CN115895918A - 一种裂解性多糖单加氧酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和生物技术领域。具体地，本发明涉及一种提高曲霉降解淀粉能力的方法，具体涉及曲霉的遗传改造，更具体的涉及锥毛壳属真菌Coniochaeta sp.PMI_546裂解性多糖单加氧酶CospAA13及其基因在提高曲霉降解淀粉能力中的应用。本发明所提供的CospAA13重组表达的菌株，该菌株中的CospAA13与糖化酶协同作用，显著提升淀粉水解能力。其中糖化酶活力比出发菌株提高了22.8％，具有较高的应用价值。

Description

一种裂解性多糖单加氧酶及其应用

技术领域：

本发明属于基因工程和生物技术领域。具体地，本发明涉及一种提高曲霉降解淀粉能力的方法，具体涉及曲霉的遗传改造，更具体的涉及锥毛壳属真菌Coniochaetasp.PMI_546裂解性多糖单加氧酶CospAA13及其基因在提高曲霉降解淀粉能力中的应用。

背景技术：

丝状真菌蛋白质生产系统发展潜力巨大、应用前景广阔，它作为细胞工厂可高效表达分泌胞外蛋白，被广泛用作细胞工厂，生产许多有价值的产品。黑曲霉(Aspergillusniger)是一种常见的曲霉属丝状真菌，其生命力旺盛，菌株繁殖快。其分泌效率高、翻译后修饰能力强，被广泛用作蛋白质生产的细胞工厂，是工业上生产酶制剂的主要菌株，生产工业酶和有机酸等。

糖化酶(Glucoamylase，EC 3.2.1.3)全称为葡萄糖淀粉酶，是最重要的工业酶制剂之一，广泛应用于制糖、发酵和食品加工等众多领域，我国糖化酶主要是由黑曲霉菌株经深层发酵生产。我国糖化酶工业生产起步较晚，经过几十年的不断发展，取得了明显的进步。目前已经可以自主生产糖化酶等大宗酶制剂品种，例如中国专利文献CN105255741A公布了一株以黑曲霉G131和F285为出发菌株，通过多轮原生质体电融合育种选育获得的高产糖化酶的菌株-黑曲霉CGMCC 10788，该菌株平均发酵酶活力比出发菌株提高了99.3％。公开号为CN103937766 A的发明专利公开了一种通过将糖化酶表达盒和选择标记基因定点整合到黑曲霉An12g08830基因座，从而提高糖化酶的方法。公开号为CN113061539A的发明专利公开了通过对脂肪酸代谢通路基因过表达从而提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法。

尽管这些研究也已经达到了很高的水平，但是目前的研究主要集中在利用传统的菌种选育方法进行高产糖化酶菌株的筛选育种，或者是在原有的黑曲霉菌株中提高糖化酶基因的拷贝数或者去除某些基因。近年来裂解性多糖单加氧酶(LPMO)的发现为淀粉降解提供了一种新的方式。因此，有必要开发一种利用裂解性多糖单加氧酶与糖化酶协同作用提高糖化酶活力的菌株，显著提高重组菌株的淀粉降解能力，以满足我国糖化酶在工业领域的发酵应用，具有重要的创新性。

发明内容：

本申请经过广泛而深入的研究，目的在于提供一种利用裂解性多糖单加氧酶与糖化酶协同作用提高菌株糖化酶活力的菌种改造方法，通过遗传改造提高丝状真菌菌株的糖化活力。本发明通过将裂解性多糖单加氧酶基因随机插入整合到黑曲霉菌株的基因组中，发挥裂解性多糖单加氧酶和糖化酶的协同作用，显著提高重组菌株的糖化活力。在此基础上，完成了本发明。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供的技术方案之一，是一种曲霉重组菌，所述重组菌是在具有糖化酶的曲霉出发菌中表达裂解性多糖单加氧酶CospAA13所得；

进一步地，所述曲霉为黑曲霉；

进一步地，所述裂解性多糖单加氧酶CospAA13来源于锥毛壳属真菌Coniochaetasp.PMI_546，具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；

更进一步地，所述裂解性多糖单加氧酶CospAA13的编码基因具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

