CN104605139A - 枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元、其制备方法及其作为饲料添加剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元，由枯草芽孢杆菌在含有刺五加多糖的培养基中进行培养后加入麸皮吸附烘干后得到。本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元的制备方法。本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌作为动物饲料添加剂的应用。本发明将枯草芽孢杆菌在含有刺五加多糖的培养基中进行培养后加入麸皮吸附烘干后得到，在含有刺五加多糖的培养基中进行培养的过程中，枯草芽孢杆菌的活菌数和芽孢率均较高，在加入麸皮吸附烘干后，活菌数为109CFU/g以上，芽孢率为90%以上，可以作为动物饲料添加剂使用，且具有良好的使用效果。
Description
技术领域
本发明属于微生态饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元、其制备方法及其作为饲料添加剂的应用。
背景技术
从2006年1月1日起，欧盟已全面禁止畜禽使用抗生素类饲料添加剂。抗生素的滥用，更是近几年来我国社会各界关注和热议的焦点问题之一。随着人们生活水平的不断提高，人们对食物安全的要求也越来越高，研究开发抗生素的替代品成为必然趋势。
随着科学的发展与时代的进步，人们逐渐认识到抗生素的大量使用，特别是滥用后会引起如内源性感染或二重感染、耐药菌株的产生，畜禽细胞免疫、体液免疫功能的下降及药物残留等诸多问题。在饲料及添加剂开发领域，高效、低毒且低残留无公害饲料添加剂的研究日益为人们所重视，益生菌、植物多糖提取物、中草药添加剂和酶制剂等绿色饲料添加剂应运而生。
作为抗生素的潜在替代者，益生菌体现出许多优越性，例如可以克服滥用抗生素引起的动物内源性感染或二重感染、动物抗药性的产生和免疫功能下降等种种弊端，且具有显著抗病、促生长、提高饲料利用率、无毒、无不良反应及无残留等特点，是一种天然的生长促进剂。但以单一制剂形式使用益生菌，其功效存在一些缺憾，故畜牧科技工作者们从未懈怠对新型效用更强之饲料添加剂的开发。
研究表明，将植物多糖提取物与有益微生物结合使用，植物多糖提取物为有益微生物提供营养物质，与益生素间有加和效应，从而产生协同作用，共同维持肠道微生态区系的平衡和稳定，提高动物生产性能，提高动物免疫力，改善畜产品品质。潘宝海等研究表明，在益生素中加入天然植物多糖提取物的复合产品枯草芽孢杆菌可以提高益生素的作用效果，取得与抗生素相似的促生长和防止仔猪断奶后腹泻的效果。边连全等(2012)研究枯草芽孢杆菌—菊糖合生元对断奶仔猪生长性能及体液免疫功能的影响，与其他组对比显著提高断奶仔猪生长性能及体液免疫功能。
合生元在动物体上的作用效果要优于益生菌和益生元单独使用的效果，然而，市面上的合生元制品大多是益生菌和益生元的复合添加，即直接将益生菌和益生元混合制备，没有完全发挥合生元产品的潜能，并且得到的产品中益生菌活菌数下降很快，因而无法确保合生元产品的使用效果。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元、其制备方法及其作为饲料添加剂的应用，本发明提供的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元中活菌数和芽孢率均较高，作为动物饲料添加剂具有良好的使用效果。
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元，由枯草芽孢杆菌在含有刺五加多糖的培养基中进行培养后加入麸皮吸附烘干后得到。
优选的，所述合生元的活菌数为109CFU/g以上，芽孢率为90％以上。
本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元的制备方法，包括：
向含有刺五加多糖的培养基中接种活化的枯草芽孢杆菌进行培养，得到菌液；
向所述菌液中加入麸皮进行吸附，烘干后得到枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元。
优选的，所述培养基为LB培养基，所述刺五加多糖的含量为0.4mg/mL～10mg/mL。
优选的，所述枯草芽孢杆菌的接种量为1％～10％；所述培养基的初始pH值为5.5～8.5。
优选的，所述培养为摇床培养，所述摇床的转速为120r/min～170r/min。
优选的，所述培养的温度为30℃～40℃，所述培养的时间为24h～48h。
优选的，所述菌液和麸皮的体积质量比为1L：0.2kg～0.8kg。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元或者上述技术方案所述的方法制备得到的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元作为动物饲料添加剂的应用。
