CN112501036B - 一种促进猴头菇高产麦角甾醇的方法 - Google Patents

一种促进猴头菇高产麦角甾醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促进猴头菇高产麦角甾醇的方法。本发明提供了一种制备麦角甾醇的方法或提高河工猴头菌中的麦角甾醇产量的方法：将河工猴头菌进行液体发酵；所述液体发酵中，加入豆粕粉作为诱导物。所述液体发酵的培养基组成具体可为：葡萄糖3.3g，蛋白胨0.3g，MgSO4 0.15g，豆粕粉3.2g，KH2PO4 0.375g，100mL去离子水。本发明还保护河工猴头菌。河工猴头菌，全称为猴头菇(Hericium erinaceus)河工猴头菌，保藏登记号为CGMCC No.21056。本发明对于提高猴头菌中的麦角甾醇产量以及制备麦角甾醇具有重大的应用推广价值。

Description

一种促进猴头菇高产麦角甾醇的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种促进猴头菇高产麦角甾醇的方法。
背景技术
随着食用菌产业的不断发展，食药用真菌的研究与应用越来越广泛。猴头菌作为我国一种历史悠久的食药用真菌，被人们广泛的研究，它不仅被应用于食品开发，在医药行业的应用也十分广泛。猴头菌在治疗胃肠道疾病方面，效果较好，应用也最广泛。
优良的药用真菌菌种是提高菌物液体发酵水平的关键，药用真菌培养基中营养物质的种类及添加量对药用真菌液体发酵水平高低也有重要影响。对于提高猴头菌丝体中的活性物质而言，选择优质菌株是基本的条件，而采用一套合理且有效的发酵条件更是保证活性物质高产的关键。在菌丝体活性物质的产生方面，诱导物是一个关键因素，最佳诱导物可以在保证猴头菌菌丝生物量的基础上促进活性物质的产生。前人有利用茉莉酸甲酯(MeJA)对麦角甾醇进行诱导，效果较好，因此MeJA也被认为是非常有效的诱导子，但是MeJA自身制备工艺复杂，价格昂贵，不能符合实际生产的应用，所以本发明旨在寻找一种经济绿色的农副产品作为诱导物，不仅安全可食，也可提高猴头菌丝体中麦角甾醇含量，并应用于实践生产，创造绿色、安全的经济效益。
液体深层发酵因原料来源广泛、生产周期短、污染率低、活性物质产量高以及不受条件限制适合工厂化生产，同时可对菌丝生物量及代谢产物品质进行调控。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进猴头菇高产麦角甾醇的方法。
本发明提供了一种制备麦角甾醇的方法，包括如下步骤：
将河工猴头菌进行液体发酵；
所述液体发酵中，加入豆粕粉作为诱导物。
所述豆粕粉在培养体系中的浓度为2-4g/100mL。
所述豆粕粉在培养体系中的浓度为2-3g/100mL或3-4g/100mL。
所述豆粕粉在培养体系中的浓度为2g/100mL、3g/100mL、4g/100mL或3.2g/100mL。
所述液体发酵中，碳源为葡萄糖。
所述葡萄糖在培养体系中的浓度为2.5-4.5g/100mL。
所述葡萄糖在培养体系中的浓度为2.5-3.5g/100mL或3.5-4.5g/100mL。
所述葡萄糖在培养体系中的浓度为2.5g/100mL、3.5g/100mL、4.5g/100mL或3.3g/100mL。
所述液体发酵中，氮源为蛋白胨、酵母膏或硝酸铵。
所述液体发酵中，氮源为蛋白胨。
所述蛋白胨在培养体系中的浓度为0.2-0.5g/100mL。
所述蛋白胨在培养体系中的浓度为0.2-0.3g/100mL、0.3-0.4g/100mL或0.4-0.5g/100mL。所述蛋白胨在培养体系中的浓度为0.2g/100mL、0.3g/100mL、0.4g/100mL或0.5g/100mL。
所述液体发酵中，无机盐为MgSO4。
所述MgSO4在培养体系中的浓度为0.12-0.24g/100mL。
所述MgSO4在培养体系中的浓度为0.12-0.15g/100mL、0.15-0.18g/100mL、0.18-0.21g/100mL或0.21-0.24g/100mL。所述MgSO4在培养体系中的浓度为0.12g/100mL、0.15g/100mL、0.18g/100mL、0.21g/100mL或0.24g/100mL。
所述液体发酵的培养基组成可为：碳源，氮源，无机盐，诱导物，100mL去离子水。
所述液体发酵的培养基组成可为：碳源，氮源，无机盐，诱导物，KH2PO4 0.375g，100mL去离子水。