进一步地，所述裂解性多糖单加氧酶CospAA13的表达可以是在宿主基因组中整合CospAA13编码基因或含有CospAA13编码基因的表达盒，也可以将包含CospAA13编码基因表达盒的表达载体转入宿主细胞中实现；

优选地，所述重组菌是在产糖化酶的黑曲霉工业菌株UN1636中，通过pAN52-TN载体重组表达裂解性多糖单加氧酶CospAA13获得的，重组菌命名为CospAA13-2菌株；

进一步地，所述黑曲霉菌株UN1636，保藏编号CGMCC NO.20725；

上述重组菌是一种裂解性多糖单加氧酶与糖化酶发挥协同作用的菌株，其与出发菌株相比，获得更强的糖化酶活力和淀粉降解的能力。

本发明提供的技术方案之二，是技术方案一所述重组菌的应用，特别是在降解淀粉中的应用。

本发明获得下述有益效果：

对曲霉细胞进行遗传操作实现裂解性多糖单加氧酶的重组表达，所得重组菌是一种裂解性多糖单加氧酶与糖化酶协同作用的菌株，其与出发菌株相比，获得更强的糖化酶活力和淀粉降解的能力，显著提高重组菌株的糖化活力。本发明利用基因重组技术表达裂解性多糖单加氧酶CospAA13，得到重组曲霉突变菌株，该突变菌株能够显著提升淀粉降解能力，糖化酶的活力比出发菌提高22.8％，具有较大的应用价值。

附图说明：

图1为CospAA13基因重组表达盒转化黑曲霉菌株筛选得到的转化子的PCR鉴定核酸电泳图。M，marker；1-4为抗生素平板上筛选到的转化子；5，出发菌株对照；6，阴性对照。

图2为CospAA13重组表达菌株CospAA13-2与出发菌株黑曲霉UN1636在6天发酵摇瓶上清中糖化酶活力测定。

具体实施方式：

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例中所采用的黑曲霉出发菌株UN1636为现有技术，保藏编号CGMCCNO.20725。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。其中，所出现的百分比浓度如无特别说明均为质量百分浓度。所用引物和核酸测序均由由苏州金唯智生物科技有限公司GENEWIZ完成。其中，KAH8904799.1为锥毛壳属真菌Coniochaeta sp.PMI_546裂解性多糖单加氧酶的蛋白编号(也即SEQ ID NO.1)，其基因编号在公共序列数据库中未给出，我们将其命名为CospAA13。

在本发明中，对所用术语的含义作一说明。

“重组”被用于指代菌株、细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该菌株、细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。例如，重组菌株是表达在天然(非重组)形式的该菌株中不曾发现的基因，或者表达天然基因。

“宿主菌株”或“宿主细胞”或“出发菌株”，是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，具体而言，宿主菌株优选地是曲霉属，最优选为黑曲霉。该宿主细胞可以是曲霉宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。

“序列”是指任意合适长度的核苷酸序列，其可以是DNA或RNA；可以是线状、环状或分支状，而且可以是单链或者双链。术语“供体DNA序列”是指被插入基因组中的核苷酸序列。供体序列可以为任意长度。

以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。

实施例1、CospAA13重组表达载体的构建

(1)裂解性多糖单加氧酶CospAA13重组表达载体的构建

以质粒pAN52-TN为骨架构建表达载体(pAN52-TN载体已公开于中国发明专利申请201510129876.0中)。以嗜热毁丝霉裂解性多糖单加氧酶(MYCTH_2313229)序列为参照，在NCBI数据库中进行生物信息的分析比对，找到锥毛壳属真菌Coniochaeta sp.PMI_546裂解性多糖单加氧酶(KAH8904799.1)，KAH8904799.1氨基酸序列和核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

KAH8904799.1对应基因的核苷酸序列(SEQ ID No.2)通过苏州金唯智公司合成，利用引物cosp-amp-F(SEQ ID No.3)和cosp-amp-R(SEQ ID No.4)进行扩增。pAN52-TN载体通过限制性内切酶EcoRV酶切，扩增产物与经过酶切的pAN52-TN利用Gibson Assembly的方法连接构建成重组表达载体pAN52-TN-CospAA13。

