一种新型饲料添加剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物饲料添加剂领域,涉及一种含有溶菌酶、益生菌菌粉、载体的新型饲料添加剂及其制备方法。
背景技术
近年来,畜禽疾病的发生日趋上升,由疾病造成的死淘率逐年增加,给畜牧业造成重大经济损失。目前,对动物疾病的预防和治疗药物基本仍采用抗生素,但由于长期、大量使用抗生素,耐药性、菌群失调、免疫力下降、疾病复发率高、药物残留等种种弊端日益严重,同时也严重危害动物机体及人类健康。当前,世界各国对抗生素各自采取了禁用或限制使用的措施,如:欧盟从2006年全面禁止使用抗生素;世界卫生组织(WTO)提出了“在食用动物中减少抗生素使用的全球原则”;我国已启动“饲料安全工程”,并禁用了一批毒性和残留较大的药物。在此形式下,改变养殖观念、预防重于治疗,并开发应用无毒、无药残的新型绿色饲料添加剂是必然趋势。其中,酶制剂、微生态制剂等均是目前常用和研究较多的绿色、安全的饲料添加剂。
溶菌酶(lysozyme)是一种专门作用于微生物细胞壁肽聚糖的水解酶。它能切断肽聚糖中N—乙酰葡萄糖胺和N—乙酰胞壁酸之间的β—1,4糖苷键之间的联结,破坏肽聚糖支架,在内部渗透压的作用下使细胞胀裂开,引起细菌裂解死亡。由于G+细菌的细胞壁几乎全部由肽聚糖组成,而G-细菌只有内壁层为肽聚糖,因此溶菌酶只能破坏G+细菌的细胞壁,而对G-细菌作用不大。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖,故溶菌酶对人和动物的细胞无破坏作用。另外,溶解酶作为一种天然蛋白质,能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收,同时作为动物和微生物自身的免疫因子,具有抗菌消炎、抗病毒、止血、镇痛及加快组织修复、减少腹泻、增强机体非特异性免疫力、促进双歧杆菌增殖等多种有益作用,目前已被广泛应用于医疗、食品工业、化妆品领域、体育领域和生物工程中。相比之下,溶菌酶在饲料添加剂方面的应用研究还很少,而且,溶菌酶本身具有抗菌谱窄、性能不稳定的缺点,这也是限制其在饲料上广泛应用的原因之一。
专利CN1666635公布了一种含有溶菌酶的组合物及用途,该组合物含有溶菌酶、协同增效物、包衣材料和载体,该组合物经特殊的微囊工艺处理,并配以甘氨酸等其它组分制成产品,其工艺繁琐、成本高、规模生产难度大,且其制备方法不适合产业化应用。专利US6221404B1公布了一种能够增强益生菌—蜡状芽孢杆菌Bacilluscereus CIP5832饲喂效果的方法,即同时添加益生菌和溶菌酶或其盐,能够显著提高益生菌的饲喂效果,但其局限性是益生菌菌种单一。
发明内容
本发明首次将溶菌酶加入到益生菌制剂中并制成新型饲料添加剂,目的在于提供一种制备工艺简单、可产业化应用的、多种益生菌复合并含有溶菌酶的新型绿色饲料添加剂。此添加剂兼有并增强了微生态制剂和溶菌酶的优点,具有治疗、预防、保健、增强免疫力的多重功效。
本发明的另一目的在于提供该新型饲料添加剂的制备方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的:
本发明提供一种新型饲料添加剂,该饲料添加剂中含有溶菌酶、益生菌菌粉和载体,溶菌酶、益生菌菌粉与载体的比例为:1:1~15:84~98。
进一步,本发明的饲料添加剂中溶菌酶与益生菌菌粉的比例优选为:1:6~15。
其中,所述的溶菌酶可以通过常规方法制备或市售取得,但应保证其活力单位的存在并达到一定的量;本发明中所使用的溶菌酶,其活力单位为500万-1000万u/g,但活力单位可有所提高或降低。
本发明中所述的益生菌菌粉为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌粉、乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)菌粉和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌粉中的任一种、两种或三种。
