CN105255973A - 一种利用磁场促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的方法及装置 - Google Patents
一种利用磁场促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的方法及装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用磁场促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的方法及装置。所述方法步骤如下：(1)将活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于种子培养基中，经种子培养，制得种子液；(2)将步骤(1)制得的种子液转接至发酵培养基中，进行初发酵至菌体细胞进入对数生长期后，经连续或不连续的磁场发酵处理，然后经后续发酵处理，制得含抗菌肽的发酵液。本发明还涉及磁场发酵处理的装置。本发明利用磁场处理对数生长期的解淀粉芽孢杆菌细胞，显著提高了目标产物抗菌肽的产量和抗菌肽的活性，该方法步骤简单，易于操作，显著降低了抗菌肽的生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用磁场促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的方法及装置，属于生物技术技术领域。
背景技术
抗菌肽(Antimicrobialpeptides)是生物体先天免疫防御系统产生的一种内源性多肽，几乎存在于从原核生物到人类的各种生物体中，其分子量大多在1000-7000之间，由10-100个氨基酸残基组成。抗菌肽一般通过破坏细胞膜使细胞内容物外漏起到杀菌作用，与传统抗生素相比，抗菌肽具有不易产生耐药性、安全性高、可杀灭多重耐药菌、无残留等特点，在医药工业、畜禽养殖、食品防腐等领域具有巨大的应用潜力。
解淀粉芽孢杆菌能够产生Surfactin抗菌肽，该抗菌肽由两部分组成，即7-10个氨基酸残基组成的肽链和β-羟基脂肪酸链，其中脂肪酸链上的羟基与肽链氨基酸上的羧基结合形成内酯键，使肽链闭合形成环状酯肽。Surfactin对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等畜禽常见致病菌具有较强的抑制和杀灭活性。
近年来，利用野生菌株或基因工程菌制备抗菌肽的研究逐渐兴起，但是大部分抗菌肽产生菌株存在自身抑制现象，导致抗菌肽的终产量仅为几十至几百毫克/每升发酵液，居高不下的生产成本成为限制抗菌肽规模化应用的主要因素。
关于磁场或动态磁场对微生物的影响，国内外研究不多，而且现有研究多集中在如何利用脉冲磁场杀灭有害微生物。磁场对微生物的影响可能与细胞在磁场作用下产生感应电流有关，此外，在外加磁场下，细胞中的带电粒子由于受洛伦兹力的作用，从而影响细胞的正常生理功能。至今未见利用磁场提高解淀粉芽孢杆菌抗菌肽产量的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用磁场促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的方法及装置，该方法具有工艺简单、安全性高、生产成本低、适合工业化生产等特点。
本发明的技术方案如下：
一种利用磁场促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的方法，步骤如下：
(1)将活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于种子培养基中，经种子培养，制得种子液；
(2)将步骤(1)制得的种子液转接至发酵培养基中，进行初发酵至菌体细胞进入对数生长期后，25℃～35℃、搅拌速度100～220rpm、空气流量0.5～1.0vvm条件下，经连续或不连续的电流强度为0.20～1.20A、磁场强度为0.03～0.18T(与实施例不一致，已统一，请重点确认)的磁场发酵处理6～18h，然后经后续发酵处理，制得含抗菌肽的发酵液。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的活化，步骤如下：
将菌株接种至活化培养基，25～30℃活化培养15～36h，得到活化后的解淀粉芽孢杆菌。该培养液可直接接种至种子培养基。
所述活化培养基成分如下：
葡萄糖5～20g/L、酵母浸粉10～20g/L、蛋白胨5～10g/L，pH值6.0～7.0。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的解淀粉芽孢杆菌来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CGMCC1.10901。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，种子培养基每升组分如下:
碳源20.0～40.0g，氮源5.0～20.0g，磷酸钾1.0～4.0g，硫酸镁0.5～3.0g，硫酸锰0.001g，pH6.0～7.0，去离子水定容至1L；
进一步优选的，所述的碳源为葡萄糖或淀粉，所述的氮源为蛋白胨或酵母粉；
