KR100467462B1

KR100467462B1 - 세라티오펩티다제를 생산하는 세라티아 속 미생물

Info

Publication number: KR100467462B1
Application number: KR10-2003-0001803A
Authority: KR
Inventors: 박호용; 손광희; 신동하; 장진영; 구본환; 정반디; 안애경
Original assignee: 주식회사 인섹트 바이오텍
Priority date: 2003-01-11
Filing date: 2003-01-11
Publication date: 2005-01-24
Also published as: KR20040064916A

Abstract

본 발명은 세라티오펩티다제 생산 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 세라티오펩티다제를 대량으로 생산하는 세라티아 속 균주; 세라티아 속 HY-6 및 상기 균주를 이용하여 세라티오펩티다제를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 균주는 기존의 균주에 비해 세라티오펩티다제를 대량으로 생산하므로 소염효소제의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세라티오펩티다제를 생산하는 세라티아 속 미생물{Microorganism of Serratia genus producing serratiopeptidase}

본 발명은 세라티아 속 균주에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 소염효소제로 널리 사용되고 있는 세라티오펩티다제를 대량으로 생산하는 세라티아 속 균주에 관한 것이다.

생체내에 외래성 유독물질이 침입하면 방어기작의 하나로써 염증이나 통증을 유발하는 물질이 분비되며 이러한 염증성 물질 혹은 괴사조직을 제거해 주는 역할을 하는 것이 소염효소제이다. 소염효소제는 다당체 분해효소와 단백질 분해효소로 나누어 질 수 있는데, 다당체 분해효소에는 라이소자임(lysozyme)이 있으며 단백질분해효소는 세라티오펩티다제(serratiopeptidase), 프로테아제(semi-alkaline protease, pronase), 브로멜린(bromelin), 스트렙토키나제(streptokinase), 어신(aescin) 및 히포카스타니(hipocastani) 등이 있다.

세라티오펩티다제는 현재 가장 많이 사용되고 있는 소염효소제로서 펩타이드 결합 가수분해를 촉매함으로써 브레드키닌(bradykinin) 분해 작용, 섬유소 용해 작용 및 점성농액 용해제거 작용을 한다. 그러나, 체내에서의 작용기전, 용량 및 효과에 대해서는 분명히 밝혀져 있지 않다. 세라티오펩티다제는 방광염, 부고환염, 부비강염(sinuitis)이나 지치주위염 등의 염증 및 수술후의 종창완화의 목적으로 사용되고 있으며, 치근막 변성증에 따른 염증, 농 및 외상후의 소염 작용, 기관지염, 기관지 천식, 폐결핵 또는 마취 후의 객담용해 배출 등에 적용되고 있다. 또한, 항혈청에 의한 알레르기 염증과 각종 기염성(enthusiasm) 물질에 의한 염증성 부종에 대해서도 소염효과가 있으며, 화학 요법제와 병용할 때 혈중 화학 요법제 농도의 상승 등의 복합적인 기작으로 치료의 상승효과를 얻을 수 있다(특허등록 제1991-0008639호).

세라티오펩티다제는 세라티아 속(Serratiasp.) 에 속하는 일부 균주에서 생산한다고 보고된 주된 단백질분해효소(protease)로서 분자량이 50-52 kDa 정도이고, 아연(Zn⁺⁺)을 함유한 금속성 단백질분해효소(metalloprotease)이며, 효소의 최적 pH가 9.5인 알카리성 단백질분해효소로 알려져 있다. 또한, 금속성 단백질분해효소의 기질 특이성은 바실러스 터모프로테오리티쿠스(Bacillus thermoproteolyticus)가 생산하는 헤모라이신(hemolysin)과 매우 유사한 특성을 가지고 있다(Kimet al.Kor. J. Microbiol., 1992, 71-77).

