CN111718888A - 一种提高甘草悬浮培养细胞中甘草酸含量的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高甘草悬浮培养细胞中甘草酸含量的培养方法，包括获得甘草无菌苗、诱导愈伤组织、建立甘草细胞悬浮培养体系、诱导悬浮培养体系细胞中甘草酸积累的培养步骤，通过在诱导悬浮培养体系细胞中甘草酸积累培养过程的第8‑10天，补充添加蔗糖，在培养末期，加入茉莉酸甲酯，诱导甘草酸积累使其含量增加，在保证甘草悬浮培养细胞生物量稳定的基础上，甘草酸产量与以往方法相比提高近10倍，且能够持续、高效、稳定、快速地获得大量甘草酸含量较高的甘草悬浮培养细胞，不受季节及自然生态条件的限制，可大规模培养甘草细胞生产甘草酸，具有广阔的应用前景和显著的社会、经济效益。

Description

一种提高甘草悬浮培养细胞中甘草酸含量的培养方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养方法，具体涉及一种提高甘草悬浮培养细胞中甘草酸含量的培养方法。
背景技术
甘草酸是甘草中最重要的活性成分，具有抗炎、抗溃疡、抗病毒和免疫调节等多种药理活性。另有报道甘草酸具有抗SARS病毒的作用，并且能够增强SARS感染者的免疫力。分离提纯技术的更新将甘草酸的应用逐渐推向现代化，最新一代的甘草制剂甘草酸二铵肠溶胶囊是获两项国家发明专利具有独特制剂优势的药物，是各种肝脏炎症的特异性治疗药物。同时,由于甘草酸的甜度是蔗糖的150倍,它也是用途很广泛的甜味剂，其相关出口产品年销量可达4千万美元,市场需求量大。
植物器官和体外组织培养已成为获得植物次级代谢产物的重要替代源。细胞悬浮培养是植物细胞生长的微生物化,具有细胞分散性好,生产迅速、易于控制、节约土地等优势,成为解决目前药用植物资源危机的理想途径之一。
CN200810053014.4公开了一种甘草细胞产业化培养方法，目标产物是细胞生物量，关注点不在有效成分含量。CN201610727559.3公开了一种可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法，得到的是甘草黄酮含量高的甘草愈伤组织细胞，目标产物是甘草黄酮。CN 201110255311.9公开了一种利用组织培养方法生产甘草多糖的方法，目标产物是细胞中甘草多糖的含量。
目前对于甘草细胞培养物能否产生甘草酸一直存在争议。已有研究表明，甘草细胞培养物产量很低，完全不能满足细胞扩大培养生产甘草酸的要求。
发明内容
为了解决现有技术中甘草细胞培养物产量低，不能满足细胞扩大培养生产甘草酸的需求，本发明以甘草酸含量和细胞生物量为筛选条件，专门进行了刺激甘草酸生物合成积累增加的诱导研究，筛选出了一种提高甘草悬浮培养细胞中甘草酸含量的培养方法。采用的技术方案包括如下步骤：
(1)获得甘草无菌苗选用籽粒饱满的甘草种子，用浓硫酸腐蚀处理30-60分钟后，用清水冲洗干净，再用质量浓度为75％的乙醇表面消毒30s，无菌水洗涤2次，然后在1-3％的次氯酸钠溶液中浸泡10-20min，浸泡期间充分摇晃，之后再用无菌水洗涤3-5次，每次不少于1min；将洗涤好的种子接种到添加30g.L-1蔗糖、6g.L-1琼脂的MS基本培养基中，pH值6.0，在温度25℃±2℃，光照强度2000-4000Lux，光照时间16h/d的光照条件下培养25-30d，种子萌发生长，下胚轴长至2-3cm，子叶展开即可获得甘草无菌苗；
(2)诱导愈伤组织选取步骤(1)中正常茁壮生长的甘草无菌苗，将下胚轴切段、子叶切块，接种到愈伤组织诱导培养基上；在温度为25℃±2℃的无菌条件下黑暗培养25-30d，完成继代培养一次，获得甘草愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为：以MS为基本培养基，添加0.5-1mg.L-1萘乙酸、0.5-2mg.L-1 6-苄氨基嘌呤、0.2-1.0mg.L-1 2，4-二氯苯氧乙酸、25-30g.L-1蔗糖及5-6g.L-1琼脂，pH值5.5-6.0；
