CN103315158A - 一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂及其制备方法，其制备原料由以下百分比组成：大蒜素0.3-0.4％、维生素C0.05-0.15％、食盐15-20％、沸石粉35-45％、黄腐酸25-35％、中药提取物7.5-10.5％、益生菌粉7-13％；所述中药提取物为：大黄提取物20-40％、黄连提取物20-40％、黄芩提取物20-40％；本发明能有效的克服淡水鱼类烂鳃、烂尾、烂皮、出血病、赤皮病、体表溃烂等疾病，进而替代抗生素使用。

Description

一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂及其制备方法

技术领域：

本发明涉及一种动物饲料添加剂及其制备方法，特别涉及一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂及其制备方法。

背景技术：

我国是世界上唯一养殖产量超过捕捞产量的国家。在水产养殖中，鱼类养殖历来占养殖的主体，其中淡水鱼类养殖又是鱼类养殖业的主体；在淡水鱼类养殖中，又以池塘养殖为主体，其产量为淡水养殖总产量的2/3左右。目前随着现代集约化人工养殖业的发展，水产动物感染各种疾病的危险性大大增加，一些养殖户为追求高利润，盲目提高放养密度，长期大量使用抗生素，其负面效应日益显现，动物产生抗药性，抗生素失效，疾病大量爆发，出现的淡水鱼类烂鳃、烂尾、烂皮、出血病等多种疾病。我国饲料工业起步虽晚，但发展很快。到2008年，我国已批准使用的添加剂品种有220多个。其中，国产并制定标准的近70多种，与国外相比，我国饲料添加剂行业存在的不足具体来说有以下几点，第一品种少，数量少，总产量相对较低，很多品种包括原料均依靠进口；第二，我国饲料添加剂行业经济及技术力量相对发达国家明显落后，高技术高附加值的技术密集型产品，如氨基酸、维生素、抗生素等成本高，依赖进口的问题；第三缺少创新、仿制为主。

发明内容：

本发明的目的是提供一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂及其制备方法，有效的克服了淡水鱼类烂鳃、烂尾、烂皮、出血病、赤皮病、体表溃烂疾病，进而替代抗生素使用。

为实现上述目的，本发明提供了一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂，其制备原料由以下百分比组成：大蒜素：0.3-0.4％、维生素C0.05-0.15％、食盐15-20％、沸石粉35-45％、黄腐酸25-35％、中药提取物7.5-10.5％、益生菌粉7-13％；所述中药提取物为：大黄提取物20-40％、黄连提取物20-40％、黄芩提取物20-40％。

所述的益生菌粉包括：复合菌营养物50-70％、光合细菌营养物30-50％。

所述的复合菌营养物包括：豆粕10-25％、玉米蛋白粉10-20％、花生饼15-25％、麸皮25-40％、沸石粉15-20％、磷酸氢钙0-2％，及复合菌种液9-15％。所述的复合菌种液包括地衣芽孢杆菌8×10⁸-15×10⁸cfu/g、枯草芽孢杆菌8×10⁸-15×10⁸cfu/g、乳酸菌8×10⁸-15×10⁸cfu/g。

所述的光合细菌发酵培养物包括：沸石粉30-40％、麸皮30-50％、葡萄糖1-5％、菌种液10-30％，所述的菌种液光合细菌浓度为15×10⁸-25×10⁸cfu/g；制备后所得光合细菌营养物中光合细菌浓度为3-8×10⁸cfu/g。

所述的复合菌种液的制备方法为：

首先进行斜面菌种制作，然后进行初级菌种制作，在进行液态发酵；具体制备方法为：

(一)斜面菌种制作

1、培养基的配制

(1)MRS琼脂培养基(供乳酸菌的培养、保存用)

酪蛋白胨8-10份、牛肉膏8-10份、酵母提取物3-6份、乙酸钠3-6份、K₂HPO₄1-3份、柠檬酸二铵1-3份、吐温80 0.5-2份、葡萄糖3-6份、MgSO₄·7H₂O0.1-0.3份、MnSO₄·H₂O0-0.1份、琼脂12-17份，加15-20倍蒸馏水加热至完全溶解，调pH至6-7，分装试管，加盖橡胶塞塞紧，放入高压灭菌锅在115-125℃灭菌15-30分钟。从高压灭菌锅中取出后，倾斜摆放制成斜面。

(2)营养琼脂培养基(供枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的培养、保存用)

称取营养琼脂，加入20-25倍蒸馏水，加热至完全溶解后分装试管，加盖硅胶塞塞紧，放入高压灭菌锅115-125℃灭菌15-30分钟。从高压灭菌锅中取出后，倾斜摆放制成斜面。

2、接种

在超净台以严格的无菌操作方法进行接种，用灭菌的接种环从原菌种中分别挑取少量枯草芽抱杆菌、地衣芽孢杆菌划线接种到营养琼脂培养基斜面；乳酸菌划线接种到MRS琼脂培养基斜面。

3、培养

在恒温培养箱内，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌均为在30-37℃培养22-26小时，乳酸菌30-37℃培养22-25小时。

4、贮存

取出培养好的菌种，放在3-5℃冷藏箱内保存备用。储存期限为87-92天，待接入初级菌种培养基。

(二)、初级菌种制作

1、培养基的配制

(1)营养肉汤培养基(用于地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的增菌培养)

蛋白胨8-12份、牛肉浸膏2-5份、NaCl4-7份，加蒸馏水50-60倍，调pH至6.5-7.5；加热溶解后分装三角瓶，加塞包装，在115-125℃灭菌15-30分钟。

(2)、MRS液体培养基(用于乳酸菌的增菌培养)

酪蛋白胨8-10份、牛肉膏8-10份、酵母提取物3-6份、乙酸钠3-6份、K₂HPO₄1-3份、柠檬酸二铵1-3份、吐温80 0.5-2份、葡萄糖3-6份、MgSO₄·7H₂O0.1-0.3份、MnSO₄·H₂O0-0.1份、琼脂12-17份，加15-20倍蒸馏水，调pH至6-7，加热溶解后分装三角瓶，加塞包装，在110-120℃灭菌15-30分钟。

2、接种

(1)以严格的无菌操作方法进行接种，将枯草芽孢杆菌斜面菌种、地衣芽孢杆菌斜面菌种分别(即(一)所得)按照1环/100ml的比例接种到营养肉汤培养基中，在振荡培养箱内，30-37℃、120r/min振荡培养22-25小时。

(2)以严格的无菌操作方法进行接种，将乳酸菌斜面菌种(即(一)所得)以1环/100ml的比例接种到MRS液体培养基中，在恒温培养箱内，30-37℃静置培养22-25小时；