为达到本发明的发明目的,也应保证上述三种益生菌菌粉中活菌数的存在并达到一定的量;本发明中上述三种益生菌菌粉中的活菌数为1~5×1010cfu/g,但活菌数可有所提高或降低。
本发明中所述的载体包含可溶性淀粉、轻质碳酸钙、次粉,上述成分在载体中的比例为:1:1~5:1~3。
本发明还提供了该新型饲料添加剂的制备方法,其特征在于步骤如下:
(1)制备益生菌菌粉;
(2)按比例称取益生菌菌粉、溶菌酶和载体,混合,即得。
上述步骤(1)制备益生菌菌粉在本发明中涉及到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)三种菌的菌粉制备过程,具体过程如下:
枯草芽孢杆菌菌粉的制备过程,具体步骤:
1)平板培养复壮:将枯草芽孢杆菌菌种接种于含有5—200ug/ml溶菌酶的BPY平板培养基上,于35—37℃培养12—24h,使枯草芽孢杆菌复壮,并形成单菌落,挑取单菌落接种于斜面培养基上,35—37℃培养24—36h;
2)一级种子的制备:将步骤1)培养的枯草芽孢杆菌菌种转接茄子瓶斜面培养基上,于37℃培养12—16h,使其处于对数中后期,得一级种子;
所述的斜面培养基为BPY固体培养基;
3)二级种子的制备:将步骤2)制备的一级种子用无菌水制成菌悬液,接种到装有1—1.6M3BPY种子培养基的2M3种子罐中,温度35—37℃,转速200—250rpm,罐压0.05Mpa,通风比:1:0.6—0.8(14.4~19.2M3/h),培养10—14h,为二级种子液;
4)发酵液的制备:将步骤3)制备的二级种子液按照3—10%的接种量接种到装有12—16M3发酵培养基的发酵罐中,温度35—37℃,转速220—300rpm,罐压0.05Mpa,通风比:1:0.6—0.8,培养16—20h,至芽孢形成率90%以上,活菌数为1—2×1010cfu/ml,则中止发酵,得发酵液;
所述的发酵培养基为:麸皮1-2%,豆粕1-2%,氯化钠0.2-0.8%,硫酸镁0.01-0.05%;
5)枯草芽孢杆菌菌粉的制备:在步骤4)制备的发酵液中加入20—25%的填充物,混匀,进行喷雾干燥,进风温度120~130℃,排风温度40~50℃,雾化器转速18000rpm,得到水分含量<5%的枯草芽孢杆菌菌粉。
所述的填充物为:米糠、沸石粉、稻壳粉中的任一种。
乳酸杆菌菌粉的制备过程,具体步骤:
1)平板培养复壮:将乳酸杆菌菌种接种于含有5—200ug/ml溶菌酶的MRS平板培养基上,于32—37℃培养12—24h,使乳酸杆菌复壮,并形成单菌落;挑取单菌落接种于斜面培养基上,32—37℃培养24—36h;
2)一级种子的制备:将步骤1)培养的乳酸杆菌斜面菌种转接到装有250ml—300ml MRS培养基的500mL三角瓶中,于32—37℃培养12—16h,转速100—150rpm,使其处于对数中后期,为一级种子;
3)二级种子的制备:将步骤2)培养的乳酸杆菌一级种子转接到装有1.2—1.6L MRS培养基的2.0L三角瓶中,于32—37℃静止培养12-16h,为二级种子液;
4)发酵液的制备:将步骤3)制备的二级种子液按照3—6%的接种量接种到装有12—16M3发酵培养基的发酵罐中,温度35-37℃,转速120—160rpm,罐压0.05Mpa,培养16—20h,至活菌数为2—5×109cfu/ml,中止发酵;
所述的发酵培养基为:葡萄糖1-2%,大豆蛋白胨1-2%,硫酸铵0.5-1.0%,氯化钠0.2-0.8%,硫酸镁0.01-0.05%;
5)乳酸杆菌菌粉的制备:将步骤4)制备的发酵液,3500-5000rpm离心,得到菌泥,加入与菌泥的重量/体积百分比为15—20%的冻干保护剂,混匀,于-25℃~-45℃冷冻干燥,得到水分含量<5%的乳酸杆菌菌粉;