(3)建立甘草细胞悬浮培养体系选取步骤(2)中生长旺盛、表面干燥、质地松散的浅黄色愈伤组织，接种到细胞悬浮培养基中，接种量即愈伤组织鲜重/液体培养基体积为30-60g.L-1，然后置于摇床，摇床转速100-120rpm，黑暗培养20-25d，结束一个继代培养周期，然后用80目的无菌尼龙网对悬浮培养物进行过滤,除去大细胞团块，保留分散性较好的小细胞团以及单细胞，再加入新鲜的细胞悬浮培养基进行继代培养，如此反复，连续继代培养3-4次，将不规则细胞淘汰，最终建立起稳定的甘草细胞悬浮培养系；所述细胞悬浮培养基为：在MS基础培养基中添加0.5-1mg.L-1萘乙酸、0.2-1mg.L-16-苄氨基嘌呤、0.2-0.5mg.L-1 2，4-二氯苯氧乙酸，30-40g.L-1蔗糖，pH 5.5-6.5；
(4)诱导悬浮培养体系细胞中甘草酸的积累收获步骤(3)中所述甘草悬浮培养体系中的甘草细胞，转接到高产甘草酸的诱导培养基中进行培养,培养至第8-10天，在高产甘草酸的诱导培养基中添加经过滤灭菌的40％蔗糖溶液，使蔗糖浓度恢复到30g-40g.L-1，继续培养，培养至第16-18天，在高产甘草酸的诱导培养基中加入经过滤灭菌的浓度为50-100μmol.L-1的茉莉酸甲酯，培养至20-22天结束培养，得到完成甘草酸积累的甘草细胞；所述高产甘草酸的诱导培养基为：在步骤(3)所述的细胞悬浮培养基中，添加50-100μmol.L-1NaCl，1-2mg.L-1钼酸钠。
其中，步骤(2)中的接种方法为：下胚轴横放于愈伤组织诱导培养基上，轻按使切口两端充分接触愈伤组织诱导培养基；子叶平铺于愈伤组织诱导培养基表面。
本发明在甘草细胞诱导甘草酸积累的培养过程中，在培养周期第8-10天，补充添加蔗糖。研究发现甘草细胞培养第6天开始，细胞进入指数生长期，培养物中糖含量迅速下降。第8-10天及时补充添加蔗糖，能够保证甘草细胞有较高的生长量，收获细胞干重保持在接种材料干重的10倍以上。在培养末期，加入茉莉酸甲酯，参与植物防御相关的信号传导，促进甘草酸生物合成过程中关键酶活性增加，甘草酸生物合成关键酶基因表达增加，能瞬时诱导甘草酸积累使其含量增加。
综上所述，本发明通过模拟盐胁迫环境，及时补充能量，并添加信号分子诱导的方式，有效提高了甘草悬浮培养细胞中甘草酸的含量，对利用甘草细胞悬浮培养扩大生产甘草酸具有明显的技术效果。
经本发明所述培养方法，培养细胞中甘草酸含量可达到8-15mg.g-1,占甘草细胞干重的0.8-1.5％，与以前报道的细胞培养方式相比，目标产物甘草酸产量显著提高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实例。
实施例1：
一种提高甘草悬浮培养细胞中甘草酸含量的培养方法，采用以下步骤：
(1)获得甘草无菌苗选用籽粒饱满的甘草种子，用浓硫酸腐蚀处理30分钟后，用清水冲洗干净，再用质量浓度为75％的乙醇表面消毒30s，无菌水洗涤2次，然后在1％的次氯酸钠溶液中浸泡10min，浸泡期间充分摇晃，之后再用无菌水洗涤3次，每次不少于1min；将洗涤好的种子接种到添加30g.L-1蔗糖、6g.L-1琼脂的MS基本培养基中，pH值6.0，在温度23℃，光照强度2000Lux，光照时间16h/d的光照条件下培养25d，种子萌发生长，下胚轴长至2cm，子叶展开即可获得甘草无菌苗；