所述液体发酵的培养基组成具体可为：葡萄糖3.3g，蛋白胨0.3g，MgSO4 0.15g，豆粕粉3.2g，KH2PO4 0.375g，100mL去离子水。
所述液体发酵的培养基的pH为5.0～5.5。
所述液体发酵的方法可为：100mL基础液体培养基中接种10mL河工猴头菌液体菌种，先25℃静置培养2天，然后25℃、150rpm振荡培养13天。
所述河工猴头菌液体菌种的制备方法具体可为：挑取活化后的河工猴头菌，接种至基础液体培养基，25℃、150rpm振荡培养15天，即为液体菌种。
所述方法还包括如下步骤：完成液体发酵后，收集菌丝体。
所述方法还包括如下步骤：从菌丝体中获得麦角甾醇。
本发明还保护一种提高河工猴头菌中的麦角甾醇产量的方法，包括如下步骤：
将河工猴头菌进行液体发酵；
所述液体发酵中，加入豆粕粉作为诱导物。
所述豆粕粉在培养体系中的浓度为2-4g/100mL。
所述豆粕粉在培养体系中的浓度为2-3g/100mL或3-4g/100mL。
所述豆粕粉在培养体系中的浓度为2g/100mL、3g/100mL、4g/100mL或3.2g/100mL。
所述液体发酵中，碳源为葡萄糖。
所述葡萄糖在培养体系中的浓度为2.5-4.5g/100mL。
所述葡萄糖在培养体系中的浓度为2.5-3.5g/100mL或3.5-4.5g/100mL。
所述葡萄糖在培养体系中的浓度为2.5g/100mL、3.5g/100mL、4.5g/100mL或3.3g/100mL。
所述液体发酵中，氮源为蛋白胨、酵母膏或硝酸铵。
所述液体发酵中，氮源为蛋白胨。
所述蛋白胨在培养体系中的浓度为0.2-0.5g/100mL。
所述蛋白胨在培养体系中的浓度为0.2-0.3g/100mL、0.3-0.4g/100mL或0.4-0.5g/100mL。所述蛋白胨在培养体系中的浓度为0.2g/100mL、0.3g/100mL、0.4g/100mL或0.5g/100mL。
所述液体发酵中，无机盐为MgSO4。
所述MgSO4在培养体系中的浓度为0.12-0.24g/100mL。
所述MgSO4在培养体系中的浓度为0.12-0.15g/100mL、0.15-0.18g/100mL、0.18-0.21g/100mL或0.21-0.24g/100mL。所述MgSO4在培养体系中的浓度为0.12g/100mL、0.15g/100mL、0.18g/100mL、0.21g/100mL或0.24g/100mL。
所述液体发酵的培养基组成可为：碳源，氮源，无机盐，诱导物，100mL去离子水。
所述液体发酵的培养基组成可为：碳源，氮源，无机盐，诱导物，KH2PO4 0.375g，100mL去离子水。
所述液体发酵的培养基组成具体可为：葡萄糖3.3g，蛋白胨0.3g，MgSO4 0.15g，豆粕粉3.2g，KH2PO4 0.375g，100mL去离子水。
所述液体发酵的培养基的pH为5.0～5.5。
本发明还保护河工猴头菌。
河工猴头菌，全称为猴头菇(Hericium erinaceus)河工猴头菌，已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21056。
猴头菌是一种历史悠久的食药用真菌，富含多种生理活性物质，具有多种药理作用，因此在药物开发方面应用广泛。当猴头菌菌丝体作为开发胃药产品的原料时，对猴头菌菌丝体中的主要代谢产物-麦角甾醇有一定的含量要求。本发明旨在通过试验寻找一种经济绿色的农副产品作为诱导物，通过合理的发酵条件，提高猴头菌菌丝生物量与麦角甾醇产量，并应用于实践生产。
本发明中：先通过菌株筛选工作，确定河工猴头为目的菌株；然后确定豆粕为基础诱导物；然后进行单因素及Box-Behnken试验对液体发酵参数进行优化，确定了猴头菌高产麦角甾醇的发酵条件(葡萄糖添加量3.3％、蛋白胨添加量0.3％、MgSO4添加量0.15％、豆粕粉添加量3.2％)，且最终麦角甾醇产量达5.7770mg/100mL。本发明为猴头菌麦角甾醇的实践生产及深入研究奠定了基础。本发明对于提高猴头菌中的麦角甾醇产量以及制备麦角甾醇具有重大的应用推广价值。
附图说明
图1为河工猴头菌的形态观察照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，每次重复试验中每种供试物至少设置三个重复处理，结果取平均值。实施例中，用Excel软件进行数据基础分析及作图，用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken试验设计与优化，用SPSS软件进行显著性Duncan分析。蛋白胨：北京索莱宝科技有限公司，货号73049-73-7。葡萄糖：天津市凯通化学试剂有限公司，货号5996-10-1。豆粕粉：沂蒙山特产多种经营信誉名店(淘宝)。