优选的，所述枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元的添加量为0.1wt％～1wt％。
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元，由枯草芽孢杆菌在含有刺五加多糖的培养基中进行培养后加入麸皮吸附烘干后得到。本发明将枯草芽孢杆菌在含有适量刺五加多糖的培养基中进行培养后加入一定量的麸皮进行吸附烘干，得到的合生元产品中枯草芽孢杆菌的活菌数和芽孢率均较高，在加入麸皮烘干后，活菌数为109CFU/g以上，芽孢率为90％以上，可以作为动物饲料添加剂使用，且具有良好的使用效果。本发明提供的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元具有活菌数高、芽孢率高、保留了发酵产物及未利用完的刺五加多糖等优点，可以作为饲料添加剂使用，作为动物饲料添加剂用于饲喂动物时，能够显著提高动物的日增重，降低料重比和死淘率，并能够提高动物的免疫力，对动物的生长性能和机体免疫力有显著改善作用。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌24h的生长曲线；
图2为本发明提供的枯草芽孢杆菌在不同温度和转速下的生长曲线；
图3为枯草芽孢杆菌在0mg/mL刺五加多糖培养基培养36h显微镜下的图片；
图4为枯草芽孢杆菌在1.6mg/mL刺五加多糖培养基培养36h显微镜下的图片。
具体实施方式
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元的制备方法，包括：
向含有刺五加多糖的培养基中接种活化的枯草芽孢杆菌进行培养，得到菌液；
向所述菌液中加入麸皮吸附，烘干后得到枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元。
本发明将枯草芽孢杆菌在含有刺五加多糖的培养基中进行培养后加入麸皮进行吸附烘干，得到的合生元产品中枯草芽孢杆菌的活菌数和芽孢率均较高，在加入麸皮吸附烘干后，活菌数为109CFU/g以上，芽孢率为90％以上，可以作为动物饲料添加剂使用，且具有良好的使用效果。
本发明对所述枯草芽孢杆菌没有特殊限制，可以为枯草芽孢杆菌ACCC11025等本领域技术人员熟知的菌种。本发明按照本领域技术人员熟知的方法将其活化，得到活化后的菌液，即可进行培养。
在本发明中，所述培养基优选为LB培养基；所述培养优选为摇床培养。
本发明根据枯草芽孢杆菌的生长曲线，确定枯草芽孢杆菌的培养最佳培养温度、转速；利用菌液OD值，确定培养基pH值、装液量、接种量；根据活菌数和芽胞产率确定刺五加多糖适宜的添加量、枯草芽孢杆菌合生元的最佳培养时间，最终确定枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元的最佳制备工艺，具体方法如下：
1、绘制枯草芽孢杆菌生长曲线：在大多数细菌适宜的温度37℃和转速120r/min的条件下绘制枯草芽孢杆菌24h的生长曲线。2、培养温度、转速的确定：采用4×2设计，在无菌实验室中，将活化24h后的枯草芽孢杆菌ACCC11025种子液以1％的接种量接种于50mL市售LB培养基中，置于不同温度(30℃、34℃、37℃、40℃)和不同转速(120r/min、170r/min)的摇床中培养。从0h开始第2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24h各取样1次，在600nm分光光度计下测定其菌悬液的吸光度OD值，同时取无菌的LB培养液作对照，每组数据3个重复。以时间(h)为横坐标，OD值为纵坐标，通过绘制生长曲线，筛选适宜的温度转速。
在本发明中，所述培养的温度优选为30℃～40℃，更优选为37℃；所述摇床培养的转速优选为120r/min～170r/min，更优选为170r/min。
2、接种量、装液量、初始pH值的确定：单因素筛选接种量、培养基装液量和初始pH值。接种量分别设为1％、2％、4％、6％、8％；250ml锥形瓶的装液量分别设为50ml、100ml；初始pH值分别设为5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5。在37℃、170r/min摇床上培养24h测菌液的OD值，根据OD值的大小，确定适宜的接种量、装液量、初始pH值。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌的接种量优选为1wt％～10wt％，更优选为1wt％～8wt％，最优选为4wt％；所述装液量优选为50mL/250mL～100mL/250mL，更优选为50mL/250mL；所述培养基的初始pH值优选为5.5～8.5，更优选为7.0。
3、刺五加多糖添加量的确定及培养时间的确定：以LB培养基为基础培养基，加入不同比例的刺五加多糖，含量分别为0，0.4，0.8，1.6，2.4，3.6，4.8，6.4，8，10mg/ml。将每个浓度的培养基分装入3个250ml锥形瓶中，每瓶50ml，115℃灭菌20min后，作为试验液体培养基用。