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，种子培养条件为：25℃～40℃、100～320rpm条件下，培养18～24h。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，接种量为1％～5％(体积百分比)。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，发酵培养基每升组分如下:
淀粉20.0～40.0g，酵母粉5.0～20.0g，磷酸钾1.0～4.0g，硫酸镁0.5～3.0g，硫酸锰0.001g，pH6.0～7.0，其余为去离子水。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，初发酵条件为：25℃～35℃、搅拌速度100～220rpm、空气流量0.5～1.0vvm条件下发酵6～10h。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，后续发酵处理条件为：25℃～35℃、搅拌速度100～220rpm、空气流量0.5～1.0vvm条件下发酵4～12h。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，不连续的间隔时间为15min～45min。
上述促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的发酵培养装置，包括发酵罐罐体，其特征在于，所述的发酵罐罐体上设置有循环回流装置，循环回流装置上设置有产生磁场的装置。
根据本发明优选的，所述的产生磁场的装置为磁感应线圈。
根据本发明优选的，所述的循环回流装置包括循环回流泵和循环回流管路。
进一步优选的，所述循环回流管路上设置有液体流量计。
根据本发明优选的，所述的发酵罐罐体上设置有溶氧检测装置和pH检测装置。
有益效果
1、本发明利用磁场处理对数生长期的解淀粉芽孢杆菌细胞，显著提高了目标产物抗菌肽的产量和抗菌肽的活性，该方法步骤简单，易于操作，显著降低了抗菌肽的生产成本；
2、本发明制备的抗菌肽可用于医药、饲料、食品等多个领域，市场前景广阔，经济效益潜力巨大；
3、本发明所述的发酵培养装置用于发酵培养解淀粉芽孢杆菌细胞的发酵培养，可以方便对发酵液的磁场处理，结构简单，易于操作。
附图说明
图1是实施例1制备的含抗菌肽的发酵液对大肠杆菌的抑菌效果照片。
图2是对实施例1制备的含抗菌肽的发酵液中的抗菌肽进行检测的HPLC色谱图；
图3是对对比例1制备的含抗菌肽的发酵液中的抗菌肽进行检测的HPLC色谱图；
图4是实施例1所述的促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的发酵培养装置；
图中：1、发酵罐罐体，2、磁感应线圈，3、循环回流泵，4、循环回流管路，5、液体流量计，6、溶氧检测装置，7、pH检测装置。
具体实施方式
下面结合实施例和说明书附图对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
微生物来源
实施例中所述的解淀粉芽孢杆菌来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CGMCC1.10901；
检测发酵液效价采用如下方法(琼脂孔扩散法)：
(i)琼脂平板制作：以大肠杆菌标准菌株为指示菌，0.5ml大肠杆菌标准菌株(10ml无菌水洗斜面菌后，10倍稀释)菌液和营养琼脂培养基按0.5ml/20ml的比例混匀于90mm平板上，待其凝固后备用；
(ii)制作标准曲线：配置浓度为1500IU/mL、3000IU/mL、5000IU/mL、8000IU/mL、10000IU/mL的青霉素钠标准溶液。取3个所述琼脂平板，每个平皿等距打5个孔(直径3mm)，依次加入青霉素钠标准溶液各50μL，于37℃培养12h，用游标卡尺精确测量抑菌圈直径，以各梯度标准溶液抑菌圈直径平均值的平方对青霉素钠标准溶液效价的lg值做标准曲线；
(iii)测定样品效价：取样(一个平行样)加至琼脂平板微孔中，37℃培养12h后，精确测量每个抑菌圈直径并计算均值，带入标准曲线求出样品效价。
实施例1
如图4所示的促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的发酵培养装置，包括发酵罐罐体1，所述的发酵罐罐体1上设置有循环回流装置，循环回流装置上设置有磁感应线圈2。
所述的循环回流装置包括循环回流泵3和循环回流管路4，所述循环回流管路4上设置有液体流量计5。
所述的发酵罐罐体1上设置有溶氧检测装置6和pH检测装置7。
一种利用磁场促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的方法，步骤如下：
(1)将活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于种子培养基中，经35℃、200rpm条件下，种子培养18h，制得种子液；
所述步骤(1)中，种子培养基每升组分如下:
葡萄糖30.0g，酵母粉15.0g，磷酸钾2.0，硫酸镁1.0g，硫酸锰0.001g，pH6.5，去离子水定容至1L；