实施例中，检测菌丝体的麦角甾醇含量的方法如下：
(1)样品溶液的制备
精确称取0.1g菌丝体粉末置于15mL离心管中，加入2mL色谱级甲醇，盖紧盖子，称定重量m1；然后超声处理(200W，50℃)60min，冷却后，称重，用色谱级甲醇补足重量至m1；然后8000r/min离心10min，取上清液，采用0.45μm孔径的滤膜过滤，收集滤液，即为样品溶液。
(2)高效液相色谱
采用Agilent 1260型高效液相色谱系统进行分析，紫外检测器，使用ZORBAXExtend-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)。检测波长λ为280nm。进样步骤(1)制备的样品溶液，20μL的进样量。甲醇：超纯水(体积比为98：2)作流动相；流动相流速为1mL/min。
(3)取麦角甾醇标准品，用色谱级甲醇梯度稀释，然后按照步骤(2)的色谱参数进行检测，确定麦角甾醇的出峰位置并制作标准曲线。
(4)将步骤(2)中相应出峰位置的峰面积代入步骤(3)的标准曲线，得到麦角甾醇浓度(μg/mL)，即C。
(5)根据公式计算麦角甾醇含量(mg/g)。
Figure BDA0002836832280000051
C：麦角甾醇浓度(μg/mL)；
V：提取剂体积(mL)，为2mL；
W：称取菌丝体粉末重量(g)，为0.1g。
活化培养基：马铃薯250g，葡萄糖25g，蛋白胨2g，KH2PO4 3.75g，MgSO4 1.8g，琼脂25g，1L去离子水，pH 5.0～5.5。
基础液体培养基：马铃薯250g，葡萄糖25g，蛋白胨2g，KH2PO4 3.75g，MgSO41.8g，1L去离子水，pH 5.0～5.5。
实施例1、河工猴头菌的获得和保藏
1988年9月28日年在山西省南部中条山脉东段的历山自然保护区栎树上采集野生猴头子实体，通过组织分离纯化，再经过人工驯化栽培获得的猴头新品种，命名为河工猴头菌。
形态特征：子实体肉质，块状或头状，宽5-10cm，新鲜时白色，干后浅黄色至浅褐色，基部狭窄或略有短柄，有密集下垂长刺，刺针形，长1-3cm；子实层生刺周围，孢子无色光滑，球形或近球形，有油滴，(6.2-7.0)μm×(5.4-6.2)μm。照片见图1。
生理生化特征：猴头菇属于中低温结实性菌类，不同生长发育阶段所需温度有所不同，菌丝体生长温度范围6-33℃、适宜温度22-25℃，子实体生长的温度范围为12-24℃、适宜温度为16-20℃；菌丝生长阶段，空气相对湿度60％-70％为宜，子实体生长发育阶段，空气相对湿度保持在85％-90％为宜；菌丝生长阶段能忍受0.3％-1％或更高浓度的二氧化碳，但以较低二氧化碳浓度条件下生长迅速和健壮；菌丝生长阶段基本不需要光线，但原基形成和子实体生长均需要光线；菌丝生长阶段以pH 3.6-5.5为宜，子实体生长阶段以pH4.0-5.0为宜。
河工猴头菌，全称为猴头菇(Hericium erinaceus)河工猴头菌，已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21056。
实施例2、猴头菌菌株的比较
供试猴头菌菌株分别为：猴头3003、猴头北、河工猴头菌、猴头菇(龙海市)、猴头菇T3＇中农或晋猴头96。
1、取低温保藏的供试猴头菌菌株的试管菌种，转接至活化培养基试管斜面上，25℃培养10-15天，至菌丝生长达到最旺盛的时期，4℃保存。
2、挑取步骤1中活化后的菌株，接种至基础液体培养基，25℃、150rpm振荡培养15天，即为液体菌种，4℃保存。
3、在250mL锥形瓶中加入100mL基础液体培养基，接种10mL步骤2得到的液体菌种，先25℃静置培养2天，然后25℃、150rpm振荡培养13天。每个锥形瓶中的内容物为一个培养体系。
4、完成步骤3后，用4层干净纱布过滤，收集菌丝体，用蒸馏水洗涤菌丝体至滤液无色为止，将菌丝体冷冻干燥至无水分(称重，记录菌丝体干重)。计算菌丝体产量，即完成步骤3的每个培养体系中含有多少干重的菌丝体，单位为g/培养体系。
5、取步骤4得到的菌丝体，研磨，过80目筛，收集粉末，4℃保存。
6、检测菌丝体的麦角甾醇含量。