将制备好的枯草芽孢杆菌菌液按4％接种量接种到含不同比例刺五加多糖的液体培养基中，37℃、170r/min摇床中培养48h，分别在24、36、48h采样，平板计数法测其活菌数，显微镜下观察其芽胞产率。每组数据3个重复，根据活菌数和芽胞产率确定刺五加多糖-枯草芽孢杆菌合生元中刺五加多糖的最适添加量及培养时间。
在本发明中，所述刺五加多糖的含量优选为0.4mg/mL～10mg/mL，更优选为1.6mg/mL；所述培养时间优选为24h～48h，更优选为36h。
在一个最佳实施例中，培养基的pH值为7.0，250ml锥形瓶的装液量为50ml，枯草芽孢杆菌的接种量为4％，培养基中刺五加多糖的含量为1.6mg/ml；枯草芽孢杆菌接种于刺五加多糖液体培养基中在37℃、170r/min恒温摇床中培养36h，得到菌液。
培养后，将得到的菌液与麸皮混合进行吸附，烘干后即可得到枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元。在本发明中，所述菌液和麸皮的体积质量比优选为1L：0.2kg～0.8kg，更优选为1L：0.5kg。将培养好的菌液按2：1(1L菌液/0.5公斤麸皮)的比例加入灭好菌的干燥细麸皮进行吸附，在45℃烘箱中烘干，即为枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元。
得到枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元后，取样用平板菌落计数法测其活菌数，用显微镜观察其芽孢产率，结果表明，所述合生元的活菌数为109CFU/g以上，芽孢率为90％以上。
本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元，由枯草芽孢杆菌在含有刺五加多糖的培养基中进行培养后加入麸皮吸附烘干后得到。
本发明提供的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元按照上文所述的方法制备得到，在培养过程中，刺五加多糖作为营养物质促进枯草芽孢杆菌生长，培养后得到的菌液中不仅包括枯草芽孢杆菌，还包括刺五加多糖，从而具有合生元的功效。最为重要的是，采取本发明提供的方法制备的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元的活菌数和芽孢率均较高。在一个实施例中，所述合生元的活菌数为109CFU/g以上，芽孢率为90％以上。
本发明将枯草芽孢杆菌在含有刺五加多糖的培养基中进行培养后加入麸皮吸附得到，在含有刺五加多糖的培养基中进行培养的过程中，枯草芽孢杆菌的活菌数和芽孢率均较高，在加入麸皮吸附烘干后，活菌数为109CFU/g以上，芽孢率为90％以上，可以作为动物饲料添加剂使用，且具有良好的使用效果。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元或者上述技术方案所述的方法制备得到的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元作为动物饲料添加剂的应用。
优选的，所述枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元的添加量为0.1wt％～1wt％，优选为0.2wt％～0.6wt％，更优选为0.4wt％。
具体而言，本发明提供的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元可以添加到蛋雏鸡基础饲料中，例如添加到玉米-豆粕型日粮中。
本发明提供的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元具有活菌数高、芽孢率高、保留了发酵产物及未利用完的刺五加多糖等优点，作为动物饲料添加剂用于饲喂动物时，能够显著提高动物的日增重，降低料重比和死淘率，并能够提高动物的免疫力，对动物的生长性能和机体免疫力有显著改善作用。
以下结合实施例对本发明提供的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元、其制备方法及动物饲料进行详细说明。
以下各实施例中，枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ACCC11025。
实施例1生长曲线绘制及培养温度、转速的确定
在无菌实验室中，按37℃、120r/min的条件下绘制枯草芽孢杆菌24h的生长曲线，结果参见图1，图1为枯草芽孢杆菌24h的生长曲线；
根据上述生长曲线，按1％接种量将活化24h后的枯草芽孢杆菌液接种于装50mL市售LB培养基的250mL锥形瓶中，分别于30℃、170r/min，34℃、170r/min，37℃、170r/min，40℃、170r/min、30℃、120r/min，34℃、120r/min，37℃、120r/min和40℃、120r/min的条件下在恒温摇床中培养，隔2h或1h取样1次，连续培养24h，于600nm下测定各样品的吸光度，以时间(h)为横坐标、吸光度(OD值)为纵坐标绘制生长曲线，结果参见图2，图2为本发明提供的枯草芽孢杆菌在不同温度和转速下的生长曲线，由图2可见，该菌株在37℃和170r/min条件下生长良好，优于在其它温度、转速组合下的生长情况，因此培养该菌株的最佳温度为37℃，最佳转速为170r/min。
