CN103828939A - 一种溶栓腐乳毛坯的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种溶栓腐乳毛坯的制备方法，其特征在于，其中所使用纳豆菌HT8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC7168，毛霉从忠县忠州腐乳毛坯中分离获得，包括如下步骤：豆腐白坯的制作，菌种活化，毛霉种子液的制备，细菌种子液的制备，接种，培养。本发明以毛霉和纳豆菌产蛋白酶以及纳豆菌产纤溶酶作为评价指标的情况，接种纳豆菌后毛霉生长良好，对蛋白酶含量影响不大，获得的腐乳毛坯中纳豆激酶活力达到39.36IU/g，蛋白酶活力达到174.11u/g。本发明的另一优点在于不额外增加任何设备的情况下，仅利用腐乳毛坯的原始生产线就能完成纳豆菌和毛霉的共发酵，极大的节约了生产成本。

Description

一种溶栓腐乳毛坯的制备方法

技术领域

本发明属于健康食品制造领域，涉及一种利用纳豆菌与毛霉共发酵产纳豆激酶的溶栓腐乳毛坯的制备方法。 

背景技术

豆腐乳(Fermented bean curd)又名腐乳或乳腐，也叫酱豆腐、霉豆腐，它是我国独有的民族传统发酵豆制食品之一，系用豆浆的凝乳状物，经微生物发酵所制成的一种奶酩型产品，故欧美很多人称之为中国干酪(Chinese Cheese)。由于豆腐乳滋味鲜美，风味独特，营养丰富，质地细腻，既可以佐餐，也可用以烹饪，其不仅具有大豆所具有的营养价值，还富含生物、生理活性物质，易被人体吸收，具有较强的生理保健功能。腐乳作为最有效提升大豆效价的大众化发酵豆制品，日益引起国内外消费者及食品、医学甚至工业界的广泛关注。 

腐乳生产历史悠久，依据生产所使用的菌种不同，可分为细菌型、根霉型和毛霉型。目前，在腐乳的酿造过程中，大多采用毛霉或米根霉、华根霉等，现行生产中常用的菌种绝大多数为毛霉。毛霉的酶系丰富，水解蛋白质无苦味，且无毒无害，不产生怪味和异色等。毛霉具有菌丛细长柔软，能将豆腐坯完好的包围住，以保持腐乳成品整齐的外部形态，现已被广泛应用于工业生产过程中。 

纳豆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，是一类好氧型、内生抗逆胞子的杆状细菌，自身没有致病性，只具有单层细胞外膜，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。在极端的条件下，还可以诱导产生抗逆性很强的内源胞子。纳豆菌在发酵过过程中还产生很多其他物质如维生素K、蛋白酶、多肽等等，这些物质均有利于人体健康。此外，纳豆菌本身作为一种益生菌对调理人体肠道也有很好的作用。 

目前，发酵腐乳制品大多采用单菌种发酵或是传统自然发酵，存在酶系不全，风味单一，或是微生物不确定，杂菌较多等问题，纳豆菌发酵产物纳豆激酶虽然有预防心脑血管疾病的作用，但是有氨臭味，国人很难接受其风味。这意味着如果将二者组合，找到混合发酵的最佳条件，产品可以获得更好风味同时具有预防和治疗心脑血管疾病的效果。目前，利用毛霉和纳豆菌混合发酵腐乳毛坯尚未见报道。采用此法制备的腐乳毛坯，经后熟发酵，可用 于生产不同口味的具有溶栓功能的腐乳产品。 

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明提出一种溶栓腐乳毛坯的制备方法，利用毛霉发酵的腐乳毛坯酶系丰富，水解蛋白质无苦味，且无毒无害，不产生怪味和异色等。纳豆菌在发酵过程中能产生维生素K、蛋白酶、多肽等等利于人体健康物质，且纳豆菌本身作为一种益生菌对调理人体肠道也有很好的作用。本发明将这两者结合，在不改变腐乳毛坯酶系的同时得到产纳豆激酶的毛坯产品。 

