CN108641078B - 一种利用树脂原位吸附提取ε-聚赖氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用树脂原位吸附提取ε‑聚赖氨酸的方法，属于提取分离技术领域。本发明提供了一种利用离子交换树脂直接从未经处理的发酵液中分离提取ε‑聚赖氨酸(ε‑PL)的方法，此方法可大大缩减提取步骤，且显著降低提取成本；采用本发明的方法提取ε‑聚赖氨酸，回收率可高达75％以上、回收成品的纯度高达98％以上，相较于传统离子交换提取方法，分别提高了15％和2％，具有显著的优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用树脂原位吸附提取ε-聚赖氨酸的方法，属于提取分离技术领域。
背景技术
ε-聚赖氨酸(ε-PL)是由链霉菌、丝状真菌或芽孢杆菌等微生物胞外分泌产生的一种同型氨基酸聚合物，它一般由25-35个L-赖氨酸单体通过α-COOH和ε-NH2脱水缩合而成，分子量通常为2500-4500Da。
由于具有水溶性好、热稳定性强、抑菌谱广等优点，ε-PL目前主要作为生物食品防腐剂广泛应用于日本、韩国、欧美等国家和地区的食品工业。2014年，我国也正式批准ε-PL及其盐酸盐在果蔬、米面制品、肉制品、调味品、饮料和焙烤等食品领域中的应用。
事实上，ε-PL与其他生物食品防腐剂，如乳酸链球菌素和纳他霉素，在抑菌谱即使用范围上存在显著互补性。ε-PL能显著抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，乳酸链球菌素只对革兰氏阳性细菌和芽孢有显著抑制作用，而纳他霉素只对霉菌和酵母菌有良好抑制效果，若将它们联合应用于食品工业中，即能最大程度的保证抑菌的效果。
因此，开发和推广ε-PL及其盐在食品工业中的应用，对于解决当前化学食品防腐剂引发的食品安全问题具有重要意义。
然而，ε-PL生产偏高却成为限制其在食品工业中广泛应用的主要因素。
ε-PL的制备主要包括两部分：微生物发酵、提取与精制。在微生物发酵方面，国内学者已经将5L规模ε-PL的发酵水平从10g/L左右提高到30g/L以上(ZL201410156360.0)，最高突破到50g/L以上(ZL201510021744.6，ZL20091003033.0)。实际上，ε-PL发酵单位已经达到大多数工业化发酵产品的发酵水平，表明ε-PL发酵成本接近大规模工业化生产可接受程度。
在提取与精制方面，自ZL200910152931.2公开以来，离子交换技术一直是ε-PL提取的核心方法，受到众多研究者的关注。基于该核心操作单元，ε-PL提取工艺也得到了改进，如，CN107164417A将离子交换树脂的离子类型由氢型改变成铵型，省去了后续的脱盐操作，简化了操作流程；CN106380592A建立了两步离子交换方法，用于从高ε-PL浓度和高杂质环境的发酵液中分离提取ε-PL；ZL201110053004.2利用离子交换树脂从发酵液中提取ε-PL的同时，还将副产物γ-聚二氨基丁酸进行了分离。
然而，上述所有方法均需要将发酵液进行菌体分离。
若能利用离子交换树脂直接从未经处理的发酵液中分离提取ε-PL，可大大缩减提取步骤并显著降低提取成本。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种利用离子交换树脂直接从未经处理的发酵液中提取ε-聚赖氨酸(ε-PL)的方法。此方法可大大缩减提取步骤，且显著降低提取成本，同时，运用此方法提取ε-聚赖氨酸，具有提取回收率高、提取成品纯度高等优势。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种提取ε-聚赖氨酸的方法，所述方法为在ε-聚赖氨酸发酵液中加入一定比例的水进行稀释，得到稀释后的发酵液；在稀释后的发酵液中加入一定比例的活化后的离子交换树脂进行吸附，得到吸附后的树脂；分离吸附后的树脂，将吸附后的树脂进行洗涤后用洗脱剂进行洗脱，得到ε-聚赖氨酸洗脱液；将ε-聚赖氨酸洗脱液经精制处理后获得ε-聚赖氨酸成品；
所述ε-聚赖氨酸发酵液是利用产ε-聚赖氨酸菌进行发酵得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为在ε-聚赖氨酸发酵液中加入一定比例的水进行稀释，并搅拌均匀，得到稀释后的发酵液；在稀释后的发酵液中加入一定比例的活化后的离子交换树脂进行吸附，并进行搅拌，直至料液中不再检测到ε-聚赖氨酸，得到吸附后的树脂；分离吸附后的树脂，将吸附后的树脂进行洗涤后用洗脱剂进行洗脱，得到ε-聚赖氨酸洗脱液；将ε-聚赖氨酸洗脱液经精制处理后获得ε-聚赖氨酸成品。
在本发明的一种实施方式中，所述ε-聚赖氨酸发酵液与水的体积比为1:2-6。
在本发明的一种实施方式中，所述ε-聚赖氨酸发酵液与水的体积比为1:3。
在本发明的一种实施方式中，所述水为去离子水。