实施例2接种量、装液量、初始pH值的确定
本发明采用单因素筛选接种量、装液量和初始pH值，具体方法如下：
在无菌实验室中，分别按1％、2％、4％、6％和8％的接种量将活化后的枯草芽孢杆菌液接种于装50mL市售LB培养基的250mL锥形瓶中，每个接种量3个重复，置37℃、170r/min恒温摇床中培养24h，600nm下测菌液的OD值(用无菌培养基调零)，根据OD值的大小，确定适宜的接种量，结果参见表1，表1为枯草芽孢杆菌在不同接种量下生长24h的OD值；
表1 枯草芽孢杆菌在不同接种量下生长24h的OD值
由表1可知，随着接种量的提高24h菌液的OD值逐渐增大，接种量为4％的OD值显著高于2％，但与6％的OD值差异不显著，再从节省接种量方面考虑，确定4％为适宜的接种量。
在无菌实验室中，按1％接菌量将活化后的枯草芽孢杆菌液接种于250mL锥形瓶，分别装有50mL和100mL的市售LB培养基中，两种装液量各3个重复，置37℃、170r/min恒温摇床中培养24h，600nm下测菌液的OD值(用无菌培养基调零)，根据OD值的大小，确定适宜的装液量，结果参见表2，表2为枯草芽孢杆菌在不同装液量中生长24h的OD值。
表2 枯草芽孢杆菌在不同装液量中生长24h的OD值
由表2可知，装液量为50mL时菌液的OD值明显高于100mL时菌液的OD值，因此确定适宜的装液量为50mL。
将培养基在灭菌前用1mol.L-1的NaOH或HCl调节pH值分别为5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5，各培养基按50mL的装液量各分装入3个250mL的锥形瓶中，115℃灭菌20min。在无菌实验室中，按1％接菌量将活化后的枯草芽孢杆菌液接种于各250mL锥形瓶中在37℃、170r/min恒温摇床上培养24h，600nm下测菌液的OD值(用无菌培养基调零)，根据OD值的大小，确定适宜初始pH值，结果见表3，表3为枯草芽孢杆菌在不同初始pH值的培养基中生长24h的OD值。
表3 枯草芽孢杆菌在不同初始pH的培养基中生长24h的OD值
由表3可知，枯草芽孢杆菌在培养基初始pH值为5.5～7.5时，随着pH值的增大24h菌液的OD值逐渐增大，pH7.0以后随着pH值的增大，菌液的OD值反而降低，因此确定适宜的初始pH值为7.0。
实施例3刺五加多糖最适添加量和合生元最适培养时间的确定
以市售LB培养基为基础，加入不同比例的刺五加多糖，使刺五加多糖的浓度分别为：0，0.4，0.8，1.6，2.4，3.6，4.8，6.4，8，10mg/mL。将每个浓度的培养基分装入250mL锥形瓶中，每瓶50mL，115℃灭菌20min后，作为试验液体培养基用；将活化后的枯草芽孢杆菌菌液以容量比4％的接种量分别接种于上述含不同浓度的刺五加多糖液体培养基中，置37℃、170r.min-1培养箱中振荡培养，分别在24h，36h，48h采样，平板计数法测活菌数，显微镜下观察芽孢产率，结果见表4、图3和图4，表4为枯草芽孢杆菌在不同刺五加多糖浓度和不同培养时间的活菌数，图3为枯草芽孢杆菌在0mg/mL刺五加多糖培养基培养36h显微镜下的图片，图4为枯草芽孢杆菌在1.6mg/mL刺五加多糖培养基培养36h显微镜下的图片。
表4 枯草芽孢杆菌在不同刺五加多糖浓度和不同培养时间的活菌数
| 浓度mg/mL | 24h(CFU/mL) | 36h(CFU/mL) | 48h(CFU/mL) |
| 0.0 | 1×107 | 4.8×108 | 1.4×108 |
| 0.4 | 7.5×107 | 6.8×108 | 1.5×108 |
| 0.8 | 4.8×108 | 8.5×108 | 1.6×108 |
| 1.6 | 8.3×108 | 3.3×109 | 2.1×108 |
| 2.4 | 8.0×108 | 2.5×109 | 1.8×108 |
| 3.6 | 7.5×108 | 2.1×109 | 1.6×108 |
| 4.8 | 4.8×108 | 2.1×109 | 1.4×108 |
| 6.4 | 4.2×108 | 2.0×109 | 1.3×108 |
| 8 | 3.5×108 | 1.7×109 | 1.1×108 |
| 10 | 2.6×108 | 1.5×109 | 1.0×108 |
由表4可知，低浓度刺五加多糖促进枯草芽孢杆菌生长，高浓度抑制其生长，刺五加多糖浓度为1.6mg/mL时，生长36h菌液中枯草芽孢杆菌的活菌数最高，活菌数为3.3×109CFU/mL。
由图3和图4可知，枯草芽孢杆菌在0mg/ml的刺五加多糖培养基中培养36h时几乎无芽孢，在1.6mg/ml刺五加多糖培养基中培养36h时芽孢率在90％以上。
实施例4
向pH值为7.0的LB培养基中加入刺五加多糖，使刺五加多糖的含量为1.6mg/mL；
