CN102696879A

CN102696879A - 黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备参数的优选方法、制备工艺及应用

Info

Publication number: CN102696879A
Application number: CN2012100665608A
Authority: CN
Inventors: 陈静; 朴钟云; 刘显军; 边连全; 文宇婷; 杜欣
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2012-03-14
Filing date: 2012-03-14
Publication date: 2012-10-03

Abstract

一种黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备参数的优选方法、制备工艺及应用，将活化后的枯草芽孢杆菌ACCC11025菌液以容量比1%接种于含1~2mg?mL^-1黄芪多糖的液体培养基中，分别置37℃、120r?min^-1培养箱中振荡培养，培养4.5~6h。该发明的黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元可以显著提高动物的日增重，降低料重比和腹泻率，对动物的生长性能有显著改善作用。

Description

黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备参数的优选方法、制备工艺及应用

技术领域

本发明属于一种动物饲用微生态调节剂，具体地说是一种黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备参数的优选方法、制备工艺及应用。

背景技术

从1950年美国食品与药物管理局首次批准抗生素作为饲料添加剂以来，抗生素在提高动物的生产效率发挥了巨大作用。但抗生素在动物产品中的残留和导致病原菌耐药性等问题日益引起人们的重视。世界各国正逐步限制或禁止在饲料中使用抗生素。1999年瑞士禁止使用饲用抗生素；2006年欧盟全面禁止抗生素作为饲料添加剂；2001年9月4日我国正式规定蛋鸡饲料中不得使用任何抗生素。

抗生素作为饲料添加剂的另一缺陷是它不仅杀死动物肠道内的有害菌，也杀死了有益菌，破坏了动物肠道内微生物平衡，从而导致动物发生腹泻等疾病。因此，人们开始将目光转向微生态制剂。微生态制剂是在微生态学理论的指导下，调整生态失调，保持动物肠道微生态平衡，提高宿主健康水平或增进健康状态的生理性活菌制品及其代谢产物以及促进这些生理菌群生长繁殖的生物制品。微生态制剂包括益生菌、益生元和合生元。

益生菌是指含活菌或菌体组分及代谢产物的生物制品，它经口或其它粘膜进入机体，可在粘膜表面处改善微生物区系的屏障功能或刺激特异或非特异性免疫。它作为一种无毒、无残留、无抗药性的抗生素有效替代品而得到广泛应用。目前常用的益生菌主要有乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌和真菌四大类。其中芽孢杆菌因其抗逆性强、耐高温高压、易贮存等优良特性，且具有调节肠道菌群平衡、增强动物免疫力、提高生产性能等诸多功能，被认为是最理想的微生物添加剂。但是随着研究的深入，人们发现益生菌在产品应用方面存在较大困难，如活菌制剂稳定性差、产品种类单一、应用范围有限、效果不稳定等。

益生元是指在胃肠道的上部不能被水解也不能被吸收、能选择性地刺激肠内有益菌（如芽孢杆菌等）生长繁殖并激活其代谢功能、能促进肠内健康优势菌群的构成并提高其数量，并能增强宿主机体健康的物质。天然植物成分低聚糖（如黄芪多糖）、微藻及天然植物等都是具有益生元特性的物质。根据益生菌和益生元的特性，一些科学家也进而考虑把两者结合起来，这一想法最终促成了合生元的诞生。

合生元是把指益生菌与益生元合并使用的制剂，具有同时发挥益生菌与益生元双重作用的特点。丁轲等报道用中草药和益生菌合生元对大肠杆菌和沙门氏菌具有很好的抑制作用。李亚杰等也用黄芪多糖与益生菌制成合生元，显著提高了肉鸡的日增重，增强了肉鸡的免疫功能。合生元既可发挥益生菌的生理性细菌活性，又可选择性增加这种菌的数量使益生作用更持久，是一种很有潜力的微生态调节剂。

合生元在动物体上的作用效果要优于益生菌和益生元，然而，市面上的由合生元制品多是益生菌和益生元的复合添加，在制备工艺中没有考虑优选益生元的浓度、益生菌的培养温度、培养时间以及合生元的活菌数，因而不能确保合生元产品的使用效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备参数的优选方法、制备工艺及应用，通过体外培养试验，科学选取黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备参数，实现制备工艺优化，确保合生元产品的使用效果。