3、贮存

取出培养好的菌种，放在3-5℃冷藏箱内保存备用，储存期限为6-8天，待接入液体发酵培养基；

(三)、液态发酵

1、发酵罐空罐消毒

在发酵罐投料运转之前首先对发酵罐罐体及物料管路进行蒸汽灭菌、消毒，保持蒸汽压力0.12-0.15MPa状态下维持25-35分钟。

2、培养基的制备

(1)地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌培养基制备方法：

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌液体培养基均为：将酵母浸粉、葡萄糖、MgSO₄·7H₂O按照∶8-11∶25-35∶0.5-1.5比例混合，加入45-55倍自来水，进行搅拌至溶解，PH自然，加入一级种子发酵罐灭菌，一般罐内装液量为罐容的65-75％。

(2)乳酸菌的制备方法：

乳酸菌液体培养基为：将牛肉浸膏、酵母浸粉、葡萄糖、MgSO4·7H₂O、MnSO₄·H₂O、K₂HPO₄、乙酸钠按照8-11∶4-6∶4-6∶0.1-0.3∶0.01-0.05∶1-3∶4-6的比例添加，加入50-60倍自来水，进行搅拌至溶解，PH自然，加入一级种子发酵罐灭菌。一般罐内装液量为罐容的65-75％。

3、实消

投料结束后，开启机械搅拌装置，打开夹套蒸汽阀对罐内培养基进行预热，当罐内培养基温度上升至85-95℃时，将蒸汽直接通入内层培养基进行加热，当罐压升至0.12MPa，料温升至121-123℃时，保温、保压维持30分钟。

4、接种

培养基灭菌后冷却至菌种发酵设定温度30-37摄氏度，将无菌室准备好的初级菌种(即(二)所得)，通过火焰接种口接入一级种子发酵罐内，接种前先点燃酒精灯对接种口进行灭菌，同时必须保证罐内处于正压状态，接种完后在火焰掩护下迅速盖上接种盖，撤去酒精灯，旋紧接种口盖，接种完毕。

5、发酵培养

菌种接入一级种子发酵罐后，即开始进行发酵培养，培养过程中罐压一般控制在0.02-0.07MPa。芽孢杆菌发酵培养温度为30-37℃、转速100r/min；通气量：小罐1.5m³/h、中罐8m³/h、大罐60m³/h，搅拌培养20-26小时。乳酸菌发酵培养温度为30-37℃，静置保压厌氧培养22-26小时，得到一级种子液；

6、移种

将培养好的一级种子液从一级种子发酵罐中通过压差移种至二级种子罐，移种前先对移种管路蒸汽灭菌15-25分钟，二级种子液培养好后最终移种至发酵罐中进行发酵培养，二级菌种培养和发酵培养条件和时间与一级种子相同。

(四)、菌种混合

将上述所得枯草芽抱杆菌、地芽孢杆菌、乳酸菌发酵液(浓度在1-10×10⁸cfu/m1)按乳酸菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌1∶8～12∶8～12的比例移入储液罐中，然后开启搅拌至均匀，同时打开储液罐制冷机对菌液进行制冷，当菌液温度降到0-5℃时，关闭搅拌和制冷剂静置保存。

所述的复合菌营养物的制备过程为：

(1)原料预处理：将复合菌培养物的主料：豆粕、玉米蛋白粉、花生饼、麸皮、沸石粉进行初步清理，清除大的杂质和霉变物料。

(2)粉碎：粉碎到60-80目，粉碎后进行预混合。

(3)原料预混合：将豆粕5-25％、玉米蛋白粉10-20％、花生饼15-25％、麸皮25-40％、沸石粉15-20％干态原料进行预混合。

(4)配料：复合菌营养物的原料生产配料前先将混合机气动门关闭，然后启动混合机。根据产品配方比例，将预混合好的干态物料通过配料秤进行计量称重后并添加磷酸氢钙0-2％(先溶解于水中)，通过提升设备添加到湿料混合机中。

(5)接种混合：所有原辅料按照配方比例都加入混合机后，启动液体添加泵，将复合菌种液菌液按照固态物料9-15％比例喷洒入混合机，复合菌种液和物料充分混合搅拌5分钟后即可开启混合机气动门进行放料。

(6)固态发酵：混合机内物料充分混合均匀后，开启气动门将物料放入盛料车内，人工罐包，打包好的产品运输至固态发酵室内30℃温度下发酵6-8天，之后于50-70摄氏度闪蒸干燥。所得产品中复合营养物的浓度为1-3×10⁸cfu/g。

所述的益生菌粉为复合菌营养物50-70％、光合细菌营养物30-50％；所述的复合菌营养物中菌的的浓度为1-3×10⁸cfu/g；光合细菌营养物中菌浓度为3-8×10⁸cfu/g。

一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂的制备方法为：

(1)：将大黄20-40％、黄芩20-40％、黄连20-40％分别进行除杂、粗粉碎至60-100目；

(2)：将上述原料分别进行水质，加入6-8倍的水，煎煮三次，每次煎煮0.8-1.2小时，合并煎液，滤过，将滤液离心除渣，于60摄氏度以下减压(0.07MPa)浓缩，浓缩后的比重是1.25-1.30，冷却至18-28度，加入6-10倍75％乙醇，进行搅匀，静置1-3小时，沉淀、滤过，水蒸气蒸馏回收乙醇，将浓缩液喷雾干燥到含水量低于5％；

(3)：将上述三种中药提取物混合；

(4)：将上述混合后所得物质依次加入益生菌粉7-13％、大蒜素：0.3-0.4％、维生素C0.05-0.15％、食盐15-20％、沸石粉35-45％，混合上述物质，加入黄腐酸25-35％，搅拌均匀后即得成品。

本发明提供的一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂及其制备方法具有以下优点：有效的克服了淡水鱼类烂鳃、烂尾、烂皮、出血病、赤皮病、体表溃烂疾病，无污染，无残留，是一种绿色的淡水鱼类饲料添加剂，进而替代抗生素使用。

下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明：

图1：为本发明一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂的制备方法流程图。

图2：为本发明一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂的复合营养液物的制备方法流程图。

具体实施方式：

实施例1：

一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂，其制备原料由以下百分比组成：大蒜素：0.3％、维生素C0.1％、食盐15％、沸石粉35％、黄腐酸30％、中药提取物9.6％、益生菌粉10％；所述中药提取物为：大黄提取物30％、黄连提取物30％、黄芩提取物40％。

所述的益生菌粉包括：复合菌营养物55％、光合细菌营养物45％。

所述的复合菌营养物包括：豆粕14％、玉米蛋白粉15％、花生饼15％、麸皮26％、沸石粉19.5％、磷酸氢钙0.5％，及复合菌种液10％。所述的复合菌种液包括地衣芽孢杆菌12.9×10⁸cfu/g、枯草芽孢杆菌14.4×10⁸cfu/g、乳酸菌9.7×10⁸cfu/g。

所述的光合细菌发酵培养物包括：沸石粉35％、麸皮35％、葡萄糖5％、菌种液25％，所述的菌种液光合细菌浓度为12.5×10⁸cfu/g；制备后所得光合细菌营养物中光合细菌浓度为5×10⁸cfu/g。

所述的复合菌种液的制备方法为：

首先进行斜面菌种制作，然后进行初级菌种制作，再进行液态发酵；具体制备方法为：

(一)斜面菌种制作

1、培养基的配制

(1)MRS琼脂培养基(供乳酸菌的培养、保存用)