将活化后的枯草芽孢杆菌菌液按4％的接种量接种于上述含刺五加多糖的液体培养基中，培养基分装入250mL锥形瓶中，每瓶50mL，置37℃、170r/min的恒温摇床中培养，培养36h后取出；
把培养好的菌液按1L菌液：0.5kg麸皮的比例用干燥细麸皮吸附，在45℃烘箱中烘干即得枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元。
利用平板菌落计数法对枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元活菌数进行检测，其活菌数为5×109CFU/mL。
实施例5饲养试验
一、材料和方法
(1)试验动物及设计
采用完全随机分组试验设计，选用700只1日龄海兰褐蛋雏鸡，平均体重为43±1g，随机分为7个组，每组4个重复，每个重复25只鸡。各组雏鸡分别饲喂基础日粮(对照组、I组)、基础日粮+200g/t金霉素(II组)、基础日粮+0.1％枯草芽孢杆菌产品(购于沧州新大地生物科技有限公司)(III组)、基础日粮+0.1％实施例4制备的合生元(IV组)、基础日粮+0.2％实施例4制备的合生元(V组)、基础日粮+0.4％实施例4制备的合生元(VI组)、基础日粮+0.6％实施例4制备的合生元(VII组)，试验期56天。
(2)试验饲粮
试验基础日粮为玉米-豆粕型日粮，其组成及营养水平见表5，符合蛋雏鸡的饲养标准。
表5 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)
其中，1)预混料为每千克饲粮提供：VA4800万IU，VD31200万IU，VE 20IU，VK1mg，VB12mg，VB24mg，VB63g，VB120.01mg，生物素biotin 0.15mg，叶酸folic acid 0.45mg，泛酸pantothenic acid 10mg，烟酸nicotinic acid 20mg，抗氧化剂antioxidant 200mg；铜(as copper sulfate)8mg，铁(as ferrous sulfate)55mg，锌(as zinc sulfate)60mg，锰(as manganese sulfate)60mg，硒(assodium selenite)0.15mg，碘(as potassium iodide)0.35mg。
2)实测值were measured values。
(3)生长性能测定
分别在每周末，以重复为单位空腹称鸡体重，并准确称量、记录各阶段供料量、剩料量及损失量，计算平均日增重、平均日采食量及料重比。如有死鸡、淘汰鸡，将其体重计算在内。
(二)实验结果与分析
实验结果参见表6，表6为枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元对蛋雏鸡生长性能的影响。
表6 枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元对蛋雏鸡生长性能的影响
表6中，同行数值肩注不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。
由表6可知，蛋雏鸡饲粮中添加0.4％枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元可显著提高雏鸡28日龄的体重，提高率为8.51％(P<0.05)；1-28d的日增重，提高率为10.02％(P<0.05)；降低1-28d和28-56d料重比，降低率分别为6.98％和4.10％(P<0.05)，对蛋雏鸡生长性能有显著的改善作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元，其特征在于，由枯草芽孢杆菌在含有刺五加多糖的培养基中进行培养后加入麸皮吸附烘干后得到。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元，其特征在于，所述合生元的活菌数为109CFU/g以上，芽孢率为90%以上。
3.一种枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元的制备方法，包括：
向含有刺五加多糖的培养基中接种活化的枯草芽孢杆菌进行培养，得到菌液；
向所述菌液中加入麸皮进行吸附，烘干后得到枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养基为LB培养基，所述刺五加多糖的含量为0.4mg/mL~10mg/mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的接种量为1%~10%；所述培养基的初始pH值为5.5~8.5。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养为摇床培养，所述摇床的转速为120r/min~170r/min。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述培养的温度为30℃~40℃，所述培养的时间为24h~48h。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述菌液和麸皮的体积质量比为1L：0.2kg~0.8kg。