在本发明的一种实施方式中，所述离子交换树脂为弱酸性离子交换树脂或强酸性离子交换树脂。
在本发明的一种实施方式中，所述离子交换树脂为弱酸性离子交换树脂。
在本发明的一种实施方式中，所述离子交换树脂的活性基团为氢型、钠型或铵型。
在本发明的一种实施方式中，所述活性基团为钠型。
在本发明的一种实施方式中，所述活化为用酸或碱溶液浸泡树脂后，用水洗至近中性，重复操作多次。
在本发明的一种实施方式中，所述活化为用1.0mol/L的酸或碱溶液浸泡树脂4-6h，用水洗至近中性，重复操作三次。
在本发明的一种实施方式中，所述活化为用1.0mol/L的酸或碱溶液浸泡树脂3h，用水洗至近中性，重复操作三次。
在本发明的一种实施方式中，所述水为去离子水。
在本发明的一种实施方式中，所述酸为盐酸。
在本发明的一种实施方式中，所述碱为氢氧化钠或氨水。
在本发明的一种实施方式中，所述稀释后的发酵液与离子交换树脂的质量比为1:0.1-0.3。
在本发明的一种实施方式中，所述稀释后的发酵液与离子交换树脂的质量比为1:0.2。
在本发明的一种实施方式中，所述洗脱剂为盐酸、氢氧化钠或氨水。
在本发明的一种实施方式中，所述洗脱剂为氢氧化钠。
在本发明的一种实施方式中，所述洗脱剂的pH为4.0。
在本发明的一种实施方式中，所述洗涤为用水进行洗涤。
在本发明的一种实施方式中，所述洗涤为用去离子水进行洗涤。
在本发明的一种实施方式中，所述洗涤为用去离子水以1-3BV/h的速率进行洗涤。
在本发明的一种实施方式中，所述洗涤为用去离子水以2BV/h的速率进行洗涤。
在本发明的一种实施方式中，所述精制处理包含脱色、脱盐和干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述脱色为使用活性炭或大孔树脂进行脱色。
在本发明的一种实施方式中，所述脱盐为使用超滤或纳滤进行脱盐。
在本发明的一种实施方式中，所述干燥为冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明提供了应用上述一种提取ε-聚赖氨酸的方法分离提取得到的ε-聚赖氨酸。
本发明提供了上述一种提取ε-聚赖氨酸的方法在生产ε-聚赖氨酸方面的应用。
本发明提供了上述一种提取ε-聚赖氨酸的方法或上述分离提取得到的ε-聚赖氨酸在食品领域的应用。
有益效果：
(1)本发明采用树脂直接从未经预处理的发酵液中提取ε-PL，省去了菌体分离操作，减少了提取步骤，降低了生产成本；
(2)本发明工艺流程简单、操作时间短、投资成本低、便于工业放大，具有很高的实际应用价值且优势明显；
(3)采用本发明的方法提取ε-聚赖氨酸，回收率可高达75％以上、回收成品的纯度高达98％以上，相较于传统离子交换提取方法，分别提高了15％和2％，具有显著的优势。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中的ε-PL发酵液由下述方法制备而得，具体操作步骤为：
将小白链霉菌CGMCC NO.10480的种子液，按照6％的接种量接种到装有发酵培养基的5L发酵罐中，利用氨水或NaOH溶液将培养基pH值调节至7.5，开始发酵。在发酵过程中，温度控制在30℃左右，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量为0.5-2vvm，溶氧浓度控制在30％左右；当pH值自发下降为5.0时，自动流加氨水或NaOH溶液将pH值控制在5.0左右，保持10h；随后将pH值下调至3.0左右，并维持24h左右，后将pH值上调到4.5左右并维持至发酵结束。当发酵液中残留的甘油或葡萄糖浓度下降为10g/L时，自动流加灭菌后的纯甘油或500g/L的葡萄糖溶液，使其在发酵液中的浓度控制在10g/L左右；当发酵液中NH4+-N浓度降到1g/L时，自动流加硫酸铵溶液，使其浓度维持在1g/L。
按照上述发酵控制方法，经过192h补料分批发酵，ε-PL产量可以达到50g/L。
上述小白链霉菌CGMCC NO.10480已于2016年6月15日在Appl BiochemBiotechnol杂志的《Genome Shuffling and Gentamicin-Resistance to Improveε-Poly-L-Lysine Productivity of Streptomyces albulus W-156》一文中公开。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
回收率、纯度检测方法参考文献：Kahar P.,Iwata T.,Hiraki J.,Park E.Y.,Okabe M.,Enhancement ofε-polylysine production by Streptomyces albulus strain410 using pH control,J.Biosci.Bioeng.91(2001)190–194.