酪蛋白胨8份、牛肉膏9份、酵母提取物5份、乙酸钠4份、K₂HPO₄2份、柠檬酸二铵2份、吐温80 1份、葡萄糖4份、MgSO₄·7H₂O0.2份、、琼脂13份，加17倍蒸馏水加热至完全溶解，调pH至6.5，分装试管，加盖橡胶塞塞紧，放入高压灭菌锅在120℃灭菌20分钟；从高压灭菌锅中取出后，倾斜摆放制成斜面；

(2)营养琼脂培养基(供枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的培养、保存用)

称取营养琼脂，加入20倍蒸馏水，加热至完全溶解后分装试管，加盖硅胶塞塞紧，放入高压灭菌锅120℃灭菌20分钟。从高压灭菌锅中取出后，倾斜摆放制成斜面；

2、接种

在超净台以严格的无菌操作方法进行接种，用灭菌的接种环从原菌种中分别挑取少量枯草芽抱杆菌、地衣芽孢杆菌划线接种到营养琼脂培养基斜面；乳酸菌划线接种到MRS琼脂培养基斜面；

3、培养

在恒温培养箱内，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌均为在35℃培养24小时，乳酸菌35℃培养24小时；

4、贮存

取出培养好的菌种，放在4℃冷藏箱内保存备用。储存期限为90天，待接入初级菌种培养基；

(二)、初级菌种制作

1、培养基的配制

(1)营养肉汤培养基(用于地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的增菌培养)

蛋白胨8份、牛肉浸膏3份、NaCl5份，加蒸馏水55倍，调pH至7；加热溶解后分装三角瓶，加塞包装，在120℃灭菌20分钟；

(2)、MRS液体培养基(用于乳酸菌的增菌培养)

酪蛋白胨8份、牛肉膏9份、酵母提取物4份、乙酸钠4份、K₂HPO₄2份、柠檬酸二铵2份、吐温80 1份、葡萄糖4份、MgSO₄·7H₂O0.2份、MnSO₄·H₂O0.1份、琼脂15份，加18倍蒸馏水，调pH至6.5，加热溶解后分装三角瓶，加塞包装，在120℃灭菌20分钟；

2、接种

(1)以严格的无菌操作方法进行接种，将枯草芽孢杆菌斜面菌种、地衣芽孢杆菌斜面菌种(即(一)所得)分别按照1环/100ml的比例接种到营养肉汤培养基中，在振荡培养箱内，35℃、120r/min振荡培养24小时；

(2)以严格的无菌操作方法进行接种，将乳酸菌斜面菌种(即(一)所得)以1环/100ml的比例接种到MRS液体培养基中，在恒温培养箱内，35℃静置培养24小时；

3、贮存

取出培养好的菌种，放在4℃冷藏箱内保存备用，储存期限为8天，待接入液体发酵培养基；

(三)、液态发酵

1、发酵罐空罐消毒

在发酵罐投料运转之前首先对发酵罐罐体及物料管路进行蒸汽灭菌、消毒，保持蒸汽压力0.12MPa状态下维持30分钟；

2、培养基的制备

(1)地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌培养基制备方法：

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌液体培养基均为：将酵母浸粉、葡萄糖、MgSO₄·7H₂O按照：8∶30∶1比例混合，加入50倍自来水，进行搅拌至溶解，PH自然，加入一级种子发酵罐灭菌，一般罐内装液量为罐容的70％；

(2)乳酸菌的制备方法：

乳酸菌液体培养基为：将牛肉浸膏、酵母浸粉、葡萄糖、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、K₂HPO₄、乙酸钠按照8∶5∶5∶0.2∶0.03∶2∶5的比例混合，加入55倍自来水，进行搅拌至溶解，PH自然，加入一级种子发酵罐灭菌。一般罐内装液量为罐容的70％；

3、实消

投料结束后，开启机械搅拌装置，打开夹套蒸汽阀对罐内培养基进行预热，当罐内培养基温度上升至90℃时，将蒸汽直接通入内层培养基进行加热，当罐压升至0.12MPa，料温升至122℃时，保温、保压维持30分钟；

4、接种

培养基灭菌后冷却至菌种发酵设定温度35摄氏度，将无菌室准备好的初级菌种(即(二)所得)，通过火焰接种口接入一级种子发酵罐内，接种前先点燃酒精灯对接种口进行灭菌，同时必须保证罐内处于正压状态，接种完后在火焰掩护下迅速盖上接种盖，撤去酒精灯，旋紧接种口盖，接种完毕；

5、发酵培养

菌种接入一级种子发酵罐后，即开始进行发酵培养，培养过程中罐压一般控制在0.05MPa。芽孢杆菌发酵培养温度为35℃、转速100r/min；通气量：小罐1.5m³/h、中罐8m³/h、大罐60m³/h，搅拌培养24小时。乳酸菌发酵培养温度为35℃，静置保压厌氧培养24小时，得到一级种子液；

6、移种

将培养好的一级种子液从一级种子发酵罐中通过压差移种至二级种子罐，移种前先对移种管路蒸汽灭菌20分钟，二级种子液培养好后最终移种至发酵罐中进行发酵培养，二级菌种培养和发酵培养条件和时间与一级种子相同；

(四)、菌种混合

将上述所得枯草芽抱杆菌(14.4×10⁸cfu/ml)、地衣芽孢杆菌(12.9×10⁸cfu/ml)、乳酸菌(9.7×10⁸cfu/ml)发酵液按乳酸菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌1∶9∶10的比例移入储液罐中，然后开启搅拌至均匀，同时打开储液罐制冷机对菌液进行制冷，当菌液温度降到4℃时，关闭搅拌和制冷剂静置保存；

所述的复合菌营养物的制备过程为：

(1)原料预处理：将复合菌培养物：豆粕、玉米蛋白粉、花生饼、麸皮、沸石粉进行初步清理，清除大的杂质和霉变物料；

(2)粉碎：由于各种原料加工工艺的差异，原料的颗粒度大小也不均匀，因此，对粒度较大的原料要进行粉碎，以保证产品粒度的均一性；粉碎到80目，粉碎后进行预混合；

(3)原料预混合：豆粕14％、玉米蛋白粉15％、花生饼15％、麸皮26％、沸石粉19.5％干态原料进行预混合；

(4)配料：复合菌营养物的原料生产配料前先将混合机气动门关闭，然后启动混合机；根据产品配方比例，将预混合好的干态物料通过配料秤进行计量称重后，并添加磷酸氢钙0.5％(先溶解于水中)，通过提升设备添加到湿料混合机中；

(5)接种混合：所有原辅料按照配方比例都加入混合机后，启动液体添加泵，将复合菌种液菌液按照固态物料10％混合，复合菌种液和物料充分混合搅拌5分钟后即可开启混合机气动门进行放料；

(6)固态发酵：混合机内物料充分混合均匀后，开启气动门将物料放入盛料车内，人工罐包，打包好的产品运输至固态发酵室内30℃温度下发酵7天，之后于60摄氏度闪蒸干燥。所得产品中复合营养物的浓度为2.98×10⁸cfu/g。