9.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元或者按照权利要求3~8任意一项所述的方法制备得到的枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元作为动物饲料添加剂的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌-刺五加多糖合生元的添加量为0.1wt%~1wt%。
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Citations (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1296765A (zh) * | 2000-12-04 | 2001-05-30 | 鞍山天胜旺科技开发有限公司 | 生物饲料添加剂及其制备方法 |
| CN1868302A (zh) * | 2005-05-23 | 2006-11-29 | 河南省金鑫饲料工业有限公司 | 鸡中草药饲料添加剂 |
| CN101244088A (zh) * | 2007-02-13 | 2008-08-20 | 丁之铨 | 一种肉鸡专用的抗病微生物制剂 |
| CN101530161A (zh) * | 2008-03-10 | 2009-09-16 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一种新型饲料添加剂及其制备方法 |
| CN101580799A (zh) * | 2008-05-14 | 2009-11-18 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一种复合微生态制剂及其应用 |
| CN101971920A (zh) * | 2010-09-28 | 2011-02-16 | 北京市农林科学院 | 猪源罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂及其制备方法 |
| CN101978849A (zh) * | 2008-05-14 | 2011-02-23 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一种复合微生态制剂及其应用 |
| CN102154185A (zh) * | 2011-03-31 | 2011-08-17 | 黑龙江大学 | 一株产咖啡酸的刺五加内生细菌 |
| CN102232479A (zh) * | 2010-05-06 | 2011-11-09 | 湖南大北农农业科技有限公司 | 一种芽孢杆菌饲料添加剂的制备工艺 |
| CN102352314A (zh) * | 2011-08-03 | 2012-02-15 | 湖南农业大学 | 复合芽孢杆菌棉粕发酵剂及其制备方法 |
| CN102433283A (zh) * | 2011-12-19 | 2012-05-02 | 湖南省微生物研究所 | 一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺及其制备的菌剂和应用 |
| CN102669432A (zh) * | 2012-06-01 | 2012-09-19 | 东北农业大学 | 一种鹅用复合益生菌制剂及其制备方法 |
| CN102696879A (zh) * | 2012-03-14 | 2012-10-03 | 沈阳农业大学 | 黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备参数的优选方法、制备工艺及应用 |
| CN103283938A (zh) * | 2012-10-23 | 2013-09-11 | 广州格拉姆生物科技有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备方法 |
| CN103349161A (zh) * | 2013-07-29 | 2013-10-16 | 雨润慕德生物科技（连云港）有限公司 | 一种刺五加畜禽微生物添加剂及其制备方法 |
| CN103461670A (zh) * | 2013-01-22 | 2013-12-25 | 武汉科诺生物科技股份有限公司 | 一种复合型合生元制剂及其应用 |
| CN103550625A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-02-05 | 河南亚卫动物药业有限公司 | 一种治疗蛋鸡产蛋量下降的发酵中药及其制备方法 |
| CN103844128A (zh) * | 2012-12-06 | 2014-06-11 | 长海牧海养殖有限公司 | 鱼用饲料添加剂 |
| CN103933158A (zh) * | 2014-04-22 | 2014-07-23 | 湖州天健兽药有限公司 | 一种提高奶牛产奶量的组合物 |