지금까지 연구된 세라티오펩티다제중 가장 많이 사용하고 있으며 관심의 대상이 되고 있는 것은 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)(ATCC 21074)(미국특허 제3691014호)가 생산하는 금속성 단백질분해효소(metalloprotease)이다. 그러나, 세라티아 마르세센스 균주를 이용한 세라티오펩티다제의 생산 방법에 있어서 미생물의 배양액에 포함된 주생산물인 세라티오펩티다제 이외에 540 nm의 파장에서 최대흡광도를 보이는 프로디지오신(prodigiosin)이라는 부산물이 다량 존재하기 때문에 상기 색소를 제거하는 정제공정을 거치게 되면 세라티오펩티다제의 회수율이 떨어지고, 제조원가를 가중시키며, 제품의 품질을 저하시키는 단점이 있다(특허등록 제1990-0003744호). 또한, 배양액으로부터 세라티오펩티다제를 정제하는 공정이 매우 복잡할 뿐만 아니라, 정제하는데 장시간이 소요됨으로써 정제공정 중에 단백질이 변성되어 효소의 역가가 떨어져 생산성 및 품질이 저하되는 문제점이 있다(특허등록 제1990-0003747호; 미국특허 제3691014호).

일반적으로 세라티오펩티다제를 정제하기 위해서는 세라티아 마르세센스 균주를 적정 배지에 배양한 후, 황산암모늄 분획 침전, 투석, 아세톤분획침전, DEAE-셀룰로즈 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 G-75에 의한 겔 여과 등의 공정을 거치지만 생산 수율이 38% 정도로 매우 비경제적이다(특허등록 제1991-0008639호). 하지만, 아직까지 세라티오펩티다제를 정제하는 공정을 단순화시켜 높은 수율로 수득하는 방법에 대해서는 밝혀져 있지 않은 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 단점을 보완하기 위하여 세라티오펩티다제를 생산하는 미생물을 탐색하던 중 세라티오펩티다제를 대량으로 생산하는 미생물을 동정하고, 상기 균주를 이용하여 세라티오펩티다제를 대량으로 분리 및 정제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 세라티오펩티다제를 대량 생산하는 세라티아 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 세라티오펩티다제를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 균주(A) 및 세라티아 마르세센스 균주(B)를 단백질 첨가 배지에서 배양하여 형성된 투명환을 나타낸 그림이고,

도 2는 본 발명의 균주가 생산한 세라티오펩티다제를 SDS-PAGE에 전기영동한 사진(A) 및 자이모그람 젤 전기영동 사진(B)이고,

도 3은 A 배지에서 성장한 본 발명의 균주 및 세라티아 마르세센스 균주의 세포 성장 및 세라티오펩티다제 생산역가를 나타낸 그래프이고,

●: 세라티아 속 HY-6의 세포 성장,

○: 세라티아 속 HY-6의 세라티오펩티다제 역가,

■: 세라티아 마르세센스의 세포 성장,

□: 세라티아 마르세센스의 세라티오펩티다제 역가

도 4는 B 배지에서 성장한 본 발명의 균주 및 세라티아 마르세센스 균주의 세포 성장 및 세라티오펩티다제 생산역가를 나타낸 그래프이고,

●: 세라티아 속 HY-6의 세포 성장,

○: 세라티아 속 HY-6의 세라티오펩티다제 역가,

■: 세라티아 마르세센스의 세포 성장,

□: 세라티아 마르세센스의 세라티오펩티다제 역가

도 5는 C 배지에서 성장한 본 발명의 균주 및 세라티아 마르세센스 균주의 세포 성장 및 세라티오펩티다제 생산역가를 나타낸 그래프이다.

●: 세라티아 속 HY-6의 세포 성장,

○: 세라티아 속 HY-6의 세라티오펩티다제 역가,

■: 세라티아 마르세센스의 세포 성장,

□: 세라티아 마르세센스의 세라티오펩티다제 역가

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세라티오펩티다제를 대량 생산하는 세라티아 속 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 이용한 세라티오펩티다제의 대량 생산 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 세라티오펩티다제를 대량 생산하는 세라티아 속 균주를 제공한다.