计算每瓶发酵样品中所获得的总麦角甾醇含量即：
麦角甾醇产量(mg/培养体系)＝菌丝生物量(g/培养体系)×麦角甾醇含量(mg/g)。
结果见表1。
表1
Figure BDA0002836832280000061
实施例3、基础诱导物确定
供试猴头菌菌株为：河工猴头菌。
供试培养基：含MeJA的液体培养基或含豆粕粉的液体培养基。含MeJA的液体培养基即将MeJA原液加入基础液体培养基得到的培养基；MeJA浓度分别为10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L或200μmol/L。取茉莉酸甲酯(MeJA标准品)，加入无水乙醇助溶，得到100μmol/mL的MeJA原液，过滤除菌。含豆粕粉的液体培养基即将豆粕粉加入基础液体培养基得到的培养基，豆粕粉浓度为2g/100mL。设置基础液体培养基作为对照。
参照实施例2中的步骤，差别仅在于用供试培养基代替步骤3中的基础液体培养基。
结果见表2。
表2
Figure BDA0002836832280000071
实施例4、发酵条件参数优化
供试猴头菌菌株为：河工猴头菌。
参照实施例2中的步骤，差别仅在于用发酵液体培养基代替步骤3中的基础液体培养基。
一、碳源的优化(单因素试验)
发酵液体培养基：碳源2.5g，蛋白胨0.2g，MgSO4 0.18g，豆粕粉2g，KH2PO40.375g，100mL去离子水，pH 5.0～5.5。碳源分别设置为：葡萄糖、半乳糖、蔗糖、可溶性淀粉或麦芽糖。设置不加入碳源的对照。
结果见表3。
表3
Figure BDA0002836832280000072
二、碳源加入量的优化(单因素试验)
发酵液体培养基：葡萄糖，蛋白胨0.2g，MgSO4 0.18g，豆粕粉2g，KH2PO4 0.375g，100mL去离子水，pH 5.0～5.5。葡萄糖加入量分别设置为：0.5g、1.5g、2.5g、3.5g或4.5g。
结果见表4。
表4
Figure BDA0002836832280000081
三、氮源的优化(单因素试验)
发酵液体培养基：葡萄糖2.5g，氮源0.2g，MgSO4 0.18g，豆粕粉2g，KH2PO40.375g，100mL去离子水，pH 5.0～5.5。氮源分别设置为：蛋白胨、酵母膏、尿素、牛肉膏或硝酸铵。设置不加入氮源的对照。
结果见表5。
表5
Figure BDA0002836832280000082
四、氮源加入量的优化(单因素试验)
发酵液体培养基：葡萄糖2.5g，蛋白胨，MgSO4 0.18g，豆粕粉2g，KH2PO4 0.375g，100mL去离子水，pH 5.0～5.5。蛋白胨加入量分别设置为：0.1g、0.2g、0.3g、0.4g或0.5g。
结果见表6。
表6
Figure BDA0002836832280000083
Figure BDA0002836832280000091
五、无机盐的优化(单因素试验)
发酵液体培养基：葡萄糖2.5g，蛋白胨0.2g，无机盐0.18g，豆粕粉2g，KH2PO40.375g，100mL去离子水，pH 5.0～5.5。无机盐分别设置为：MgSO4、FeSO4、ZnSO4、K2SO4或CuSO4。设置不加入无机盐的对照。
结果见表7。
表7
Figure BDA0002836832280000092
六、无机盐加入量的优化(单因素试验)
发酵液体培养基：葡萄糖2.5g，蛋白胨0.2g，MgSO4，豆粕粉2g，KH2PO4 0.375g，100mL去离子水，pH 5.0～5.5。MgSO4加入量分别设置为：0.12g、0.15g、0.18g、0.21g或0.24g。
结果见表8。
表8
Figure BDA0002836832280000093
七、诱导物的优化(单因素试验)
发酵液体培养基：葡萄糖2.5g，蛋白胨0.2g，MgSO4 0.18g，诱导物2g，KH2PO40.375g，100mL去离子水，pH 5.0～5.5。诱导物分别设置为：豆饼粉、豆粕粉、燕麦粉、黑小麦粉、糙米粉、玉米粉或高粱米粉。设置不加入诱导物的对照。
结果见表9。
表9
Figure BDA0002836832280000094
Figure BDA0002836832280000101
八、诱导物加入量的优化(单因素试验)
发酵液体培养基：葡萄糖2.5g，蛋白胨0.2g，MgSO4 0.18g，豆粕粉，KH2PO4 0.375g，100mL去离子水，pH 5.0～5.5。豆粕粉加入量分别设置为：0.5g、1g、2g、3g或4g。