所述的益生菌粉为复合菌营养物55％、光合细菌营养物45％；所述的复合菌营养物中菌的的浓度为2.98×10⁸cfu/g；光合细菌营养物中菌浓度为5×10⁸cfu/g。

一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂的制备方法，制备方法为：

(1)：将大黄30％、黄芩30％、黄连40％分别进行除杂、粗粉碎至80目；

(2)：将上述原料分别进行水质，加入7倍的水，煎煮三次，每次煎煮1小时，合并煎液，滤过，将滤液离心除渣，于60摄氏度以下减压(0.07MPa)浓缩，浓缩后的比重是1.25，冷却至25度，加入8倍75％乙醇，进行搅匀，静置2小时，沉淀、滤过，水蒸气蒸馏回收乙醇，将浓缩液喷雾干燥到含水量为3％；

(3)：将上述三种中药提取物混合；

(4)将上述混合后所得物质按照百分比依次加入中药提取物9.6％、益生菌粉10％、大蒜素0.3％、维生素C0.1％、食盐15％、沸石粉35％，混合上述物质，加入黄腐酸30％，搅拌均匀后即得成品。

实施例2

一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂，其制备原料由以下百分比组成：大蒜素：0.35％、维生素C0.15％、食盐18％、沸石粉40％、黄腐酸25％、中药提取物8.5％、益生菌粉8％；所述中药提取物为：大黄提取物35％、黄连提取物35％、黄芩提取物30％。

所述的益生菌粉包括：复合菌营养物50％、光合细菌营养物50％。

所述的复合菌营养物包括：豆粕12％、玉米蛋白粉10％、花生饼18％、麸皮30％、沸石粉17％、磷酸氢钙1％，及复合菌种液12％。所述的复合菌种液包括地衣芽孢杆菌11.9×10⁸cfu/g、枯草芽孢杆菌12.8×10⁸cfu/g、乳酸菌8×10⁸cfu/g。

所述的光合细菌发酵培养物包括：沸石粉40％、麸皮40％、葡萄糖3％、菌种液17％，所述的菌种液光合细菌其浓度为22×10⁸cfu/g；制备后所得光合细菌营养物中光合细菌浓度为7.8×10⁸cfu/g。

所述的复合菌种液的制备方法为：

首先进行斜面菌种制作，然后进行初级菌种制作，再进行液态发酵；具体制备方法为：

(一)斜面菌种制作

1、培养基的配制

(1)MRS琼脂培养基(供乳酸菌的培养、保存用)

酪蛋白胨10份、牛肉膏8份、酵母提取物3份、乙酸钠6份、K₂HPO₄1份、柠檬酸二铵1份、吐温80 2份、葡萄糖3份、MgSO₄·7H₂O0.1份、MnSO4·H₂O0_.1份、琼脂15份，加18倍蒸馏水加热至完全溶解，调pH至6，分装试管，加盖橡胶塞塞紧，放入高压灭菌锅在125℃灭菌15分钟；从高压灭菌锅中取出后，倾斜摆放制成斜面；

(2)营养琼脂培养基(供枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的培养、保存用)

称取营养琼脂，加入25倍蒸馏水，加热至完全溶解后分装试管，加盖硅胶塞塞紧，放入高压灭菌锅125℃灭菌15分钟。从高压灭菌锅中取出后，倾斜摆放制成斜面；

2、接种

在超净台以严格的无菌操作方法进行接种，用灭菌的接种环从原菌种中分别挑取少量枯草芽抱杆菌、地衣芽孢杆菌划线接种到营养琼脂培养基斜面；乳酸菌划线接种到MRS琼脂培养基斜面；

3、培养

在恒温培养箱内，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌均为在30℃培养26小时，乳酸菌30℃培养26小时；

4、贮存

取出培养好的菌种，放在3℃冷藏箱内保存备用。储存期限为92天，待接入初级菌种培养基；

(二)、初级菌种制作

1、培养基的配制

(1)营养肉汤培养基(用于地芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的增菌培养)

蛋白胨12份、牛肉浸膏2份、NaCl6份，加蒸馏水50倍，调pH至6.5；加热溶解后分装三角瓶，加塞包装，在125℃灭菌15分钟；

(2)、MRS液体培养基(用于乳酸菌的增菌培养)

酪蛋白胨10份、牛肉膏8份、酵母提取物6份、乙酸钠6份、K₂HPO₄2份、柠檬酸二铵1份、吐温80 2份、葡萄糖3份、MgSO₄·7H₂O0.2份、MnSO₄·H₂O0.1份、琼脂12份，加15倍蒸馏水，调pH至7，加热溶解后分装三角瓶，加塞包装，在110℃灭菌25分钟；

2、接种

(1)以严格的无菌操作方法进行接种，将枯草芽孢杆菌斜面菌种、地衣芽孢杆菌斜面菌种(即(一)所得)分别按照1环/100ml的比例接种到营养肉汤培养基中，在振荡培养箱内，30℃、120r/min振荡培养25小时；

(2)以严格的无菌操作方法进行接种，将乳酸菌斜面菌种(即(一)所得)以1环/100ml的比例接种到MRS液体培养基中，在恒温培养箱内，30℃静置培养25小时；

3、贮存

取出培养好的菌种，放在3℃冷藏箱内保存备用，储存期限为7天，待接入液体发酵培养基；

(三)、液态发酵

1、发酵罐空罐消毒

在发酵罐投料运转之前首先对发酵罐罐体及物料管路进行蒸汽灭菌、消毒，保持蒸汽压力0.14MPa状态下维持32分钟；

2、培养基的制备

(1)地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌培养基制备方法：

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌液体培养基均为：将酵母浸粉、葡萄糖、MgSO₄·7H₂O按照10∶35∶1.5比例混合，加入45倍自来水，进行搅拌至溶解，PH自然，加入一级种子发酵罐灭菌，一般罐内装液量为罐容的65％；

(2)乳酸菌的制备方法：

乳酸菌液体培养基为：将牛肉浸膏、酵母浸粉、葡萄糖、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、K₂HPO₄、乙酸钠按照10∶6∶6∶0.3∶0.02∶3∶4的比例混合，加入50倍自来水，进行搅拌至溶解，PH自然，加入一级种子发酵罐灭菌。一般罐内装液量为罐容的65％；

3、实消

投料结束后，开启机械搅拌装置，打开夹套蒸汽阀对罐内培养基进行预热，当罐内培养基温度上升至85℃时，将蒸汽直接通入内层培养基进行加热，当罐压升至0.12MPa，料温升至123℃时，保温、保压维持30分钟；

4、接种

培养基灭菌后冷却至菌种发酵设定温度33摄氏度，将无菌室准备好的初级菌种(即(二)所得)，通过火焰接种口接入一级种子发酵罐内，接种前先点燃酒精灯对接种口进行灭菌，同时必须保证罐内处于正压状态，接种完后在火焰掩护下迅速盖上接种盖，撤去酒精灯，旋紧接种口盖，接种完毕；