实施例1
(1)发酵液的稀释：取ε-PL发酵液100mL加入去离子水稀释2倍后，搅拌均匀；
(2)树脂吸附ε-PL：将25g活化好的氢型弱酸离子交换树脂Amberlite IRC-50投入到稀释好的发酵液中，一边搅拌、一边检测发酵液中的ε-PL含量，直至检测不到ε-PL；
(3)ε-PL解吸附：吸附完成后，停止搅拌，静置5h后，移除上层发酵液，加入500mL去离子水并搅拌，去除残留发酵液和吸附在树脂表面的菌体，最后用500mL 0.2M HCl在搅拌条件下，解吸附4h；
(4)ε-PL精制：将500mL洗脱液pH值调节至4.0左右，加入10g活性炭，升温至80℃保持20min；脱色液经截留分子量200Da纳滤膜脱盐和浓缩，浓缩液经冷冻干燥，得到ε-PL成品。
本实例的ε-PL回收率达到76.6％，纯度达到98.3％。
实施例2
(1)发酵液的稀释：取ε-PL发酵液100mL加入去离子水稀释6倍后，搅拌均匀；
(2)树脂吸附ε-PL：将20g活化好的钠型弱酸离子交换树脂Amberlite IRC-50投入到稀释好的发酵液中，一边搅拌、一边检测发酵液中的ε-PL含量，直至检测不到ε-PL；
(3)ε-PL解吸附：吸附完成后，停止搅拌，静置4h后，移除树脂，加入到离交柱中，并利用去离子水以5BV/h速率以下进上出方式去除吸附在树脂表面的菌体和发酵液，最后利用1M NaOH以2BV/h速率洗脱ε-PL；
(4)ε-PL精制：将400mL洗脱液pH值调节至4.0左右，加入10g活性炭，升温至85℃保持30min；脱色液经截留分子量200Da纳滤膜脱盐和浓缩，浓缩液经冷冻干燥，得到ε-PL成品。
本实例的ε-PL收率达到75.6％，纯度达到99.3％。
实施例3
(1)发酵液的稀释：取ε-PL发酵液100mL加入去离子水稀释5倍后，搅拌均匀；
(2)树脂吸附ε-PL：将35g活化好的氨型弱酸离子交换树脂Amberlite IRC-50投入到稀释好的发酵液中，一边搅拌、一边检测发酵液中的ε-PL含量，直至检测不到ε-PL；
(3)ε-PL解吸附：吸附完成后，停止搅拌，静置6h后，移除树脂，加入到离交柱中，并利用去离子水以6BV/h速率以下进上出方式去除吸附在树脂表面的菌体和发酵液，最后利用1M NH3·H2O以2BV/h速率洗脱ε-PL；
(4)ε-PL精制：将600mL洗脱液pH值调节至4.0左右，加入15g活性炭，升温至85℃保持30min；脱色液经截留分子量200Da纳滤膜脱盐和浓缩，浓缩液经冷冻干燥，得到ε-PL成品。
本实例的ε-PL收率达到77.78％，纯度达到98.21％。
实施例4
(1)发酵液的稀释：取ε-PL发酵液100mL加入去离子水稀释5倍后，搅拌均匀；
(2)树脂吸附ε-PL：将38g活化好的氨型弱酸离子交换树脂Amberlite IRC-50投入到稀释好的发酵液中，一边搅拌、一边检测发酵液中的ε-PL含量，直至检测不到ε-PL；
(3)ε-PL解吸附：吸附完成后，停止搅拌，静置4h后，移除树脂，加入到离交柱中，并利用去离子水以4BV/h速率以下进上出方式去除吸附在树脂表面的菌体和发酵液，最后利用0.8M NH3·H2O以2BV/h速率洗脱ε-PL；
(4)ε-PL精制：将800mL洗脱液pH值调节至4.0左右，加入20g活性炭，升温至85℃保持30min；脱色液经截留分子量200Da纳滤膜脱盐和浓缩，浓缩液经冷冻干燥，得到ε-PL成品。
本实例的ε-PL收率达到76.78％，纯度达到99.21％。
对比例1
(1)发酵液的稀释：取ε-PL发酵液100mL加入去离子水稀释5倍后，搅拌均匀；
(2)树脂吸附ε-PL：将38g活化好的氨型弱酸离子交换树脂Amberlite IRC-50投入到稀释好的发酵液中，一边搅拌、一边检测发酵液中的ε-PL含量，直至检测不到ε-PL；
(3)ε-PL解吸附：吸附完成后，停止搅拌，静置4h后，移除树脂，加入到离交柱中，并利用去离子水以4BV/h速率以下进上出方式去除吸附在树脂表面的菌体和发酵液，最后利用0.8M NH3·H2O以2BV/h速率洗脱ε-PL；
(4)ε-PL精制：将800mL洗脱液pH值调节至3.0左右，加入20g活性炭，升温至85℃保持30min；脱色液经截留分子量200Da纳滤膜脱盐和浓缩，浓缩液经冷冻干燥，得到ε-PL成品。
本对比例的ε-PL收率达到54.28％，纯度达到97.8％。
对比例2
(1)发酵液的稀释：取ε-PL发酵液100mL加入去离子水稀释5倍后，搅拌均匀；