본 발명의 미생물은 곤충의 장으로부터 분리되었으며, 효소의 활성, 탄소원의 이용, 탄소원으로부터 산 생성, 질소가스의 생성여부 및 세포를 구성하는 지방산의 성분조사 등을 수행한 결과 본 발명의 균주는 장내 세균(Enterobacteriaceae)에 속하는 세라티아 속(Serratiasp.) 또는 라넬라 속(Rhenellasp.)으로 분류됨을 알 수 있다. 즉, 포자를 생성하지 않는 그람 음성 세균으로, 0.3-0.5 ㎛의 세포 크기와 0.7-1.2 ㎛의 세포 길이를 갖는 막대형의 세포로서, 운동성이 강하여 장내 세균류와 유사한 형태학적 특성을 가지고 있었으며, 베타 갈락토시다제(β-galactosidase), 우레아제(urease)를 생산하고 질산염을 아질산염으로 환원시키는 특징을 가지고 있었다. 더 자세한 동정을 위해 본 발명의 균주로부터 게놈 DNA를 분리하고 16S rDNA를 얻어 염기서열을 분석한 결과, 본 발명의 균주는 세라티아 마르세센스 ATCC 21074와 89%의 상동성을 가지고, 세라티아 마르세센스 SM6과는 88%의 상동성을 보여 세라티아 속 균주와 높은 상동성이 있음을 확인하였다. 그러나, 알콜성 탄수화물로부터의 산을 생성하는 능력이 있으며 옥시다제(oxidase)를 생산하지 않는 등 세라티아 속 미생물과 생리 생화학적으로 차이점이 있음을 확인하였다. 이에, 본 발명의 균주를 '세라티아 속 HY-6(serratiasp.HY-6)'이라 명명하고, 2002년 2월 28일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10186BP).

단백질 분해활성이 있음을 확인한 본 발명의 균주가 생산하는 단백질 분해효소가 무엇인지 확인한 결과, 본 발명의 균주가 생산하는 단백질 분해효소는 세라티오펩티다제와 동일한 크기를 갖는 단백질이며(도 2의 A 참조), 단백질을 분해하는 활성을 가짐을 확인함으로써(도 2의 B 참조) 본 발명의 균주가 생산한 단백질 분해효소는 세라티오펩티다제임을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 균주가 생산하는 세라티오펩티다제의 생산량이 기존의 균주가 생산하는 것보다 많은지 확인하기 위해 현재 세라티오펩티다제를 생산하기 위해 널리 사용되고 있는 세라티아 마르세센스(ATCC 21074)의 산업적 배지 조건을 바탕으로 하여 다양한 배지조성으로 균주를 배양하면서 생산되는 세라티오펩티다제의 양을 비교 조사한 결과, 본 발명의 균주는 배지의 조성에 따라 약간 차이가 나긴 하지만 세라티아 마르세센스 균주와 비슷한 수준이거나 높은 세포 성장률을 보였으며, 모든 배지 조성에서 세라티오펩티다제의 생산량은 2.4배 내지 6배 정도 높았다(도 3,도 4및도 5참조). 따라서, 본 발명의 균주는 현재 상용화된 균주보다 세라티오펩티다제 생산에 있어서 훨씬 우수한 균주임을 알 수 있다.

본 발명의 생산 방법은

1) 세라티아 속 HY-6을 배양 배지에서 배양하는 단계; 및

2) 단계 1의 세포 배양액에 유기용매 또는 황산암모늄을 처리하여 세라티오펩티다제를 정제하는 단계로 구성된다.

상기 단계 1에 있어서, 세라티아 속 HY-6이 세라티오펩티다제를 대량 생산하기 위한 적당한 배지의 조성은 세라티아 속 미생물의 산업적 생산 배지 조성이면 어떤 배지 조성이든 무관하다. 즉, 세라티아 속 HY-6을 배양하기 위한 적당한 배지에는 탄소원으로 글리세린(glycerine) 및 유당(lactose)을 사용할 수 있고, 질소원으로 소이빔 밀(soy beam meal), 효모 추출물(yeast extract)을 사용할 수 있으며, 단백질분해효소가 단백질을 분해하도록 유도하는 탈지유(skim milk), 나트륨 카제인네이트(sodium caseinate), 대두박 등을 사용할 수 있다.