5、发酵培养

菌种接入一级种子发酵罐后，即开始进行发酵培养，培养过程中罐压一般控制在0.03MPa。芽孢杆菌发酵培养温度为30℃、转速100r/min；通气量：小罐1.5m³/h、中罐8m³/h、大罐60m³/h，搅拌培养26小时。乳酸菌发酵培养温度为30℃，静置保压厌氧培养26小时，得到一级种子液；

6、移种

将培养好的一级种子液从一级种子发酵罐中通过压差移种至二级种子罐，移种前先对移种管路蒸汽灭菌25分钟，二级种子液培养好后最终移种至发酵罐中进行发酵培养，二级菌种培养和发酵培养条件和时间与一级种子相同；

(四)、菌种混合

将上述所得枯草芽抱杆菌(12.8×10⁸cfu/ml)、地衣芽孢杆菌(11.9×10⁸cfu/ml)、乳酸菌(8×10⁸cfu/ml)发酵液按乳酸菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌1∶8∶11的比例移入储液罐中，然后开启搅拌至均匀，同时打开储液罐制冷机对菌液进行制冷，当菌液温度降到3℃时，关闭搅拌和制冷剂静置保存；

所述的复合菌营养物的制备过程为：

(1)原料预处理：将复合菌培养物：豆粕、玉米蛋白粉、花生饼、麸皮、沸石粉进行初步清理，清除大的杂质和霉变物料；

(2)粉碎：由于各种原料加工工艺的差异，原料的颗粒度大小也不均匀，因此，对粒度较大的原料要进行粉碎，以保证产品粒度的均一性；粉碎到70目，粉碎后进行预混合；

(3)原料预混合：将豆粕12％、玉米蛋白粉10％、花生饼18％、麸皮30％、沸石粉17％干态原料进行预混合；

(4)配料：复合菌营养物的原料生产配料前先将混合机气动门关闭，然后启动混合机；根据产品配方比例，将预混合好的干态物料通过配料秤进行计量称重后并添加磷酸氢钙1％(先溶解于水中)，通过提升设备添加到湿料混合机中；

(5)接种混合：所有原辅料按照配方比例都加入混合机后，启动液体添加泵，将复合菌种液菌液按照固态物料12％比例喷洒入混合机，符合复合菌种液和物料充分混合搅拌5分钟后即可开启混合机气动门进行放料；

(6)固态发酵：混合机内物料充分混合均匀后，开启气动门将物料放入盛料车内，人工罐包，打包好的产品运输至固态发酵室内30℃温度下发酵8天，之后于65摄氏度烘干(或喷雾干燥)。所得产品中复合营养物的浓度为2.5×10⁸cfu/g。

所述的益生菌粉为复合菌营养物50％、光合细菌营养物50％；所述的复合菌营养物中菌的的浓度为2.5×10⁸cfu/g；光合细菌营养物中菌浓度为7.8×10⁸cfu/g。

所述的一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂的制备方法为：

(1)：将大黄35％、黄芩35％、黄连30％分别进行除杂、粗粉碎至70目；

(2)：将上述原料分别进行水质，加入8倍的水，煎煮三次，每次煎煮0.8小时，合并煎液，滤过，将滤液离心除渣，于60摄氏度以下减压(0.07MPa)浓缩，浓缩后的比重是1.30，冷却至20度，加入9倍75％乙醇，进行搅匀，静置2.5小时，沉淀、滤过，水蒸气蒸馏回收乙醇，将浓缩液喷雾干燥到含水量为2％；

(3)：将上述三种中药提取物混合；

(4)将上述混合后所得物质按照百分比依次加入中药提取物8.5％、益生菌粉8％、大蒜素0.35％、维生素C0.15％、食盐18％、沸石粉40％，混合上述物质，加入黄腐酸25％，搅拌均匀后即得成品。

实施例3：

一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂，其制备原料由以下百分比组成：大蒜素：0.4％、维生素C0.05％、食盐16.05％、沸石粉37％、黄腐酸26.5％、中药提取物9％、益生菌粉11％；所述中药提取物为：大黄提取物33.3％、黄连提取物33.3％、黄芩提取物33.4％。

所述的益生菌粉包括：复合菌营养物30％、光合细菌营养物70％。

所述的复合菌营养物包括：豆粕5％、玉米蛋白粉12％、花生饼20％、麸皮32％、沸石粉15.5％、磷酸氢钙1.5％，及复合菌种液14％。所述的复合菌种液包括地衣芽孢杆菌14.2×10⁸cfu/g、枯草芽孢杆菌13.6×10⁸cfu/g、乳酸菌11×10⁸cfu/g。

所述的光合细菌发酵培养物包括：沸石粉35％、麸皮40％、葡萄糖5％、菌种液20％，所述的菌种液光合细菌其浓度为20×10⁸cfu/g；制备后所得光合细菌营养物中光合细菌浓度为6.5×10⁸cfu/g。

所述的复合菌种液的制备方法为：

首先进行斜面菌种制作，然后进行初级菌种制作，再进行液态发酵；具体制备方法为：

(一)斜面菌种制作

1、培养基的配制

(1)MRS琼脂培养基(供乳酸菌的培养、保存用)

酪蛋白胨9份、牛肉膏9份、酵母提取物5份、乙酸钠3份、K₂HPO₄2份、柠檬酸二铵2份、吐温80 1份、葡萄糖4份、MgSO₄·7H₂O0.2份、MnSO4·H₂O0.2份、琼脂17份，加16倍蒸馏水加热至完全溶解，调pH至7，分装试管，加盖橡胶塞塞紧，放入高压灭菌锅在122℃灭菌20分钟；从高压灭菌锅中取出后，倾斜摆放制成斜面；

(2)营养琼脂培养基(供枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的培养、保存用)

称取营养琼脂，加入22倍蒸馏水，加热至完全溶解后分装试管，加盖硅胶塞塞紧，放入高压灭菌锅122℃灭菌20分钟。从高压灭菌锅中取出后，倾斜摆放制成斜面；

2、接种

在超净台以严格的无菌操作方法进行接种，用灭菌的接种环从原菌种中分别挑取少量枯草芽抱杆菌、地衣芽孢杆菌划线接种到营养琼脂培养基斜面；乳酸菌划线接种到MRS琼脂培养基斜面；

3、培养

在恒温培养箱内，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌均为在33℃培养23小时，乳酸菌33℃培养23小时；

4、贮存

取出培养好的菌种，放在5℃冷藏箱内保存备用。储存期限为88天，待接入初级菌种培养基；

(二)、初级菌种制作

1、培养基的配制

(1)营养肉汤培养基(用于地芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的增菌培养)

蛋白胨8份、牛肉浸膏4份、NaCl7份，加蒸馏水53倍，调pH至7；加热溶解后分装三角瓶，加塞包装，在122℃灭菌20分钟；

(2)、MRS液体培养基(用于乳酸菌的增菌培养)