(2)将步骤(1)制得的种子液按2％(体积百分比)的比例转接至发酵培养基中，在35℃、搅拌速度220rpm、空气流量1.0vvm条件下初发酵6h，菌体细胞进入对数生长期，然后在35℃、搅拌速度220rpm、空气流量1.0vvm条件下，经电流强度为0.30A、磁场强度为0.07T的磁场发酵处理9h，采用上述促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的发酵培养装置处理，整个罐体内发酵液完成一次循环需要时间30min，然后在35℃、搅拌速度200rpm、空气流量0.6vvm条件下经后续发酵处理发酵9h，停止发酵，制得含抗菌肽的发酵液；
所述步骤(2)中，发酵培养基每升组分如下:
淀粉20.0g，酵母粉20.0g，磷酸钾1.0g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.001g，pH6.7，其余为去离子水。
所述步骤(1)中的活化，步骤如下：
将菌株接种至活化培养基，25℃活化培养36h，得到活化后的解淀粉芽孢杆菌。
活化培养基成分如下：葡萄糖20g/L、酵母浸粉10g/L、蛋白胨10g/L，pH值6.5。
对比例1
一种利用磁场促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的方法，步骤如下：
(1)将活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于种子培养基中，经35℃、200rpm条件下，种子培养18h，制得种子液；
所述步骤(1)中，种子培养基每升组分如下:
葡萄糖30.0g，酵母粉15.0g，磷酸钾2.0，硫酸镁1.0g，硫酸锰0.001g，pH6.5，去离子水定容至1L；
(2)将步骤(1)制得的种子液按2％(体积百分比)的比例转接至发酵培养基中，在35℃、搅拌速度200rpm、空气流量0.6vvm条件下发酵24h，停止发酵，制得含抗菌肽的发酵液；
所述步骤(2)中，发酵培养基每升组分如下:
淀粉20.0g，酵母粉20.0g，磷酸钾1.0g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.001g，pH6.7，其余为去离子水。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的活化，步骤如下：
将菌株接种至活化培养基，25℃活化培养36h，得到活化后的解淀粉芽孢杆菌。
活化培养基成分如下：葡萄糖20g/L、酵母浸粉10g/L、蛋白胨10g/L，pH值6.5。
试验例1
取实施例1和对比例1制得的发酵液，经离心后，取上清液，通过HPLC方法检测发酵液中抗菌肽的含量，检测结果如图2和图3所示，图2结果如表1所示：
表1
信号1：DAD1A，sig＝210，4Ref＝off
其中，表1中保留时间13.309min、14.241min、15.872min、16.262min、17.710min为抗菌肽色谱峰。图3结果如表2所示：
表2
信号1：DAD1A，sig＝210，4Ref＝off
其中，表2中保留时间13.379min、14.333min、15.988min、16.415min、17.891min为抗菌肽色谱峰。
结果显示实施例1中的发酵液中抗菌肽含量为1987mg/L，对比例1中的抗菌肽的含量为720mg/L，实施例1中发酵液相对于对比例1中发酵液含量提高了176％。
采用琼脂孔扩散法检测发酵液离心后的上清液中抗菌肽效价。检测结果显示，实施例1相对于对比例1中的抗菌肽的效价提高了1.7倍。
实施例2
如实施例1所述的利用磁场促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的方法，不同之处在于，步骤如下：
(1)将活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于种子培养基中，经40℃、320rpm条件下，种子培养16h，制得种子液；
所述步骤(1)中，种子培养基每升组分如下:
淀粉20g，酵母粉5g，磷酸钾4g，硫酸镁3g，硫酸锰0.001g，pH6.5，去离子水定容至1L；
(2)将步骤(1)制得的种子液按5％(体积百分比)的比例转接至发酵培养基中，在25℃、搅拌速度100rpm、空气流量0.5vvm条件下初发酵10h，菌体细胞进入对数生长期，然后在25℃、搅拌速度100rpm、空气流量0.5vvm条件下，经电流强度为1.20A、磁场强度为0.18T的磁场发酵处理18h，然后在25℃、搅拌速度220rpm、空气流量0.5vvm条件下经后续发酵处理发酵12h，停止发酵，制得含抗菌肽的发酵液；
所述步骤(2)中，发酵培养基每升组分如下:
淀粉20.0g，酵母粉20.0g，磷酸钾1.0g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.001g，pH6.7，其余为去离子水。
所述步骤(1)中的活化，步骤如下：
将菌株接种至活化培养基，30℃培养15h，得到活化后的解淀粉芽孢杆菌。
活化培养基成分如下：
葡萄糖5g/L、酵母浸粉20g/L、蛋白胨5g/L，pH值7.0。
对比例2
一种利用磁场促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的方法，步骤如下：
