 비교예 1 추출물과 비교하여 코니페린 함량이 2~3배 가량 높음을 확인할 수 있다. 각 추출물의 함량을 확인한 각 크로마토그램 중 대표적으로 실시예 1-1의 분석결과를 도 1에, 비교예 1-1의 결과를 도 2에 나타내었다.

<실험예 2. 가시오가피 뿌리 추출물 및 코니페린의 세포독성 확인>

MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 이용하여 실시예 1-1 및 비교예 1-1의 추출물, 코니페린 화합물을 시료로 사용하여 HaCaT 피부 각질 세포주에 대한 세포 독성을 평가하였다. 24-well plate에 피부 각질 세포주를 접종하여 24시간 배양한 뒤 배양된 세포의 배지를 serum-free 배지로 교체하고 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 세포에 2.5 mg/㎖의 MTT 용액을 10배 희석시킨 배지로 교체하여 반응시킨 후, 상등액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 1 ml을 첨가하여 생성된 MTT-formazan 결정체를 용해시켜 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme-linked immunospecific assay) reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

시료	실험 농도 (㎍/㎖)	세포 생존율 (%)
비교예 1-1	10	88.75
	25	89.91
	50	91.12
	100	93.77
실시예 1-1	10	92.99
	25	91.72
	50	95.73
	100	96.88
코니페린	10	101.46
	25	104.22
	50	107.13
	100	104.16
대조구	-	100

측정 결과, 상기 표 5에 나타낸 바와 같이 모든 시료에서 일반 세포 독성은 나타나지 않음을 확인할 수 있다.

<실험예 3. 자외선에 대한 세포 생존율 평가>

실시예 1 및 비교예 1의 추출물, 코니페린을 시료로 사용하여 자외선으로 유발된 세포사멸 저해능을 측정하였다. HaCaT 피부 각질 세포주를 이용한 세포사멸 저해능 평가는 Moseman의 방법(Moseman T., 1983. J. Immuno. Methods, 65, 55) 및 Skaper의 방법(Skaper S.D., et al., 1990, Cell Culture, 2, 17-33)을 참고하여 측정하였다. 세포를 96-well plate에 분주하여 배양한 후 50 mJ/cm² 자외선(UVB)을 1분 40초 조사한 뒤에 시료를 농도별로 처리하여 5% CO₂ 배양기에서 12시간 동안 배양 시킨다. 그 후 MTT 2.5 mg/㎖ 용액을 처리하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거한 후 DMSO를 넣어 형성된 MTT-formazan을 DMSO에 용해한 후, ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 측정하였다.

시료	실험 농도 (㎍/㎖)	세포 생존율 (%)
비교예 1-1	10	47
	25	51
	50	55
	100	58
비교예 1-2	10	55
비교예 1-3	10	56
비교예 1-4	10	59
실시예 1-1	10	77
	25	81
	50	84
	100	88
실시예 1-2	10	79
실시예 1-3	10	80
실시예 1-4	10	85
코니페린	10	85
	25	88
	50	90
	100	95
대조구(자외선만 처리)	-	31

표 6에 나타낸 바와 같이, 증숙 전/후 가시오가피 추출물과 코니페린을 농도별로 처리한 뒤 자외선에 노출된 세포 생존율을 측정한 결과, 자외선만 처리한 세포의 경우 31%의 생존율을 나타내었고, 증숙 가시오가피 뿌리 추출물(실시예 1)과 코니페린을 처리했을 때는 세포 생존율이 농도 의존적으로 높아지는 것이 확인된다.

<실험예 4. 세포내 활성산소종 생성 측정>

자외선(UVB)이 조사된 HaCaT 피부 각질세포 내 활성산소종(Reactive Oxygen Species:ROS)를 측정하기 위해, 세포를 24 well plate에 4×10⁴ cells/well 농도로 접종하여 50 mJ/cm² UVB를 조사 한 다음 실시예 1 및 비교예 1의 추출물 및 코니페린 화합물을 각각 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 12시간 배양하였다. 배양된 세포는 10 μM DCF-DA(dichlorofluorescein diacetate)가 첨가된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium)을 가하여 배양기에서 30분간 배양한 후 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)로 DCFH-DA를 씻어낸 뒤 형광 마이크로플레이트 리더(fluorescence microplate reader)를 이용하여 여기(excitation) 485 nm, 방출(emission) 530 nm에서 형광을 측정하였다.

시료	실험 농도 (㎍/㎖)	Intracellular ROS (rfu)/ Cell number
비교예 1-1	10	280
	25	271
	50	269
	100	261
비교예 1-2	10	275
비교예 1-3	10	271
비교예 1-4	10	283
실시예 1-1	10	251
	25	248
	50	237
	100	231
실시예 1-2	10	245
실시예 1-3	10	249
실시예 1-4	10	250
코니페린	10	221
	25	210
	50	168
	100	151
대조구(자외선만 처리)	-	291

표 7에 나타난 바와 같이 본 발명의 실시예 1의 추출물 및 코니페린 화합물은 UVB 조사로 유발된 세포내 ROS 생성 억제효과를 유의적으로 나타냄으로써 피부의 광손상 보호 효과가 있음을 보여준다.