酪蛋白胨9份、牛肉膏9份、酵母提取物5份、乙酸钠3份、K₂HPO₄2份、柠檬酸二铵2份、吐温80 1份、葡萄糖4份、MgSO₄·7H₂O0.2份、MnSO4·H₂O0.2份、琼脂17份，加16倍蒸馏水加热至完全溶解，调pH至7，加热溶解后分装三角瓶，加塞包装，在122℃灭菌20分钟；

2、接种

(1)以严格的无菌操作方法进行接种，将枯草芽孢杆菌斜面菌种、地衣芽孢杆菌斜面菌种(即(一)所得)分别按照1环/100m1的比例接种到营养肉汤培养基中，在振荡培养箱内，35℃、120r/min振荡培养24小时；

(2)以严格的无菌操作方法进行接种，将乳酸菌斜面菌种(即(一)所得)以1环/100ml的比例接种到MRS液体培养基中，在恒温培养箱内，35℃静置培养24小时；

3、贮存

取出培养好的菌种，放在5℃冷藏箱内保存备用，储存期限为6天，待接入液体发酵培养基；

(三)、液态发酵

1、发酵罐空罐消毒

在发酵罐投料运转之前首先对发酵罐罐体及物料管路进行蒸汽灭菌、消毒，保持蒸汽压力0.12MPa状态下维持30分钟；

2、培养基的制备

(1)地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌培养基制备方法：

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌液体培养基均为：将酵母浸粉、葡萄糖、MgSO₄·7H₂O按照9∶30∶1比例混合，加入47倍自来水，进行搅拌至溶解，PH自然，加入一级种子发酵罐灭菌，一般罐内装液量为罐容的70％；

(2)乳酸菌的制备方法：

乳酸菌液体培养基为：将牛肉浸膏、酵母浸粉、葡萄糖、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、K₂HPO₄、乙酸钠按照9∶4∶5∶0.2∶0.05∶2∶5的比例混合，加入54倍自来水，进行搅拌至溶解，PH自然，加入一级种子发酵罐灭菌。一般罐内装液量为罐容的70％；

3、实消

投料结束后，开启机械搅拌装置，打开夹套蒸汽阀对罐内培养基进行预热，当罐内培养基温度上升至90℃时，将蒸汽直接通入内层培养基进行加热，当罐压升至0.12MPa，料温升至121℃时，保温、保压维持30分钟；

4、接种

培养基灭菌后冷却至菌种发酵设定温度35摄氏度，将无菌室准备好的初级菌种(即(二)所得)，通过火焰接种口接入一级种子发酵罐内，接种前先点燃酒精环对接种口进行灭菌，同时必须保证罐内处于正压状态，接种完后在火焰掩护下迅速盖上接种盖，撤去酒精环，旋紧接种口盖，接种完毕；

5、发酵培养

菌种接入一级种子发酵罐后，即开始进行发酵培养，培养过程中罐压一般控制在0.07MPa。芽孢杆菌发酵培养温度为35℃、转速100r/min；通气量：小罐1.5m³/h、中罐8m³/h、大罐60m³/h，搅拌培养24小时。乳酸菌发酵培养温度为30℃，静置保压厌氧培养24小时，得到一级种子液；

6、移种

将培养好的一级种子液从一级种子发酵罐中通过压差移种至二级种子罐，移种前先对移种管路蒸汽灭菌19分钟，二级种子液培养好后最终移种至发酵罐中进行发酵培养，二级菌种培养和发酵培养条件和时间与一级种子相同；

(四)、菌种混合

将上述所得枯草芽抱杆菌(13.6×10⁸cfu/ml)、地衣芽孢杆菌(14.2×10⁸cfu/ml)、乳酸菌(11×10⁸cfu/ml)发酵液，按乳酸菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌1∶10∶8的比例移入储液罐中，然后开启搅拌至均匀，同时打开储液罐制冷机对菌液进行制冷，当菌液温度降到5℃时，关闭搅拌和制冷剂静置保存；

所述的复合菌营养物的制备过程为：

(1)原料预处理：将复合菌培养物：豆粕、玉米蛋白粉、花生饼、麸皮、沸石粉进行初步清理，清除大的杂质和霉变物料；

(2)粉碎：由于各种原料加工工艺的差异，原料的颗粒度大小也不均匀，因此，对粒度较大的原料要进行粉碎，以保证产品粒度的均一性；粉碎到60目，粉碎后进行预混合；

(3)原料预混合：将豆粕5％、玉米蛋白粉12％、花生饼20％、麸皮32％、沸石粉15.5％干态原料进行预混合；

(4)配料：复合菌营养物的原料生产配料前先将混合机气动门关闭，然后启动混合机；根据产品配方比例，将预混合好的干态物料通过配料秤进行计量称重后并添加磷酸氢钙1.5％(先溶解于水中)，通过提升设备添加到湿料混合机中；

(5)接种混合：所有原辅料按照配方比例都加入混合机后，启动液体添加泵，将复合菌种液菌液按照固态物料14％比例喷洒入混合机，符合复合菌种液和物料充分混合搅拌5分钟后即可开启混合机气动门进行放料；

(6)固态发酵：混合机内物料充分混合均匀后，开启气动门将物料放入盛料车内，人工罐包，打包好的产品运输至固态发酵室内30℃温度下发酵7天，之后于50摄氏度烘干(或喷雾干燥)。所得产品中复合营养物的浓度为2.9×10⁸cfu/g。

所述的益生菌粉为复合菌营养物30％、光合细菌营养物70％；所述的复合菌营养物中菌的的浓度为3×10⁸cfu/g；光合细菌营养物中菌浓度为6.54×10⁸cfu/g。

所述的一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂的制备方法为：

(1)：将大黄33.3％、黄芩33.3％、黄连33.4％分别进行除杂、粗粉碎至60目；

(2)：将上述原料分别进行水质，加入7倍的水，煎煮三次，每次煎煮1.1小时，合并煎液，滤过，将滤液离心除渣，于60摄氏度以下减压(0.07MPa)浓缩，浓缩后的比重是1.30，冷却至27度，加入7倍75％乙醇，进行搅匀，静置2小时，沉淀、滤过，水蒸气蒸馏回收乙醇，将浓缩液喷雾干燥到含水量为1％；

(3)：将上述三种中药提取物混合；

(4)将上述混合后所得物质按照百分比依次加入中药提取物9％、益生菌粉11％、大蒜素0.4％、维生素C0.05％、食盐16.05％、沸石粉37％，混合上述物质，加入黄腐酸26.5％，搅拌均匀后即得成品。

通过本发明上述实施例的技术方案可以看出，与现有技术相比，本发明有效的克服了淡水鱼类烂鳃、烂尾、烂皮、出血病、赤皮病、体表溃烂疾病及一些细菌性疾病，可替代抗生素使用。同时促进鱼类消化，为鱼类补充所需的全部常量元素和大部分微量元素，吸附水体细菌，改善水质，从根源上净化水体。