(1)将活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于种子培养基中，经40℃、200rpm条件下，种子培养16h，制得种子液；
所述步骤(1)中，种子培养基每升组分如下:
淀粉20g，酵母粉15g，磷酸钾2g，硫酸镁1g，硫酸锰0.001g，pH6.5，去离子水定容至1L；
(2)将步骤(1)制得的种子液按5％(体积百分比)的比例转接至发酵培养基中，在25℃、搅拌速度220rpm、空气流量0.5vvm条件下初发酵6h，菌体细胞进入对数生长期，然后在35℃、搅拌速度200rpm、空气流量0.6vvm条件下，发酵处理10h，然后在25℃、搅拌速度220rpm、空气流量0.5vvm条件下经后续发酵处理发酵12h，停止发酵，制得含抗菌肽的发酵液；
所述步骤(2)中，发酵培养基每升组分如下:
淀粉20.0g，酵母粉20.0g，磷酸钾1.0g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.001g，pH6.7，其余为去离子水。
所述步骤(1)中的活化，步骤如下：
将菌株接种至活化培养基，30℃培养15h，得到活化后的解淀粉芽孢杆菌。
活化培养基成分如下：
葡萄糖5g/L、酵母浸粉20g/L、蛋白胨5g/L，pH值7.0。
试验例2
取实施例2和对比例2制得的发酵液，经离心后，取上清液，通过HPLC方法检测发酵液中抗菌肽的含量，经检测，实施例2中的发酵液中抗菌肽含量为2953mg/L，对比例2中的抗菌肽的含量为872mg/L，实施例2中发酵液相对于对比例2中发酵液含量提高了239％。
采用琼脂孔扩散法检测发酵液离心后的上清液中抗菌肽效价。检测结果显示，实施例2相对于对比例2中的抗菌肽的效价提高了3.0倍。
实施例3
一种利用磁场促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的方法，步骤如下：
(1)将活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于种子培养基中，经25℃、100rpm条件下，种子培养24h，制得种子液；
所述步骤(1)中，种子培养基每升组分如下:
葡萄糖40.0g，酵母粉20.0g，磷酸钾1.0，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.001g，pH6.5，去离子水定容至1L；
(2)将步骤(1)制得的种子液按1％(体积百分比)的比例转接至发酵培养基中，在30℃、搅拌速度180rpm、空气流量0.8vvm条件下初发酵8h，菌体细胞进入对数生长期，然后在30℃、搅拌速度180rpm、空气流量0.8vvm条件下，经电流强度为0.30A、磁场强度为0.10T的磁场发酵处理12h，采用上述促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的发酵培养装置处理，整个罐体内发酵液完成一次循环需要时间45min，然后在35℃、搅拌速度200rpm、空气流量0.6vvm条件下经后续发酵处理发酵4h，停止发酵，制得含抗菌肽的发酵液；
所述步骤(2)中，发酵培养基每升组分如下:
淀粉20.0g，酵母粉20.0g，磷酸钾1.0g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.001g，pH6.7，其余为去离子水。
所述步骤(1)中的活化，步骤如下：
将菌株接种至活化培养基，25℃活化培养36h，得到活化后的解淀粉芽孢杆菌。
活化培养基成分如下：葡萄糖20g/L、酵母浸粉10g/L、蛋白胨10g/L，pH值6.5。
对比例3
一种利用磁场促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的方法，步骤如下：
(1)将活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于种子培养基中，经25℃、100rpm条件下，种子培养24h，制得种子液；
所述步骤(1)中，种子培养基每升组分如下:
葡萄糖40.0g，酵母粉20.0g，磷酸钾1.0，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.001g，pH6.5，去离子水定容至1L；
(2)将步骤(1)制得的种子液按1％(体积百分比)的比例转接至发酵培养基中，在30℃、搅拌速度180rpm、空气流量0.8vvm条件下初发酵8h，菌体细胞进入对数生长期，然后在30℃、搅拌速度180rpm、空气流量0.8vvm条件下，发酵处理12h，然后在35℃、搅拌速度200rpm、空气流量0.6vvm条件下经后续发酵处理发酵4h，停止发酵，制得含抗菌肽的发酵液；
所述步骤(2)中，发酵培养基每升组分如下:
淀粉20.0g，酵母粉20.0g，磷酸钾1.0g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.001g，pH6.7，其余为去离子水。
所述步骤(1)中的活化，步骤如下：
将菌株接种至活化培养基，25℃活化培养36h，得到活化后的解淀粉芽孢杆菌。