PCR反应体系为：5×phusion HF缓冲液10μL，10mM dNTPs 1μL，上游/下游引物2.5μL，模板DNA 1μL，Phusion DNA聚合酶0.5μL，ddH₂O 32.5μL。

PCR反应条件为：先98℃30s；然后98℃15s，60℃15s，72℃1min，34个循环；最后72℃10min，4℃10min。

实施例2、裂解性多糖单加氧酶在黑曲霉中的重组表达

将10μg由限制性内切酶线性化的重组表达载体pAN52-TN-CospAA13转化导入黑曲霉菌株UN1636的原生质体细胞中，然后通过遗传霉素抗性筛选出阳性转化子。

(1)黑曲霉原生质体转化

A、菌丝体准备

将成熟的黑曲霉孢子，用0.05％吐温-80灭菌水收集，经擦镜纸过滤除去菌丝后，接种于MM液体培养中，30℃，200rpm培养16h。

MM培养基：50×Vogel’s盐20mL，蔗糖20g，琼脂15g，定容体积到1L，高压灭菌。50×Vogel’s盐(1L)：柠檬酸三钠(1/2H₂O)150g，无水KH₂PO₄ 250g，无水NH₄NO₃ 100g，MgSO₄·7H₂O 10g，CaCl₂·2H₂O 5g，微量元素盐溶液5mL，生物素(0.1mg/mL)2.5mL，定容体积到1L。

B、原生质体制备

将菌丝过滤收集后置于30mL裂解液(配方：0.15g裂解酶，30mL溶液A，过滤除菌；溶液A：磷酸二氢钾1.0361g，山梨醇21.864g，溶于90mL去离子水，pH调至5.6，定量至100mL，高温灭菌)中，30℃裂解2h，每隔30min轻轻摇动。而后用玻璃纸过滤后，4℃2000rpm离心10min，弃上清，加入4mL溶液B(配方：氯化钙0.735g，山梨醇18.22g，Tris-HCl(1M，pH 7.5)1mL，溶于90mL去离子水，pH调至7.6，定量至100mL，高温灭菌)，2000rpm 4℃离心10min；弃上清，加入200μL溶液B。

C、原生质体转化

在预冷的15mL离心管中，依次加入50μL预冷PEG(12.5g PEG6000，0.368g氯化钙，500μL Tris HCl(1M pH 7.5)，将待转化的DNA片段加至200μL原生质体中。置于冰上20min后加入2mL预冷PEG液体，置于室温5min，而后加入4mL溶液B，轻轻混匀。将融化的MM培养基倒入离心管中使遗传霉素浓度为250mg/L，平铺于平板中，30℃培养，5天后于挑取单个菌丝体于相应抗性平板生长。

(2)黑曲霉转化子验证

A.黑曲霉基因组的提取

采用酚氯仿法从上述转化过程中挑选的转化子提取基因组DNA，具体包括以下操作：

1)2.0mL的无菌的DNA提取管中加入200mg的锆珠及1mL的裂解液(配方：0.2MTris-HCl(pH 7.5)，0.5M NaCl，10mM EDTA，1％SDS(w/v))，挑取平板中生长的黑曲霉菌丝于DNA提取管中；

2)将所有DNA提取管置于助磨器上，最大转速振荡30s，重复两次；

3)65℃水浴30min，在水浴过程中每隔几分钟漩涡振荡；

4)水浴结束后取出，每管加入80μL pH 7.5的1M的Tris·HCl中和；

5)加入400μL的酚：氯仿(1:1)，13000rpm离心5分钟；

6)取300μL上清液于新的1.5mL EP管中，加入600μL 95％的乙醇(DNA级)；

7)冰上孵育一小时，随后4℃、13000rpm离心，可看到白色的DNA沉淀于EP管底部；

8)用75％的酒精(DNA级)400μL清洗，4℃13000rpm离心，轻轻取出上清液；

9)将EP管置于真空浓缩仪中，除去残留的酒精；

10)加入50μL ddH2O溶解DNA，用NanoDrop测DNA浓度，测完浓度后将提取的DNA置于-20℃冰箱保存，以备下一步进行PCR验证。

B、PCR验证转化子

以上述提取的基因组DNA为模版，用引物PAN52-seq-F1(SEQ ID No.5)和PAN52-seq-R1(SEQ ID No.6)对转化子进行基因PCR验证。PCR反应试剂购于南京诺唯赞生物科技有限公司。