(2)树脂吸附ε-PL：将38g活化好的氨型弱酸离子交换树脂Amberlite IRC-50投入到稀释好的发酵液中，一边搅拌、一边检测发酵液中的ε-PL含量，直至检测不到ε-PL；
(3)ε-PL解吸附：吸附完成后，停止搅拌，静置4h后，移除树脂，加入到离交柱中，并利用去离子水以4BV/h速率以下进上出方式去除吸附在树脂表面的菌体和发酵液，最后利用0.8M NH3·H2O以2BV/h速率洗脱ε-PL；
(4)ε-PL精制：将800mL洗脱液pH值调节至5.0左右，加入20g活性炭，升温至85℃保持30min；脱色液经截留分子量200Da纳滤膜脱盐和浓缩，浓缩液经冷冻干燥，得到ε-PL成品。
本对比例的ε-PL收率达到52.78％，纯度达到97.3％。
对比例3
(1)发酵液的稀释：取ε-PL发酵液100mL加入去离子水稀释5倍后，搅拌均匀；
(2)树脂吸附ε-PL：将38g活化好的氨型弱酸离子交换树脂Amberlite IRC-50投入到稀释好的发酵液中，一边搅拌、一边检测发酵液中的ε-PL含量，直至检测不到ε-PL；
(3)ε-PL解吸附：吸附完成后，停止搅拌，静置4h后，移除树脂，加入到离交柱中，并利用去离子水以4BV/h速率以下进上出方式去除吸附在树脂表面的菌体和发酵液，最后利用0.8M NH3·H2O以4BV/h速率洗脱ε-PL；
(4)ε-PL精制：将800mL洗脱液pH值调节至4.0左右，加入20g活性炭，升温至85℃保持30min；脱色液经截留分子量200Da纳滤膜脱盐和浓缩，浓缩液经冷冻干燥，得到ε-PL成品。
本对比例的ε-PL收率达到62.78％，纯度达到97.3％。
对比例4
(1)发酵液的稀释：取ε-PL发酵液100mL加入去离子水稀释5倍后，搅拌均匀；
(2)树脂吸附ε-PL：将38g活化好的氨型弱酸离子交换树脂Amberlite IRC-50投入到稀释好的发酵液中，一边搅拌、一边检测发酵液中的ε-PL含量，直至检测不到ε-PL；
(3)ε-PL解吸附：吸附完成后，停止搅拌，静置4h后，移除树脂，加入到离交柱中，并利用去离子水以4BV/h速率以下进上出方式去除吸附在树脂表面的菌体和发酵液，最后利用0.8M NH3·H2O以2BV/h速率洗脱ε-PL；
(4)ε-PL精制：将800mL洗脱液pH值调节至4.0左右，加入20g活性炭，升温至85℃保持30min；脱色液经截留分子量200Da纳滤膜脱盐和浓缩，浓缩液经冷冻干燥，得到ε-PL成品。
本对比例的ε-PL收率达到62.78％，纯度达到97.3％。
对比例5
(1)发酵液的稀释：取ε-PL发酵液100mL加入去离子水稀释5倍后，搅拌均匀；
(2)树脂吸附ε-PL：将38g活化好的氨型弱酸离子交换树脂Amberlite IRC-50投入到稀释好的发酵液中，一边搅拌、一边检测发酵液中的ε-PL含量，直至检测不到ε-PL；
(3)ε-PL解吸附：吸附完成后，停止搅拌，静置3h后，移除树脂，加入到离交柱中，并利用去离子水以2BV/h速率以下进上出方式去除吸附在树脂表面的菌体和发酵液，最后利用0.8M NH3·H2O以2BV/h速率洗脱ε-PL；
(4)ε-PL精制：将800mL洗脱液pH值调节至4.0左右，加入20g活性炭，升温至85℃保持30min；脱色液经截留分子量200Da纳滤膜脱盐和浓缩，浓缩液经冷冻干燥，得到ε-PL成品。
本对比例的ε-PL收率达到63.89％，纯度达到97.3％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (14)
1.一种提取ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法为在ε-聚赖氨酸发酵液中加入一定比例的水进行稀释，得到稀释后的发酵液；在稀释后的发酵液中加入一定比例的活化后的离子交换树脂进行吸附，得到吸附后的树脂；分离吸附后的树脂，将吸附后的树脂进行洗涤后用洗脱剂进行洗脱，得到ε-聚赖氨酸洗脱液；将ε-聚赖氨酸洗脱液经精制处理后获得ε-聚赖氨酸成品；
所述ε-聚赖氨酸发酵液是利用产ε-聚赖氨酸菌进行发酵得到的；
所述ε-聚赖氨酸发酵液与水的体积比为1:2-6；
所述稀释后的发酵液与离子交换树脂的质量比为1:0.1-0.3。