상기 단계 2에 있어서, 상기 유기용매는 아세톤, 에탄올, 메탄올 및 이소프로판올로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 아세톤인 것이 바람직하다.

상기 방법을 통해 본 발명의 균주를 배양하여 생산된 세라티오펩티다제의 회수율은 60% 내지 80% 이상이다. 따라서, 종래 통상적인 생산 방법을 이용해 종래의 균주로부터 생산된 세라티오펩티다제의 회수율은 38% 정도인데 비하면 본 발명의 생산 방법은 매우 회수율이 높으며, 생산량도 많기 때문에 세라티오펩티다제를 생산하는데 있어서 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 미생물의 분리

나방을 70%(w/w) 에탄올에 1-2분 정도 침지시켜 곤충 표면의 오염원 및 오염균을 제거한 후 증류수로 2-3회 정도 세척하였다. 세척한 곤충의 내장을 핀셋으로 꺼내어 PBS(phosphate buffered saline)(0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.144% Na₂HPO₄, 0.024% KH₂PO₄)에 넣고 분쇄기로 분쇄한 후 적당히 희석하여 LB배지(1% 효모추출물, 2% 트립톤, 2% NaCl)에서 24-48시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 미생물을 단백질 성분이 함유된 고체배지(2% 탈지유, 1.5% 아가)에 옮겨 배양한 후, 균주 주변에 단백질이 분해되어 투명환이 형성되는 균주를 선별하였다.

<실시예 2> 분리된 균주의 동정

상기 실시예 1에서 단백질 분해능이 있음이 확인된 균주를 동정하기 위해 형태학적, 생리ㆍ생화학적 및 균체화학적 특성을 조사하였다. 구체적으로, 효소의 활성, 탄소원의 이용, 탄소원으로부터 산 생성, 질소가스의 생성여부 및 세포를 구성하는 지방산의 성분조사 등을 수행하였다.

그 결과, 본 발명의 균주는 포자를 생성하지 않는 그람 음성균으로 0.3-0.5㎛의 세포크기와 0.7-1.2 ㎛의 세포 길이를 갖는 막대형의 세포이고, 베타 갈락토시다제(β-galactosidase), 우레아제(urase) 및 디카르복시다제(dicarboxydase)와 같은 효소를 생산하였다. 또한, 구아닉산(guaric acid), 만니톨(mannitol), 이노시톨(inositol), 소비톨(sorbitol)등의 알콜성 탄수화물로부터 산을 생성하고, 질산염을 아질산염으로 환원하는 능력이 있고, 옥시다제(oxidase) 음성을 나타내었다(표 1).

특성	반응성
베타 갈락토시다제	+
우레아제	+
디카르복시다제	+
디하이드롤라제	-
카탈라제	+
옥시다제	-
인돌생성	-
황화수소 생성	-
시트레이트 생성	+

또한, 균체내 지방산 조성은 탄소수 16개의 포화 지방산이 32%, 탄소수 17개의 고리형 포화 지방산이 12% 그리고 탄소수 16개 및 15개 복합체가 20%로 존재하였다(표 2). 장내 세균(Enterobacteriaceae)에 속하는 세라티아 속(Serratiasp.) 또는 라넬라 속(Rhenellasp.)으로 분류되었다.

지방산 종류	함유량 (%)
C12:O	3.5
C14:O	5.0
C16:O	32.0
C17:O cyclo	12.0
C16:O w7c	20
C15:O 2OH	21