下面结合具体实施例做进一步说明：

实施例1：

将草金鱼养殖28天-30天，这期间以三种方式进行饲喂，分别为对照组(普通饲料)、三黄散组、饲料添加剂组(普通饲料+本发明饲料添加剂)，之后进行细菌感染。将135尾草金鱼去掉部分鳞片后浸泡嗜水单胞菌，浸泡浓度为7.3*10⁷cfu/g，浸泡时间为15分钟，浸泡温度为20-22℃，将感染后的草金鱼分别放入鱼缸中进行饲养，定时观察草金鱼的发病和死亡状况，共观察20天左右。

为如下表所示：

表1不同饲喂条件下的死亡率

从表1可以看出，在50天左右的养殖过程中，使用本发明淡水鱼类饲料添加剂的死亡率明显降低。

实施例2：

将草金鱼分为三组，每组45尾，设为对照组(普通饲料)、三黄散组、饲料添加剂组(普通饲料+本发明饲料添加剂)，养殖28天-30天后，将135尾草金鱼人工注射感染柱状黄杆菌，每尾注射0.1ml，浓度为4.5*10⁶cfu，注射温度为23～24℃，注射感染后分别放入鱼缸中进行饲养，定时观察草金鱼的发病和死亡状况。注射病菌后草金鱼在20天期间的状况，如表2所示：

表2人工注射柱状黄杆菌后鱼的情况

从表2可以看出，在50天的养殖过程中，使用本发明淡水鱼类饲料添加剂的感染率明显低于其他两种饲喂方式，且体表溃烂明显降低。

实施例3：

将体长为10cm左右的鲫鱼，分为三组，分别饲喂普通饲料、板加三(板蓝根+三黄散组)、添加本发明饲料添加剂(普通饲料+本发明饲料添加剂)，养殖30天，人工注射感染柱状黄杆菌，浓度为4.5*10⁶cfu，注射温度为23～24℃，之后分别放入小型玻璃鱼缸中进行饲养，定时观察鲫鱼的体表和死亡状况，共观察20天，具体情况如表3：

表3人工注射柱状黄杆菌后鱼的情况

从表3可以看出，在50天的养殖过程中，使用本发明淡水鱼类饲料添加剂的感染率明显低于其他两种饲喂方式，且体表溃烂明显降低。

实施例4：

将体长为10cm左右的鲫鱼，分为三组，每组30尾，分别饲喂普通饲料、板加三(板蓝根+三黄散组)、添加本发明饲料添加剂(普通饲料+本发明饲料添加剂)，养殖30天后，人工浸泡感染嗜水气单胞菌，之后分别放入小型玻璃鱼缸中进行饲养，定时观察鲫鱼的体表和死亡状况，共观察20天，具体情况如表4：

表4人工感染嗜水气单胞菌后鱼的情况

从表4可以看出，在50天的养殖过程中，使用本发明淡水鱼类饲料添加剂的鲫鱼的感染率明显低于其他两种饲喂方式，且体表溃烂明显降低。

以上实施例1-4中提及的三黄散组为基础饲料+维生素C+食盐+沸石粉+地衣芽孢杆菌+枯草芽抱杆菌+光合细菌+乳酸菌+黄腐植酸+三黄散；三黄散为：大黄、黄连、黄芩提取物。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，在本发明基础上，本领域技术人员比较容易在不脱离本发明技术方案的精神和范围内做一些修改或者等同替换。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂，其特征在于：其制备原料由以下百分比组成：大蒜素：0.3-0.4％、维生素C0.05-0.15％、食盐15-20％、沸石粉35-45％、黄腐酸25-35％、中药提取物7.5-10.5％、益生菌粉7-13％；所述中药提取物为：大黄提取物20-40％、黄连提取物20-40％、黄芩提取物20-40％。 

2.根据权利要求1所述的一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂，其特征在于：所述的益生菌粉包括：复合菌营养物50-70％、光合细菌营养物30-50％。 

3.根据权利要求2所述的一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂，其特征在于：所述的复合菌营养物包括：豆粕5-25％、玉米蛋白粉10-20％、花生饼15-25％、麸皮25-40％、沸石粉15-20％、磷酸氢钙0-2％，及复合菌种液9-15％。所述的复合菌种液包括地衣芽孢杆菌8×10⁸-15×10⁸cfu/g、枯草芽孢杆菌8×10⁸-15×10⁸cfu/g、乳酸菌8×10⁸-15×10⁸cfu/g。 

4.根据权利要求2所述的一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂，其特征在于：所述的光合细菌发酵培养物包括：沸石粉30-40％、麸皮30-50％、葡萄糖1-5％、菌种液10-30％，所述的菌种液为光合细菌其浓度为15×10⁸-25×10⁸cfu/g；制备后所得光合细菌营养物中光合细菌浓度为3-8×10⁸cfu/g。 

5.根据权利要求3所述的一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂，其特征在于：所述的复合菌种液的制备方法为： 

首先进行斜面菌种制作，然后进行初级菌种制作，再进行液态发酵；具体制备方法为： 

(一)斜面菌种制作 

1、培养基的配制 

(1)MRS琼脂培养基(供乳酸菌的培养、保存用) 

酪蛋白胨8-10份、牛肉膏8-10份、酵母提取物3-6份、乙酸钠3-6份、K₂HPO₄1-3份、柠檬酸二铵1-3份、吐温80 0.5-2份、葡萄糖3-6份、MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3份、MnSO₄·H₂O0-0.1份、琼脂12-17份，加15-20倍蒸馏水加热至完全溶解，调pH至6-7，分装试管，加盖橡胶塞塞紧，放入高压灭菌锅在115-125℃灭菌15-30分钟；从高压灭菌锅中取出后，倾斜摆放制成斜面； 

(2)营养琼脂培养基(供枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌的培养、保存用) 

称取营养琼脂，加入20-25倍蒸馏水，加热至完全溶解后分装试管，加盖硅胶塞塞紧，放入高压灭菌锅115-125℃灭菌15-30分钟。从高压灭菌锅中取出后，倾斜摆放制成斜面； 

2、接种 

在超净台以严格的无菌操作方法进行接种，用灭菌的接种环从原菌种中分别挑取少量枯草芽抱杆菌、地衣芽孢杆菌划线接种到营养琼脂培养基斜面；乳酸菌划线接种到MRS琼脂培养基斜面； 

3、培养 

在恒温培养箱内，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌均为在30-37℃培养22-26小时，乳酸菌30-37℃培养22-25小时； 

4、贮存 

取出培养好的菌种，放在3-5℃冷藏箱内保存备用。储存期限为87-92天，待接入初级菌种培养基； 

(二)、初级菌种制作 

1、培养基的配制 

(1)营养肉汤培养基(用于地芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的增菌培养) 

蛋白胨8-12份、牛肉浸膏2-5份、NaCl4-7份，加蒸馏水50-60倍，调pH至6.5-7.5；加热溶解后分装三角瓶，加塞包装，在115-125℃灭菌15-30分钟； 

(2)MRS液体培养基(用于乳酸菌的增菌培养) 