所述的冻干保护剂为:脱脂奶粉、甘油、蔗糖、麦芽糊精和谷氨酸钠的混合物,按照:脱脂奶粉:甘油:蔗糖:麦芽糊精:谷氨酸钠=2:1:1:1:1的比例混合而成。
酿酒酵母菌粉的制备过程,具体步骤:
1)平板培养复壮:将酿酒酵母接种于98号平板培养基上,28—32℃培养24—36h,使酿酒酵母复壮,并形成单菌落;挑取单菌落接种于98号斜面培养基上,于28—32℃培养24—36h;
2)一级种子的制备:将步骤1)培养的酿酒酵母斜面菌种转接到装有250ml—300ml98号培养基的500mL三角瓶中,于28—32℃培养12—16h,转速150—200rpm,使其处于对数中后期,为一级种子;
3)二级种子的制备:将步骤2)培养的酿酒酵母一级种子转接到装有1.2—1.6L98号培养基的2.0L三角瓶中,于28—32℃静止培养12—16h,为二级种子液;
4)发酵液的制备:将步骤3)制备的二级种子液按照3—10%的接种量接种到装有12—16M3发酵培养基的发酵罐中,温度28—32℃,转速150—200rpm,罐压0.05Mpa,培养16—20h,至活菌数为2—5×109cfu/ml,中止发酵;
所述的发酵培养基为:红糖1-2%,大豆蛋白胨1-2%,酵母膏0.2-1%,氯化钠0.2-0.8%,硫酸镁0.01-0.05%,磷酸氢二钾0.2-1.0%;
5)酿酒酵母菌粉的制备:将步骤4)制备的发酵液,3000-4000rpm离心,得到菌泥,加入与菌泥的重量/体积百分比为15—20%的冻干保护剂,混匀,-25℃~-45℃冷冻干燥,得到水分含量<5%的酿酒酵母菌粉;
所述的冻干保护剂为:脱脂奶粉、甘油、麦芽糊精的混合物,按照:脱脂奶粉:甘油:麦芽糊精=2:1:1的比例混合而成。
本发明首次将溶菌酶加入到益生菌制剂中并制成新型饲料添加剂,产品兼有并增强了微生态制剂和溶菌酶的优点,比各自单独添加效果均好,能显著促进增重,提高饲料转化率;改善肠道菌群的平衡,提高免疫力和抗病力,具有治疗、预防、保健、增强免疫力的多重功效。该饲料添加剂,在使用中添加量占饲料的0.5-5‰即可,且可替代抗生素,抗菌谱广,防治效果显著,从而改善动物产品品质,达到绿色、安全、无药物残留。
另外,本发明的新型饲料添加剂,其制备工艺简单、适合产业化应用。
通过下列实施例将更具体的说明本发明,但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明,而不是以任何方式限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例1 枯草芽孢杆菌菌粉的制备
1)平板培养复壮:将冰箱保藏的枯草芽孢杆菌斜面菌种采用划线接种的方法在含有200ug/ml溶菌酶的BPY平板培养基上划线接种,于37℃培养24h,使枯草芽孢杆菌复壮,并形成单菌落;挑取单菌落于新鲜的斜面培养基上,于37℃培养36h,放置冰箱备用;
2)一级种子的制备:将步骤1)培养好的枯草芽孢杆菌新鲜斜面菌种转接茄子瓶新鲜斜面培养基上,于37℃培养12h,使其处于对数中后期,为一级种子;
所述的斜面培养基为BPY固体培养基;
3)二级种子的制备:将步骤2)制备的一级种子用无菌水制成菌悬液,接种到装有1.6M3BPY种子培养基的2M3种子罐中,温度37℃,转速250rpm,罐压0.05Mpa,通风比:1:0.8,培养10h,为二级种子液。
4)发酵液的制备:将步骤3)制备的二级种子按照10%的接种量接种到装有16M3发酵培养基的发酵罐中,温度37℃,转速300rpm,罐压0.05Mpa,通风比:1:0.6,培养20h中止发酵,此时芽孢形成率90%以上,活菌数为2.0×1010cfu/ml;
所述的发酵培养基为:麸皮2%,豆粕2%,氯化钠0.2%,硫酸镁0.01%;
5)枯草芽孢杆菌菌粉的制备:在步骤4)制备的发酵液中加入20%的米糠载体,混匀,进行喷雾干燥,进风温度130℃,排风温度50℃,雾化器转速18000rpm,得到水分含量为4%的枯草芽孢菌粉。