本发明的原理：根据枯草芽孢杆菌的生长曲线，确定枯草芽孢杆菌的培养最佳温度。利用菌液OD值，确定适宜的黄芪多糖添加量。再根据枯草芽孢杆菌生长代时G，确定合生元的最佳培养时间，最终确定黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元的最佳制备工艺。

本发明提供的黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备参数的优选方法如下：

1、生长曲线绘制和培养温度的确定：将活化后的枯草芽孢杆菌ACCC11025菌液以 1%的接种量接种于营养肉汤培养基中，分别于32 ℃、120 r•min^-1和 37 ℃和120 r•min^-1的条件下振荡培养，隔0.5 h取样1次，连续培养12h，于540 nm下测定其吸光度，以时间为横坐标、吸光度为纵坐标绘制曲线，根据生长曲线确定培养最佳温度；

2、黄芪多糖最适添加量的确定：在营养肉汤培养基里加入不同比例的黄芪多糖，使黄芪多糖的浓度分别为：0 mg•mL^-1、1 mg•mL^-1、1.5 mg•mL^-1、2 mg•mL^-1，将每个浓度的培养基分装入 3 个容器瓶中，每个容器瓶中的液体相等，115 ℃灭菌 15 min 后作为实验用培养基；

将活化后的枯草芽孢杆菌菌液以容量比 1%的接种量分别加入上述含不同浓度的黄芪多糖液体培养基中，置37 ℃、120 r•min^-1培养箱中振荡培养，分别在4，4.5，5，5.5，6，6.5，7 h时采样，根据540 nm下测定吸光度（以黄芪多糖浓度为0 mg•mL^-1培养基组为空白对照管调零），以确定黄芪多糖适宜添加量；

3、黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元最适培养时间的确定：将黄芪多糖的最适添加量确定好后，根据测量的最适添加浓度组的OD值，利用公式计算代时G，从而根据枯草芽孢杆菌在每个时间段的代时以确定合生元的最适培养时间；

G =(t2-t1)/3.322(lgx2-lgx1)

式中：t1、t2分别代表培养时间，x1、x2分别代表不同时间合生元的OD值；

4、黄芪多糖-枯草芽孢杆菌菌液活菌数检测：利用平板菌落计数法对黄芪多糖-枯草芽孢杆菌菌液活菌数进行检测。

本发明提供的黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备工艺如下：

1、以营养肉汤培养基，加入黄芪多糖，使黄芪多糖的含量为1~2 mg•mL^-1 ，最佳为1.5 mg•mL^-1；

2、将活化后的枯草芽孢杆菌菌液以容量比 1%的接种量接种于含量为1~2mg•mL^-1的黄芪多糖液体培养基中，置37℃、120 r•min^-1培养箱中振荡培养，4.5~6h后取出，最适培养时间为5.5 h，即得深黄色的黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元产品。

本发明提供的黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元的应用：每天灌喂一次，灌喂量10~16 mL。

本发明的积极效果：

1、科学选取黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备参数，实现制备工艺优化，确保合生元产品的使用效果;

2、用量小，黄芪多糖最佳添加浓度为1.5mg·mL^-1，枯草芽孢杆菌菌量为1.25×10⁸ mL^-1，本发明制备的微生态制剂的原料用量不会对动物本身产生毒副作用，同时也不会增加生产成本；

3、本发明的黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元菌液中活菌数为10⁹ CFU•mL^-1以上，活菌数较高。

附图说明

图1 是枯草芽孢杆菌（ACCC11025）32 ℃与37 ℃的生长曲线示意图。

图2是不同时间段合生元菌液中枯草芽孢杆菌的代时示意图。

具体实施方式

（1）生长曲线绘制及培养温度的确定

在无菌实验室中，按1 %容量比例的接菌量将活化后的枯草芽孢杆菌液接种于装有50 mL营养肉汤培养基（市场销售）的100 mL锥形瓶中，分别于32 ℃、120 r•min^-1和 37 ℃和120 r•min^-1的条件下振荡培养，隔0.5 h取样1次，连续培养12h，于540 nm下测定其吸光度，以时间(h)为横坐标、吸光度(OD值)为纵坐标绘制曲线（见图1），根据生长曲线确定枯草芽孢杆菌培养最佳温度。由图1可见，该菌株在37 ℃和32 ℃都能良好的生长，但 37 ℃条件下的枯草芽孢杆菌的生长情况要优于32 ℃。因此培养该菌株的最佳温度为37 ℃。