为达到上述目的，本发明的技术方案为： 

一种溶栓腐乳毛坯的制备方法，其中所使用纳豆菌HT8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC7168，保藏日期：2013年01月18日，分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；毛霉从忠县忠州腐乳毛坯中分离获得，包括如下步骤： 

步骤一、豆腐白坯的制作：将选取的大豆经浸泡、磨浆、滤浆、煮浆、点浆、蹲脑、压榨降温、切坯处理，制得豆腐白坯；泡豆水温在20℃-25℃，时间3-8h，压榨至豆腐坯含水量在65-70％，厚薄均匀，压榨成型后切成(2.8×2.8×1.7cm)的小块； 

步骤二、菌种活化：将斜面保藏毛霉菌种于无菌操作下接种到PDA斜面培养基，于恒温培养箱18-20℃培养72h，于冰箱中保存备用；吸取100ul保藏的纳豆菌HT8菌种到10mlLB培养基，37℃，200r/min培养12h，于冰箱保存备用； 

步骤三、毛霉种子液的制备：将活化的毛霉斜面菌种加入适量的无菌生理盐水水，用移液器吸取适量菌液，接种于麸皮培养基，20℃下培养96h，至三角瓶内鼓皮长满菌丝和灰色孢子后取出备用；在培养好的种曲培养瓶中加入500ml灭菌生理盐水充分摇匀，双层纱布过滤，滤渣再加500ml灭菌生理盐水洗涤一次过滤，两次滤液混合制成孢子悬液；将此孢子悬浮液置于4℃冰箱中，作为菌种保存； 

步骤四、细菌种子液的制备：取200ul的活化HT8菌种到20ml液体种子培养基，37℃，200r/min培养18h； 

步骤五、接种：将纳豆菌HT8菌种和毛霉按50：1-70：1的比例接种； 

步骤六、培养：在18℃，湿度为85％-90％的条件下培养80-100h，即得溶栓腐乳毛坯。 

所述步骤二中LB培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，磷酸二氢钾1g/L及余量的水。 

所述步骤五中接种方式为喷雾或者豆腐坯浸泡菌液的方法进行。 

相对于现有技术，本发明的有益效果为： 

本发明以毛霉和纳豆菌产蛋白酶以及纳豆菌产纤溶酶作为评价指标的情况，接种纳豆菌后毛霉生长良好，对蛋白酶含量影响不大，获得的腐乳毛坯中纳豆激酶活力达到39.36IU/g，蛋白酶活力达到174.11u/g。在不额外增加任何设备的情况下，仅利用腐乳毛坯的原始生产线就能完成纳豆菌和毛霉的共发酵，极大的节约了生产成本。 

附图说明

图1、为本发明腐乳毛坯生长情况照片； 

其中，图1a：毛霉单独接种；图1b：HT8和毛霉按64：1的接种比例混合接种； 

图2、尿激酶标准曲线图； 

图3、溶栓腐乳毛坯制备流程图。 

具体实施方式

下面结合附图和实施例更详细地说明本发明的实施方案。但本发明的实施并不局限于以下所述，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。 

在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。 

实施例1： 

豆腐白坯的制备：选取的大豆经温水(22℃)浸泡4h后，磨浆、滤浆、煮浆、点浆、蹲脑，压榨到豆腐坯含水量在70％，降温处理后，切成(2.8×2.8×1.7cm)的小块。 

菌种活化：将斜面保藏毛霉菌种于无菌操作下接种到PDA斜面培养基，于恒温培养箱20℃培养72h，于冰箱中保存备用。吸取100ul保藏纳豆菌菌种到10mlLB培养基，37℃，200r/min培养12h，于冰箱保存备用。 

毛霉种子液的制备：将活化的毛霉斜面菌种加入适量的无菌生理盐水水，用移液器吸取适量菌液，接种于麸皮培养基，20℃下培养96h，至三角瓶内鼓皮长满菌丝和灰色孢子后取出备用。在培养好的种曲培养瓶中加入500ml灭菌生理盐水充分摇匀，双层纱布过滤，滤渣再加500ml灭菌生理盐水洗涤一次过滤，两次滤液混合制成孢子悬液。将此孢子悬浮液置于4℃冰箱中，作为菌种保存。 