<실험예 5. 세포내 광보호 효과 확인>

자외선(UVB)에 대한 실시예 1-1의 추출물과 코니페린 화합물의 광보호 효과를 확인하기 위해 JC-1 Staining 분석을 수행하였다. HaCaT 각질 세포주를 35 mm plate에 분주하여 24시간 안정화 후, serum-free medium으로 교체하고 시료를 농도별로 처리하였다. 1시간 뒤, HBSS로 washing 후 fresh HBSS를 첨가한 뒤 UVB 50 mJ을 조사하였다. Serum-free medium으로 배지를 교체한 뒤 시료를 처리하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양하였다. 배지 제거 후 1 μg/ml의 JC-1 solution을 처리하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 빛이 없는 상태로 2시간 반응시킨 뒤 배지를 제거하고 형광 현미경으로 관찰하였다.

초기 세포자연사 현상인 미토콘드리아 막 전위의 변화는 미토콘드리아 내부의 전기 화학적 전위에 민감한 형광색소를 사용하여 측정할 수 있는데 green fluorescent cyanine dye인 JC-1이 진핵세포의 세포기질 내로 침투하여 전위에 따라 미토콘드리아에 축적되게 된다. 축적 시 JC-1은 green(~529 nm)으로부터 red(~590 nm)로 fluorescence emission shift가 일어나게 되며 결과적으로 미토콘드리아의 탈분극이 일어나게 되면 red/green fluorescence intensity ratio가 감소하게 된다.

실시예 1-1의 추출물과 코니페린을 처리한 각질세포에 JC-1 Staining을 수행한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 시료들의 처리 농도가 높아짐에 따라 세포의 붉은 형광이 증가하여 UVB에 의한 손상으로부터 피부 보호 효과가 있는 것이 확인된다.

<실험예 6. 데이크림의 피부 손상 억제 효과 비교>

자외선에 의한 피부 손상도를 최소화시키는 효과를 확인하기 위해 화장료 제조예 3, 화장료 비교제조예 1, 2 및 3의 데이크림과 시판 선블록 크림을 20명의 성인에게 공급하고 각각 팔과 다리를 5 부분으로 분획하여 바르게 한 후, 8월 초에 오전 11~오후 4시까지 야외활동을 하게 한 뒤 피부 상태를 확인하였다. 야외활동 후, 각 그룹의 피부 상태를 확인하고, 각 로션에 대한 피부 홍반 상태를 비교하게 하였다. 각 효과는 5점 타점법으로 나타내게 하였다(5점:아주 좋음, 4점:좋음, 3점:보통, 2점:나쁨, 1점:아주 나쁨)

화장품	피부 홍반 억제 효과 평점
시판 선블록 로션	3.9
화장료 제조예 3	4.3
화장료 비교제조예 1	3.0
화장료 비교제조예 2	3.1
화장료 비교제조예 3	2.1

상기 표 8을 참고하면, 화장료 비교제조예 3의 데이크림에는 가시오가피 유래의 어떤 조성물도 포함되어 있지 않아 피부 홍반이 과하게 나타난 반면, 본 발명의 증숙 가시오가피 뿌리 추출물이 포함된 화장료 제조예 3의 데이크림은 피부 홍반을 현저하게 억제하여 피부 보호 효과가 가장 우수한 것으로 확인된다.

Claims

건조물 기준으로 하기 화학식 1의 코니페린(coniferin) 화합물이 0.3 ~ 0.6 중량% 함유된 증숙 가시오가피 뿌리 추출물을 함유하는 화장료 조성물로서, 상기 증숙 가시오가피 뿌리는 90~120℃에서 1~3시간 동안 증숙한 뒤, 40~80℃에서 1~30시간 동안 건조하여 얻는 것을 특징으로 하는 피부 광손상 보호용 화장료 조성물.
[화학식 1]
삭제
제1항에 있어서,
상기 증숙 가시오가피 뿌리 추출물은 증숙 가시오가피 뿌리를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출하는 것을 특징으로 하는 피부 광손상 보호용 화장료 조성물.
삭제
제1항 또는 제3항의 조성물을 함유하는 피부 광손상 보호용 화장료.
제5항에 있어서,
상기 화장료는 피부외용연고, 에센스, 미백크림, 로션, 에멀젼, 팩, 일반화장수, 스킨밀크, 스킨, 크림, 세럼, 미용비누, 유연화장수, 약용화장수, 전신세정제, 클렌징 오일, 클렌징 크림, 클렌징 티슈 및 클렌징 워터에서 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 피부 광손상 보호용 화장료.
건조물 기준으로 하기 화학식 1의 코니페린(coniferin) 화합물이 0.3 ~ 0.6 중량% 함유된 증숙 가시오가피 뿌리 추출물을 함유하는 조성물로서, 상기 증숙 가시오가피 뿌리는 90~120℃에서 1~3시간 동안 증숙한 뒤, 40~80℃에서 1~30시간 동안 건조하여 얻는 것을 특징으로 하는 피부 광손상 보호용 조성물.
[화학식 1]
삭제
제7항에 있어서,
상기 증숙 가시오가피 뿌리 추출물은 증숙 가시오가피 뿌리를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출하는 것을 특징으로 하는 피부 광손상 보호용 조성물.
삭제