-
2015
- 2015-01-08 CN CN201510008920.2A patent/CN104605139A/zh active Pending
Patent Citations (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1296765A (zh) * | 2000-12-04 | 2001-05-30 | 鞍山天胜旺科技开发有限公司 | 生物饲料添加剂及其制备方法 |
| CN1868302A (zh) * | 2005-05-23 | 2006-11-29 | 河南省金鑫饲料工业有限公司 | 鸡中草药饲料添加剂 |
| CN101244088A (zh) * | 2007-02-13 | 2008-08-20 | 丁之铨 | 一种肉鸡专用的抗病微生物制剂 |
| CN101530161A (zh) * | 2008-03-10 | 2009-09-16 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一种新型饲料添加剂及其制备方法 |
| CN101978849A (zh) * | 2008-05-14 | 2011-02-23 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一种复合微生态制剂及其应用 |
| CN101580799A (zh) * | 2008-05-14 | 2009-11-18 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 一种复合微生态制剂及其应用 |
| CN102232479A (zh) * | 2010-05-06 | 2011-11-09 | 湖南大北农农业科技有限公司 | 一种芽孢杆菌饲料添加剂的制备工艺 |
| CN101971920A (zh) * | 2010-09-28 | 2011-02-16 | 北京市农林科学院 | 猪源罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂及其制备方法 |
| CN102154185A (zh) * | 2011-03-31 | 2011-08-17 | 黑龙江大学 | 一株产咖啡酸的刺五加内生细菌 |
| CN102352314A (zh) * | 2011-08-03 | 2012-02-15 | 湖南农业大学 | 复合芽孢杆菌棉粕发酵剂及其制备方法 |
| CN102433283A (zh) * | 2011-12-19 | 2012-05-02 | 湖南省微生物研究所 | 一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺及其制备的菌剂和应用 |
| CN102696879A (zh) * | 2012-03-14 | 2012-10-03 | 沈阳农业大学 | 黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备参数的优选方法、制备工艺及应用 |
| CN102669432A (zh) * | 2012-06-01 | 2012-09-19 | 东北农业大学 | 一种鹅用复合益生菌制剂及其制备方法 |
| CN103283938A (zh) * | 2012-10-23 | 2013-09-11 | 广州格拉姆生物科技有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备方法 |
| CN103844128A (zh) * | 2012-12-06 | 2014-06-11 | 长海牧海养殖有限公司 | 鱼用饲料添加剂 |
| CN103461670A (zh) * | 2013-01-22 | 2013-12-25 | 武汉科诺生物科技股份有限公司 | 一种复合型合生元制剂及其应用 |
| CN103349161A (zh) * | 2013-07-29 | 2013-10-16 | 雨润慕德生物科技（连云港）有限公司 | 一种刺五加畜禽微生物添加剂及其制备方法 |
| CN103550625A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-02-05 | 河南亚卫动物药业有限公司 | 一种治疗蛋鸡产蛋量下降的发酵中药及其制备方法 |
| CN103933158A (zh) * | 2014-04-22 | 2014-07-23 | 湖州天健兽药有限公司 | 一种提高奶牛产奶量的组合物 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 杨侃侃等: "刺五加多糖的生理功能及在动物生产上的作用", 《中国畜牧兽医》 * |
| 边连全等: "枯草芽孢杆菌-菊糖合生元对断奶仔猪生长性能及体液免疫功能的影响", 《动物营养学报》 * |
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