本发明所述的枯草芽孢杆菌活化后用平板菌落计数法计算细菌数，确定含菌量为1.25×10⁸ CFU•mL^-1。

（2）黄芪多糖最适添加量的确定

考察在不同黄芪多糖稀释浓度以及不同的培养时间下枯草芽孢杆菌ACCC11025 的生长情况。以营养肉汤培养基，加入不同比例的黄芪多糖，使黄芪多糖的浓度分别为：0 mg•mL^-1，1 mg•mL^-1，1.5 mg•mL^-1，2 mg•mL^-1。将每个浓度的培养基分装入 3 个100 mL锥形瓶中，每瓶50mL，115 ℃灭菌 15 min 后作为实验用培养基。

将活化后的枯草芽孢杆菌菌液以容量比例 1%的接种量分别加入上述含不同浓度的黄芪多糖液体培养基中，置 37 ℃、120 r•min^-1培养箱中振荡培养，分别在4h，4.5h，5h，5.5h，6h，6.5h，7 h采样，于540 nm下测定其吸光度（以黄芪多糖浓度为0 mg•mL^-1培养基组为空白对照组）（见表1）。

由表1可见，随着培养时间的延长，菌液OD值呈上升趋势，即枯草芽孢杆菌ACCC11025在不断生长。添加浓度为1.5 mg•mL^-1黄芪多糖的培养基中枯草芽孢杆菌ACCC11025菌液浓度达到最高，并且显著的高于1 mg•mL^-1黄芪多糖的培养基和2 mg•mL^-1黄芪多糖的培养基组（P<0.05）。试验说明，适量的黄芪多糖能促进枯草芽孢杆菌的生长，过量的黄芪多糖能抑制其生长。黄芪多糖的最适添加量为1.5 mg•mL^-1。

同列数值肩注不同字母表示差异显著（P<0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P>0.05）。

（3）黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元最适培养时间的确定

将黄芪多糖的最适添加量确定好后，根据测量的最适添加浓度组的OD值，利用公式计算代时G，从而根据枯草芽孢杆菌在每个时间段的代时以确定他们的最适培养时间（见表2，图2）；

G =(t2-t1)/3.322(lgx2-lgx1)

式中：t1、t2分别代表培养时间，x1、x2分别代表不同时间合生元的OD值。

由表2和图2可见，添加1.5 mg•mL^-1黄芪多糖组的枯草芽孢杆菌在5.5h时繁殖速度最快，即5.5h所需的代时最短。可见，添加1.5 mg•mL^-1黄芪多糖可促进枯草芽孢杆菌ACCC11025生长，最适培养时间为5.5 h。

表2 不同培养时间对合生元菌液中枯草芽孢杆菌生长的影响

时间(h)	OD值 OD	代时（h）
			4	0.77±0.01	-
4.5	0.85±0.04	3.36
			5	0.90±0.03	6.48
5.5	1.19±0.03	1.22
			6	1.23±0.03	11.42
6.5	1.21±0.03	10.80
			7	1.31±0.02	7.01

（4）黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元活菌数检测

利用公知的平板菌落计数法对黄芪多糖-枯草芽孢杆菌菌液活菌数进行检测，黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元菌液中活菌数为10⁹ CFU•mL^-1。

黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备工艺如下：

2、将活化后的枯草芽孢杆菌菌液以容量比1%的接种量接种于含量为1.5 mg•mL^-1的黄芪多糖液体培养基中，置37℃、120 r•min^-1培养箱中振荡培养，4.5~6h后取出，最适培养时间为5.5 h，即得深黄色的黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元产品。

黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元的应用：每天灌喂一次，10~16 mL。

本发明进行如下饲养试验：

一、材料和方法

（1）试验动物及设计

采用完全随机分组试验设计，选用72头21日龄断奶的三元杂交猪（杜洛克猪×长白猪×大白猪）；平均体重为4.30 kg±0.23kg，随机分为4个组，每组3个重复，每个重复6头猪。各组试猪分别灌喂营养肉汤培养基（对照组）、营养肉汤培养基+1.5 mg•mL^-1黄芪多糖（黄芪多糖组）、营养肉汤培养基+1.25×10⁸ CFU•mL^-1枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌组）、营养肉汤培养基+1.5 mg•mL^-1黄芪多糖+1.25×10⁸ CFU•mL^-1枯草芽孢杆菌（合生元组），各组每天灌喂一次，灌喂量为16 mL•d^-1。试验期为14 d。

（2）试验饲粮

试验基础日粮为玉米-豆粕型日粮，营养需要量符合NRC（1998）仔猪饲养标准。

（3）生长性能测定

试验期间每天观察仔猪精神状况、腹泻情况以及持续时间。试验开始前及试验最后1天的20:00停止喂料，照常供水，于次日早上对试猪逐只称重；试验结束后，以重复（栏）为单位称剩料量，记录耗料量，计算试验期的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）、料重比（F/G）及腹泻率。

腹泻率(%)=（每天腹泻头数×腹泻天数）/（试验猪头数×试验天数）×100。

（二）实验结果与分析（见表3）

同行数值肩注不同字母表示差异显著（P<0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P>0.05）。

断奶仔猪应用试验表明；每天饲喂16 mL的黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元可提高显著断奶仔猪日增重，降低料重比和腹泻率，对仔猪生长性能有改善作用。

Claims

1.一种黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备参数的优选方法，其特征是：

a、生长曲线及培养温度的确定：将活化后的枯草芽孢杆菌ACCC11025菌液以容量比1%的接种量接种于营养肉汤培养基中，分别于32 ℃、120 r•min^-1和 37 ℃和120 r•min^-1的条件下培养，隔0.5 h取样1次，连续培养12h，于540 nm下测定其吸光度，以时间为横坐标、吸光度为纵坐标绘制生长曲线，确定培养温度；

b、黄芪多糖最适添加量的确定：以营养肉汤培养基，加入不同比例的黄芪多糖，使黄芪多糖的浓度分别为：0 mg•mL^-1、1 mg•mL^-1、1.5 mg•mL^-1、2 mg•mL^-1，将每个浓度的培养基分装入 3 个容器瓶中，每个容器瓶中的液体相等，115 ℃灭菌15 min 后作为实验用培养基；

将活化后的枯草芽孢杆菌菌液以容量比1%的接种量分别加入上述含不同浓度的黄芪多糖液体培养基中，置 37 ℃、120 r•min^-1培养箱中振荡培养，分别在4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7 h时采样，于540 nm下测定其吸光度，以确定黄芪多糖最适添加量；

c、黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元最适培养时间的确定：将黄芪多糖的最适添加量确定好后，根据测量的最适添加浓度组的OD值，利用公式计算代时G，从而根据枯草芽孢杆菌在每个时间段的代时以确定他们的最适培养时间；

G =(t2-t1)/3.322(lgx2-lgx1)

d、黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元菌液活菌数检测：利用平板菌落计数法对黄芪多糖-枯草芽孢杆菌菌液活菌数进行检测。

2.一种如权利要求1所述黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备参数的优选方法的制备工艺如下：

a、以营养肉汤培养基，加入黄芪多糖，使黄芪多糖的含量为1~2 mg•mL^-1；

b、将活化后的枯草芽孢杆菌菌液以容量比 1%的接种量接种于含量为1~2 mg•mL^-1的黄芪多糖液体培养基中，置37℃、120 r•min^-1培养箱中振荡培养，4.5~6h后取出，即得深黄色的黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元产品。

3.根据权利要求2所述的黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备参数的优选方法的制备工艺，其特征是：营养肉汤培养基中的黄芪多糖的最佳含量为1.5 mg•mL^-1；枯草芽孢杆菌接种于黄芪多糖液体培养基中在37 ℃、120 r•min^-1培养箱中振荡培养，最适培养时间为5.5 h。

4.一种如权利要求2所述黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元制备工艺的应用：每天灌喂一次，灌喂量10~16 mL。