이에 본 발명의 균주를 더 자세하게 동정하기 위해 균주로부터 게놈 DNA를 분리하고 16S rDNA를 얻어 염기서열을 분석하였다. 구체적으로, 로셀 등의 방법(Rochell, P. A.,et al.,FEMS Microbiol. Lett., 1992, 100, 59-66)을 이용해서 게놈 유전자(genomic DNA)를 분리한 후 리보솜 소단위 유전자(16S rDNA)를 PCR(polymerase chain reaction) 방법으로 합성하였다. 합성된 유전자는 태그 다이디옥시 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(Tag Dye Deoxy Termicator Cycle Sequencing Kit)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열에 대해 NCBI(National Center for Biological Information) BLAST를 이용하여 데이터베이스 분석한 결과, 본 발명의 균주는 세라티아 속의 다른 균주인 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) ATCC 21074와는 89%의 상동성을 보이고, 세라티아 마르세센스 SM6(Sharon Cet al.,Mol. Gen. Genet., 1990, 222, 446-451)과는 88%의 상동성을 보여 세라티아 속 다른 균주와 높은 상동성이 있음이 확인되었으나,표 1에서 보는 바와 같이 생리ㆍ생화학적 특성에 있어 알콜성 탄수화물로부터의 산생성능(즉, 시트레이트 생성), 옥시다제(oxidase)의 음성등과 같은 특성으로 인해 정통적으로 알려진 세라티아 속과는 차이가 있었다. 이에, 본 발명자들은 상기에서 분리한 균주를 '세라티아 속 HY-6(serratiasp.HY-6)'이라 명명하고, 2002년2월 28일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10186BP).

<실시예 3> 세라티아 속 HY-6과 소염제 생산 균주와의 단백질 분해능 비교

세라티아 속 HY-6이 생산하는 단백질 분해 효소의 단백질 분해능을 확인하기 위해 현재 보편적으로 사용하고 있는 소염효소제 생산 균주인 세라티아 마르세센스 균주(Serratia marcescens,ATCC 21074)를 이용하여 미생물의 성장과 함께 생성되는 단백질분해효소 생성 양상을 비교하였다. 구체적으로, 세라티아 마르세센스 균주 및 본 발명의 세라티아 속 HY-6의 단일 균체를 탈지유 배지(2% 탈지유, 1.5% 아가)에 도말한 후, 30 ℃ 항온조(incubater)에서 18시간 동안 배양시켰다. 상기 배양 온도는 현재 보편적으로 보고되어 있는 세라티오펩티다제를 생산하는 세라티아 속 미생물의 배양온도이다(Kim, H. Ret al.,Kor. J. appl. Microbiol. biotechnol., 1991, 19, 450-455; Ro, H. Set al.,Kor. J. Appl. Microbiol. Bitechnol., 1992, 20, 207-212; 특허등록 제1990-0003744호; 특허등록 제 1991-0008639호). 배양 후 미생물의 성장 정도 및 탈지유 배지내의 단백질 성분을 분해하여 형성된 균주 주위의 투명환의 크기를 비교하였다.

그 결과, 세라티아 속 HY-6은 성장 속도가 빠르고 상당히 넓은 범위의 투명환을 보인 반면에 비교 균주인 세라티아 마르세센스 균주는 미생물의 성장 정도와 비교했을 때 세라티아 속 HY-6보다 좁은 범위의 투명환을 보였다(도 1). 상기 결과로부터 본 발명의 균주는 기존의 세라티오펩티다제 생산 균주보다 단백질 분해능이 뛰어남을 알 수 있다.

<실시예 4> 세라티아 속 HY-6이 생산한 단백질분해효소의 검증

상기 실시예 3에서 단백질분해능이 있음이 확인된 세라티아 속 HY-6이 생산하는 단백질분해효소가 무엇인지 확인하기 위해 먼저 분자량을 측정하였다. 구체적으로, 본 발명의 미생물을 TY 배지(0.5% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.1% NaCl, 0.05% KCl, 0.02% CaCl₂, 0.02% MgSO₄)에서 24시간 동안 배양한 후 세포 배양액을 수거하여 원심분리한 후 상등액을 얻었다. 상기 세포 배양액의 상등액을 10% SDS-폴리아크릴아마이드젤(polyacrylamide gel)에 전기영동한 후 젤을 코마쉬 브릴리언트 블루(Coomasseie Brilliant Blue R-250)로 염색하여 단백질분해효소의 분자량을 확인하였다(Laemmli, U. K.,Nature, 1970, 680-685).

그 결과, 본 발명의 미생물이 생산하는 단백질 분해효소는 51-52 kDa의 분자량을 가져 세라티오펩티다제와 비슷한 분자량을 가짐을 알 수 있으며 전체 분리된 단백질의 80% 정도를 차지하였다(도 2의A).