(2)诱导愈伤组织选取步骤(1)中正常茁壮生长的甘草无菌苗，将下胚轴切段，接种到愈伤组织诱导培养基上；在温度为23℃的无菌条件下黑暗培养25d，完成继代培养一次，获得甘草愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为：以MS为基本培养基，添加0.5mg.L-1萘乙酸、0.5mg.L-1 6-苄氨基嘌呤、0.2mg.L-12，4-二氯苯氧乙酸、25g.L-1蔗糖及5g.L-1琼脂，pH值5.5；
(3)建立甘草细胞悬浮培养体系选取步骤(2)中生长旺盛、表面干燥、质地松散的浅黄色愈伤组织，接种到细胞悬浮培养基中，接种量即愈伤组织鲜重/液体培养基体积为30g.L-1，然后置于摇床，摇床转速100rpm，黑暗培养20d，结束一个继代培养周期，然后用80目的无菌尼龙网对悬浮培养物进行过滤,除去大细胞团块，保留分散性较好的小细胞团以及单细胞，再加入新鲜的细胞悬浮培养基进行继代培养，如此反复，连续继代培养3次，将不规则细胞淘汰，最终建立起稳定的甘草细胞悬浮培养系；所述细胞悬浮培养基为：在MS基础培养基中添加0.5mg.L-1萘乙酸、0.2mg.L-16-苄氨基嘌呤、0.2mg.L-1 2，4-二氯苯氧乙酸，30g.L-1蔗糖，pH5.5；
(4)诱导悬浮培养体系细胞中甘草酸的积累收获步骤(3)中所述甘草悬浮培养体系中的甘草细胞，转接到高产甘草酸的诱导培养基中进行培养,培养至第8天，在高产甘草酸的诱导培养基中添加经过滤灭菌的40％蔗糖溶液，使蔗糖浓度恢复到30g.L-1，继续培养，培养至第16天，在高产甘草酸的诱导培养基中加入经过滤灭菌的浓度为50μmol.L-1的茉莉酸甲酯，培养至20天结束培养，得到完成甘草酸积累的甘草细胞；所述高产甘草酸的诱导培养基为：在步骤(3)所述的细胞悬浮培养基中，添加50μmol.L-1NaCl，1mg.L-1钼酸钠。
其中，步骤(2)中的接种方法为：下胚轴横放于愈伤组织诱导培养基上，轻按使切口两端充分接触愈伤组织诱导培养基。
实施例2：
一种提高甘草悬浮培养细胞中甘草酸含量的培养方法,包括如下步骤：
(1)获得甘草无菌苗选用籽粒饱满的甘草种子，用浓硫酸腐蚀处理60分钟后，用清水冲洗干净，再用质量浓度为75％的乙醇表面消毒30s，无菌水洗涤2次，然后在3％的次氯酸钠溶液中浸泡20min，浸泡期间充分摇晃，之后再用无菌水洗涤5次，每次不少于1min；将洗涤好的种子接种到添加30g.L-1蔗糖、6g.L-1琼脂的MS基本培养基中，pH值6.0，在温度27℃，光照强度4000Lux，光照时间16h/d的光照条件下培养30d，种子萌发生长，下胚轴长至3cm，子叶展开即可获得甘草无菌苗；
(2)诱导愈伤组织选取步骤(1)中正常茁壮生长的甘草无菌苗，将子叶切块，接种到愈伤组织诱导培养基上；在温度为27℃的无菌条件下黑暗培养30d，完成继代培养一次，获得甘草愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为：以MS为基本培养基，添加1mg.L-1萘乙酸、2mg.L-1 6-苄氨基嘌呤、1.0mg.L-1 2，4-二氯苯氧乙酸、30g.L-1蔗糖及6g.L-1琼脂，pH值6.0；
(3)建立甘草细胞悬浮培养体系选取步骤(2)中生长旺盛、表面干燥、质地松散的浅黄色愈伤组织，接种到细胞悬浮培养基中，接种量即愈伤组织鲜重/液体培养基体积为60g.L-1，然后置于摇床，摇床转速120rpm，黑暗培养25d，结束一个继代培养周期，然后用80目的无菌尼龙网对悬浮培养物进行过滤,除去大细胞团块，保留分散性较好的小细胞团以及单细胞，再加入新鲜的细胞悬浮培养基进行继代培养，如此反复，连续继代培养4次，将不规则细胞淘汰，最终建立起稳定的甘草细胞悬浮培养系；所述细胞悬浮培养基为：在MS基础培养基中添加1mg.L-1萘乙酸、1mg.L-16-苄氨基嘌呤、0.5mg.L-1 2，4-二氯苯氧乙酸，40g.L-1蔗糖，pH6.5；