实施例2 乳酸杆菌菌粉的制备
1)平板培养复壮:将冰箱保藏的乳酸杆菌斜面菌种采用划线接种的方法在含有200ug/ml溶菌酶的MRS平板培养基上划线接种,于37℃培养24h,使乳酸杆菌复壮,并形成单菌落;挑取单菌落于新鲜的MRS斜面培养基上,于37℃培养36h,放置冰箱备用;
2)一级种子的制备:将步骤1)培养好的乳酸杆菌新鲜斜面菌种转接到装有300ml MRS培养基的500mL三角瓶中,于37℃培养12h,转速100rpm,使其处于对数中后期,为一级种子;
3)二级种子的制备:将步骤2)培养好的乳酸杆菌种子液按照10%接种量接种到装有1.6L MRS培养基的2.0L三角瓶中,于37℃静止培养16h,为二级种子液;
4)发酵液的制备:将步骤3)制备的二级种子液按照6%的接种量接种到装有16M3发酵液的发酵罐中,温度35℃,转速120rpm,罐压0.05Mpa,培养16h中止发酵,此时活菌数为5×109cfu/ml;所述的发酵培养基为:葡萄糖2%,大豆蛋白胨1%,硫酸铵1.0%,氯化钠0.2%,硫酸镁0.05%;
5)乳酸杆菌菌粉的制备:将步骤4)制备的发酵液,5000rpm离心,得到菌泥,加入与菌泥的重量/体积百分比为15%的冻干保护剂,混匀,-25℃~-45℃冷冻干燥,得到水分含量<5%的乳酸杆菌菌粉;
所述的冻干保护剂为脱脂奶粉、甘油、蔗糖、麦芽糊精、谷氨酸钠按照:2:1:1:1:1比例混合而成。
实施例3 酿酒酵母菌粉的制备
1)平板培养复壮:将冰箱保藏的酿酒酵母斜面菌种采用划线接种的方法在98号平板培养基上划线接种,于28℃培养36h,使酿酒酵母复壮,并形成单菌落;挑取单菌落于新鲜的98号斜面培养基上,于28℃培养24-36h,放置冰箱备用;
2)一级种子的制备:将步骤1)培养好的酿酒酵母新鲜斜面菌种转接到装有250ml98号培养基的500mL三角瓶中,于28℃培养12h,转速150rpm,使其处于对数中后期,为一级种子;
3)二级种子的制备:将步骤2)培养好的酿酒酵母种子液转接到装有1.2L98号培养基的2.0L三角瓶中,于28℃静止培养16h,为二级种子液;
4)发酵液的制备:将步骤3)制备的二级种子按照3%的接种量接种到装有16M3发酵培养基的发酵罐中,温度28℃,转速200rpm,罐压0.05Mpa,培养16h中止发酵,此时活菌数为2×109cfu/ml;
所述的发酵培养基为:红糖2%,大豆蛋白胨1%,酵母膏0.2%,氯化钠0.8%,硫酸镁0.01%,磷酸氢二钾0.2%;
5)酿酒酵母菌粉的制备:将步骤4)制备的发酵液,3000rpm离心,得到菌泥,加入与菌泥的重量/体积百分比为15%的冻干保护剂,混匀后于-25℃~-45℃冷冻干燥,得到水分含量<5%的酿酒酵母菌粉;
所述的冻干保护剂为脱脂奶粉、甘油、麦芽糊精按照:2:1:1比例混合而成。
实施例4 本发明的新型饲料添加剂的制备及其对防治仔猪腹泻的影响。
本发明的新型饲料添加剂的制备:将实施例2和3中制备的乳酸杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉与溶菌酶和载体按照如下重量比(wt%)进行混合:乳酸杆菌菌粉10wt%,酿酒酵母菌粉10wt%,溶菌酶1.3wt%,可溶性淀粉20wt%,轻质碳酸钙38.7wt%,次粉20wt%。
试验动物:选用35日龄断奶,体重在9kg左右的长白x大白杂交仔猪作为试验动物,共120头,试验猪来源于饲养管理规范、防疫措施严格的北京全利民猪场,一批选齐,出生日期相差不超过7天。
试验设计:采用随机单因子设计。试验分四组,每组有三个重复,每个重复10头断奶仔猪,组间和重复间体重差异不超过平均体重的5%。
试验日粮:采用玉米—豆粕型日粮作为基础日粮,对照组饲喂基础日粮,试验组I为在基础日粮上添加1‰乳酸杆菌菌粉和酿酒酵母菌粉的混合物,试验组II为在基础日粮上添加100g/T预防拉稀的抗生素阿散酸,试验组III为在基础日粮中添加5‰本实施例制备的新型饲料饲料添加剂,试验组IV为在基础日粮上添加5mg/kg的溶菌酶。基础日粮组成及营养水平见表1。