引物序列如下：

PAN52-seq-F1:CATCTTTCCCATCATCATCTC(SEQ ID No.5)

PAN52-seq-R1:CTGACATCGACACCAACGATC(SEQ ID No.6)

PCR反应体系为：10×Taq Buffer 2μL，10mM dNTP Mix 0.2μL，10μM上游/下游引物各0.4μL，DNA模板1μL，Taq DNA Polymerase 0.2μL，水15.8μL。

PCR反应条件为：先94℃5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃1.2min，30个循环；最后72℃10min，4℃10min.

实验结果：对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(130V电压，20分钟)，在凝胶成像系统下显示出明显的基因扩增条带，CospAA13过表达菌株的PCR扩增条带为1376bp，野生型菌株扩增不出条带，结果如图1所示，表明CospAA13通过随机插入的方式插入黑曲霉UN1636的基因组上，从而得到重组黑曲霉菌株CospAA13-2菌株。

实施例3、重组基因菌株生产糖化酶的表型分析

将上述所得CospAA13基因重组表达菌株(CospAA13 -2)和出发菌株黑曲霉UN1636分别接种至250mL三角瓶中的50mL发酵培养基中。孢子接种量为5×10⁴个/mL，30℃，240rpm培养6天，样品离心取上清液即为粗酶液，测定糖化酶活力。

糖化酶活力测定：将粗酶液用0.05M pH 4.6醋酸钠缓冲液稀释适当的倍数，终体积为0.25mL，放入40℃水浴锅内预热，取出，加入40℃水浴锅内预热后的0.25mL 1％可溶性淀粉底物溶液，混匀，40℃反应10min，用0.5mL DNS溶液终止反应，煮沸10min，至冰上冷却，加蒸馏水定容至2.5mL，上下摇匀，释放的葡萄糖的量用DNS的方法测定，在波长540nm下，测定OD值，空白组使用灭活的酶液作对照。

结果如图2所示，与出发菌株UN1636相比，基因过表达菌株的糖化酶的酶活力显著提高，其糖化酶活力比出发菌株提高～22.8％。

由于本发明所用单加氧酶发挥其氧化降解淀粉的活性需要一定的反应条件，提供氧化反应所需电子的还原剂如抗坏血酸，微酸性反应环境(pH 6.0)，并且需要较长的反应时间(2-4小时)。在本发明中测定糖化酶活性的反应条件下(pH 4.6,反应时间10分钟)，单加氧酶本身的氧化断裂产生的还原糖极少。因此确定，基因过表达菌株的糖化酶酶活力的显著提高是由于单加氧酶与糖化酶之间的协同作用产生的效果。

Claims (7)

1.一种曲霉重组菌，其特征在于，所述重组菌是在具有糖化酶的曲霉出发菌中表达裂解性多糖单加氧酶CospAA13所得；

所述裂解性多糖单加氧酶CospAA13具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的一种曲霉重组菌，其特征在于，所述裂解性多糖单加氧酶CospAA13的编码基因具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的一种曲霉重组菌，其特征在于，所述裂解性多糖单加氧酶CospAA13的表达可以是在宿主基因组中整合CospAA13编码基因或含有CospAA13编码基因的表达盒，也可以将包含CospAA13编码基因表达盒的表达载体转入宿主细胞中实现。

4.如权利要求1所述的一种曲霉重组菌，其特征在于，所述曲霉为黑曲霉。

5.如权利要求1所述的一种曲霉重组菌，其特征在于，所述重组菌是在产糖化酶的黑曲霉工业菌株UN1636中，通过pAN52-TN载体重组表达裂解性多糖单加氧酶CospAA13获得的。

6.权利要求1-5任意一项所述曲霉重组菌的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，是在降解淀粉中的应用。

Images