酪蛋白胨8-10份、牛肉膏8-10份、酵母提取物3-6份、乙酸钠3-6份、K₂HPO₄1-3份、柠檬酸二铵1-3份、吐温80 0.5-2份、葡萄糖3-6份、MgSO₄·7H₂O0.1-0.3份、MnSO₄·H₂O0-0.1份、琼脂12-17份，加15-20倍蒸馏水，调pH至6-7，加热溶解后分装三角瓶，加塞包装，在110-120℃灭菌15-30分钟； 

2、接种 

(1)以严格的无菌操作方法进行接种，将枯草芽孢杆菌斜面菌种、地衣芽孢杆菌斜面菌种(即(一)所得)分别按照1环/100ml的比例接种到营养肉汤培养基中，在振荡培养箱内，30-37℃、120r/min振荡培养22-25小时； 

(2)以严格的无菌操作方法进行接种，将乳酸菌斜面菌种(即(一)所得)以1环/100ml的比例接种到MRS液体培养基中，在恒温培养箱内，30-37℃静置培养22-25小时； 

3、贮存 

取出培养好的菌种，放在3-5℃冷藏箱内保存备用，储存期限为6-8天，待接入液体发酵培养基； 

(三)、液态发酵 

1、发酵罐空罐消毒 

在发酵罐投料运转之前首先对发酵罐罐体及物料管路进行蒸汽灭菌、消毒，保持蒸汽压力0.12-0.15MPa状态下维持25-35分钟； 

2、培养基的制备 

(1)地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌培养基制备方法： 

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌液体培养基均为：将酵母浸粉、葡萄糖、MgSO₄·7H₂O按照：8-11∶25-35∶0.5-1.5比例混合，加入45-55倍自来水，进行搅拌至溶解，PH自然，加入一级种子发酵罐灭菌，一般罐内装液量为罐容的65-75％； 

(2)乳酸菌的制备方法： 

乳酸菌液体培养基为：将牛肉浸膏、酵母浸粉、葡萄糖、MgSO4·7H₂O、MnSO₄·H₂O、K₂HPO₄、乙酸钠按照8-11∶4-6∶4-6∶0.1-0.3∶0.01-0.05∶1-3∶4-6的比例混合，加入50-60倍自来水，进行搅拌至溶解，PH自然，加入一级种子发酵罐灭菌。一般罐内装液量为罐容的65-75％； 

3、实消 

投料结束后，开启机械搅拌装置，打开夹套蒸汽阀对罐内培养基进行预热，当罐内培养基温度上升至85-95℃时，将蒸汽直接通入内层培养基进行加热，当罐压升至0.12MPa，料温升至121-123℃时，保温、保压维持30分钟； 

4、接种 

培养基灭菌后冷却至菌种发酵设定温度30-37摄氏度，将无菌室准备好的初级菌种(即(二)所得)，通过火焰接种口接入一级种子发酵罐内，接种前先点燃酒精环对接种口进行灭菌，同时必须保证罐内处于正压状态，接种完后在火焰掩护下迅速盖上接种盖，撤去酒精环，旋紧接种口盖，接种完毕； 

5、发酵培养 

菌种接入一级种子发酵罐后，即开始进行发酵培养，培养过程中罐压一般控制在0.02-0.07MPa。芽孢杆菌发酵培养温度为30-37℃、转速100r/min；通气量：小罐1.5m³/h、中罐8m³/h、大罐60m³/h，搅拌培养20-26小时。乳酸菌发酵培养温度为30-37℃，静置保压厌氧培养22-26小时，得到一级种子液； 

6、移种 

将培养好的一级种子液从一级种子发酵罐中通过压差移种至二级种子罐，移种前先对移种管路蒸汽灭菌15-25分钟，二级种子液培养好后最终移种至发酵罐中进行发酵培养，二级菌种培养和发酵培养条件和时间与一级种子相同； 

(四)、菌种混合 

将上述所得枯草芽抱杆菌、地芽孢杆菌、乳酸菌发酵液(浓度在1-10×10⁸cfu/ml)按乳酸菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌1∶8～12∶8～12的比例移入储液罐中，然后开启搅拌至均匀，同时打开储液罐制冷机对菌液进行制冷，当菌液温度降到0-5℃时，关闭搅拌和制冷剂静置保存。 

6.根据权利要求2、3、5所述的一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂，其特征在于：所述的复合菌营养物的制备过程为： 

(1)原料预处理：将复合菌培养物：豆粕、玉米蛋白粉、花生饼、麸皮、沸石粉进行初步清理，清除大的杂质和霉变物料； 

(2)粉碎：将上述原料分别粉碎到60-80目，粉碎后进行预混合； 

(3)原料预混合：将豆粕5-25％、玉米蛋白粉10-20％、花生饼15-25％、麸皮25-40％、沸石粉15-20％干态原料进行预混合； 

(4)配料：复合菌营养物的原料生产配料前先将混合机气动门关闭，然后启动混合机；根据产品配方比例，将预混合好的干态物料通过配料秤进行计量称重后，并添加磷酸氢钙0-2％(先溶解于水中)，通过提升设备添加到湿料混合机中； 

(5)接种混合：所有原辅料按照配方比例都加入混合机后，启动液体添加泵，将复合菌种液按照固态物料9-15％比例喷洒入混合机，复合菌种液和物料充分混合搅拌5分钟后即可开启混合机气动门进行放料； 

(6)固态发酵：混合机内物料充分混合均匀后，开启气动门将物料放入盛 料车内，人工罐包，打包好的产品运输至固态发酵室内30℃温度下发酵6-8天，之后于50-70摄氏度闪蒸干燥。所得产品中复合菌营养物的浓度为1-3×10⁸cfu/g。 

7.根据权利要求1、2、3、4、5、6所述的一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂，其特征在于：所述的益生菌粉为复合菌营养物50-70％、光合细菌营养物30-50％；所述的复合菌营养物中菌的的浓度为1-3×10⁸cfu/g；光合细菌营养物中菌浓度为1-4×10⁸cfu/g。 

8.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7所述的一种淡水鱼类抗病性饲料添加剂的制备方法，其特征在于其制备方法为： 

(1)：将大黄20-40％、黄芩20-40％、黄连20-40％分别进行除杂、粗粉碎至60-100目； 

(2)：将上述原料分别进行水质，加入6-8倍的水，煎煮三次，每次煎煮0.8-1.2小时，合并煎液，滤过，将滤液离心除渣，于60摄氏度以下减压(0.07MPa)浓缩，浓缩后的比重是1.25-1.30，冷却至18-28度，加入6-10倍75％乙醇，进行搅匀，静置1-3小时，沉淀、滤过，水蒸气蒸馏回收乙醇，将浓缩液喷雾干燥到含水量低于5％； 

(3)：将上述三种中药提取物混合； 

(4)将上述混合后所得物质依次加入益生菌粉7-13％、大蒜素：0.3-0.4％、维生素C0.05-0.15％、食盐15-20％、沸石粉35-45％，混合上述物质，加入黄腐酸25-35％，搅拌均匀后即得成品。 

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