(4)诱导悬浮培养体系细胞中甘草酸的积累收获步骤(3)中所述甘草悬浮培养体系中的甘草细胞，转接到高产甘草酸的诱导培养基中进行培养,培养至第10天，在高产甘草酸的诱导培养基中添加经过滤灭菌的40％蔗糖溶液，使蔗糖浓度恢复到40g.L-1，继续培养，培养至第18天，在高产甘草酸的诱导培养基中加入经过滤灭菌的浓度为50-100μmol.L-1的茉莉酸甲酯，培养至22天结束培养，得到完成甘草酸积累的甘草细胞；所述高产甘草酸的诱导培养基为：在步骤(3)所述的细胞悬浮培养基中，添加100μmol.L-1NaCl，1-2mg.L-1钼酸钠。
其中，步骤(2)中的接种方法为：子叶平铺于愈伤组织诱导培养基表面。

Claims (2)

1.一种提高甘草悬浮培养细胞中甘草酸含量的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获得甘草无菌苗选用籽粒饱满的甘草种子，用浓硫酸腐蚀处理30-60分钟后，用清水冲洗干净，再用质量浓度为75％的乙醇表面消毒30s，无菌水洗涤2次，然后在1-3％的次氯酸钠溶液中浸泡10-20min，浸泡期间充分摇晃，之后再用无菌水洗涤3-5次，每次不少于1min；将洗涤好的种子接种到添加30g.L-1蔗糖、6g.L-1琼脂的MS基本培养基中，pH值6.0，在温度25℃±2℃，光照强度2000-4000Lux，光照时间16h/d的光照条件下培养25-30d，种子萌发生长，下胚轴长至2-3cm，子叶展开即可获得甘草无菌苗；
(2)诱导愈伤组织选取步骤(1)中正常茁壮生长的甘草无菌苗，将下胚轴切段、子叶切块，接种到愈伤组织诱导培养基上；在温度为25℃±2℃的无菌条件下黑暗培养25-30d，完成继代培养一次，获得甘草愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为：以MS为基本培养基，添加0.5-1mg.L-1萘乙酸、0.5-2mg.L-16-苄氨基嘌呤、0.2-1.0mg.L-1 2，4-二氯苯氧乙酸、25-30g.L-1蔗糖及5-6g.L-1琼脂，pH值5.5-6.0；
(3)建立甘草细胞悬浮培养体系选取步骤(2)中生长旺盛、表面干燥、质地松散的浅黄色愈伤组织，接种到细胞悬浮培养基中，接种量即愈伤组织鲜重/液体培养基体积为30-60g.L-1，然后置于摇床，摇床转速100-120rpm，黑暗培养20-25d，结束一个继代培养周期，然后用80目的无菌尼龙网对悬浮培养物进行过滤,除去大细胞团块，保留分散性较好的小细胞团以及单细胞，再加入新鲜的细胞悬浮培养基进行继代培养，如此反复，连续继代培养3-4次，将不规则细胞淘汰，最终建立起稳定的甘草细胞悬浮培养系；所述细胞悬浮培养基为：在MS基础培养基中添加0.5-1mg.L-1萘乙酸、0.2-1mg.L-16-苄氨基嘌呤、0.2-0.5mg.L-1 2，4-二氯苯氧乙酸，30-40g.L-1蔗糖，pH 5.5-6.5；
(4)诱导悬浮培养体系细胞中甘草酸的积累收获步骤(3)中所述甘草悬浮培养体系中的甘草细胞，转接到高产甘草酸的诱导培养基中进行培养,培养至第8-10天，在高产甘草酸的诱导培养基中添加经过滤灭菌的40％蔗糖溶液，使蔗糖浓度恢复到30g-40g.L-1，继续培养，培养至第16-18天，在高产甘草酸的诱导培养基中加入经过滤灭菌的浓度为50-100μmol.L-1的茉莉酸甲酯，培养至20-22天结束培养，得到完成甘草酸积累的甘草细胞；所述高产甘草酸的诱导培养基为：在步骤(3)所述的细胞悬浮培养基中，添加50-100μmol.L-1NaCl，1-2mg.L-1钼酸钠。
2.根据权利要求1所述的提高甘草悬浮培养细胞中甘草酸含量的培养方法，步骤(2)中的接种方法为：下胚轴横放于愈伤组织诱导培养基上，轻按使切口两端充分接触愈伤组织诱导培养基；子叶平铺于愈伤组织诱导培养基表面。
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