结果见表10。
表10
Figure BDA0002836832280000102
实施例5、获得最优参数
根据实施例4中单因素试验的结果，以麦角甾醇产量为响应值(Y)，分别以葡萄糖、蛋白胨、MgSO4、豆粕粉为影响因素，其最适添加量为中心水平，设计4因素3水平的Box-Behnken优化试验，见表11。经Box-Behnken试验设计的回归模型进行预测，得到猴头菌液体发酵的最优条件及该条件下响应值的预测值。
表11 Box-Behnken设计的因素和水平
Figure BDA0002836832280000103
A：葡萄糖添加量(％)；B：蛋白胨添加量(％)；C：MgSO4添加量(％)；D：豆粕粉添加量(％)
由Box-Behnken优化设计得到一种最优的发酵条件，经验证并结合实际情况，最后确定最佳发酵培养基为：葡萄糖3.3g，蛋白胨0.3g，MgSO4 0.15g，豆粕粉3.2g，KH2PO40.375g，100mL去离子水，pH 5.0～5.5。
实施例6、验证试验
供试猴头菌菌株为：河工猴头菌。
参照实施例2中的步骤，差别仅在于用发酵液体培养基代替步骤3中的基础液体培养基。
发酵液体培养基分别为培养基A(即实施例5中的最佳培养基)、培养基B、培养基C或培养基D。
培养基A：葡萄糖3.3g，蛋白胨0.3g，MgSO4 0.15g，豆粕粉3.2g，KH2PO4 0.375g，100mL去离子水，pH 5.0～5.5。
培养基B：葡萄糖1.5g，蛋白胨0.3g，MgSO4 0.15g，豆粕粉3.2g，KH2PO4 0.375g，100mL去离子水，pH 5.0～5.5。
培养基C：葡萄糖3.3g，蛋白胨0.1g，MgSO4 0.15g，豆粕粉3.2g，KH2PO4 0.375g，100mL去离子水，pH 5.0～5.5。
培养基D：葡萄糖3.3g，蛋白胨0.1g，MgSO4 0.15g，豆粕粉1g，KH2PO4 0.375g，100mL去离子水，pH 5.0～5.5。
结果见表12。
表12
麦角甾醇产量(mg/培养体系)
培养基A 5.7770
培养基B 3.1782
培养基C 3.6845
培养基D 2.8361
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种制备麦角甾醇的方法，包括如下步骤：
将河工猴头菌进行液体发酵；河工猴头菌即猴头菇（Hericium erinaceus）河工猴头菌，其保藏登记号为CGMCC No. 21056；
所述液体发酵中，加入豆粕粉作为诱导物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述豆粕粉在培养体系中的浓度为2-4 g/100mL。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述液体发酵中，碳源为葡萄糖。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖在培养体系中的浓度为2.5-4.5g/100mL。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述液体发酵中，氮源为蛋白胨、酵母膏或硝酸铵。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述液体发酵中，氮源为蛋白胨；所述蛋白胨在培养体系中的浓度为0.2-0.5 g/100mL。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述液体发酵中，无机盐为MgSO4。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述MgSO4在培养体系中的浓度为0.12-0.24g/100mL。
9.一种提高河工猴头菌中的麦角甾醇产量的方法，包括如下步骤：
将河工猴头菌进行液体发酵；河工猴头菌即猴头菇（Hericium erinaceus）河工猴头菌，其保藏登记号为CGMCC No. 21056；
所述液体发酵中，加入豆粕粉作为诱导物。
10.猴头菇（Hericium erinaceus）河工猴头菌，其保藏登记号为CGMCC No. 21056。
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