또한, 본 발명의 균주가 생산하는 단백질 분해효소가 세라티오펩티다제인지 확인하기 위해 단백질 분해 활성을 측정하였다. 구체적으로, 상기 세포 배양액의 상등액을 젤라틴이 함유된 10% 자이모그람 젤(Zymogram ready gel)(Bio-Rad,catalog No.161-113)에 전기영동하였다. 전기영동 후 상기 젤을 복원 완충용액(renaturation buffer)에 넣어 실온에서 30분 동안 방치시킨 후 전개 완충용액(development buffer)에 넣어 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 후 0.5% 코마쉬 브릴리언트 블루로 젤을 염색하여 활성이 있는 단백질분해효소를 확인하였다.

그 결과, SDS-폴리아크릴아마이드젤에서 확인한 50-52 kDa의 분자량을 가진 단백질이 자이모그람 젤에 함유되어 있는 젤라틴을 분해하여 푸른색 시약인 코마쉬 브릴리언트 블루에 염색되지 않는 투명 지역(clear zone)을 형성함을 확인하였다(도 2의B). 상기 결과로부터 본 발명의 균주가 생산하는 단백질 분해 효소는 단백질 분해 활성이 있으며, 세라티오펩티다제와 분자량이 동일하므로 세라티오펩티다제임을 알 수 있었다.

<실시예 5> 세라티아 속 HY-6의 세라티오펩티다제 생산량 조사

본 발명의 균주가 생산하는 세라티오펩티다제의 생산량이 기존의 균주가 생산하는 것보다 많은지 확인하기 위해 현재 세라티오펩티다제를 생산하기 위해 사용되는 세라티아 마르세센스(ATCC 21074)의 산업적 배지 조건을 바탕으로 하여 다양한 배지조성으로 균주를 배양하면서 생산되는 세라티오펩티다제의 생성양을 비교 조사하였다. 구체적으로, 상기 균주들은 전체적인 배양 양상을 동일하게 하기 위하여 동일 배지인 LB 배지로 12시간 동안 전배양한 후, 전체 배양 부피의 1%를 하기표 3에 기재된 A(Ro, H. Set al.,Kor. J. Appl. Microbiol. Bitechnol.,1992, 20, 207-212), B(Kim, H. Ret al.,Kor. J. appl. Microbiol. biotechnol., 1991, 19, 450-455) 및 C(Luria-Bertani 배지, Difco) 배지에 각각 접종하여 30℃ 진탕배양기에서 180 rpm으로 48시간 배양하였다.

배양배지	A	B	C
배지조성(%)	트립톤 0.5효모 추출물 0.5NaCl 0.1KCl 0.05CaCl₂0.02MgSO₄0.02	카제인 3.0소이빔 밀 1.5글루코스 2.0수크로즈 0.5(NH₄)₂HPO₄0.1NaCl 0.02KCl 0.01CaCl₂0.01MgSO₄0.02KH₂PO₄0.2K₂HPO₄0.4	카제인 1.0효모 추출물 0.5NaCl 1.0

상기 배양 후 아조-카세인(azo-casein)(sigma, USA) 24 ㎎을 50 mM 인산 용액(pH 7.6) 1 ㎖에 녹이고 37℃에서 5분간 전처리하였다. 전처리한 아조-카세인 용액 300 ㎕에 미생물을 배양한 후 균체를 제거시킨 조효소액 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응한 다음 300 ㎕의 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 용액을 넣어 반응을 종결시킨 후 1시간 동안 정치시켰다. 정치시킨 용액을 13,000 g에서 7분 동안 원심분리한 후 10% NaOH 15 ㎕를 첨가하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다(Braun, V. and G. Schmitz.,Archiv. Microbiol., 1980, 124, 55-61). 미생물의 세포 농도는 흡광도 값이 0.5를 넘지 않도록 세포 배양액을 희석하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였으며, 세라티오펩티다제의 역가는 405 nm에서 흡광도 값이 1.0 증가하는 값을 1 유니트로 정의하였다.