表1 饲喂基础日粮组成及营养水平
测试指标及方法:在试验开始和结束时早晨空腹对猪只称重,分别以重复组为单位进行全群称重、计算耗料量、日增重、料肉比、腹泻率等指标,并进行差异性显著检验。
试验结果:试验仔猪的生产性能见表2。从表2可见在平均日增重仔猪试验组I、试验组II、试验组III和试验组IV比对照组分别提高6.7%、7.5%、9.5%、7.2%;在料肉比方面试验组I、试验组II、试验组III和试验组IV比对照组分别降低7.5%、5.2%、8.0%、6.0%;在腹泻率方面试验组I、试验组II、试验组III和试验组IV比对照组分别降低67.3%、47.7%、70.1%、62.6%。
试验组III在日增重、料肉比、腹泻率均比试验组I、试验组II与验组IV好,且差异显著,说明本发明的新型饲料添加剂完全能够替代抗生素,益生菌和溶菌酶有协同增效作用。
表2 试验仔猪的生产性能
实施例5 本发明的新型饲料添加剂的制备及其对矮小蛋鸡的影响
本发明的新型饲料添加剂的制备:将实施例1、2和3制备的枯草芽孢杆菌菌粉、乳酸杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉与溶菌酶和载体按照如下百分比进行混合:枯草芽孢杆菌菌粉1wt%,乳酸杆菌菌粉5wt%,酿酒酵母菌粉1wt%,溶菌酶0.47wt%,可溶性淀粉15wt%,轻质碳酸钙32.53wt%,次粉45wt%。
试验动物:随机选用60周龄矮小蛋鸡3000只,随机分为2个试验组,每个试验组1500只,按照随机分组安排试验。
基础日粮的组成和营养成分见表1。试验鸡为三层笼养,每笼3只,自由采食和饮水,按常规进行饲养管理。对照组饲喂基础日粮,试验组I为在基础日粮上添加1‰枯草芽孢杆菌菌粉、乳酸杆菌菌粉和酿酒酵母菌粉的混合物,试验组II为在基础日粮上添加1‰本实施例制备的新型饲料饲料添加剂,试验组III为在基础日粮上添加200mg/kg的溶菌酶。
表1 基础日粮组成和营养成分
注:每千克日粮中:维生素A 12000IU,维生素D 31500IU,维生素E 25IU,维生素K 31.0mg,硫胺素5.5mg,核黄素5.0mg,泛酸16mg,维生素B 68.0mg,生物素0.3mg,胆碱500mg,叶酸1.8mg,维生素B 120.008mg,铁90mg,铜20mg,碘0.45mg,锰80mg,锌80mg,硒0.2mg,DL-蛋氨酸1.50g.
测定指标:每天观察记录每重复产蛋数、蛋重、不合格蛋数和鸡只死淘情况;每周末统计耗料量;分别统计每组鸡产蛋后期的产蛋率、蛋重、破损率、死亡率、采食量和料蛋比。
试验结果如表2所示,在产蛋后期,试验组产蛋率分别比空白对照组提高2.53%,蛋重有所增加;在蛋鸡死亡率和蛋壳破损率方面下降。
试验组I、II、III产蛋率分别比空白对照组提高1.79%、2.81%、1.61%;试验组I、II、III蛋鸡死亡率分别比空白对照组分别降低0.3%、0.35%、0.32%;可见添加本发明的新型饲料添加剂效果最佳。
表2 矮小蛋鸡生产性能
实施例7 本发明的新型饲料添加剂的制备及其临床治疗效果
本发明的新型饲料添加剂的制备,将实施例2制备的乳酸杆菌菌粉与溶菌酶和载体按照如下重量比进行混合:乳酸杆菌菌粉5wt%,溶菌酶5wt%,可溶性淀粉10wt%,轻质碳酸钙50wt%,次粉30wt%。
将上述制备的饲料添加剂用做诊断患有细菌系腹泻的仔猪试验。
试验对象:150头经诊断患有细菌性腹泻的仔猪。
试验设计:将150头患病仔猪随机分为两组,每组三个重复,每个重复25头,试验组I饲喂2.5‰本实施例制备的新型饲料添加剂,试验组II:大剂量的痢菌净;观察患病仔猪的恢复情况及治愈后的情况。
试验结果:试验组I的治愈率为95.8%,试验组II治愈率为75.%,说明本发明的新型饲料添加剂对细菌性仔猪腹泻有很好的治疗效果,完全能够替代抗生素。