细菌种子液的制备：取200ul的活化HT8菌种到20ml液体种子培养基，37℃，200r/min培养18h。 

将HT8和毛霉按64：1的接种比例混合，采用喷雾法进行接种，以单独接种毛霉菌种为对照，18℃、相对湿度90％条件下分别培养96h，对比结果如图1。 

实施例2：酶活性测定 

粗酶液制备：将腐乳称重于烧杯中绞碎，每1g腐乳加入2ml缓冲液于三角瓶中，置于摇床中4℃浸提1h，取出于高速冷冻离心机中10000r/min离心10min，取上清液。 

酶活测定：纤溶酶活力测定依据中华人民共和国药典(二部)和邵荣军的方法，进行综合改进后，制备纤维蛋白平板方法。将粗酶液加入纤维蛋白平板，在37℃恒温培养箱中培养18h，测定溶圈的直径。以尿激酶标准曲线(见附图2)计算样品的相对酶活力大小；蛋白酶活力测定按照GB/T23527-2009(福林法)进行测定。 

传统单独毛霉发酵制备的毛坯中，蛋白酶活性为94.30U/g；而按此法制备的腐乳毛坯蛋白酶活性达174.11U/g，纤溶活性为39.36IU/g；说明采用本专利的方法制备的腐乳毛坯中含有更多的蛋白酶，更易于后期的发酵，可缩短后熟时间，同时含有纳豆激酶活性成分，具有预防血栓的功能。 

试验例： 

体外溶栓：取新鲜兔血，待自然凝固后切成相同大小的小血块，用吸水纸吸干表面水分后称重，加入含有10ml豆腐毛坯粗酶液的试管中，同时以生理盐水为空白对照，放于37℃恒温培养箱内，2h后取出试管中的血块，用吸水纸吸干表面水分称重，结果见表1，豆腐毛坯粗酶液的体外溶栓率达64.0％±6.6％。 

表1 豆腐毛坯粗酶液溶栓效果 

注：与生理盐水组比较^**，P＜0.01。 

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。 

Claims (3)

1.一种溶栓腐乳毛坯的制备方法，其特征在于，其中所使用纳豆菌HT8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC7168，毛霉从忠县忠州腐乳毛坯中分离获得，包括如下步骤：

步骤一、豆腐白坯的制作：将选取的大豆经浸泡、磨浆、滤浆、煮浆、点浆、蹲脑、压榨降温、切坯处理，制得豆腐白坯；泡豆水温在20℃-25℃，时间3-8h，压榨至豆腐坯含水量在65-70％，厚薄均匀，压榨成型后切成(2.8×2.8×1.7cm)的小块；

步骤二、菌种活化：将斜面保藏毛霉菌种于无菌操作下接种到PDA斜面培养基，于恒温培养箱18-20℃培养72h，于冰箱中保存备用；吸取100ul保藏的纳豆菌HT8菌种到10mlLB培养基，37℃，200r/min培养12h，于冰箱保存备用；

步骤三、毛霉种子液的制备：将活化的毛霉斜面菌种加入适量的无菌生理盐水水，用移液器吸取适量菌液，接种于麸皮培养基，20℃下培养96h，至三角瓶内鼓皮长满菌丝和灰色孢子后取出备用；在培养好的种曲培养瓶中加入500ml灭菌生理盐水充分摇匀，双层纱布过滤，滤渣再加500ml灭菌生理盐水洗涤一次过滤，两次滤液混合制成孢子悬液；将此孢子悬浮液置于4℃冰箱中，作为菌种保存；

步骤四、细菌种子液的制备：取200ul的活化HT8菌种到20ml液体种子培养基，37℃，200r/min培养18h；

步骤五、接种：将纳豆菌HT8菌种和毛霉按50-70∶1的比例接种；

步骤六、培养：在18℃，湿度为85％-90％的条件下培养80-100h，即得溶栓腐乳毛坯。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中LB培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，磷酸二氢钾1g/L及余量的水。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤五中接种方式为喷雾或者豆腐坯浸泡菌液的方法进行。

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