그 결과, A 배지의 경우 세포 성장은 비슷한 양상을 보였으나, 세라티오펩티다제의 생산량은 본 발명의 미생물이 세라티아 마르세센스 균주와 비교해 2.4배 정도 높았다. 또한, 본 발명의 미생물의 세라티오펩티다제 생산은 42-48시간 정도에서 끝난 것에 비해 세라티아 마르세센스 균주는 48시간 이후에도 계속 생산되어 비교적 생산속도가 느렸다(도 3). 또한, B 배지의 경우 세포 성장은 세라티아 마르세센스 균주가 본 발명의 미생물보다 2배 정도 높은 세포 성장률을 보인 반면, 세라티오펩티다제의 생산은 본 발명의 미생물이 약 6배 정도 높았다(도 4). 또한, 미생물의 배양에 기본이 되는 LB 배지인 C 배지의 경우 세포 성장은 본 발명의 미생물이 세라티아 마르세센스 균주에 비해 약간 빠르게 성장하는 것을 확인 할 수 있었으며, 세라티오펩티다제의 생산량 또한 약 6배 정도 높았다(도 5).

상기의 결과로부터, 본 발명의 균주는 세라티아 마르세센스 균주보다 세포성장률이 높고, 세라티오펩티다제 생산량도 높음을 알 수 있었다.

<실시예 6> 세라티오펩티다제의 정제

본 발명자들은 세라티오펩티다제를 정제하기 위해 유기용매 침전 또는 황산암모늄을 이용한 침전을 하였다. 구체적으로, 유기용매 침전을 하기 위해 세라티아속 HY-6을 배양한 배양액을 멤브레인 필터(Membrane filter; Pall sep-400, Pallcorporation)를 통과시켜 균체를 제거하고, 울트라 필터(Ultra filter; sartorius, B. Braun Biotech International)를 통과시켜 농축하였다. 농축이 끝난 조효소액은 30-40% 아세톤으로 1차 침전하여 상등액만을 회수하고, 다시 70-80% 아세톤으로 2차 침전하여 침전된 액을 회수하였다.

그 결과, 회수율 60% 이상의 순수한 세라티오펩티다제를 얻을 수 있었다.

또한, 황산암모늄을 이용하여 염석에 의한 침전 방법으로 정제하였다. 구체적으로, 상기에서 멤브레인 필터와 울트라 필터를 하고 난 농축된 조효소액에 70-80%의 황산암모늄을 넣어 침전시키고, 침전된 액을 회수하여 다시 울트라 필터를 통과시켜 염을 제거한 후 세라티오펩티다제를 회수하였다.

그 결과, 회수율 80% 이상의 순수한 세라티오펩티다제를 얻을 수 있다.

상기와 같이 세라티오펩티다제를 일반적으로 정제하기 위해 사용하는 유기용매를 이용한 침전 및 황산암모늄을 이용한 염석에 의한 침전 방법으로 본 발명의 균주로부터 분리한 세라티오펩티다제의 회수율은 60 내지 80% 이상이 되며, 프로디지오신과 같은 색소를 생산하지 않아 컬럼을 통한 크로마토그래피와 같은 과정을 거치지 않아도 되기 때문에 쉽게 대량으로 수득할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 미생물은 기존의 세라티오펩티다제생산 균주에 비해 세라티오펩티다제를 훨씬 많이 생산하며, 본 발명의 미생물을 이용하여 세라티오펩티다제를 분리하면 대량으로 고순도로 분리할 수 있어 소염효소제의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

세라티오펩티다제를 생산하는 세라티아 속 HY-6 균주(수탁번호: KCTC 10186BP).
1) 제 1항의 균주를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및

2) 단계 1의 배양액에 유기용매 또는 황산암모늄을 처리하여 세라티오펩티다제를 정제하는 단계로 구성되는 제 1항의 균주를 이용한 세라티오펩티다제의 대량 생산 방법.
제 2항에 있어서, 유기용매는 아세톤, 에탄올, 메탄올 및 이소프로판올로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 유기용매는 아세톤인 것을 특징으로 하는 방법.