活化培养基成分如下：葡萄糖20g/L、酵母浸粉10g/L、蛋白胨10g/L，pH值6.5。
试验例3
取实施例3和对比例3制得的发酵液，经离心后，取上清液，通过HPLC方法检测发酵液中抗菌肽的含量，经检测，实施例2中的发酵液中抗菌肽含量为2117mg/L，对比例2中的抗菌肽的含量为931mg/L，实施例2中发酵液相对于对比例2中发酵液含量提高了127％。
采用琼脂孔扩散法检测发酵液离心后的上清液中抗菌肽效价。检测结果显示，实施例3相对于对比例3中的抗菌肽的效价提高了1.2倍。
结果分析
由上述试验例可以看出，经过磁场处理后，可以明显提高抗菌肽的产量和活性。
本文所描述的具体实施案例仅作为对本发明精神和部分实验做举例说明。本发明所属领域的技术人员可以对所描述的具体实施案例做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (10)
1.一种利用磁场促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将活化后的解淀粉芽孢杆菌接种于种子培养基中，经种子培养，制得种子液；
(2)将步骤(1)制得的种子液转接至发酵培养基中，进行初发酵至菌体细胞进入对数生长期后，25℃～35℃、搅拌速度100～220rpm、空气流量0.5～1.0vvm条件下，经连续或不连续的电流强度为0.20～1.20A、磁场强度为0.03～0.18T的磁场发酵处理6～18h，然后经后续发酵处理，制得含抗菌肽的发酵液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的活化，步骤如下：
将菌株接种至活化培养基，25～30℃活化培养15～36h，得到活化后的解淀粉芽孢杆菌；
优选的，所述活化培养基成分如下：
葡萄糖5～20g/L、酵母浸粉10～20g/L、蛋白胨5～10g/L，pH值6.0～7.0。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的解淀粉芽孢杆菌来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CGMCC1.10901。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，种子培养基每升组分如下:
碳源20.0～40.0g，氮源5.0～20.0g，磷酸钾1.0～4.0g，硫酸镁0.5～3.0g，硫酸锰0.001g，pH6.0～7.0，去离子水定容至1L；
优选的，所述的碳源为葡萄糖或淀粉，所述的氮源为蛋白胨或酵母粉；
优选的，所述步骤(1)中，种子培养条件为：25℃～40℃、100～320rpm条件下，培养18～24h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，接种量为1％～5％(体积百分比)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，发酵培养基每升组分如下:
淀粉20.0～40.0g，酵母粉5.0～20.0g，磷酸钾1.0～4.0g，硫酸镁0.5～3.0g，硫酸锰0.001g，pH6.0～7.0，其余为去离子水；
优选的，所述步骤(2)中，初发酵条件为：25℃～35℃、搅拌速度100～220rpm、空气流量0.5～1.0vvm条件下发酵6～10h；
优选的，所述步骤(2)中，后续发酵处理条件为：25℃～35℃、搅拌速度100～220rpm、空气流量0.5～1.0vvm条件下发酵4～12h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，不连续的间隔时间为15min～45min。
8.一种促进解淀粉芽孢杆菌高产抗菌肽的发酵培养装置，包括发酵罐罐体，其特征在于，所述的发酵罐罐体上设置有循环回流装置，循环回流装置上设置有产生磁场的装置。
9.如权利要求8所述的发酵培养装置，其特征在于，所述的产生磁场的装置为磁感应线圈。
10.如权利要求8所述的发酵培养装置，其特征在于，所述的循环回流装置包括循环回流泵和循环回流管路；优选的，所述循环回流管路上设置有液体流量计；
优选的，所述的发酵罐罐体上设置有溶氧检测装置和pH检测装置。
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Denomination of invention: A method of using magnetic field to promote high-yield antibacterial peptide of Bacillus amyloliquefaciens Effective date of registration: 20220221 Granted publication date: 20190201 Pledgee: Weifang rural commercial bank Limited by Share Ltd. hi tech sub branch Pledgor: SHANDONG HUACHEN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Registration number: Y2022980001690 |