2.如权利要求1所述的一种提取ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法为在ε-聚赖氨酸发酵液中加入一定比例的水进行稀释，并搅拌均匀，得到稀释后的发酵液；在稀释后的发酵液中加入一定比例的活化后的离子交换树脂进行吸附，并进行搅拌，直至料液中不再检测到ε-聚赖氨酸，得到吸附后的树脂；分离吸附后的树脂，将吸附后的树脂进行洗涤后用洗脱剂进行洗脱，得到ε-聚赖氨酸洗脱液；将ε-聚赖氨酸洗脱液经精制处理后获得ε-聚赖氨酸成品；
所述ε-聚赖氨酸发酵液与水的体积比为1:2-6；
所述稀释后的发酵液与离子交换树脂的质量比为1:0.1-0.3。
3.如权利要求1所述的一种提取ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，所述离子交换树脂为弱酸性离子交换树脂或强酸性离子交换树脂。
4.如权利要求2所述的一种提取ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，所述离子交换树脂为弱酸性离子交换树脂或强酸性离子交换树脂。
5.如权利要求1所述的一种提取ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，所述活化为用酸或碱溶液浸泡树脂后，用水洗至近中性，重复操作多次。
6.如权利要求2所述的一种提取ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，所述活化为用酸或碱溶液浸泡树脂后，用水洗至近中性，重复操作多次。
7.如权利要求3所述的一种提取ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，所述活化为用酸或碱溶液浸泡树脂后，用水洗至近中性，重复操作多次。
8.如权利要求1所述的一种提取ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，所述洗脱剂为盐酸、氢氧化钠或氨水。
9.如权利要求2所述的一种提取ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，所述洗脱剂为盐酸、氢氧化钠或氨水。
10.如权利要求3所述的一种提取ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，所述洗脱剂为盐酸、氢氧化钠或氨水。
11.如权利要求4所述的一种提取ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，所述洗脱剂为盐酸、氢氧化钠或氨水。
12.如权利要求5所述的一种提取ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，所述洗脱剂为盐酸、氢氧化钠或氨水。
13.权利要求1-12任一所述的一种提取ε-聚赖氨酸的方法在生产ε-聚赖氨酸方面的应用。
14.权利要求1-12任一所述的一种提取ε-聚赖氨酸的方法在食品领域的应用。
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| US3565951A (en) * | 1966-03-23 | 1971-02-23 | Ajinomoto Kk | Recovery of lysine from fermentative broths |
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| CN106380592A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-02-08 | 江南大学 | 一种从发酵液中提取ε‑聚赖氨酸及其盐酸盐的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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| Separation and purification of ε-poly-L-lysine from fermentation broth;Xu-Sheng Chen et al;《Process Biochemistry》;20151115;第51卷;第134-141页 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108641078A (zh) | 2018-10-12 |
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